تأثیر شبیه‌سازی هضم انسان در شرایط آزمایشگاهی بر محتویات فنولیک و فعالیت‌های بیولوژیکی عصاره‌های آبی گونه‌های سیستوس ترکیه قسمت 2

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

برای جمع بندی

عصاره آبی C.salvifolius فعالیت مهاری آنزیم گوارشی بهتری نسبت به عصاره سایر گونه ها نشان داد. علاوه بر این، نمونه‌های IN تمام عصاره‌های آبی فعالیت‌های بازدارندگی آنزیمی کمتری را در مقایسه با نمونه‌های ND نشان دادند.

فعالیت بازدارنده AGEs 2.4

همانطور که در جدول 4 ارائه شده است، فعالیت مهاری AGE وابسته به غلظت در تمام عصاره های آبی مشاهده شد. نمونه‌های ND از CCA، CPA و CSA فعالیت بازدارندگی بهتری نسبت به ترکیب مرجع کورستین در هر دو غلظت 5/0 0 و 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر نشان دادند. با این حال، تنها عصاره C.saluifolius فعالیت بازدارندگی بهتری نسبت به کوئرستین در بین نمونه‌های IN عصاره‌ها نشان داد. نمونه‌های در دسترس زیستی عصاره‌های آبی در مقایسه با نمونه‌های هضم نشده فعالیت بازدارندگی AGE کمتری نشان دادند. بر اساس نتایج، نمونه ND عصاره آبی C.salvifolius دارای بیشترین فعالیت بازدارندگی AGE بود. با این حال، نمونه IN عصاره آبی C.monspeliensis ضعیف ترین پتانسیل مهار AGE را در غلظت های آزمایش شده نشان داد.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

3. بحث

رادیکال های آزاد ممکن است برای تهیه الکترون به پروتئین ها، لیپیدها یا DNA حمله کنند و در نتیجه مشکلات سلامتی مختلفی ایجاد کنند. به همین دلیل، تعادل بین سیستم آنتی اکسیدانی بدن و رادیکال های آزاد تشکیل شده در اثر اکسیداسیون ضروری است. در صورت از بین رفتن این تعادل، استرس اکسیداتیو به وجود می آید [29]. استرس اکسیداتیو یکی از عوامل اصلی ایجاد اختلالات مزمن مختلف مانند سرطان، دیابت، بیماری های قلبی عروقی، بیماری آلزایمر و غیره است. در حالی که سیستم های خود آنتی اکسیدانی در بدن انسان برای مبارزه بااکسیداتیوآسیب به بافت ها و اندام ها، این سیستم های دفاعی ممکن است کارایی خود را به دلیل شرایط مختلف از جمله مصرف بیش از حد الکل، سیگار کشیدن، استرس، مصرف مزمن مواد مخدر و تشعشع و غیره از دست بدهند [30]. گزارش‌های علمی مختلف نشان داده‌اند که متابولیت‌های ثانویه گیاهی نقش مهمی در جلوگیری از استرس اکسیداتیو و اثرات مضر آن دارند [13،14،31] اگرچه فراهمی زیستی پارامتر مهمی است که بر فعالیت زیستی این ترکیبات تأثیر می‌گذارد، اما در نظر گرفته نشده است. اکثر مطالعات با این حال، به خوبی شناخته شده است که متابولیت های ثانویه به دلیل شرایط مختلف pH، فعالیت آنزیمی و دمای بدن در سیستم گوارشی در معرض تغییرات ساختاری قرار می گیرند. علاوه بر این، ویژگی های شیمیایی متابولیت های ثانویه مانندمولکولیوزن، قطبیت و درجه اتصال به ماکرومولکول‌ها در زمینه گیاهی نیز عوامل مهمی هستند که بر فراهمی زیستی آنها تأثیر می‌گذارند [13]. بر این اساس، جذب ترکیبات یا متابولیت‌های آنها در جریان خون پس از مصرف برای اعمال اثرات فیزیولوژیکی سیستمیک ضروری است. مدل‌های شبیه‌سازی هضم آزمایشگاهی ممکن است شواهدی برای ارزیابی ویژگی‌های فراهمی زیستی احتمالی مواد فراهم کنند. در حالی که تأیید در آزمایش‌های انسانی برای ادعای هرگونه ویژگی عملکردی ضروری است، مدل‌های شبیه‌سازی آزمایشگاهی به طور گسترده به عنوان جایگزینی برای مطالعات in vivo یا آزمایش‌های انسانی استفاده می‌شوند که اغلب از نظر اخلاقی قابل بحث، منابع فشرده، پرهزینه و زمان‌بر هستند [32].

سیستانچ می تواند ایمنی را بهبود بخشد

چندین محقق همچنین پتانسیل آنتی اکسیدانی عصاره های تهیه شده از اندام های مختلف گونه Cistus را بررسی کرده اند. با توجه به بررسی ادبیات، این اولین مطالعه بر روی گونه‌های سیستوس با توجه به فراهمی زیستی مواد فنلی و تأثیر آنها بر فعالیت آنتی‌اکسیدانی با استفاده از یک مدل شبیه‌سازی هضم آزمایشگاهی است. کاراس و همکاران [33] پیشنهاد کرد که 10 درصد از اجزای پلی فنولی در ماتریکس گیاه هضم نشده باقی می‌مانند و 90 درصد آنها در فاز معده یا روده در معرض هضم قرار می‌گیرند (به ترتیب تقریباً 48 درصد و 52 درصد). همانطور که قبلا ذکر شد، تمام مقادیر فنلی در عصاره های آبی تحت تاثیر روش شبیه سازی هضم آزمایشگاهی انسانی قرار گرفتند. بنابراین، تلفات قابل‌توجهی در محتویات فنلی نمونه‌های در دسترس زیستی همه عصاره‌ها مشاهده شد. علاوه بر این، غلظت کل پروآنتوسیانیدین نمونه های IN زیر حد تشخیص در تمام عصاره های آبی بود. مطالعات مختلف همچنین تأثیر منفی فرآیند هضم را بر ترکیبات فنلی موجود در عصاره‌های گیاهی و در نتیجه فعالیت‌های زیستی مرتبط با آن نشان داد. به عنوان مثال، ما کل محتوای فنلی سالویا ویرگاتا ژاک را گزارش کردیم. همچنین در مطالعه قبلی ما تحت تأثیر روش هضم قرار گرفت. علاوه بر این، مقدار متابولیت های اصلی عصاره، یعنی روتین و رزمارینیک اسید، تمایل به کاهش داشت [13]. در مقابل، چندین مطالعه نتایج متناقضی را گزارش کرده اند. در مطالعه Celeb و همکاران. [34]، آنها افزایش مقدار کل اسید فنولیک، فلاونوئید و فنولیک را در نمونه های زیستی موجود در عصاره متانولی از Hypericum perfoliatum L مشاهده کردند. در واقع، متابولیت های اصلی، کوئرسیترین، کلروژنیک و اسید گالیک، دارای نسبت دسترسی زیستی بیش از 10 بودند. درصد . این مطالعات نشان داد که اثرات روش هضم ممکن است با توجه به مواد گیاهی متفاوت باشد. برای روشن شدن این تفاوت ها، بررسی مکانیسم اثر سیستم گوارش بر روی مواد فنلی ضروری است. سرا و همکاران [35] پیشنهاد کرد که ترکیبات فنلی عمدتاً در گلیکوزیدها، پلیمرها و اشکال استر در ماتریکس گیاه یافت می‌شوند و قبل از جذب در دستگاه گوارش هیدرولیز می‌شوند. عوامل مختلفی ممکن است بر تغییرات ساختاری ترکیبات فنلی در دستگاه گوارش تأثیر بگذارد. به عنوان مثال، ترکیبات با وزن مولکولی بالاتر، مانند پروآنتوسیانیدین ها یا پروسیانیدین ها، باید قبل از جذب در روده هیدرولیز شوند. ساختار ماتریکس گیاهی نیز یک عامل برجسته در فراهمی زیستی فنولیک ها است. ترکیبات فنلی می توانند به ماکرومولکول های موجود در زمینه گیاهی مانند الیاف، پروتئین ها و مولکول های چربی متصل شوند. بنابراین، تنها اجزای فنلی آزاد شده از ماتریکس ممکن است از دستگاه گوارش قابل جذب شوند. علاوه بر این، مقادیر مختلف pH و اعمال آنزیمی میکروبیوتای روده از دیگر عوامل مهمی هستند که بر تغییر ساختار شیمیایی ترکیبات فنلی تأثیر می‌گذارند [36]. در پرتو این داده‌ها، می‌توانیم فرض کنیم که نتایج متفاوت به‌دست‌آمده از انواع مشابه مطالعات تجربی ممکن است به دلیل پیچیدگی سیستم هضم و ترکیب ماتریکس گیاه باشد. همانطور که در جدول 3 ارائه شده است، نمونه های موجود زیستی عصاره سیستوس فعالیت آنتی اکسیدانی ضعیف تری نسبت به نمونه های هضم نشده و پس از معده به دلیل محتویات فنلی پایین تر از خود نشان دادند.

علاوه بر این، هر دو عصاره C. saluifolius فعالیت آنتی اکسیدانی بهتری را در سنجش‌های DPPH، CUPRAC، FRAP و TOAC در مقایسه با گونه‌های دیگر نشان دادند. علاوه بر این، هر دو عصاره C.paroiflorus فعالیت مهار رادیکال DMPD بالاتری را نسبت به عصاره‌های سایر گونه‌ها نشان دادند. همانطور که در جدول 1 نشان داده شده است، کل فنول ها، فلاونوئیدها و محتویات اسید فنولیک C. salviifolius بیشتر از سایر نمونه ها بود. بنابراین، پتانسیل آنتی اکسیدانی بالاتر عصاره C. saloiifolius ممکن است به محتوای فنلی آن مربوط باشد.

علاوه بر این، کاهش پتانسیل های آنتی اکسیدانی، فعالیت های بازدارنده بر روی آنزیم های مرتبط با کربوهیدرات، و AGE های نمونه های زیستی ممکن است با کاهش گلیکوزیدهای فلاونوئید نشانگر مرتبط باشد. با این حال، عصاره سیستوس حاوی مواد فنولی دیگری نیز بود، همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است. بنابراین، تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی دقیق از عصاره ها برای نظارت بر تاثیر هضم بر فعالیت بیولوژیکی مورد نیاز است.

پتانسیل بازدارندگی عصاره های گیاهی بر روی آنزیم های گوارشی اخیراً به دلیل نگرانی ایمنی مهارکننده های مصنوعی توجه بیشتری را به خود جلب کرده است. بنابراین، اثر بازدارندگی عصاره‌های گیاهی در چندین مطالعه مشخص شد و این اثر عموماً با مواد فنلی مانند فلاونوئیدها، اسیدهای فنولیک، پروآنتوسیانیدین‌ها و غیره مرتبط بود. [37] پیشنهاد کرد که ترکیبات پلی فنلی اثرات بازدارندگی خود را با اتصال به آنزیم های ذکر شده در بالا با کمک نیروهای آبگریز و پیوندهای غیرکووالانسی نشان می دهند. بنابراین، مهار فعالیت آنزیم آمیلاز و گلوکوزیداز توسط پلی فنل ها به ساختار مولکولی آنها مرتبط است. در حالی که این مکانیسم تعامل با استفاده از تکنیک‌های مختلف مانند سینتیک مهار، خاموش کردن فلورسانس اتصال مولکولی و غیره مورد مطالعه قرار گرفته است، هنوز نتیجه‌گیری قطعی به دست نیامده است [38]. با این حال، مطالعات متعدد گزارش کرده اند که مهار آنزیم های گوارشی عصاره های گیاهی به طور مستقیم با محتوای فنلی آنها مرتبط است. مطالعات مشابهی در مورد فعالیت های بازدارنده آنزیم گونه Cistus نیز قبلا گزارش شده است. سیاح و همکاران [39] فعالیت های بازدارنده آمیلاز و a-گلوکوزیداز 8{11}} درصد عصاره متانولی و آبی از C. monspeliensis و C. saluifolius را بررسی کردند. نتایج آنها مطابق با مطالعه حاضر بود، و نشان داد که عصاره آبی C. salvijfolius دارای گلوکوزیداز بالاتر (IC5{13}} ug/mL∶0.95±0.14) و o است. -آمیلاز (IC5{55}} ug/mL∶217.1±0.15) فعالیت بازدارنده نسبت به عصاره آبی C.monspeliensis (IC50 ug/mL∶14.58±1.26) و (به ترتیب (ICsn.81±8.10±8.8) ug/mL:08. نرخ مهاری هر دو عصاره آبی روی این آنزیم‌ها بیشتر از ترکیب مرجع آکاربوز بود (ICso ug/mL: 2±18.01.{33}}) مشابه مطالعه ما، آنها همبستگی را با نرخ مهار آنزیم و کل پیدا کردند. مقدار فنول و فلاونوئید هر دو محتوای فنلی و کل فلاونوئید عصاره آبی C. salvijfolius (1.09±408.43 میلی گرم GAE و 140.{39}}±1.15 RE، به ترتیب) بیشتر از عصاره آبی C.monspeliensis (261.76 میلی گرم GAE و 19±261.76 میلی گرم GAE بود. 78.00±1.15 RE به ترتیب). اورهان و همکاران [40] همچنین پتانسیل بازدارندگی آنزیم گوارشی 80 درصد عصاره های آبی و اتانولی برگ های C.laurifolius را بررسی کردند. با توجه به نتایج آنها، 80 درصد عصاره اتانولی (71.7 ± 0.6 درصد) در مقایسه با عصاره آبی (2.2 ± 39.3 درصد) در غلظت 1 میلی گرم در میلی لیتر فعالیت مهاری آمیلاز قوی نشان داد. آنها پیشنهاد کردند که ترکیبات فنلی، به ویژه فلاونوئیدها، با جلوگیری از آپوپتوز سلول های بتا و حمایت از فعالیت ضد دیابت، مستقیماً بر ترشح انسولین تأثیر می گذارد. این فرضیه، که با نتایج ما همبستگی دارد، نشان می‌دهد که نمونه ND از عصاره‌های آبی C. salviifolius بالاترین محتوای کل فلاونوئید و فنول و بیشترین فعالیت‌های مهاری o-amylase و o-glucosidase را اعمال می‌کند. همانطور که در جدول 4 آورده شده است، عصاره آبی C. salviifolius نسبت به سایر عصاره ها فعالیت های بازدارندگی بهتری بر روی آنزیم های گوارشی نشان داد.

علاوه بر این، نمونه‌های IN از عصاره‌های آبی حاوی مقادیر کمتر فنلی و فلاونوئیدی نسبت به نمونه‌های ND بودند و بنابراین فعالیت‌های بازدارندگی آنزیم کمتری را در کار حاضر نشان دادند. در حالی که محتویات فنلی عصاره ها تحت تأثیر منفی فرآیند هضم قرار گرفت، آنها همچنان فعالیت مهاری قابل توجهی از آنزیم گوارشی را نشان دادند. در چندین مطالعه، گلیکوزیدهای فلاونوئید به عنوان متابولیت های اصلی عصاره های گیاهی با قوی گزارش شده اندa- آمیلازپتانسیل های بازدارندگی گلوکوزیداز و گلوکوزیداز [41-43]در حالی که مکانیسم مهاری ترکیبات فنلی بر روی آنزیم های گوارشی هنوز آشکار نشده است، مطالعات رابطه ساختار-فعالیت بر روی برخی از اجزای فنلی مانند فلاونوئیدها، اسیدهای فنولیک، پروآنتوسیانیدین ها انجام شده است. و تانن ها مطالعات رابطه ساختار-فعالیت در مورد فلاونوئیدها نشان داد که پیوند دوگانه C2=C3 حلقه C پتانسیل مهار آنزیم گوارشی چنین ترکیباتی را افزایش می دهد. از آنجایی که این پیوند چگالی الکترون را افزایش می دهد، قدرت برهمکنش بین فلاونوئید و آنزیم افزایش می یابد [44]. علاوه بر این، گروه های هیدروکسیل در C-5 و C-7 پتانسیل مهاری o-amylase فلاونوئیدها را تسهیل می کنند. همچنین پیشنهاد شد که هیدروکسیلاسیون اسکلت فلاونوئیدها تأثیر مثبتی بر a-آمیلاز و آنها دارد.-آنزیم گلوکوزیدازپتانسیل های بازدارنده [45]. همانطور که قبلاً اشاره شد، تمام فلاونوئیدهای نشانگر در مطالعه حاضر، گلیکوزیدهای فلاونول بودند که این الزامات ساختاری شرح داده شده در بالا را دارند. با این حال، پس از فرآیند هضم آزمایشگاهی، فعالیت‌های مرتبط با آن‌ها به طور قابل‌توجهی در نمونه‌های موجود زیستی عصاره‌های آبی کاهش یافت.

به طور کلی، پتانسیل بازدارندگی عصاره های گیاهی بر روی AGE ها به عوامل متعددی مربوط می شود، به عنوان مثال، محتویات فنلی، پتانسیل آنتی اکسیدانی، قابلیت کیلیت فلزی، برهمکنش های پروتئینی، و فعالیت های مسدود کننده گیرنده AGE [13]. همانطور که در جدول 4 ارائه شده است، نمونه های زیستی در دسترس عصاره های آبی در مقایسه با نمونه های ND فعالیت های بازدارندگی AGE کمتری را نشان می دهند زیرا فرآیند هضم آزمایشگاهی بر محتوای فنلی عصاره ها تأثیر منفی می گذارد. با توجه به نتایج مطالعه حاضر، نمونه ND عصاره آبی C.salvifolius دارای بالاترین فعالیت بازدارندگی AGE و همچنین محتویات کل فنول و فلاونوئید بود. در مقایسه، نمونه IN عصاره آبی C.monspeliensis ضعیف ترین پتانسیل بازدارندگی AGE را نشان داد که ممکن است به کمترین مقدار کل فلاونوئید و فنلی آن نسبت داده شود. از آنجایی که فلاونوئیدها توزیع گسترده ای در عصاره های گیاهی، میوه ها، سبزیجات و نوشیدنی ها دارند، مطالعات متعددی در مورد پتانسیل مهار فلاونوئیدها در سازندهای AGE تشدید شده است. همان فلاونوئیدهای اختصاص داده شده به عنوان فنولیک نشانگر در این مطالعه نیز به عنوان ترکیبات نشانگر در مطالعات دیگر گزارش شده است[46-48].

مشابه مهار آنزیم گوارشی، فعالیت‌های بازدارنده AGE فلاونوئیدها توسط پیوند دوگانه C{0}}C3 و هیدروکسیلاسیون حلقه‌های A و C تحریک می‌شوند. با این حال، اتصال قند به اسکلت فلاونوئید منجر به کاهش فعالیت مهاری می شود [49]. از سوی دیگر، سروانتس لورن و همکاران. [50] پیشنهاد کرد که فلاون-3-گلیکوزیدها دارای پتانسیل بازدارندگی AGE بیشتری نسبت به سایر گلیکوزیدهای فلاونوئیدی هستند. این فرضیه ممکن است توضیحی برای کاهش مهار AGE در نمونه‌های موجود زیستی باشد. به عنوان مثال، کوئرسیترین و هیپروزید در نمونه های موجود زیستی عصاره آبی C.monspeliensis شناسایی نشد که دلیل فعالیت کمتر نمونه های IN C.monspeliensis در مقایسه با عصاره های سایر گونه ها است. حتی اگر کوئرسیترین در عصاره آبی C. saloifolius شناسایی نشد، مقادیر قابل توجهی بالاتر هیپروسید و سالیدروسید ممکن است علت فعالیت بازدارندگی بالای AGE آن باشد. به طور کلی، یک همبستگی مثبت بین محتویات فلاونوئید نشانگر نمونه ها و پتانسیل مهاری آن ها بر روی AGE ها مشاهده شد.

4. مواد و روش ها

4.1.مواد شیمیایی

تمام مراجع، آنزیم ها و مواد شیمیایی به کار رفته در آزمایش ها از شرکت شیمیایی سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. در آزمایش ها از مواد با درجه تحلیلی استفاده شد.

4.2. نمونه های گیاهی

بخش‌های هوایی C.creticus و C.saloifolius از محوطه دانشگاه Yeditepe (Kayisdagi، استانبول) در هفته آخر آوریل 2018 جمع‌آوری شدند. قسمت‌های هوایی C.mon-speliensis و C.paroiflorus از نزدیکی AlacatI Kutlu Aktas جمع‌آوری شدند. Balaji, Cesme, Izmir در هفته دوم می 2018. قسمت های هوایی C. laurifolius از جاده کمر-دوگانحیسار قونیه در هفته اول ژوئن 2018 جمع آوری شد. پروفسور دکتر Erdem Yesilada مواد گیاهی را تأیید کرد. نمونه‌های کوپن برای C.creticus (YEF18013)، C.lauri-folios (YEF18017)، C.monspeliensis (YEF18015)، C.paroifforus (YEF18016) و C.salvifolus (YEF18014) در دپارتمان داروسازی هربارینوسی نگهداری شدند. دانشکده داروسازی، دانشگاه یدیتپه، استانبول، ترکیه.

4.3. روش استخراج

استخراج آب از آنجایی انتخاب شد که معمولاً به عنوان یک تکنیک آماده سازی در طب سنتی استفاده می شود. قسمت های هوایی درشت خشک شده و پودر شده ازسیستانچگونه های (100 گرم) با آب مقطر گرم (80 درجه، 1.5 لیتر) با استفاده از دستگاه تکان دهنده به مدت 15 دقیقه استخراج شدند. سپس عصاره های آبی از طریق کاغذ صافی فیلتر شده و تحت فشار کاهش یافته تا خشک شدن تبخیر شدند. پس از تکمیل فرآیند لیوفیلیزاسیون، عصاره ها برای پردازش بیشتر در آب مقطر حل شدند (نمونه هضم نشده: ND) (بازده عصاره: 13.04 درصد برای C.creticus، 15.7 درصد برای C.laurifolius، 12.8 درصد برای C.monspeliensis. 14.94 درصد برای C.parviflorus، 14.74 درصد برای C.salvifolius).

4.4. روش شبیه سازی هضم انسان در شرایط آزمایشگاهی

مدل شبیه‌سازی هضم انسانی برای نمونه‌های سیستوس در شرایط آزمایشگاهی، به دنبال روشی که قبلاً توسط Celeb و همکاران شرح داده شد، اعمال شد. [34]. ابتدا، 1 گرم نمک طعام و 1.6 گرم پپسین در 500 میلی لیتر آب مقطر حل شد تا یک محلول شبیه‌سازی شده مایع معده به دست آید. (SGF). سپس pH محلول SGF با HCl(5 M) به 2 مرتب شد؛ 17.5 میلی لیتر از این محلول با 2.5 میلی لیتر نمونه گیاهی مخلوط شد و این مخلوط به مدت 2 ساعت در حمام آب تکان دهنده در دمای 37 درجه قرار گرفت. حرکات پریستالتیک سیستم گوارش را تقلید کنید. پس از 2 ساعت، نمونه ها در یک حمام یخ قرار گرفتند تا واکنش های آنزیمی غیرفعال شود؛ 2 میلی لیتر از نمونه ها به عنوان یک نمونه "پس از معده" (P) برای آزمایش های بیشتر کنار گذاشته شد. غشای دیالیز سلولزی با مقدار مناسب NaHCO3 (1 M، pH7) در محلول‌های نمونه سرد قرار داشت. بنابراین، جذب گوارشی تقلید شد. سپس 4.5 میلی لیتر محلول اسیدهای صفراوی/ پانکراتین با محلول ها ترکیب شد و مخلوط به مدت 2 ساعت دیگر در دمای 37 درجه انکوبه شد. در نهایت، مایع داخل غشای دیالیز به عنوان نمونه "بیو در دسترس" (IN) به دست آمد. پس از پایان روش، تمام نمونه‌ها در درجه {23}} برای آزمایش‌های بعدی نگهداری شدند. 4.5. برآورد نمایه فنلی در شرایط آزمایشگاهی

4.5.1. سنجش محتوای فنلی کل

تعیین اسپکتروفتومتری کل محتوای فنلی نمونه‌ها در قالب 96-چاهی طبق روشی که قبلاً توسط Barak و همکاران شرح داده شد انجام شد. 20 میکرولیتر نمونه تازه تهیه شده و محلول مرجع. سپس 100 میکرولیتر از معرف Folin-Ciocalteu با مخلوط ترکیب شد. پس از یک دوره انکوباسیون 30 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی، جذب در 690 نانومتر اندازه گیری شد. اسید گالیک به عنوان محلول مرجع در غلظت‌های مختلف برای ایجاد منحنی کالیبراسیون استفاده شد و محتوای فنلی کل به عنوان معادل‌های اسید گالیک (GAE) بیان شد.

4.5.2. سنجش محتوای فلاونوئید کل

تعیین اسپکتروفتومتری کل محتوای فلاونوئید نمونه‌ها در قالب 96-چاهی مطابق با روشی که قبلاً توسط Bardakci و همکاران توضیح داده شد، مدیریت شد. و 10 میکرولیتر تری هیدرات استات سدیم 1 مولار با 50 میکرولیتر نمونه و محلول مرجع، به طور جداگانه ترکیب شدند. سپس این مخلوط ها به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق تاریک قرار گرفتند. پس از دوره انکوباسیون، جذب در طول موج 405 نانومتر محاسبه شد.کوئرستینبه عنوان یک محلول مرجع در غلظت های مختلف برای ایجاد یک منحنی کالیبراسیون استفاده شد و محتویات فلاونوئید کل به عنوان معادل کوئرستین (QE) نشان داده شد. 4.5.3. سنجش محتوای اسید فنولیک کل

محتوای فنولیک اسید کل نمونه ها به روش اسپکتروفتومتری طبق روشی که قبلا توسط باراک و همکاران گزارش شده بود اندازه گیری شد. [52]. ابتدا مقادیر مناسب نیتریت سدیم و مولیبدات سدیم در آب مقطر حل شد تا معرف آرنو به دست آید. سپس 1 میلی‌لیتر از نمونه‌ها به‌طور جداگانه با 1 میلی‌لیتر معرف آرنو، 1 میلی‌لیتر 0.1 مولار هیدروکلراید و 1 میلی‌لیتر NaOH 1 مولار ترکیب شد. پس از آن، حجم مخلوط با آب مقطر به 10 میلی لیتر تنظیم شد و جذب بلافاصله در 490 نانومتر قرائت شد. اسید کافئیک به عنوان یک محلول مرجع در غلظت های مختلف برای به دست آوردن یک منحنی کالیبراسیون استفاده شد و محتویات کل اسید فنولیک به عنوان معادل اسید کافئیک (CAE) داده شد.

4.5.4. سنجش محتوای کل پروآنتوسیانیدین

تعیین اسپکتروفتومتری کل محتوای پروآنتوسیانیدین نمونه ها در قالب 96-چاهی با پیروی از روش باراک و همکاران انجام شد. [1] به طور خلاصه، 25 uL از محلول های نمونه به ترتیب با 150 میکرولیتر وانیلین 4 درصد و 75 میکرولیتر محلول هیدروکلراید (32 درصد) مخلوط شد. پس از 15 دقیقه زمان انکوباسیون در دمای اتاق تاریک، جذب به 492 نانومتر تنظیم شد. هیدرات کاتچین به عنوان یک محلول مرجع در غلظت های مختلف برای به دست آوردن منحنی کالیبراسیون استفاده شد. از متانول به عنوان محلول شاهد استفاده شد. محتوای کل پروآنتوسیانیدین نمونه ها به عنوان معادل کاتچین (CE) بیان شد.

4.6. سنجش فعالیت پاکسازی رادیکال آزاد 4.6.1. سنجش فعالیت پاکسازی رادیکال DPPH

فعالیت مهار رادیکال DPPH نمونه‌ها در 96-الگوی صفحه چاهی به دنبال روش اصلاح‌شده توسط Celeb و همکاران تعیین شد.[53]. ابتدا 150 میکرومولار محلول DPPH تازه تهیه شد. سپس 200 میکرولیتر محلول DPPH با 25 میکرولیتر محلول نمونه مخلوط شد. سپس این مخلوط به مدت 50 دقیقه در دمای اتاق تاریک قرار داده شد. جذب در طول موج 540 نانومتر محاسبه شد. هیدروکسی تولوئن بوتیله (BHT) به عنوان محلول مرجع در غلظت های مختلف استفاده شد. از متانول به عنوان محلول شاهد استفاده شد. فعالیت نمونه ها به صورت EC50 نشان داده شد که مربوط به غلظتی است که 50 درصد فعالیت را نشان می دهد.

4.6.2. DMPD سنجش فعالیت پاکسازی رادیکال

فعالیت مهار رادیکال DMPD plus (N, N-dimethyl-p-phenylenediamine) نمونه ها در قالب صفحه چاهی مطابق روشی که قبلا توسط Inan و همکارانش توضیح داده شد انجام شد. [13]. در مرحله اول، 10{{10}} mM DMPD plus محلول، 0.05 M FeCl. محلول 6H2O و بافر 0.01 مولار استات تازه تهیه شد. سپس، 1 میلی لیتر محلول DMPD، 100 میلی لیتر بافر استات، و 0.2 میلی لیتر FeCl. محلول 6H2O مخلوط شد و بعداً 15 میکرولیتر محلول نمونه با 210 میکرولیتر از این مخلوط ترکیب شد. پس از دوره انکوباسیون در دمای اتاق تاریک به مدت 50 دقیقه، جذب در 492 نانومتر اندازه‌گیری شد. Trolox به عنوان یک محلول مرجع در غلظت های مختلف برای به دست آوردن منحنی کالیبراسیون استفاده شد. غلظت محلول های نمونه 1 میلی گرم بر میلی لیتر بود. فعالیت های مهار رادیکال DMPD نمونه ها به عنوان معادل ترلوکس (TE) بیان شد. 4.7. سنجش فعالیت کاهش دهنده فلز

4.7.1. سنجش قدرت آنتی اکسیدانی کاهش دهنده آهن (FRAP)

تعیین فعالیت FRAP نمونه ها در قالب 96 صفحه چاهی به دنبال روشی که قبلاً توسط Bardakci و همکاران گزارش شده بود، انجام شد.[54]. در ابتدای آزمایش، معرف FRAP با مخلوط کردن بافر استات، فریک-تری پیریدیل تریازین و FeCl تشکیل شد. محلول های 6H2O. پس از آن، معرف FRAP به مدت 3{14}دقیقه در فر 37 درجه قرار داده شد. سپس 10 میکرولیتر از محلول های نمونه به ترتیب با 30 میکرولیتر آب مقطر و 260 میکرولیتر معرف FRAP ترکیب شدند. پس از زمان انکوباسیون در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه، جذب به 593 نانومتر تنظیم شد. یک منحنی استاندارد با استفاده از مولاریت های مختلف محلول سولفات آهن (0.{15}} میلی مولار) برای ارزیابی نتایج ساخته شد. BHT به عنوان محلول مرجع در غلظت های مختلف استفاده شد. فعالیت FRAP نمونه ها به صورت mM FeSO4 در 1 گرم عصاره خشک ارائه شد.

4.7.2. سنجش ظرفیت آنتی اکسیدانی کاهنده جام (CUPRAC)

فعالیت CUPRAC نمونه‌ها در قالب 96-چاهی به دنبال روش اصلاح‌شده توسط Celeb و همکاران تعیین شد. 【31】; 85 میکرولیتر CuSO4 (10 میلی‌مولار)، محلول‌های نئوکوپراین و استات آمونیوم و 51 میکرولیتر آب مقطر به طور جداگانه به 43 میکرولیتر محلول نمونه اضافه شد. پس از یک دوره انکوباسیون (20 دقیقه) در 50 درجه در حمام آب، جذب در 450 نانومتر اندازه‌گیری شد. اسید اسکوربیک به عنوان محلول مرجع در غلظت های مختلف برای به دست آوردن منحنی کالیبراسیون استفاده شد. فعالیت CUPRAC نمونه ها به عنوان معادل اسید اسکوربیک (AAE) ارائه شد. 4.8. سنجش فعالیت آنتی‌اکسیدانی کل (TOAC) تعیین فعالیت آنتی‌اکسیدانی کل نمونه‌ها در قالب 96-چاهی به دنبال روش Celeb و همکاران انجام شد. [55]. در ابتدا مقدار معینی از سدیم فسفات مونوبازیک، آمونیوم مولیبدات تتراهیدرات و اسید سولفوریک برای به دست آوردن محلول TOAC مخلوط شد. سپس 300 میکرولیتر محلول TOAC به 30 میکرولیتر محلول نمونه اضافه شد. پس از دوره انکوباسیون در دمای 95 درجه در حمام آب به مدت 90 دقیقه، جذب در طول موج 690 نانومتر تعیین شد. اسید اسکوربیک به عنوان محلول مرجع در غلظت های مختلف برای به دست آوردن منحنی کالیبراسیون استفاده شد. فعالیت های TOAC نمونه ها به عنوان معادل اسید اسکوربیک (AAE) نشان داده شد. 4.9. برآورد شاخص فراهمی زیستی

شاخص فراهمی زیستی (BAvI) با توجه به معادله نظری توصیف شده توسط اینان و همکاران محاسبه شد. در نمونه موجود زیستی (IN) به نمونه غیرهضم نشده (ND). 4.10. تعیین کمیت فلاونوئیدهای نشانگر توسط HPTLC

تعیین کمی غلظت سالیدروسید، هیپروسید و کوئرسیترین در تمام نمونه‌های شبیه‌سازی (ND، PG، IN) عصاره‌های آبی گونه‌های سیستوس توسط کروماتوگرافی لایه نازک با کارایی بالا (HPTLC) (CAMAG، Muttenz، سوئیس) انجام شد. به دنبال روش تایید شده توسط Guzelmeric و همکاران.[16]. Hyperoside، Salidroside و Quercitrin در غلظت‌های 25،50 و 100 ug/mL تهیه شدند و غلظت محلول‌های نمونه تازه تهیه‌شده روی 10mg/mL تنظیم شد. این محلول‌ها با استفاده از سرنگ‌های 100 میکرولیتری (20 سانتی‌متر × 10 سانتی‌متر، مرک، دارمشتات، آلمان) با حجم‌های معین ({10}} محلول استاندارد میکرولیتر و محلول‌های نمونه 5 میکرولیتری) روی صفحه‌های سیلیکاژل پشت شیشه‌ای فاز معمولی استفاده شد. همیلتون، بونادوز، سوئیس. روش کاربرد با اپلیکاتور نمونه Linomat 5 انجام شد. فرآیند توسعه در اتاقک توسعه خودکار (ADC 2) و اتیل استات: دی کلرومتان، اسید استیک، اسید فرمیک: آب (10:25:10) انجام شد. :10:10:10me) به عنوان فاز متحرک انتخاب شد.سپس، صفحات با معرف محصول طبیعی (NPR) (1 گرم دی فنیل بوریکاسید 2-آمینواتیل استرین 200 میلی لیتر اتیل استات) در دستگاه غوطه وری (CAMAG) مشتق شدند.هیپروزیدو کوئرسیترین به روش اسپکتروفتومتری در 260 نانومتر، مقدار سالیدروسید در طول موج ۳۳0 نانومتر توسط اسکنر UV اندازه‌گیری شد. مقادیر Rf استانداردها به‌عنوان هیپروزید (35/0.{{6})، کوئرسیترین (45/0.{9}})، تیلیروزید (65/0) تعیین شد. ضرایب همبستگی (r2.9) 0 × 8 یافت شد. برای تعیین کمیت فلاونوئیدهای نشانگر

4.11. فعالیت مهاری بر روی آنزیم های مرتبط با دیابت

4.11.1. -فعالیت مهاری گلوکوزیداز

فعالیت های مهاری گلوکوزیداز نمونه های غیر هضم شده و در دسترس زیستی به دست آمده از عصاره های آبی گونه های سیستوس به دنبال روشی که قبلا توسط بالان و همکاران توضیح داده شد مورد بررسی قرار گرفت. [56]. ابتدا مقادیر مناسبی از مونوسدیم فسفات و دی سدیم فسفات با تهیه 1{7}}{23}} میلی مولار بافر فسفات (pH7) مخلوط شد. o--آنزیم گلوکوزیداز در بافر فسفات حل شد تا محلول a-glucosidase (0.2U/mL) بدست آید. سپس 170 uL بافر فسفات، 2{0 میکرولیتر از محلول گلوکوزیداز و 20 uL از محلول‌های نمونه با هم ترکیب شده و در آون 37 درجه به مدت 15 دقیقه انکوبه شدند. پس از آن، 2{83}} میکرولیتر محلول 2.5 میلی مولار p-نیتروفنیل{19}}D-گلوکوپیرانوزید در بافر 100 میلی مولار فسفات پتاسیم (pH7.0) به مخلوط اضافه شد و دوره انکوباسیون دیگری در 37 انجام شد. درجه به مدت 15 دقیقه سپس 80 میکرولیتر از محلول کربنات سدیم 0.2 مولار به مخلوط اضافه شد تا واکنش خاتمه یابد. میزان جذب در طول موج 405 نانومتر اندازه گیری شد. محلول کوئرستین در غلظت های مختلف به عنوان مرجع استفاده شد. نتایج به‌عنوان درصد فعالیت بازدارندگی در غلظت‌های 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و 5/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر نمونه‌های ND و IN عصاره‌های آبی گونه سیستوس برآورد شد. 4.11.2. فعالیت مهاری آمیلاز فعالیت مهاری o-آمیلاز نمونه‌های غیرهضم‌نشده و در دسترس زیستی به‌دست‌آمده از عصاره‌های آبی گونه‌های سیستوس با پیروی از روشی که قبلاً توسط Balan و همکارانش شرح داده شد، تعیین شد.[56] تعیین اسپکتروفتومتری فعالیت های مهاری a-amylase نمونه ها با استفاده از معرف DNS (3,{42}}دی نیتروسالیسیلیک اسید) انجام شد. همانطور که در روش بیان شد، مالتوز از تبدیل نشاسته تشکیل می شود و رنگ زرد DNS قلیایی به دلیل مالتوز تولید شده از نشاسته به رنگ نارنجی مایل به قرمز تبدیل می شود. بنابراین، محلول 96 میلی مولار DNS از مخلوط محلول تارتارات سدیم پتاسیم (محلول در 2 مولار NaOH) و مقدار معینی از DNS (محلول در آب مقطر) تهیه شد. سپس بافر 20 میلی‌مولار سدیم فسفات با 7/6 میلی‌مولار کلرید سدیم (هم‌فاکتور آنزیم u-آمیلاز) در دمای 20 درجه (9/6 pH) تهیه شد. آنزیم a-Amylase (1U/mL) و نشاسته (mg/ml 10) در این بافر حل شدند. پس از آن، 50 میکرولیتر بافر فسفات سدیم و 10 میکرولیتر محلول آنزیم a-amylase با 20 میکرولیتر از محلول‌های نمونه مخلوط شدند. این مخلوط در دمای 37 درجه به مدت 45 دقیقه انکوبه شد. پس از دوره انکوباسیون، 20 میکرولیتر از محلول نشاسته به مخلوط اضافه شد. دوره جوجه کشی دیگر در دمای 37 درجه به مدت 45 دقیقه آغاز شد. همین روش بدون افزودن محلول آنزیم w-amylase به نام «زمینه نمونه» روی نمونه‌ها اعمال شد. میزان جذب در طول موج 540 نانومتر اندازه گیری شد. آکاربوز به عنوان محلول مرجع در غلظت های مختلف استفاده شد. نتایج به‌عنوان درصدی از فعالیت بازدارندگی در غلظت‌های 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و 5/0 میلی‌گرم در میلی‌لیتر نمونه‌های ND و IN از عصاره‌های آبی گونه‌های سیستوس ارائه شد. 4.11.3. فعالیت بازدارنده AGE فعالیت بازدارندگی AGE نمونه های غیرهضم نشده و زیست در دسترس از عصاره های آبی گونه Cistus به دنبال روش توصیف شده توسط Starow-icz و همکاران تعیین شد. [57]. قبل از هر فرآیند، غلظت 1 میلی گرم در میلی لیتر و 0.5 میلی گرم در میلی لیتر از نمونه های ND و IN به تازگی تهیه شد. سپس 1 میلی لیتر از محلول آلبومین سرم گاوی (BSA) با غلظت 10 میلی گرم بر میلی لیتر به 1 میلی لیتر محلول نمونه ND و IN اضافه شد. نمونه های شاهد بدون افزودن محلول های نمونه ND و IN و نمونه های خالی بدون افزودن 0.5 مولار گلوکز تهیه شدند. سپس تمامی نمونه های آماده شده به مدت 40 ساعت در حمام آب لرزان در دمای 55 درجه انکوبه شدند. پس از پایان دوره جوجه کشی، ریزپلیت خوان چند حالته Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX در محدوده تحریک 370 نانومتر/ انتشار 440 نانومتر برای محاسبه شدت فلورسانس استفاده شد. کوئرستین به عنوان محلول مرجع در غلظت های مختلف استفاده شد.

4.12.تحلیل آماری

تمام آزمایش ها به طور مستقل در سه زمان مختلف انجام شد. برنامه نرم افزار GraphPad Prism (نسخه 6.1) برای تعیین توزیع پارامتری یا ناپارامتریک داده ها استفاده شد. بخش تجزیه و تحلیل مقایسه‌های چندگانه یک‌طرفه ANOVA Tukey برای ارزیابی سنجش‌های TPC، TFC، TPAC، TSC، TPACC، FRAP، CUPRAC، TOAC، DPPH و DMPD استفاده شد. از سوی دیگر، نتایج آزمایش‌های o-amylase، -glucosidase و AGE با استفاده از آنالیز مقایسه‌های چندگانه دو طرفه ANOVA Sidak مورد بررسی قرار گرفت. نتایج قابل توجهی با p نشان داده شد<0.05. 5.="">

در مطالعه حاضر، عصاره آبی تمامی گونه‌های سیستوس ثبت‌شده در فلور ترکیه از نظر مشخصات فنلی و پتانسیل آنتی‌اکسیدانی و ضد دیابتی در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار گرفت. از آنجایی که جوشانده یا دم کرده شکل رایج در طب سنتی است، استفاده از عصاره های آبی برای ارزیابی فعالیت در مطالعات تجربی اهمیت ویژه ای دارد. از سوی دیگر، ترکیبات آبدوست در عصاره آبی پس از مصرف در معرض یک سری تغییرات متابولیکی در سیستم گوارشی قرار می گیرند. بنابراین برای ارزیابی صحیح فعالیت فرمولاسیون های سنتی، فعالیت متابولیت های زیست در دسترس نیز باید بررسی شود.

این اولین مطالعه ای است که پیامدهای روش شبیه سازی هضم انسان در شرایط آزمایشگاهی را بر روی گونه های سیستوس ترکیه بررسی می کند. علاوه بر این، پتانسیل بازدارندگی گونه سیستوس ترکیه در AGEs در این مطالعه برای اولین بار مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، نشانگر سالیدروسید، هیپروسید و کوئرسیترین اختصاص داده شدفلاونوئیدهاو تغییرات در غلظت آنها در روش هضم آزمایشگاهی بررسی شد. در حالی که محتویات فنلی و فعالیت های ضد دیابتی و آنتی اکسیدانی عصاره ها به طور منفی تحت تاثیر روش های هضم گوارشی قرار گرفتند، آنها همچنان زیست فعالی قابل توجهی از خود نشان دادند. با توجه به نتایج، عصاره C.saloifolius به عنوان قوی ترین گیاه از نظر محتوای فنلی و فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد دیابتی تشخیص داده شد. در نتیجه، قسمت‌های هوایی گونه‌های سیستوس ترکیه دارای محتوای فنلی غنی و فعالیت‌های آنتی اکسیدانی و ضد دیابتی بالقوه است. در حالی که روش شبیه‌سازی هضم آزمایشگاهی برای ارزیابی فراهمی زیستی به کار گرفته شد، ممکن است به طور کامل مسیرهای متابولیک موجود در ارگانیسم را تقلید نکند. بنابراین، مطالعات بیشتری در داخل بدن و بالینی برای ارزیابی فراهمی زیستی ترکیبات فنلی و سهم آنها در اثرات فارماکولوژیک گزارش شده با جزئیات مورد نیاز است.

این مقاله از Molecules 2021, 26, 5322 استخراج شده است