معماری سه بعدی نفرون ها در کلیه طبیعی و کیستیک

تماس: emily.li@wecistanche.com

توماس بلان1،2،7، نیکلاس گودین3،7، محمد زیدان1،4،7، مریم گارفا ترائوره3، فرانک بینیم1،5، لیزا تورینسکی1، سرژ گاربای1، کلمنت نگوین1، مارتین برتین1، جرارد فریدلندربیولا، ژرارد فریدلندربیولا1،6، Terzi1,8 و Marco Pontoglio1,8

سیستانچ برای کلیه مفید است

کلمات کلیدی: بیماری کلیه کیستیک. کلیه; نفرون; نفرونوفتیز؛پاکسازی بافت

عملکرد کلیه به طور اساسی به ساختار سه بعدی پیچیده نفرون ها بستگی دارد. هر گونه تغییر شکل آنها ممکن است منجر بهاختلال عملکرد کلیه. روش های بافت شناسی سنتی محدودیت های عمده ای را برای بازسازی بافت سه بعدی ایجاد می کنند. در اینجا، ما پاکسازی بافت، میکروسکوپ چند فوتونی و ردیابی دیجیتال را برای بازسازی تک نفرون ها تحت شرایط فیزیولوژیکی و پاتولوژیک ترکیب کردیم. مجموعه ای ازنفرون هامتفاوت در محل، شکل و اندازه با توجه به عملکرد آنها شناسایی شد. نکته جالب این است که نفرون ها تمایل دارند در هواپیما قرار بگیرند. زمانی که این تکنیک برای مدلی ازبیماری کلیه کیستیککیست‌ها فقط در بخش‌های نفرون خاصی ایجاد می‌شوند. در امتداد همان بخش، کیست ها در داخل لوله های عادی غیر متسع به هم پیوسته هستند. علاوه بر این، شکل کیست ها با توجه به بخش نفرون متفاوت بود. بنابراین، یافته های ما یک استراتژی ارزشمند برای تجسم ساختار پیچیده کلیه ها در سطح نفرون منفرد و مهمتر از آن، پایه ای برای درک فرآیندهای پاتولوژیک مانند سیستوژنز ارائه می دهد.

بیانیه ترجمه

روش های پاکسازی ابزار منحصر به فردی برای درک اینکه چگونه تغییرات مورفولوژیکی منجر به پیامدهای پاتولوژیک می شود فراهم می کند. کلیه ها اندام های حیاتی هستند که هموستاز بدن را از طریق آب، متابولیت ها و الکترولیت ها حفظ می کنند، که به طور اساسی به ساختار بعدی 3-نفرون ها وابسته هستند. هنگامی که این سازمان ساختاری تغییر می کند، پاتوفیزیولوژی کلیه ایجاد می شود. در مطالعه حاضر، ما یک روش قدرتمند مبتنی بر پاکسازی نوری را توسعه داده ایم،

میکروسکوپ چند فوتونی و ردیابی دیجیتال برای مطالعه کلیه در سطح تک نفرون تحت شرایط فیزیولوژیکی و پاتولوژیک. به طور خاص، ما اولین 3-بازسازی بعدی کلیه پلی کیستیک در مقیاس نفرون های منفرد را ارائه می کنیم. این روش را می توان در چندین زمینه پاتولوژیک به کار برد و به ما امکان می دهد تا روند پیچیده زوال کلیه را بهتر درک کنیم و در نتیجه، استراتژی های درمانی هدفمندتری را توسعه دهیم.

کلیه از طریق ساختار نفرون پیچیده 3-بعدی (3D) خود، هموستاز بدن را حفظ می کند. هنگامی که این سازمان ساختاری تغییر می کند، پاتوفیزیولوژی کلیه ایجاد می شود.بیماری های مزمن کلیهبا ایجاد ضایعات کلیوی مشخص می شوند. به طور جالبی، آسیب شناسان ناهمگونی گسترده ای را در توزیع ضایعات در طول بیماری های مزمن کلیوی گزارش کرده اند. 1،2 آیا این منعکس کننده این واقعیت است که بخش های خاص نفرون می توانند به طور متفاوتی آسیب ببینند، یا به طور متناوب، برخی نفرون ها استعداد متفاوتی برای آسیب دیدگی دارند. ، ناشناخته است. برای پرداختن به این موضوع، بازسازی شکل سه بعدی نفرون ها در زمینه های پاتولوژیک الزامی است.

تا آن جایی که می دانیم،نفرون هاتنها با استفاده از مقاطع 2 بعدی سریال به طور کامل بازسازی شده است. این در درجه اول به دلیل اعوجاج های مکانیکی است، که یک اثر اجتناب ناپذیر از روش برش است. علاوه بر این، بازسازی سه بعدی از تصاویر دوبعدی اجازه تصویربرداری مستقیم از ساختارهای سه بعدی در بافت های نصب شده را نمی دهد.

میکروسکوپ چند فوتونی توانایی ما را برای تشخیص تغییرات مورفولوژیکی در مقاطع ضخیم بهبود بخشیده است. با این حال، یک محدودیت قابل توجه، عمق کم در دسترس به دلیل پراکندگی نور است. با به حداقل رساندن تفاوت های ضریب شکست، عوامل پاک کننده به طور چشمگیری توانایی تصویربرداری از عمق را بهبود بخشیده اند. .9-17 مطالعات اخیر پتانسیل آنها را برای تصویربرداری از سایر اندام های جامد مانند کبد، لوزالمعده یا کلیه نشان داده اند. 18-26

سیستانچ برای بیماری کلیوی

بیماری کلیه پلی‌کیستیکیک اختلال ژنتیکی ناهمگن که شامل جهش در چندین ژن مژگانی است، شایع ترین بیماری کلیوی ارثی است. بیماری کلیه پلی کیستیک با ایجاد کیست هایی مشخص می شود که منجر به تخریب کامل کلیه می شود. ایجاد می شود یا به عنوان "هل به بیرون" بخش نفرون، مانند پلی کیستیک اتوزومال غالببیماری کلیوی; به عنوان انبساط اکتاتیک مجاری جمع کننده (CD)، مانند پلی کیستیک اتوزومال مغلوببیماری کلیوی; یا به طور انحصاری در لوله های مدولاری، مانند نفرونوفتیزیس (NPHP). 27،29، با این حال، چگونگی ایجاد کیست ها به صورت سه بعدی و سازماندهی با یکدیگر و توبول های همسایه طبیعی هنوز ناشناخته است.

در اینجا، ما پاکسازی نوری را با میکروسکوپ چند فوتونی ترکیب کردیم تا بینش جدیدی در مورد چگونگی ارائه کنیمنفرون هادر شرایط فیزیولوژیکی و نحوه اصلاح آنها در طول بیماری، مانند سیستوژنز، شکل می گیرند و سازماندهی می شوند. نتایج ما نشان می‌دهد که 3 نوع نفرون وجود دارد و رگ‌ها ممکن است بر سازمان فضایی نفرون تأثیر بگذارند. جالب توجه است، ما مشاهده کردیم که نفرون ها تمایل دارند در صفحات خاصی قرار بگیرند. به طور غیرمنتظره ای، هنگامی که ما این تکنیک را روی موش های jck به کار بردیم، مشاهده کردیم که کیست ها تنها در بخش های نفرون خاص با کیست های دوکی شکل در هم آمیخته با لوله های طبیعی ایجاد می شوند.

نتایج

راه اندازی آزمایشی

برای مطالعه شکل کلنفرون هادر رابطه با محیط آنها، ما یک تکنیک مبتنی بر پاکسازی نوری و میکروسکوپ چند فوتونی را اتخاذ کردیم (شکل تکمیلی S1A). با مقایسه پروتکل‌های پاکسازی نوری مختلف، تعیین کردیم که برای کلیه، بنزیل الکل/ بنزیل بنزوات (BABB) از نظر کارایی مناسب‌ترین است (شکل تکمیلی S1B و C و جدول تکمیلی S1).

بازسازی سه بعدی و ردیابی دیجیتال به تصاویر با کیفیت بالا با وضوح بالا و نسبت سیگنال به پس زمینه بالا نیاز دارد. ما مشاهده کردیم که سیگنال نوری ارائه شده توسط فلورسانس بومی در بخش کلیه یکنواخت نیست. به طور خاص، تصاویر از بصل النخاع با نسبت سیگنال به پس زمینه کم تضاد ضعیفی داشتند (شکل S2 تکمیلی). برای بهبود نسبت سیگنال به پس‌زمینه، بخش‌ها را با اسید پریودیک شیف (شکل تکمیلی S1D) رنگ‌آمیزی کردیم، زیرا به‌طور تجربی متوجه شدیم که این رنگ‌آمیزی کنتراست بالایی را در بخش‌های نازک در طول 2-فلورسانس فوتون ایجاد می‌کند. با این حال، سیگنال در سراسر مقاطع کلیه رنگ آمیزی شده با اسید پریودیک پریودیک یکنواخت نبود (شکل تکمیلی S1E). بنابراین، ما بخش‌های کلیه را با لکتین‌های همراه با فلوروکروم رنگ‌آمیزی کردیم: آگلوتینین بادام زمینی و آگلوتینین جوانه گندم، که گلومرول‌ها و لوله‌ها را رنگ‌آمیزی می‌کند، و Griffonia simplicifolia آگلوتینین، که رگ‌های خونی را مشخص می‌کند. نسبت پس زمینه به طور چشمگیری در کل افزایش یافتبخش های کلیه، با بهبود قابل توجهی هم در صفحه xy و هم در محور z (شکل تکمیلی S1E و فیلم تکمیلی S1).

تجسم بخش نفرون سه بعدی

برای تجسم شکل نفرون های کامل، مسیرهای آنها را که از قطب ادراری گلومرول شروع می شود و به محل اتصال سی دی ختم می شود، ردیابی کردیم (فیلم تکمیلی S2). علی‌رغم این واقعیت که لکتین‌های مورد استفاده در سطح جهانی همه بخش‌های نفرون را به هم متصل می‌کنند، ما متوجه شدیم که هنگام بازرسی دقیق، این لکتین‌ها با یک الگوی خاص در نحوه رنگ‌آمیزی غشاهای پایه یا مجرا در بخش‌های مختلف نفرون مشخص می‌شوند. به عبارت دیگر، ما از الگوی کلیشه‌ای رنگ‌آمیزی لکتین برای شناسایی بخش‌های مختلف نفرون استفاده کردیم. به این ترتیب، ما به راحتی می‌توانیم 6 موجودیت را شناسایی کنیم: لوله پروگزیمال (PT)، اندام نازک (TL) حلقه هنل (HL)، اندام صعودی ضخیم (TAL) HL، لوله پیچیده دیستال (DCT)، لوله اتصال (CNT) ) و سی دی. انتقال بین PT و TL با از دست دادن ناگهانی سیگنال مرزی برس معمولی PT و با کاهش عرض لومن مشخص شد که تقریباً در TL وجود نداشت (شکل 1a). برعکس، انتقال بین TL و TAL با افزایش قابل توجهی در قطر لوله خارجی و عرض لومن نسبتاً ثابت مشخص شد (شکل 1b). در همهنفرون هاانتقال TAL به DCT به طور سیستماتیک در قطب عروقی گلومرول مشاهده شد. این انتقال با بزرگ شدن ناگهانی قطر لوله خارجی مشخص شد که عمدتاً به دلیل افزایش قابل توجه قطر لومن بود (شکل 1c). انتقال بین DCT و CNT با کاهش قطر لوله و لومن مشخص شد (شکل 1d). در نهایت، ارتباط بین CNT و CD قشر مغز با افزایش ناگهانی قطر لوله و لومن مشخص شد (شکل 1e). کمی سازی این انتقالات مورفولوژیکی از نظر آماری معنی دار بود (شکل 1f)، و مناسب بودن آن با رنگ آمیزی با نشانگرهای لوله ای خاص (شکل های تکمیلی S3-S5 و فیلم تکمیلی S3-S5) تأیید شد.

شکل و اندازه PT با توجه به عمق آنها متفاوت است

رنگ آمیزی ضخیمبخش های کلیهبه ما اجازه داد مختصات تکامل فضایی کل بخش‌های PT را ردیابی کنیم. جالب توجه است، ما کشف کردیم که شکل آنها بسیار متغیر بود و با موقعیت گلومرول آنها در قشر مغز تعیین می شد. در سطح جهانی، ما 3 الگو را شناسایی کردیم. کور اول به سطحی ترین نفرون ها (SNs) پاسخ داد (شکل 2a؛ فیلم تکمیلی S6)، که بیشترین قسمت خارجی قشر (30 درصد خارجی ترین قسمت نزدیک به کپسول کلیه) را اشغال می کرد. بخش‌های پیچیده آن‌ها ساختارهای فشرده‌ای را با تنها 6 تا 7 پیچش در اطراف گلومرول خودشان تشکیل می‌داد که فضاهای بسیار کوچک و فشرده را اشغال می‌کرد. پیچیدگی این SN ها به پارس رکتای بلند و مستقیم ختم می شد که به داخل بصل النخاع نزول می کرد. در طرف مقابل این طیف، الگوی دومی را مشاهده کردیمنفرون هاواقع در عمیق ترین قسمت قشر (40 درصد عمق داخلی بیشتر)، در کنار بصل النخاع (نفرون های جانبی مدولاری [JNs]) (شکل 2a؛ شکل تکمیلی S6 و فیلم تکمیلی S6). PTهای آنها با یک حلقه کوتاه اولیه مشخص می شد که به طور سیستماتیک به سمت پاپیلا پایین می آمد و سپس U تبدیل می شد تا به سمت کپسول کلیوی صعود کند. برخلاف SNs، لوله‌های پیچ‌خورده پروگزیمال JN با سیم‌پیچ‌های بزرگی مشخص می‌شوند که در اطراف گلومرول خود تکامل یافته و دامنه‌های بزرگ و شل را در قشر کنار هم اشغال کرده‌اند. بخش پیچیده PT از JN ها دارای 10 تا 15 پیچیدگی بود که دامنه های بزرگی را تشکیل می داد. در نهایت، الگوی سوم شامل نفرون‌های واقع در بخش میانی قشر (نفرون‌های میانی [MNs]) بود (شکل 2a؛ فیلم تکمیلی S6). جالب اینجاست که این لوله‌ها دارای یک شکل و جهت فضایی بودند که انتقال بین SNs و JNs را نشان می‌داد. در واقع، آنها حاوی 8 تا 9 کولون با سیم پیچ هایی بودند که بزرگتر از SN ها، اما کوچکتر از JN ها بودند. علاوه بر این، MN ها پارس راست بلندتری نسبت به JN داشتند. جالب توجه است، یک مقایسه جهانی از اشکال PT ها نشان داد که SNs و MNs یک الگوی همگن داشتند در حالی که JNs بسیار ناهمگن بودند (شکل تکمیلی S6). علاوه بر این، بازسازی فضایی چندین نفرون نشان داد که PT ها هرگز با هم مخلوط نمی شوند (فیلم تکمیلی S6)، که نشان می دهد هر نفرون فضای جداگانه خود را در قشر مغز اشغال می کند.

تجزیه و تحلیل‌های مورفومتریک تفاوت‌های بزرگ در اندازه و شکل SNs و JNs را با یک جنبه متوسط ​​برای MNs تأیید کرد. PT از JN ها بیش از 2- برابر بیشتر از PT SN ها بود (شکل 2b). با این حال، صافی در SN ها بیشتر از JN ها بود (شکل 2c)، مطابق با مشاهداتی که لوله های JN بسیار پرپیچ و خم تر بودند (شکل 2a؛ شکل تکمیلی S6).

شکل 1|معیارهای مورفولوژیکی مورد استفاده برای شناسایی بخش های نفرون. (a-e) مورفولوژی بخش‌های مختلف نفرون در موش‌های کنترل. نفرون ها از قطب ادرار گلومرول تا مجرای جمع کننده ردیابی شدند (توبول پروگزیمال [PT]: فیروزه ای؛ اندام نازک [TL] حلقه هنله: خاکستری روشن؛ اندام صعودی ضخیم [TAL] حلقه هنله: خاکستری تیره؛ لوله پیچیده دیستال [DCT]: صورتی؛ لوله اتصال [CNT]: زرد؛ مجرای جمع کننده قشر [CCD]: نارنجی). فلش ها قطر بخش های مختلف نفرون را نشان می دهد. (ادامه دارد)

شکل 1|(ادامه) (f) تعیین کمیت قطر لوله بیرونی بخشهای مختلف نفرون. داده ها به صورت میانگین SEM بیان می شوند. تجزیه و تحلیل واریانس و به دنبال آن آزمون توکی کرامر: **P < 0.01،="" ***p=""><>

شکل 3|بازسازی نفرون سه بعدی (سه بعدی) 3 نوع مختلف نفرون را نشان می دهد. (الف) تصاویر سه‌بعدی نماینده یک نفرون کامل (پانل‌های سمت چپ) از گلومرول‌ها تا مجرای جمع‌آوری در قشر سطحی (آبی)، قشر میانی (سبز) و ناحیه کناری مدولاری (قرمز) در موش‌های کنترل. تقسیم بندی نفرون (پانل های سمت راست) برای 3 نوع مختلف نفرون. میله ¼ 150 میلی متر. (ب) کمی کردن فاصله بین 2 اندام حلقه هنل برای 3 نوع نفرون. (ج) کمی سازی طول نفرون برای (ادامه)

شکل 3|(ادامه) 3 نوع نفرون. (د) تعیین کمی طول بخش های مختلف نفرون با توجه به نوع نفرون. داده ها به صورت میانگین -SEM بیان می شوند. تجزیه و تحلیل واریانس و به دنبال آن آزمون توکی کرامر: نفرون جانبی (JN) در مقابل نفرون سطحی (SN): ###P < 0.001;="" jn="" در="" مقابل="" نفرون="" میانی="" (mn):="" *="" p="">< 0.05،="" **p=""><0.01، ***p=""><0.001. cnt،="" لوله="" اتصال؛="" dct،="" لوله="" پیچیده="" دیستال.="" pt،="" لوله="" پروگزیمال؛="" tal،="" اندام="" صعودی="" ضخیم="" حلقه="" هنله.="" tl،="" اندام="" نازک="" حلقه="">

اندازه گلومرولی با عمق متفاوت است

سپس عمق و قطر گلومرول‌ها را به‌طور تصادفی از هر یک از 3 ناحیه انتخاب کردیم. آنالیزهای مورفومتریک نشان داد که گلومرول ها به ترتیب در فاصله 783 و 355 میلی متری از کپسول کلیه در JNs و SNs قرار دارند. همانطور که قبلاً گزارش شد، مشاهده کردیم که اندازه گلومرول ها با توجه به عمق آنها متفاوت است. به طور خاص، حجم گلومرولی JNs 3 برابر بیشتر از SNs و MNs بود (شکل 2d).

بازسازی نفرون سه بعدی

سپس تکامل فضایی کل نفرون ها را از PT تا CNT ردیابی کردیم. نمای کلی بازسازی سه بعدی آنها تأیید کرد که شکل نفرون در SNs، MNs و JNs متفاوت است (شکل 3a؛ فیلم تکمیلی S7). این تفاوت عمدتاً به دلیل ساختار PT بود. علاوه بر این، مشاهده کردیم که HL یک سازمان فضایی سه بعدی متفاوت دارد. به طور خاص، TL و TAL در JNs نسبت به SNs و MNs با فاصله بیشتری از هم جدا شدند (شکل 3b). آنالیزهای مورفومتریک نشان داد که JNها در سطح جهانی 2- برابر بیشتر از SNها هستند (شکل 3c). طول افزایش یافته به طور متناسب در همه بخش ها توزیع شد، به جز TAL و DCT، که تمایل به داشتن طول مطلق مشابه در همه انواع نفرون داشتند (شکل 3d). این نشان می دهد که ازدیاد طول نفرون یک فرآیند کاملاً همگن است.

عروق کمانی بر تابش PT مجاور مدولاری تأثیر می گذارند

برای به دست آوردن دیدگاه جامع تر ازساختار کلیهما از رنگ‌آمیزی آگلوتینین Griffonia simplicifolia استفاده کردیم، که به ما امکان داد رگ‌های قوسی شکل و شاخه‌های آن‌ها را در رگ‌های تشعشع قشری ردیابی کنیم (شکل 4a؛ فیلم تکمیلی S8). جالب توجه است، بازسازی سه بعدی نفرون ها و عروق همزمان نشان داد که رگ های قوسی در یک سازمان فضایی موازی شگفت انگیز با لوله های مجاور قرار دارند. به طور خاص، ما مشاهده کردیم که مسیری که توسط JN های خاص دنبال می شود (JNs محدود) تمایل دارد مسیر کشتی مجاور را دنبال کند (شکل 4b؛ فیلم تکمیلی S9). به طور قابل توجهی، این سوگیری (که فقط در زیر مجموعه ای از نفرون های JN مشاهده شد) ناهمگنی بزرگ در اشکال PT را به حساب آورد (شکل تکمیلی S6). تجزیه و تحلیل مورفومتریک نشان داد که PT های "محدود" به طور قابل توجهی طولانی تر و پرپیچ و خم تر (صراحت کاهش یافته) از موارد "غیر محدود" بودند (شکل 4c و d). شایان ذکر است که قسمت های پیچ خورده SNs و MNs در بالای عروق کمانی قرار داشتند و محدود نبودند.

لوله ها تمایل دارند در صفحات قرار بگیرند

جالب توجه است، بررسی اشکال سه بعدی نفرون ها نشان داد که آنها تمایل دارند در صفحات قرار بگیرند (شکل 5a؛ فیلم تکمیلی S10). برای تعیین کمیت این پارامتر و ارزیابی سوگیری آماری احتمالی این ترکیب، تمایل کلی لوله‌ها به خم شدن به خارج از صفحه تعریف شده توسط حلقه‌هایشان را اندازه‌گیری کردیم. اندازه‌گیری‌های ما نشان داد که در مقایسه با یک مدل شبیه‌سازی شده از راه رفتن تصادفی ایجاد شده با مجموعه‌ای از زوایای اندازه‌گیری‌شده و طول متوالی بین نقاط متوالی (شکل 5b)، لوله‌ها تمایل به تکامل با انحراف کوچک‌تری از یک صفحه داشتند (شکل 5c). این نشان داد که لوله ها تمایل دارند مسیر خود را در امتداد یک صفحه محدود کنند. تفاوت های مشاهده شده از نظر آماری بسیار معنی دار بود (001/0 P <>

سیستانچ می تواند عملکرد کلیه را بهبود بخشد

بازسازی نفرون سه بعدی یک الگوی خاص برای ایجاد کیست را نشان می دهد

برای تعیین اینکه آیا پروتکل ما امکان ردیابی نفرون‌ها را در بافت‌های پاتولوژیک بهم ریخته می‌دهد یا نه، شکل‌ها و توزیع فضایی کیست‌ها را در موش‌های jck، مدلی پرکاربرد از NPHP و بیماری کیستیک، مشخص کردیم. 31–33 3تصاویر D نشان داد که علی‌رغم از نظر ظاهر کیست های برجسته، سیر سه بعدی کلی نفرون ها تفاوت معنی داری با موش های کنترل نداشت (فیلم تکمیلی S11). به طور مشابه، آنالیزهای مورفومتریک تأیید کردند که طول کلی نفرون ها، حجم گلومرولی و طول هر کدامنفرونبخش قابل مقایسه با موش های کنترل بود (شکل تکمیلی S7). قابل توجه است، به دلیل ایجاد کیست، ما قادر به افتراق TL از TAL در HL نبودیم. همه نفرون ها کیست های دوکی شکل ایجاد کردند (فیلم های تکمیلی S11 و S12). یکی از قابل توجه ترین ویژگی ها مشاهده این بود که اتساع کیستیک دوکی شکل در چندین مکان در امتداد یکسان رخ می دهد.نفرونبخش (فیلم های تکمیلی S12 و S13). به طرز جالبی مشاهده کردیم که کیست ها هرگز در PT ها و اندام های نزولی HL ایجاد نشدند (شکل 6a؛ فیلم تکمیلی S12). در مقابل، آنها عمدتاً در اندامهای صعودی HL، DCTها، CNTها، و در قسمت بالایی CDها، به طور پیوسته با CNT شناسایی شدند (شکل 6a؛ فیلم تکمیلی S12). به طور خاص، ما مشاهده کردیم که DCT، و همچنین بخش‌های CNT، احتمال ایجاد کیست‌ها در قسمت‌های دیستال‌تر مربوطه را افزایش می‌دهند (شکل 6b). تجزیه و تحلیل مورفومتریک کمی تصاویر بازسازی سه بعدی نشان داد که حجم کل کیست در هرنفرونبه ویژه در CNT بالا بود (شکل 7a). علاوه بر این، مشاهده کردیم که بزرگ شدن کیست در HL و DCT در JNs بیشتر از SNs و MNs بود (شکل 7a؛ فیلم تکمیلی S12). علاوه بر این، بروز کیست در JN ها به طور قابل توجهی بیشتر از سایر انواع نفرون ها بود (شکل 7b). ما همچنین مشاهده کردیم که میانگین فاصله گلومرولی (محاسبه شده بر روی نزدیکترین 5 گلومرول) به ویژه در موش های کیستیک، به ویژه در قشر سطحی تر افزایش می یابد (شکل تکمیلی S8).

بازسازی سه بعدی کیست های متعدد نشان داد که آنها از نظر شکل و حجم بسیار متغیر هستند (شکل 6c؛ فیلم های تکمیلی S11 و S13). در اندام صعودی HL، کیست ها شکل دوکی با قطر کوچک داشتند. در DCT، کیست‌ها شکل نسبتاً کروی و بزرگ‌تری داشتند و در میان لوله‌های گشاد نشده پراکنده بودند. جالب توجه است، انتقال بین DCT و CNT به طور سیستماتیک با یک ساختار غیر متسع طبیعی مشخص شد. در مقابل، در CNT، ما به طور سیستماتیک یک ساختار کیستیک متسع به هم پیوسته را در تماس مستقیم با CD مشاهده کردیم. جالب اینجاست که در سی دی، این ساختار به تدریج به اندازه توبول طبیعی کوچک شد. بیشتر دیستال، هیچ کیست دیگری را نمی توان در بخش مجاور CD تشخیص داد. یکی دیگر از ویژگی های سازگار سازمان فضایی عجیب کیست ها در اندام صعودی HL بود. در واقع، اگرچه کیست‌ها در SNs عمیق‌تر و نزدیک‌تر به حلقه بودند، اما در JNs سطحی‌تر و به DCT نزدیک‌تر بودند (شکل 6c). باز هم، کیست ها یک موقعیت میانی در MNs اشغال کردند (شکل 6c).

شکل 5|لوله های نفرون تمایل به تکامل به عنوان یک ساختار صاف دارند. (الف) یک مسیر معمولی یک لوله پروگزیمال نفرون. این مسیر تمایل آن به دراز کشیدن در هواپیما را نشان می دهد. وقتی به درستی چرخانده شود و با دیدگاه ناظر در یک راستا باشد، می توان مسطح تکامل مسیر را بهتر دید (نگاه کنید به نمایش سمت راست همان بخش لوله ای، که در سمت چپ، در قسمتی متفاوت نشان داده شده است. زاویه). (ب) نمایش شماتیک یک مسیر لوله‌ای متشکل از 4 بخش (بین 5 نقطه که یک مسیر لوله‌ای معین را به عنوان مثال نشان می‌دهد). میزان تمایل مسیرها به "خارج از صفحه خود" را می توان با زاویه ای که در اینجا به عنوان "بتا" نشان داده شده است نشان داد. (ادامه دارد)

شکل 5|(ادامه) این زاویه بین پاره p3-p4 نسبت به صفحه (تعریف شده توسط نقاط بلافاصله قبل p3، p2 و p1) اندازه گیری می شود و با یک مستطیل خاکستری تیره در طرح نشان داده می شود. محاسبه زوایای بتا سپس به صورت بازگشتی در سراسر مجموعه نقاط در یک مسیر لوله‌ای محاسبه شد. برای ارزیابی میزان تعصب این زوایای بتا، ما یک راه رفتن تصادفی (شبیه‌سازی مونت کارلو [MCs]) را با استفاده از مجموعه‌ای از زوایای آلفای متوالی هر مسیر لوله‌ای (اندازه‌گیری شده بین تمام بخش‌های متوالی) شبیه‌سازی کردیم. این پیاده‌روی تصادفی مسیری را با مجموعه‌ای یکسان از زوایای آلفا و زوایای بتای تصادفی ایجاد کرد. (ج) نمودارهای ویولن از توزیع جهانی زوایای بتا و نتیجه MC ها در لوله پروگزیمال (PT)، اندام نازک (TL) حلقه هنل، اندام صعودی ضخیم (TAL) حلقه هنل، لوله پیچیده دیستال ( DCT) و لوله همبند (CNT). MCs، P <>

بحث

روش‌های بافت‌شناسی سنتی در توانایی تشخیص تغییرات پاتولوژیک که بر شکل کلی نفرون‌ها تأثیر می‌گذارند، محدود هستند. در اینجا، ما یک رویکرد قدرتمند مبتنی بر پاکسازی بافت ارائه می‌کنیم که پتانسیل پاسخگویی به سؤالات مهم در مورد معماری کلیه را با جزئیات فضایی بی‌سابقه در شرایط عادی و پاتولوژیک دارد. نتایج ما وجود 3 نوع نفرون را تأیید کرد که در مکان، شکل و اندازه آنها مطابق با ویژگی های عملکردی آنها متفاوت است. علاوه بر این، ما نشان دادیم که نفرون‌ها تمایل دارند در هواپیماها قرار بگیرند و با سازمان فضایی عروق سازگار شوند. جالب است که وقتی این تکنیک را در مدلی ازبیماری کلیه کیستیکمشاهده کردیم که در همه کیست ها ایجاد می شود

نفرون ها، اما فقط در بخش های خاص. جالب توجه است، ما نشان دادیم که شکل کیست با توجه به بخش نفرون متفاوت است، و در امتداد همان نفرون، کیست‌ها با لوله‌های گشاد نشده طبیعی در هم می‌آیند. در مجموع، این نتایج اولین توصیف سه بعدی از آرایش فضایی نفرون ها و عروق را ارائه می دهد و به طور مهمی پایه ای را برای درک یک فرآیند پاتولوژیک، مانند سیستوژنز، فراهم می کند.

پاکسازی نوری کلیه به دلیل سطوح بالای خودفلورسانس و تراکم سلولی چالش برانگیز است. با مقایسه پروتکل های پاکسازی مختلف، ما در BABB یک تکنیک قدرتمند برای پیاده سازی تجسم و بازسازی سازه های واقع در عمیق ترین بخش شناسایی کردیم.کلیه، یعنی مدولا. علاوه بر این، BABB سریع و مقیاس پذیر است و پس از پاکسازی، نمونه ها را می توان برای ماه ها قبل از گرفتن تصویر ذخیره کرد. یکی دیگر از مزایای اصلی این تکنیک هزینه پایین آن است. عوامل پاک کننده ممکن است منجر به کوچک شدن یا بزرگ شدن ساختارها شوند. 9-17 با این حال، از آنجایی که این تغییرات اندازه کلیه همسانگرد است، انتظار نمی رود که اندازه گیری های نسبی تحت تأثیر قرار گیرند یا تفسیر آنها را سوگیری کنند. یکی از مهمترین محدودیت ها حاشیه نویسی سازه ها است که بسیار وقت گیر است. با این وجود، تعداد فزاینده ای از تکنیک های مبتنی بر یادگیری عمیق وجود دارد که باید به سرعت بر این محدودیت غلبه کند.

مطابق با نتایج به‌دست‌آمده با تکنیک‌های کلاسیک، مطالعه ما نشان داد که نفرون‌ها از نظر شکل و طول بر اساس موقعیتشان متفاوت هستند. به طور خاص، مشاهده کردیم که JN ها دارای PT های پیچیده تر و گلومرول های بزرگتر هستند و 2 برابر طولانی تر از SN ها هستند. افزایش طول نتیجه یک فرآیند هماهنگ است زیرا افزایش طول به طور متناسب بر تمام بخش های نفرون تأثیر می گذارد. ما همچنین مشاهده کردیم که JN ها HL بزرگتری دارند. در مجموع، این داده‌ها به وضوح نشان می‌دهند که میکروآناتومی SNs و JNs به طور قابل‌توجهی متفاوت است و MNs ویژگی‌های میانی را نشان می‌دهد. جالب توجه است، مطالعات فیزیولوژیکی نشان داده اند که نفرون ها از نظر عملکردی نیز متفاوت هستند. رویدادهای مورفوژنتیکی که زمینه ساز این تفاوت ها هستند، هنوز شناخته نشده اند. بنابراین وسوسه انگیز است که حدس بزنیم که ساختار خاص JN ها ممکن است برای ویژگی عملکرد آنها باشد.

جالب توجه است، با ارائه برای اولین بار بازسازی سه بعدی نفرون ها و عروق اطراف آنها، ما یک محدودیت فضایی بین عروق کمانی و زیر گروه نفرون ها کشف کردیم. بنابراین، می توان تصور کرد که کشتی ها ممکن است راه را دیکته کنندنفرون هابازرسی اشکال سه بعدی نفرون ها همراه با شبیه سازی های محاسباتی همچنین نشان داد که نفرون ها هرگز در هم نمی آمیزند و هر نفرون تمایل دارد در یک صفحه قرار بگیرد. اهمیت عملکردی این مشاهدات باید روشن شود.

ایجاد کیست در طولبیماری کلیه پلی‌کیستیکهنوز یک فرآیند جذاب است. NPHP، یک وضعیت پاتولوژیک که با ایجاد کیست مشخص می شود، شایع ترین بیماری ژنتیکی است که باعث بیماری کلیوی مرحله نهایی در کودکان و نوجوانان می شود. تاکنون بیست ژن NPHP شناسایی شده است. در میان آنها، NEK8 عضوی از خانواده کیناز A-مربوط به هرگز در میتوز را کد می کند، که در عملکرد مژگان و پیشرفت چرخه سلولی نقش دارد. Nek8 در ابتدا به عنوان ژن جهش یافته در مشخص شد. موش‌های jck.32 مشخصاً نشان داده شده است که یک جهش در حوزه پروتئینی یکسان منجر به NPHP9 در انسان می‌شود.{7}}مطالعات D نشان می‌دهد که ایجاد کیست به طور چشمگیری در بین اشکال مختلف بیماری کلیه پلی کیستیک متفاوت است. به ویژه در NPHP، به نظر می‌رسد که کیست‌ها منحصراً از CD و DCT مشتق شده‌اند. اگرچه اطلاعاتی است، اما این مطالعات ایمونوهیستوشیمی نمی‌توانند با این احتمال که از دست دادن نشانگرهای لوله‌ای خاص به‌طور مصنوعی این مشاهدات را توضیح می‌دهد، استدلال کنند. بنابراین، مطالعه 3 بعدی ما اولین شواهد روشنی را ارائه می دهد که توسعه کیست فرآیندی است که ممکن است فقط بخش های نفرون خاصی را شامل شود. جالب توجه است، اگرچه NIMA (Never In mitosis gene A) - Related Kinase 8 (NEK8) در سیتوپلاسم تمام بخش های نفرون بیان می شود، بیان آن در مژک ها به DCT و CD محدود می شود. از آنجایی که فقط این بخش‌ها مستعد ایجاد کیست هستند، می‌توانیم فرض کنیم که اختلال عملکرد مژگانی NEK8 رویداد مهمی برای تشکیل کیست است. به طرز جالبی، ما همچنین مشاهده کرده‌ایم که کیست‌های دوکی شکل با توبول‌های گشاد نشده طبیعی تداوم دارند. این واقعیت که یک جهش ژرمینال مغلوب منجر به یک فنوتیپ پاتولوژیک تنها در زیر مجموعه ای از سلول ها می شود، نشان می دهد که یک رویداد دوم ممکن است باعث ایجاد کیست در این سلول ها شود، همانطور که برای پلی کیستیک اتوزومال غالب پیشنهاد می شود.بیماری کلیوی.40,41

ما همچنین مشاهده کردیم که بزرگ شدن کیست در JNs غالب تر از SNs است، حداقل با توجه به کیست هایی که بین PT و CNT قرار دارند. به طور مداوم، گزارش شده است که در زمینه گلومرولواسکلروز، ضایعات گلومرولی در JNs بیشتر از SNs یافت می شود.نفروننرخ‌های فیلتراسیون گلومرولی و فعالیت‌های حمل‌ونقل/آنزیمی دلیل افزایش حساسیت JNs به زوال، فرضیه‌ای جالب است که مستحق بررسی بیشتر است.

به طور خلاصه، ما یک تکنیک جدید برای تصویربرداری از کلیه ها به صورت سه بعدی با ویژگی و وضوح مولکولی کافی برای ثبت مستقیم توزیع فضایی و کمی ساختارهای داخلی مشخص شده (نفرون ها، عروق و کیست ها) توصیف می کنیم. با توجه به راحتی، سرعت و توانایی برای تعیین کمیت مستقیم، ما پیش بینی می کنیم که این تکنیک به ابزاری قدرتمند برای درک پاتوفیزیولوژی کلیه تبدیل شود.

شکل 6|بازسازی نفرون سه بعدی (سه بعدی) نشان می دهد که کیست ها فقط در بخش های نفرون خاص ایجاد می شوند. (الف) تصاویر سه بعدی با رندر حجم کیست از یک نفرون کامل (پانل های سمت چپ) از گلومرول ها تا مجرای جمع کننده در قشر سطحی (آبی)، قشر میانی (سبز) و ناحیه juxtamedullary (قرمز) در موش های jck. تقسیم بندی نفرون (پانل های سمت راست) برای 3 نوع مختلف نفرون. میله ¼ 150 میلی متر. (ب) احتمال ایجاد کیست در بخش های مختلف نفرون در موش jck. (ادامه دارد)

شکل 6|(ادامه) محور افقی یک طول نرمال شده نفرون است که مربوط به 50 سطل است (توبول پروگزیمال [PT]، فیروزه ای؛ حلقه هنل [HL]، سفید؛ لوله پیچیده دیستال [DCT]، صورتی؛ لوله اتصال [CNT]، زرد) . (ج) تصاویر بازسازی کیست های سه بعدی با نمایش حجم کیست اندام صعودی HL (پانل های سمت چپ)، DCT ها (پانل های میانی) و CNT ها و مجاری جمع کننده قشر مغز (CCD) (پانل های سمت راست) در سطحی (پانل های بالایی)، وسط (پانل های میانی)، و نفرون های جانبی (پانل های پایینی) در موش های jck. میله ¼ 50 میلی متر.

مواد و روش ها

حیوانات

همه رویه های حیوانات توسط "سرویس دامپزشکی د لا پرفکتور پلیس پاریس" و کمیته اخلاقی دانشگاه پاریس دکارت تایید شد. موش دو ماهه FVB/N (20 ¼) برای تنظیم شرایط آزمایشی برای پاکسازی کلیه استفاده شد. سپس مطالعه بر روی 2-موش‌های نر jck هفته‌ای (4 ¼ n) و همزادهای کنترل (n ¼ 3) انجام شد.

آماده سازی بافت های کلیوی

قبل از کشتن، موش ها از طریق کاتتریزاسیون داخل قلب، با 25 میلی لیتر سالین هپارینه شده (1000 واحد در لیتر) و سپس 75 میلی لیتر پارافورمالدئید 4 درصد در سالین بافر فسفات (PBS) پرفیوژن شدند. آزمایش‌ها تحت بیهوشی زایلازین (Rompun 2 درصد، بایر، لورکوزن، آلمان، 6 میلی‌گرم بر گرم وزن بدن) و کتامین (Clorketam 1000، Vetoquinol SA، Lure، فرانسه، 120 میلی‌گرم بر گرم وزن بدن) انجام شد.

برای مطالعات پاکسازی، کلیه ها به مدت 4 ساعت در پارافورمالدئید 4 درصد تثبیت شدند و در آگارز 4 درصد و 1. برش داده شدند و بخش هایی به ضخامت {4}} میلی متر در اطراف نایل کلیوی بریده شدند و در PBS در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند.بخش های کلیهابتدا رنگ آمیزی و سپس پاکسازی شدند.

برای مطالعات ایمونوهیستوشیمی در مقاطع نازک،کلیه هایک شبه در پارافورمالدئید 4 درصد تثبیت شد و مقاطع پارافین جاسازی شده و 4- میلی متر برش داده شد.

رنگآمیزی

رنگ آمیزی دوره ای اسید-شیف. بخش‌های کلیه 1.5- میلی‌متری در اسید پریودیک-شیف خالص یا 1:100 PBS رقیق‌شده به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق قبل از پاک‌سازی انکوبه شدند.

ایمونوهیستوشیمی بر روی مقاطع نازک تعبیه شده در پارافین. بخش‌های چهار میکرومتری کلیه‌های تعبیه‌شده در پارافین برای بازیابی آنتی‌ژن حرارت داده شدند و یک شبه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد با لکتین‌های همراه با فلوروکروم برای ردیابی توبول‌ها (آگلوتینین بادام‌زمینی رودامین [RL-1072-5] و رودامین [RL{5}}] و رودامین [RL-1072-5] انکوبه شدند. 6}}]، Vector Laboratories، Burlingame، CA، رقیق‌شده در 1:200) و آنتی‌بادی اولیه خاص برای نشان دادن بخش‌های لوله‌ای متمایز (لکتین تتراگونولوبوس لوتوس بیوتینیله شده [B{10}}]، آزمایشگاه‌های برداری، رقیق‌شده در ۱: 100؛ موش ضد کالبیندین D28K [D-4]، سانتا کروز، هایدلبرگ، آلمان، رقیق‌شده در 1:200؛ ضد بز ضد AQP2 [C-17]، سانتا کروز، رقیق‌شده در 1:200) . روز بعد، مقاطع با آنتی بادی ثانویه به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند (Alexa Fluor 488 conjugate [S32354], Invitrogen; Antigoat Alexa Fluor 488 [A{26}}], Invitrogen; Anti-Mouse Alexa Fluor 488 [A{29}}]، Invitrogen، Carlsbad، CA؛ همه در 1:500 رقیق شده اند) قبل از رنگ آمیزی با 40،6-دیامیدینو-2- فنیلندول. تمامی تصاویر با میکروسکوپ Nikon Eclipse E800 (Champigny sur Marne، فرانسه) تهیه و با استفاده از نرم افزار FiJi (نسخه 1.50) تهیه شد.

رنگ آمیزی لکتین در مقاطع ضخیم. مقاطع کلیه به ضخامت 1.{1}}میلی متر در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 1 ماه در لکتین های جفت شده ایزوتیوسیانات فلورسینات تگزاس رد یا فلورسئین انکوبه شدند: آگلوتینین بادام زمینی (RL-1072-5) و آگلوتینین جوانه گندم (RL{{6} })، در 1:100 در 0.1 درصد آزید PBS و 0.1 درصد Triton-X رقیق شده است. سپس مقاطع قبل از پاکسازی هر روز به مدت 2 هفته با PBS شسته شدند.

پاکسازی نوری

برای پاکسازی مقیاس، مقاطع کلیه 1.5- میلی‌متری در ScaleA2 (4 مولار اوره، 0.1 درصد Triton X-100، 10 درصد گلیسرول) یا ScaleB4 انکوبه شدند. (8 مولار اوره، 0.1 درصد Triton X{12}}) به مدت 2 هفته، تا 1 سال، در دمای 4 درجه سانتیگراد.

برای پاکسازی BABB، بخش‌های کلیه 1.5- میلی‌متری در شستشوهای متوالی اتانول در دمای اتاق کم آب شدند. نمونه‌ها سپس در BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) در نسبت 1:2 به مدت حداقل 2 روز در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شدند.

گرفتن تصویر با میکروسکوپ دو فوتونی

بافت ها با ژل آبی روی یک میکروسکوپ چند فوتونی معکوس (LaVision BioTec) مجهز به لیزر تیتانیوم یاقوت کبود Mai Tai HP (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) تصویربرداری شدند (شکل تکمیلی S1A). طول موج تحریک 815 نانومتر در 8 درصد توان بود. ما از یک هدف غوطه ور در آب 20 استفاده کردیم (XLUMPLFL20XW، Olympus [توکیو، ژاپن]؛ دیافراگم عددی، 0.95، فاصله کاری، 2.0 میلی متر). برای بدست آوردن فلورسانس، ما از یک آشکارساز غیر دسکن شده در 80 درصد با یک فیلتر باند گذر 593/40 نانومتر استفاده کردیم.

مرحله اول شامل جمع‌آوری تصویر موزاییکی دوبعدی در پشته z وسط با استفاده از پارامترهای جذب غیربهینه (400 میلی‌متر 400 میلی‌متر و 1011 پیکسل 1011، با 10 درصد همپوشانی و میانگین خط 2) برای هدایت انتخاب مرتبط‌ترین فیلدهای مرکزی بود. (شکل تکمیلی S9A). هنگامی که شبکه xy و فیلدهای مورد علاقه z تعریف شدند، پارامترها برای به دست آوردن تصاویر با کیفیت بالا تنظیم شدند. چنین رویکردی منطقه مورد نظر را به 512 فیفیلد در هر پشته z کاهش داد. سپس، پشته‌های 850 z/برش‌های نوری (1-میلی‌متر اندازه گام) در اطراف ناف کلیوی در قسمت میانی به دست آوردیم.بخش کلیه.

دوخت، پردازش و ردیابی تصویر

هر پشته طبق روشی که توسط Preibisch و همکاران (43) توسعه داده شده است، کاشی کاری شده است که امکان دوخت مجموعه بزرگی از تصاویر را با استفاده از پلاگین "Grid/Collection stitching" نرم افزار فیجی (http://fifiji.sc/Fiji) فراهم می کند. . از آنجایی که ما بعد از دوخت یک تغییر مهم بین 2 تصویر مجاور مشاهده کردیم، یک برنامه تطبیق سفارشی در پایتون نوشتیم. این برنامه جابجایی تصویر را جبران می کند و به ما امکان می دهد تصاویر را به درستی تراز کنیم (شکل تکمیلی S9B). تصاویر تصحیح شده با استفاده از Imaris نسخه 8.4.2 (Bitplane، زوریخ، سوئیس) تجزیه و تحلیل شدند. لوله‌ها و رگ‌ها با استفاده از حالت دستی بسته ردیاب fifilament Imaris ردیابی شدند و توسط Imaris Xtension که با MATLAB توسعه داده‌ایم (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone{11}}پیوستن{12} به آن ملحق شدند. }} رشته_Tool.zip?dl¼0) (شکل تکمیلی S9C). گلومرول ها و کیست ها با استفاده از حالت دستی بسته سطحی ایماریس به صورت سه بعدی بازسازی شدند. سازماندهی فضایی گلومرولی سه بعدی با استفاده از حالت دستی بسته نقطه ای ایماریس نمایش داده شد.

مورفومتری

طول قطعه لوله، طول نفرون و صافی با استفاده از بسته ردیاب رشته ای ایماریس تعیین شد. با توجه به نرم افزار ایماریس، صافی به عنوان نسبت بین فاصله بین 2 نقطه و طول مسیر قطعه نفرون تعیین شد. سی و یک PTs و 12 نفرون کامل در 3 موش نوع وحشی بازسازی و اندازه‌گیری شدند، در حالی که 37 PTs و 17 نفرون کامل در 4 موش jck بازسازی و اندازه‌گیری شدند. کیست و

حجم گلومرولی با استفاده از "بسته سطحی" ایماریس تعیین شد. سی و یک و 34 گلومرول به ترتیب در موش های نوع وحشی و jck اندازه گیری شد. در مجموع هفتاد و چهار کیست اندازه گیری شد.

زوایای "خارج از صفحه" پیچ های لوله ای (که به عنوان "بتا" نشان داده شده است) بین صفحه (تعریف شده توسط 3 نقطه متوالی) و جهت با نقطه چهارم متوالی بعدی در فضا اندازه گیری شد (شکل 5b). برای ارزیابی اهمیت آماری سوگیری مشاهده‌شده، توزیع زوایای بتا را با چرخش تصادفی زوایای بتا (شبیه‌سازی مونت کارلو) در ساختارهایی شبیه‌سازی کردیم که توسط همان بخش‌ها با مجموعه‌ای از زوایای آلفا یکسان تشکیل شده‌اند.

برای محاسبه احتمال ایجاد یک ضایعه کیستیک در طولنفرونبخش ها، هر نفرون را با مجموعه ای از نقاط در فضا نشان دادیم. هر نقطه با توجه به وجود کیست در مقابل ساختار طبیعی و نوع قطعه حاشیه نویسی شد. احتمال در هر طول استاندارد شده (تنظیم شده در 50 بن) به عنوان نسبت بین تعداد نقاط دارای حاشیه کیستیک و تعداد کل نقاط در سطل محاسبه شد.

برای محاسبه میانگین فاصله گلومرولی، ما برای هر گلومرول میانگین فاصله گلومرولی محاسبه شده بر روی نزدیکترین 5 گلومرول را در نظر گرفتیم.

تجزیه و تحلیل داده ها و آمار

داده ها به صورت میانگین SEM بیان می شوند. تفاوت‌های بین گروه‌های آزمایشی با استفاده از تحلیل واریانس و در صورت معنی‌دار بودن (P <{{0}}.05) با="" آزمون="" توکی="" کرامر="" مورد="" ارزیابی="" قرار="" گرفت.="" هنگامی="" که="" تنها="" 2="" گروه="" مقایسه="" شدند،="" از="" آزمون="" من="" ویتنی="" استفاده="" شد.="" تجزیه="" و="" تحلیل="" های="" آماری="" با="" استفاده="" از="" نرم="" افزار="" graph="" prism="" (san="" diego,="" ca,="" version="" 9.0.0)="" انجام="">

افشای

همه نویسندگان هیچ علاقه رقیبی را اعلام نکردند.

قدردانی

ما از Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT)، بافت شناسی و بسترهای تصویربرداری ساختار Federative de Recherche Necker برای کمک های فنی تشکر می کنیم. ما از پیر ایزنارد، ماری-کلر گوبلر و نیکلاس کوپرواسر برای خواندن انتقادی این نسخه تشکر می کنیم. این اثر توسط Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale، Université Paris Descartes، Assistance Publique – Hôpitaux de Paris، Agence Nationale de la Recherche، Whoami Laboratoire d'Excellence Who am, Roche Pharma Research and Early Development (بازل) پشتیبانی شده است. ، سوئیس)، و Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (پاریس، فرانسه).

مشارکت های نویسنده

TB، NG و MZ آزمایش ها را طراحی و اجرا کردند و داده ها را تجزیه و تحلیل کردند. FB، LT، MGT و SG نیز آزمایش هایی را انجام دادند و داده ها را تجزیه و تحلیل کردند. MB و CN آزمایش‌های موش را انجام دادند. TB و MZ نیز در نگارش این دست نوشته سهیم بودند. GF نسخه خطی را اصلاح کرد. FT و MP چارچوب مفهومی را ارائه کردند و مطالعه را طراحی کردند، بر پروژه نظارت کردند و مقاله را نوشتند.

سیستانچ می تواند کلیه را مقوی کند

مواد تکمیلی

فایل تکمیلی (PDF)

شکل S1. راه اندازی آزمایشی، روش اکتساب، و پردازش تصویر.

شکل S2. محدودیت سیگنال فلورسانس خودکار در وضوح xy و z.

شکل S3. تصویر دو بعدی از انتقال بین PT و TL بر روی بخش‌های کلیه پارافین‌دار 4- میلی‌متری.

شکل S4. تصویر دو بعدی از انتقال بین TAL و DCT بر روی بخش‌های کلیه پارافین‌دار 4- میلی‌متری.

شکل S5. تصویر دو بعدی از انتقال بین DCT و CNT بر روی بخش‌های کلیه پارافین‌دار 4- میلی‌متری.

شکل S6. بازسازی سه بعدی 3 شکل مختلف از لوله های پروگزیمال را نشان می دهد.

شکل S7. بازسازی سه بعدی نشان می دهد که طول و قطعه بندی نفرون ها تحت تأثیر کیست ها قرار نمی گیرد.

شکل S8. تراکم گلومرول ها در کلیه های کنترل و کیستیک.

شکل S9. روش اکتساب و پردازش تصویر پس از درمان

جدول S1. مقایسه روش های پاکسازی فایل تکمیلی (فیلم)

فیلم S1. رنگ آمیزی لکتین به طور قابل توجهی وضوح و نسبت سیگنال به پس زمینه را بهبود می بخشد.

فیلم S2. ردیابی مسیر یک لوله.

فیلم S3. بازسازی سه بعدی کلیه پاک شده که محل اتصال لوله پروگزیمال و اندام نازک حلقه هنل را نشان می دهد.

فیلم S4. بازسازی سه بعدی کلیه پاک شده که محل اتصال بین اندام بالارونده ضخیم حلقه هنل و لوله پیچیده دیستال را نشان می دهد.

فیلم S5. بازسازی سه بعدی کلیه پاک شده که محل اتصال لوله پیچیده دیستال و لوله اتصال را نشان می دهد.

فیلم S6. شکل و اندازه لوله های پروگزیمال با توجه به عمق آنها متفاوت است.

فیلم S7. بازسازی نفرون سه بعدی در موش های کنترل

فیلم S8. ردیابی مسیر یک رگ از یک رگ کمانی به یک رگ تشعشع قشری.

فیلم S9. رگ های قوسی شکل لوله های پروگزیمال کنار هم را مدل می کنند.

فیلم S10. نفرون ها تمایل دارند در هواپیما دراز بکشند.

فیلم S11. بازسازی نفرون سه بعدی الگوی خاصی را برای ایجاد کیست نشان می دهد.

فیلم S12. تقسیم بندی نفرون سه بعدی نشان می دهد که کیست ها در بخش های نفرون خاصی ایجاد می شوند.

فیلم S13. آرایش فضایی و رابطه متقابل نفرون ها و عروق در کلیه پلی کیستیک

منابع

1. Rich AR. یک آسیب‌پذیری توصیف‌نشده از گلومرول‌های جانبی در نفروز لیپویید. بیمارستان بول جانز هاپکینز 1957؛ 100: 173-186.

2. Bankir L، Bouby N، Trinh-Trang-Tan MM. ناهمگونی آناتومی نفرون کلیه های Int Suppl. 1987؛ 20: S25–S39.

3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al. بازسازی سه بعدی نفرون موش صحرایی. من جی فیزیول فیزیول هستم. 2014؛ 306: F664–F671.

4. Zhai XY، Birn H، Jensen KB، و همکاران. بازسازی دیجیتال سه بعدی و فراساختار لوله پروگزیمال ماوس. جی ام سوک نفرول. 2003؛ 14:611-619.

5. Zhai XY، تامسن JS، Birn H، و همکاران. بازسازی سه بعدی نفرون موش. جی ام سوک نفرول. 2006؛ 17:77-88.

6. Puelles VG، Moeller MJ، Bertram JF. اکنون می توانیم به وضوح ببینیم: پاکسازی نوری و مورفومتریک کلیه. Curr Opin Nephrol Hypertens. 2017؛ 26:179-186.

7. سئو جی، چو ام، کیم سی. تکنیک های پاکسازی و برچسب گذاری برای بافت های بیولوژیکی در مقیاس بزرگ. سلول های مول. 2016؛ 39:439-446.

8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang: Über Knochenfärbung. لایپزیگ، آلمان: S. Hierzel; 1914.

9. Hama H، Kurokawa H، Kawano H، و همکاران. مقیاس: یک رویکرد شیمیایی برای تصویربرداری فلورسانس FL و بازسازی مغز شفاف موش Nat Neurosci. 2011؛ ​​14:1481-1488.

10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al. تصویربرداری سه بعدی از اندام های پاک شده با حلال با استفاده از 3DISCO. پروتوک Nat. 2012؛ 7: 1983-1995.

11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: یک روش پاکسازی بدون مواد شوینده و حلال برای بافت عصبی و غیر عصبی. توسعه. 2013؛ 140:1364-1368.

12. Ke MT، Imai T. پاکسازی نوری نمونه های ثابت مغز با استفاده از SeeDB. Curr Protoc Neurosci. 2014؛ 66:2.22.1–2.22.19.

13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY برای نقشه برداری از سیستم عصبی. روش‌های Nat 2013؛ 10:508-513.

14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY برای تصویربرداری سریع و با وضوح بالا از بافت های دست نخورده. پروتوک Nat. 2014؛ 9:1682-1697.

15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. فنوتیپ تک سلولی در بافت سالم شفاف از طریق پاکسازی کل بدن. سلول. 2014؛ 158: 945-958.

16. Susaki EA، Tainaka K، Perrin D، و همکاران. تصویربرداری از کل مغز با وضوح تک سلولی با استفاده از کوکتل های شیمیایی و تجزیه و تحلیل محاسباتی. سلول. 2014؛ 157:726-739.

17. آلاننتالو تی، آسایش آ، موریسون اچ، و همکاران. تصویربرداری مولکولی توموگرافی و تعیین کمیت سه بعدی در اندام های موش بالغ روش‌های Nat 2007؛ 4:31-33.

18. Parra SG، Chia TH، Zinter JP، و همکاران. میکروسکوپ چند فوتونی از اندام های پاک شده موش. J Biomed Opt. 2010؛ 15:036017.

19. Renier N، Wu Z، Simon DJ، و همکاران. iDISCO: روشی ساده و سریع برای برچسب گذاری نمونه های بافت بزرگ برای تصویربرداری حجمی. سلول. 2014؛ 159: 896-910.

20. لی اچ، پارک جی اچ، سئو آی، و همکاران. کاربرد بهبود یافته فناوری پاکسازی بافت الکتروفورتیک، CLARITY، برای اندام های جامد دست نخورده از جمله مغز، پانکراس، کبد، کلیه، ریه و روده. BMC Dev Biol. 2014؛ 14: 1-7.

21. آیورسن BM، Amann K، Kvam FI، و همکاران. افزایش فشار و اندازه مویرگی گلومرولی باعث گلومرولواسکلروز در قشر جانبی SHR می شود. من جی فیزیول فیزیول هستم. 1998؛ 274: F365–F373.

22. Angelotti ML، Antonelli G، Conte C، Romagnani P. تصویربرداری از کلیه: از نور تا میکروسکوپ با وضوح فوق العاده. پیوند نفرول دیال. 2021؛ 36:19-28.

23. Puelles VG، van der Wolde JW، Schulze KE، و همکاران. اعتبار سنجی یک روش سه بعدی برای شمارش و اندازه گیری سلول های پادوسیت در کل گلومرول ها. جی ام سوک نفرول. 2016؛ 27:3093-3104.

24. Pannabecker TL، Dantzler WH، Layton HE، Layton AT. نقش معماری سه بعدی در مکانیسم تمرکز ادرار در بصل النخاع داخلی کلیه موش صحرایی من جی فیزیول فیزیول هستم. 2008؛ 295:F1271–F1285.

25. Saritas T، Puelles VG، Su XT، و همکاران. پاکسازی نوری در کلیه، بازسازی توبول با واسطه پتاسیم را نشان می دهد. Cell Rep. 2018؛ 25:2668–2675.e3.

26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. تصویربرداری ترکیبی ساختاری و عملکردی کلیه تفاوت های محوری عمده را در اندوسیتوز توبول پروگزیمال نشان می دهد. جی ام سوک نفرول. 2018؛ 29:2696–2712.

27. Braun DA، Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017؛ 9:a028191.

28. برگمان سی، گوای-وودفورد ال ام، هریس پی سی، و همکاران. بیماری کلیه پلی‌کیستیک. Nat Rev Dis Prim. 2018؛ 4:50.

29. Wilson PD. بیماری کلیه پلی‌کیستیک. N Engl J Med. 2004؛ 350: 151-164.

30. Laitinen L، Virtanen I، Saxén L. تغییرات در الگوی گلیکوزیلاسیون در طول رشد جنینی کلیه موش همانطور که با مزدوج های لکتین نشان داده شد. J Histochem Cytochem. 1987؛ 35:55-65.

31. اسمیت LA، Bukanov NO، Husson H، و همکاران. توسعه بیماری کلیه پلی کیستیک در موش های نوجوان کلیه کیستیک: بینش هایی در مورد پاتوژنز، ناهنجاری های مژگانی و ویژگی های مشترک با بیماری انسانی جی ام سوک نفرول. 2006؛ 17:2821-2831.

32. لیو اس، لو دبلیو، اوبارا تی، و همکاران. نقص در یک کیناز جدید خانواده Nek باعث بیماری کلیه کیستیک در موش و در گورخرماهی می شود. توسعه. 2002؛ 129:5839-5846.

33. Franke M, Baeßler B, Vechtel J, et al. نقشه برداری رزونانس مغناطیسی T2 و تصویربرداری با وزن انتشار برای تشخیص زودهنگام سیستوژنز و پاسخ به درمان در مدل موشی بیماری کلیه پلی کیستیک. کلیه بین المللی 2017؛ 92: 1544-1554. 34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. عوامل تعیین کننده مولکولی تخصص عروق نفرون در کلیه Nat Commun. 2019؛ 10: 5705.

35. Perretta-Tejedor N، Jafree DJ، Long DA. ارتباط اندوتلیال-اپیتلیال در بیماری کلیه پلی کیستیک: نقش سیگنال دهی فاکتور رشد اندوتلیال عروقی سیگنال سلولی 2020؛ 72:109624.

36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. بسیاری از ژن-یک بیماری؟ ژنتیک نفرونوفتیزیس (NPHP) و اختلالات مرتبط با NPHP. اطفال جلو. 2017؛ 5:287.

37. Fry AM، O'Regan L، Sabir SR، Bayliss R. تنظیم چرخه سلولی توسط خانواده پروتئین کینازهای NEK. J Cell Sci. 2012؛ 125:4423-4433.

38. Otto EA، Trapp ML، Schultheiss UT، و همکاران. جهش‌های NEK8 بر موضع‌گیری مژگانی و سانتروزومی تأثیر می‌گذارند و ممکن است باعث نفرونوفتیس شوند. جی ام سوک نفرول. 2008؛ 19:587-592.

39. Wilson PD. قطبیت آپیکو بازال در اپیتلیوم بیماری کلیه پلی کیستیک Biochim Biophys Acta. 2011؛ ​​1812: 1239-1248.

40. هاپه اچ، لئونارد WN، ون در وال آ، و همکاران. آسیب لوله‌ای سمی در کلیه‌ها از موش‌های حذف‌شده Pkd، سیستوژنز همراه با قطبیت سلولی مسطح و مسیرهای سیگنال دهی متعارف Wnt را تسریع می‌کند. هوم مول ژنت. 2009؛ 18: 2532-2542.

41. Piontek K، Menezes LF، Garcia-Gonzalez MA، و همکاران. یک سوئیچ رشدی حیاتی سینتیک تشکیل کیست کلیه را پس از از دست دادن Pkd1 تعریف می کند. نات مد. 2007؛ 13:1490-1495.

42. Ikoma M، Yoshioka T، Ichikawa I، Fogo A. مکانیسم حساسیت منحصر به فرد گلومرول های قشر عمیق کلیه های بالغ به اسکلروز گلومرولی کانونی شدید. Pediatr Res. 1990؛ 28:270-276.

43. Preibisch S، Saalfeld S، Tomancak P. دوخت بهینه جهانی از تصاویر میکروسکوپی سه بعدی کاشی شده. بیوانفورماتیک. 2009؛ 25: 1463-1465.