انواع آپولیپوپروتئین L1 مرتبط با بیماری کلیوی افزایش عملکرد را در فعالیت کانال کاتیونی نشان می دهد

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

جاناتان برونو و جان سی. ادواردز

انواع آپولیپوپروتئین L1 (ApoL1) مسئول افزایش خطر ابتلا به برخی از بیماری های پیشرونده هستند.کلیهبیماری هادر میان مردم آفریقایی تبار ApoL1 یک پروتئین آمفیتروپیک است که می تواند به غشاهای فسفولیپیدی وارد شود و بسته به pH نفوذ پذیری انتخابی آنیونی یا کاتیونی را به غشاهای فسفولیپیدی بدهد. اینکه آیا این فعالیت‌ها در میان انواع مختلف متفاوت هستند یا اینکه در پاتوژنز بیماری نقش دارند، ناشناخته است. ما از سنجش شار یونی مبتنی بر ولتاژ از وزیکول‌های فسفولیپید و ارتباط غشایی پایدار برای ارزیابی تفاوت بین ایزوفرم‌های ApoL1 استفاده کردیم. افزایش قابل توجهی (تقریباً دو برابر) در فعالیت یون پرماز انتخابی کاتیونی در دو نوع مرتبط با بیماری کلیوی در مقایسه با پروتئین مرجع وجود دارد. در مقابل، ما هیچ تفاوتی در فعالیت پرماز انتخابی آنیون در pH پایین در بین ایزوفرم‌ها پیدا نکردیم. در مقایسه با توالی مرجع، دو نوع مرتبط با بیماری افزایش ارتباط پایدار با وزیکول‌های فسفولیپید را تحت شرایطی نشان می‌دهند که از فعالیت کاتیون پرماز پشتیبانی می‌کنند، که نشان می‌دهد که افزایش فعالیت ممکن است به ارتباط کارآمدتر غشاء و درج باشد. هیچ تفاوتی در ارتباط غشایی بین ایزوفرم ها تحت شرایط بهینه برای فعالیت آنیون پرماز وجود ندارد. این داده‌ها از مدلی پشتیبانی می‌کنند که در آن افزایش نفوذپذیری کاتیون ممکن است به بیماری‌های پیشرونده کلیوی مرتبط با آلل‌های پرخطر ApoL1 کمک کند.

دو نوع متمایز در پروتئین ApoL1 مسئول افزایش خطر شناخته شده پروتیینوری پیشرونده هستند.کلیهمرضدر افراد با اصل و نسب آفریقایی، به ویژه به دلیل گلومرولوسکلروزیس سگمنتال کانونی، نفرواسکلروز فشار خون بالا، و نفروپاتی مرتبط با HIV (1-3). نقش های عملکردی ApoL1 در سلول های انسانی، تأثیر انواع مرتبط با بیماری بر این عملکردها، و چگونگی تسریع عدم فعالیت چنین تغییراتیبیماری کلیوینامشخص هستند (4، 5).

تنها فعالیت بیوشیمیایی که پروتئین ApoL1 شناخته شده است این است که به عنوان یک کانال یونی عمل کند. دامنه N ترمینال ApoL1 دارای شباهت ساختاری با کولیسین A1 باکتریایی است (6). مانند کولیسین A1، ApoL1 یک پروتئین آمفیتروپیک است که تحت شرایط خاص می تواند غشای لیپیدی را از محلول آبی وارد کرده و سپس به عنوان یک یون پرماز عمل کند (6-9). ApoL1 نوع وحشی نوترکیب خالص شده در محلول شوینده با pH خنثی (8، 9) پایدار است. در pH پایین، ApoL1 می تواند وارد غشاهای فسفولیپیدی شود و نفوذپذیری انتخابی آنیون غشاها را افزایش دهد (6، 7، 9). هنگامی که pH سیس به حالت خنثی افزایش می یابد، نفوذپذیری انتخابی آنیون سرکوب می شود و یک کانال انتخابی کاتیونی فعال می شود (8، 9). این داده‌ها از مدلی پشتیبانی می‌کنند که در آن ApoL1، که به یک محفظه اسیدی در امتداد مسیرهای اگزوسیتی یا درون‌سیتی ارائه می‌شود، می‌تواند به غشای محدود کننده ارگانل وارد شود که منجر به افزایش نفوذپذیری آنیون می‌شود. قاچاق بعدی پروتئین به بخش های غشایی دیگر که در آن pH سیس خنثی است (مانند غشای پلاسما یا غشای میتوکندری) نفوذپذیری آنیون را سرکوب کرده و کاتیون پرماز را فعال می کند. آیا این فعالیت‌های یون پرماز نقشی در پاتوژنز ApoL مرتبط دارند یا خیرکلیهبیماری هانامشخص است

ما از روش‌های مبتنی بر وزیکول برای سنجش تفاوت‌های فعالیت‌های یون پرماز و اتصال غشایی بین توالی مرجع (نوع وحشی)، با نام G{1}} و انواع مرتبط با دو بیماری، با نام‌های G1 و G2 استفاده کردیم. ما دریافتیم که در مقایسه با G{5}}، هر دو ایزوفرم G1 و G2 فعالیت ویژه فعالیت پرماز کاتیونی را در pH خنثی بدون تغییر فعالیت پرماز انتخابی آنیون در pH پایین افزایش می‌دهند. علاوه بر این، ایزوفرم‌های مرتبط با بیماری G1 و G2 در مقایسه با G{12}} در شرایطی که از فعالیت کاتیون پرماز پشتیبانی می‌کنند، اما در شرایطی که از فعالیت آنیون پرماز پشتیبانی می‌کنند، افزایش یافته است. ما هیچ تأثیری بر روی الگوی حساسیت pH مرحله اتصال یا گام خروجی فعالیت کانال کاتیونی پیدا نکردیم، و هیچ تأثیری بر روی حساسیت pH فعالیت پرماز انتخابی آنیون نمی‌یابیم. نتیجه می گیریم که گونه های مرتبط با بیماری ApoL1 به طور انتخابی فعالیت کانال کاتیونی پروتئین را افزایش می دهند، احتمالاً حداقل تا حدی با افزایش درج غشاء. ما پیشنهاد می کنیم که این فعالیت کانال افزایش یافته به پیشرفت کمک کندکلیهمرضدر افراد حامل ژنوتیپ های پرخطر.

سیستانچ می تواند درمان کندبیماری کلیوی

نتایج

ایزوفرم های نوترکیب ApoL1 با توالی سیگنال ترمینال N حذف و با برچسب اپی توپ 6His/T7 بیان و خالص شدند. هر سه خواص کروماتوگرافی یکسانی را از طریق خالص سازی نشان دادند و با الکتروفورز ژل قابل تشخیص نبودند شکل 1.

فراکسیون های پیک به ug/ml 100 رقیق شدند و برای توانایی اعطای نفوذپذیری کلرید و پتاسیم، آزمایش های خروجی tovesicle را انجام دادند. آزمایش شامل دو مرحله جداگانه است. در مرحله پیوند، ApoL1 با وزیکول‌های فسفولیپیدی حاوی KCl مخلوط شده و اجازه داده می‌شود تا به غشاها وارد شود. سپس KCl و بافر خارج از مخزن با عبور از ستون چرخش نمک‌زدایی متعادل شده در ساکارز ایزوتونیک حذف می‌شوند و شیب‌های بزرگی از داخل به خارج هر دو ایجاد می‌کنند. یون های کلر در مرحله خروجی، مایع شستشوی ستون اسپین به یک محلول ساکارز بافر ایزوتونیک رقیق می شود که گرادیان KCl را در pH مورد نظر حفظ می کند. غلظت کلر خارج از مخزن با یک الکترود انتخابی کلرید کنترل می شود. حتی اگر نفوذپذیری انتخابی K یا کلر وجود داشته باشد، هیچ یونی نمی تواند از وزیکول ها خارج شود به دلیل عدم حرکت یون ضد. جریان یون ولتاژ محور با افزودن غلظت اشباع یک یونوفور ضد یون آغاز می شود. افزودن یونوفور انتخابی K، والینومایسین (Val)، پتانسیل غشای منفی داخلی بزرگی را القا می کند که اگر نفوذپذیری کلر وجود داشته باشد، جریان KCl را هدایت می کند که توسط الکترود انتخابی کلرید شناسایی می شود. بنابراین پس از Val، میزان جریان کلر منعکس کننده نفوذپذیری کلر است. برعکس، افزودن یونوفور کلر انتخابی، کلرید یونوفور 1 (CI1)، پتانسیل غشایی مثبت درونی را القا می کند که در صورت وجود نفوذپذیری K، جریان KCl را تحریک می کند. از این رو، پس از افزودن CI1، میزان جریان کلر منعکس کننده نفوذپذیری K است. بنابراین، این سنجش بسته به اینکه کدام یونوفور استفاده می شود، می تواند به عنوان یک سنجش نفوذپذیری کلر یا K عمل کند. سرعت اولیه جریان یون پس از افزودن یونوفور به عنوان نفوذپذیری اختصاصی وزیکول ها در نظر گرفته می شود. توجه داشته باشید، جریان کلر قبل از افزودن یونوفور نشان دهنده مقداری نفوذپذیری به هر دو کلر Kand است. حتی در این شرایط، نرخ خروج کلر پس از افزودن بیش از حد یونوفور ضد یون، نشان دهنده نفوذپذیری به یون مورد نظر - کلر پس از افزودن Val، و K پس از افزودن CI1 است.

سیستانچ می تواند درمان کندبیماری کلیوی

فعالیت کلرید پرماز

مطالعات قبلی ما نشان داد که نفوذپذیری آنیون زمانی که هر دو مرحله پیوند غشاء و مرحله جریان در pH 5 انجام می‌شوند، بیشترین است.{1}} و این شرایط برای مقایسه فعالیت نفوذپذیری کلر در سه ایزوفرم، با استفاده از Val برای شروع استفاده شد. جریان وابسته به نفوذپذیری کلر نمونه هایی از داده های خام در شکل 2A نشان داده شده است که خروجی از الکترود انتخابی کلر را بر حسب میلی ولت رسم شده در مقابل زمان نشان می دهد. ضبط قبل از افزودن محلول اسپینکلون حاوی وزیکول و پروتئین آغاز می‌شود، مقدار mV غلظت 10 میکرومولار کلر را منعکس می‌کند. شستشوی ستون چرخش بدون کلر در فلش اول اضافه می شود و کلر را رقیق می کند که در انحراف به سمت بالا ردیابی mV منعکس می شود. Val در فلش دوم اضافه می شود و در صورت وجود نفوذپذیری کلر، جریان کلر را تحریک می کند که با افت تدریجی inmV منعکس می شود. تریتون X{7}} در فلش سوم اضافه می شود و کلرید داخل مثانه باقی مانده را آزاد می کند. پس از تبدیل از غلظت mV به کلرید با استفاده از یک منحنی استاندارد تولید شده برای الکترود در شرایط سنجش، نرخ کسری اولیه انتشار کلر پس از افزودن Val تعیین می شود و به عنوان نفوذپذیری کلرید در نظر گرفته می شود. در مقایسه با کنترل بدون پروتئین (ردیابی آبی)، نرخ بالای آزادسازی کلر پس از افزودن Val نشان می‌دهد که ApoL1 نفوذپذیری قابل‌توجهی به کلر می‌دهد که در بین سه ایزوفرم (ردیابی قرمز، سبز و زرد) قابل مقایسه به نظر می‌رسد. نرخ بسیار کم خروج قبل از Val نشان می دهد که نفوذپذیری پتاسیم بسیار کمتر از نفوذپذیری کلر است. طیف وسیعی از غلظت های ایزوفرم ApoL1 برای نفوذپذیری کلر مورد سنجش قرار گرفت (شکل 2B). همانطور که قبلا برای G0 گزارش شد، متوجه شدیم که فعالیت Clpermease به طور خطی با جرم پروتئین در سنجش برای هر سه ایزوفرم مرتبط است. فعالیت پرماز در هر غلظت در بین سه ایزوفرم تفاوتی ندارد. منحنی غلظت دو بار با استفاده از دو مجموعه مختلف از آماده سازی پروتئین انجام شد که نتیجه یکسانی را به همراه داشت.

شش آماده سازی مستقل از سه پروتئین برای فعالیت کلر پرماز در pH 5 مورد سنجش قرار گرفتند.{1}} همانطور که در شکل 2C خلاصه شده است. در هیچ یک از مجموعه‌های آماده‌سازی، تفاوت معنی‌داری در فعالیت پرماز کلر در بین ایزوفرم‌ها پیدا نکردیم (p > 0.05 برای مقایسه G0 با G1 یا G2 در هر مجموعه) . متوسط ​​نرخ جریان هر شش آماده سازی (برچسب شده ALL در شکل 2C) 1.21 ± 0.32 درصد در ثانیه برای توالی مرجع G0، 1.36 ± 0}.41 درصد / ثانیه بود. برای G1، و 1.18 ± 0.34 برای G2 (میانگین ± SD، n=6 برای هر کدام؛ p=0.47 و 0.94 برای مقایسه G0 با G1 و G2 به ترتیب). برای تعیین اینکه آیا جهش‌های مرتبط با بیماری حساسیت pH آنیون پرماز را تغییر می‌دهند یا خیر، نفوذپذیری کلر اعطا شده توسط هر ایزوفرم از طریق طیف وسیعی از مقادیر pH، با استفاده از pH نشان‌داده‌شده برای هر دو مرحله ارتباط و جریان سنجش (شکل 2D) مورد سنجش قرار گرفت. تفاوت معنی داری بین ایزوفرم ها این آزمایش دو بار با استفاده از دو مجموعه مختلف آماده سازی پروتئینی انجام شد که نتیجه یکسانی داشت. بنابراین، فعالیت Clpermease بین انواع مرتبط با دو بیماری و دنباله مرجع تفاوت معنی‌داری ندارد.

فعالیت پتاسیم پرمئاز

مطالعات قبلی ما نشان داد که نفوذپذیری کاتیون زمانی که مرحله تداعی غشاء در pH 6 انجام می‌شود، بیشترین است.{1}} و مرحله خروجی در pH 7.5 انجام می‌شود، و ما از این شرایط استفاده می‌کنیم مگر اینکه خلاف آن مشخص شود. نمونه‌هایی از داده‌های خام از سنجش K permease در شکل 3 نشان داده شده است. همانطور که با سنجش نفوذپذیری کلر، محلول شستشوی ستون چرخشی در فلش اول اضافه می‌شود، یونوفور (در این مورد، کلرید یونوفور 1، CI1) در فلش دوم اضافه می‌شود، و مواد شوینده در فلش سوم اضافه می شود. نرخ‌های اولیه جریان پس از افزودن آیونوفور، که نشان‌دهنده نفوذپذیری K است، با خطوط تیره خاکستری نشان داده می‌شود. ردیابی آبی از کنترل بدون پروتئین است که نفوذپذیری پس‌زمینه درون‌زای وزیکول‌ها را به تنهایی نشان می‌دهد. ردیابی قرمز فعالیت گونه G0(نوع وحشی) را نشان می‌دهد، که به وضوح وجود نفوذپذیری K بیشتر از وزیکول‌های کنترل ارائه شده توسط پروتئین را همانطور که قبلاً گزارش شده نشان می‌دهد (9). رنگ زرد و سبز به ترتیب فعالیت انواع G1 و G2 را نشان می دهد. شیب های اولیه پس از افزودن یونوفور به وضوح برای G1 و G2 بیشتر از G0 است، که نشان می‌دهد واریانت‌های مرتبط با بیماری از فعالیت K permease بیشتری نسبت به G{15}} پشتیبانی می‌کنند.

بر خلاف سنجش نفوذپذیری کلر، و همانطور که قبلاً برای ایزوفرم G{0}} (9) گزارش شده است، تحت شرایط سنجش K permease، مقداری جریان قبل از یونوفور در وزیکول های حاوی هر یک از سه ایزوفرم وجود دارد که با شیب رو به پایین نشان داده می شود. از موارد ضبط شده پس از افزودن نمونه و قبل از افزودن یونوفور. در حالی که نرخ بالای جریان پس از افزودن یونوفور نشان‌دهنده وجود نفوذپذیری قابل‌توجه K است، جریان قبل از یونوفور نیز نشان‌دهنده وجود مقداری نفوذپذیری کلر است که به هر دو یون اجازه می‌دهد در غیاب یونوفور از وزیکول‌ها نشت کنند. این احتمالاً باعث افزایش بی‌حجم در خروجی الکترود بلافاصله پس از افزودن مایع شستشوی ستون اسپین و شیب رو به پایین متعاقب آن قبل از CI1 می‌شود که با همه ضبط‌های حاوی ApoL1 دیده می‌شود. با فرض اینکه این نشت با عبور نمونه از ستون چرخش شروع می شود، همچنین تفاوت در غلظت نهایی کلر پس از افزودن مواد شوینده را نیز به حساب می آورد، زیرا هر گونه از دست دادن KCl در ستون چرخش به معنای کل KCl کمتری است که به سنجش اضافه می شود. تفسیر کمی نرخ یونوفور ساده نیست، زیرا باید تابعی از نفوذپذیری به هر دو کلر Kand باشد. مانند قبل (9)، ما این فعالیت را به فعالیت پرماز کلرید باقیمانده که در pH 7.5 می بینیم مانند شکل 2D نسبت می دهیم (همچنین برونو و همکاران (9)، شکل 4D را ببینید.

سنجش‌های پتاسیم پرماز در محدوده‌ای از غلظت‌های پروتئین انجام شد (شکل 4A). فعالیت به طور خطی با جرم پروتئین در سنجش برای هر ایزوفرم مرتبط بود، اما دو ایزوفرم مرتبط با بیماری در مقایسه با G{2}} به طور قابل‌توجهی فعالیت خروجی را افزایش دادند. این منحنی غلظت با سه مجموعه جداگانه از آماده سازی پروتئین تولید شد که نتایج بسیار مشابهی را به همراه داشت.

شش آماده سازی مستقل از سه ایزوفرم برای فعالیت جریان K با استفاده از 2 میکروگرم پروتئین در هر روش مورد سنجش قرار گرفت. در هر یک از شش مجموعه، فعالیت برای ایزوفرم های G1 و G2 به طور قابل توجهی بیشتر از G0 بود (شکل 4B). میانگین هر شش مجموعه داده نرخ جریان 0.349 ± 0 را به همراه داشت.063 درصد /s برای G{{10}}، {{15} }.709 ± 0.176 درصد / ثانیه برای G1، و 0.673 ± 0.142 درصد / ثانیه برای G2 (میانگین ± SD، n=6 برای هر کدام؛ p <0.00001 برای="" مقایسه="" g0="" با="" g1="" یا="" g2).="" فعالیت‌های="" خاص="" k="" permease="" g1="" و="" g2="" به‌ترتیب="" 2.{29}}="" و="" 1.{31}}برابر="" g0="" با="" این="" سنجش="" بیشتر="">

وابستگی فعالیت K permease به pH مرحله تداعی غشاء و مرحله خروج یون به طور جداگانه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. اگرچه ما تأیید کردیم که فعالیت جریان کل G1 و G2 بیشتر از G0 در شرایط "استاندارد" است (اتصال در pH 6، جریان در pH 7.5)، تفاوت قابل توجهی در شکل منحنی پیدا نکردیم. فعالیت در مقابل pH خارجی (cis) مرحله پیوند غشاء (شکل 4C) یا مرحله خروج یون (شکل 4D). ما همچنین هیچ تفاوتی بین ایزوفرم ها در وابستگی فعالیت به pH داخل وزیکولار (ترانس) بالا یا لزوم وجود کاتیون دو ظرفیتی (شکل 4E) پیدا نکردیم، و همچنین توجه داشته باشید که کلسیم یا منیزیم به همان اندازه در تهیه کاتیون دو ظرفیتی لازم برای کامل کارآمد هستند. فعالیت. هر یک از این آزمایش‌ها دو بار با استفاده از مجموعه‌های مختلف پروتئین خالص انجام شد که نتایج یکسانی را به همراه داشت.

ارتباط غشایی پایدار

ما قبلاً نشان داده‌ایم که ApoL1 نوترکیب خالص شده به طور خود به خود به غشای فسفولیپیدی متصل می‌شود که وابستگی مشابهی به pH و ترکیب فسفولیپیدی مانند فعالیت‌های یون پرماز نشان می‌دهد (9). با استفاده از روش‌های مشابه، ویژگی‌های اتصال وزیکول لیپیدی نسخه مرجع ApoL1 را با انواع مرتبط با بیماری کلیوی تحت شرایطی که از فعالیت‌های بهینه کلر یا K پرماز پشتیبانی می‌کنند، مقایسه کردیم (شکل 5). برای شرایط Clpermease، پروتئین با وزیکول‌های لیپیدی pH 5 انکوبه شد.{6}} قبل از استخراج آشوب‌گرد برای حذف پروتئین‌هایی که به طور پایدار با وزیکول‌ها مرتبط نبودند، انکوبه شد. پروتئین متصل به غشاء توسط فلوتاسیون از طریق ساکاروسکوشیون جدا شد و با وسترن بلات کمی ارزیابی شد. نتایج در شکل 5 الف نشان داده شده است. تفاوت معنی داری در میزان پروتئین متصل به وزیکول بین G{{{{{0}} و ایزوفرم G1 یا G2 وجود نداشت. از 5{26}}0 نانوگرم پروتئین در هر واکنش، مقدار متصل به وزیکول برای G0,239 ± 38 نانوگرم برای G1 33 ± 223 نانوگرم و برای G2 28 ± 191 نانوگرم (میانگین ± انحراف معیار) بود. ؛ n=8 برای هر گروه، p=0.35 و 0.076 برای مقایسه G0 با G1 و G2، به ترتیب). تقریباً 40 تا 50 درصد از پروتئین در سنجش تحت این شرایط به غشاها متصل می شود. این آزمایش دو بار انجام شد و نتایج بسیار مشابهی را به همراه داشت.

برای ارزیابی اتصال تحت شرایط بهینه برای فعالیت Kpermease، پروتئین با وزیکول‌ها در pH 6 انکوبه شد.{1}} سپس قبل از استخراج آشوب‌گردان به pH 7.5 منتقل شد تا پروتئین غیرپایدار درج شده حذف شود. پروتئین متصل به غشاء با شناورسازی وزیکول های غشایی از طریق بالشتک آسوکروز جدا شد و با وسترن بلاتینگ کمی ارزیابی شد. نتایج در شکل 5B نشان داده شده است. واریانت‌های مرتبط با بیماری در مقایسه با G{8}} اتصال مؤثرتری را نشان می‌دهند. از 5{15}}0 نانوگرم پروتئین اضافه شده به هر واکنش، مقدار متصل به وزیکول‌ها 43.5 ± 14.5 نانوگرم (n=8) برای G{{30}} بود. 73.0 ± 17.7 نانوگرم (n=7) برای G1، و 69.3 ± 10.3 نانوگرم (n=8) برای G2 (میانگین ± SD؛ p=0.00076 و 0.0018 برای مقایسه G0 با G1 و G2 به ترتیب). تقریباً 9 درصد از پروتئین G0 در واکنش به طور پایدار با وزیکول ها در مقایسه با تقریباً 14 درصد از G1 و G2 در این شرایط مرتبط بود. این آزمایش دو بار با استفاده از آماده سازی مستقل انجام شد که نتایج مشابهی را به همراه داشت.

بحث

ما در اینجا نتایج مطالعات مربوط به فعالیت یون پرماز ApoL1 و آن را ارائه می دهیمکلیه-مرضانواع مرتبط که چندین نتیجه قابل توجه به همراه داشت. اول، متوجه شدیم که انواع مرتبط با بیماری ApoL1 به طور قابل ملاحظه ای فعالیت Kpermease را افزایش داده اند، که تقریباً دو برابر ایزوفرم G0 در سنجش ما است. دوم، بر خلاف Kpermease، تفاوت معنی داری در ویژگی فعالیت کلر پرماز در pH 5 وجود ندارد.{5}} در بین ایزوفرم ها. سوم، هیچ تفاوتی در حساسیت pH فعالیت‌های پرماز K یا Cl، یا نیاز به pH ترانس بالا و لزوم کاتیون دو ظرفیتی برای فعالیت Kpermease در بین ایزوفرم‌ها وجود ندارد. چهارم، تحت شرایط بهینه حمایت از K permease، متغیرهای مرتبط با بیماری در مقایسه با G{7}} ارتباط غشایی پایدار را نشان می‌دهند، اما هیچ تفاوتی در ارتباط غشایی تحت شرایط بهینه برای فعالیت کلر پرماز نشان نمی‌دهند.

یافته‌های ما نشان‌دهنده افزایش پرماز پتاسیم با بی‌اثری بر پرماز کلر، بسیار قوی هستند. با استفاده از شرایط بهینه برای هر فعالیت پرماز، نتایج اساساً یکسانی را در بین شش مجموعه آماده سازی مستقل یافتیم، با فعالیت Kpermease انواع مرتبط با بیماری به طور قابل توجهی بیشتر از G0 در هر کدام. هر مجموعه تهیه شد و همزمان با استفاده از معرف‌های رایج مورد سنجش قرار گرفت. اعتبار غلظت پروتئین تعیین شده توسط سنجش BCA با شدت قابل مقایسه رنگ آمیزی Coomassie در SDS-PAGE تایید شد. این داده‌ها شامل تمام تلاش‌های موفقیت‌آمیز در تصفیه همزمان می‌شود - ما هرگز با موفقیت دارایی از هر سه نوع را که در آن این فعالیت‌های نسبی مشاهده نشد، تولید نکردیم.

به همین ترتیب، عدم وجود تفاوت در فعالیت خاص آنیون-پرماز در pH 5 در بین تمام مجموعه های آماده سازی سازگار بود. بنابراین نتیجه گیری اولیه ما این است که گونه های مرتبط با بیماری ApoL1 افزایش عملکرد انتخابی را در فعالیت پرماز K بدون تأثیر بر نفوذپذیری کلر، همانطور که در شرایط بهینه برای هر یک از این فعالیت ها مورد سنجش قرار می گیرد، ایجاد می کنند. وجود تفاوت‌های اساسی در فعالیت کانال کاتیونی انواع ApoL1 که با ظرفیت هدایت بیماری مرتبط است، پیامدهایی برای مکانیسم‌های بیماری‌زای احتمالی دارد. ماهیت انتخابی افزایش نفوذپذیری یونی نشان می‌دهد که افزایش فعالیت پرماز کاتیونی انواع مرتبط با بیماری می‌تواند به بیماری کمک کند، اما فعالیت آنیون پرماز در pH پایین، که بین ایزوفرم‌ها متفاوت نیست، بعید است که نقش مهمی ایفا کند.

بررسی اثرات انواع بر روی حساسیت pH فعالیت ها و میزان اتصال غشایی پایدار توسط پروتئین، مکانیسمی را که توسط آن فعالیت K permease ممکن است افزایش یابد روشن می کند. اولاً، به غیر از تأیید فعالیت افزایش‌یافته K permease در شرایط بهینه، ما هیچ تفاوتی در شکل منحنی‌ها پیدا نکردیم که اثرات pH را بر روی پیوند غشاء و مراحل خروجی فعالیت K permease یا تأثیر pH بر فعالیت کلی کلر پرماز نشان می‌دهد. علاوه بر این، هیچ تفاوتی در نیاز به pH بالا در قسمت داخلی وزیکول ها یا نیاز به حضور کاتیون دو ظرفیتی در واکنش برای فعالیت K permease در بین همه ایزوفرم ها وجود نداشت. بنابراین ما هیچ مدرکی برای تفاوت در خواص ذاتی خود کانال نیافتیم. در مقابل، متغیرها ارتباط پایدار قابل توجهی با وزیکول‌های فسفولیپید را تحت شرایطی نشان دادند که از فعالیت Kpermease پشتیبانی می‌کنند، با مقیاس این اثر تقریباً همان محدوده غیرفعال بودن تغییر است. در مجموع، داده‌ها نشان می‌دهند که مبنای افزایش فعالیت K permease صرفاً درج کارآمدتر غشاء تحت شرایط حمایت کننده از فعالیت است، بدون نیاز به فراخوانی تغییر اساسی در خواص پروتئین وارد شده.

سه دامنه در ساختار ApoL1 شناسایی شده است (6). تصور می شود که فعالیت کانال یونی در حوزه همولوگ کولیسین "تشکیل دهنده منافذ" قرار دارد که حدود 60 درصد پروتئین را در انتهای N آن اشغال می کند. تغییرات توالی مرتبط با بیماری در حوزه تشکیل منافذ نیست، بلکه در فاصله ای از آن در یک دامنه سیم پیچی است که حدود 16 درصد از پروتئین را در انتهای C تشکیل می دهد. حذف این دامنه هیچ تأثیری بر فعالیت تریپانولیتیک ندارد، اما در بین ایزوفرم‌های آپول هم در درون و هم بین گونه‌ها بسیار محافظت می‌شود (10). پیشنهاد شده است که این منطقه به عنوان دامنه کنترل شده عمل می کند (10)، و داده های ما نشان می دهد که جهش یافته های بیماری زا در این حوزه در واقع در شرایطی که از فعالیت کانال کاتیونی پشتیبانی می کند و فعالیت کانال کاتیونی را افزایش می دهد، پیوند غشا را افزایش می دهد. یک تفسیر این است که دامنه C ترمینال برای سرکوب پیوند غشایی / درج لازم برای فعالیت کاتیون پرماز عمل می کند، و جهش این دامنه این سرکوب را آرام می کند.

سیستانچ می تواند درمان کندکلیهمرض

مشاهدات مربوط به اتصال غشا پیامدهای بیشتری دارد و برخی از جنبه های رابطه بین فعالیت های آنیون و کاتیون پرماز را روشن می کند. ما در اینجا دریافتیم که پروتئین به طور قابل ملاحظه‌ای بیشتری به شرایط فعالیت آنیون پرماز آتوپتیمال غشا (PH 5.{1}}) نسبت به شرایط اتصال اولیه که از فعالیت کاتیون پرماز پشتیبانی می‌کنند (PH 6.{3}}) متصل می‌شود و این برای همه صادق است. ایزوفرم ها (شکل 5). به تفاوت در حساسیت pH فعالیت آنیون پرماز (شکل 2D) و مرحله اتصال غشایی فعالیت کاتیون پرماز (شکل 4C) توجه کنید: آنیون پرماز به طور چشمگیری کمتر از pH 6 افزایش می یابد، در حالی که توانایی پروتئین وارد شده به غشاء برای حمایت از کاتیون می شود. فعالیت permease به طور قابل توجهی کاهش می یابد. داده‌های گزارش‌شده قبلی ما نشان داد که ارتباط غشایی پایدار G0 به طور قابل‌توجهی با کاهش pH از همان محدوده pH افزایش می‌یابد، و این محدوده‌ای است که فلورسانس پروتئین ذاتی به‌طور چشمگیری سرکوب می‌شود (9)، که نشان‌دهنده یک انتقال قابل توجه در ساختار پروتئین است. . در مجموع داده‌ها نشان می‌دهند که درج غشا در pH 6.{12}} اساساً با وارد کردن غشاء در pH 5 تفاوت دارد.{14}}. در pH 6.{16}}، بخش کوچک‌تری از پروتئین‌ها با غشاها مرتبط می‌شوند، که تنها با یک تغییر جزئی در فلورسانس ذاتی و نفوذپذیری محدود آنیون همراه است، اما با ظرفیت انتقال به شکل کاتیون‌نفوذ هنگامی که محفظه cis به pH7 تیتر می‌شود. .5. علاوه بر این، کارایی این اتصال برای انواع مرتبط با بیماری بیشتر است و به موازات افزایش فعالیت کاتیون پرماز پس از تغییر pH است. در مقابل، در pH 5.{21}} بخش بسیار بزرگتری از پروتئین با غشاها مرتبط است؛ این اتصال با تغییر زیادی در فلورسانس درونی و ظهور فعالیت آنیونپرماز بسیار بیشتر همراه است. نه اتصال غشایی و نه فعالیت آنیونپرماز در بین ایزوفرم ها متفاوت است. ظرفیت این پروتئین وارد شده برای انتقال به تایید نفوذ کاتیونی تا حد زیادی کاهش می یابد. ما فرض می‌کنیم که تغییر قبلاً گزارش‌شده در فلورسانس ذاتی با کاهش pH از 6 به 5، منعکس‌کننده یک تبدیل ساختاری به شکلی است که قادر به انتقال به ساختار نفوذ کاتیونی نیست، و تفاوت‌های بین ایزوفرم‌ها تأثیری بر ویژگی‌های نفوذ یونی این ترکیب ندارد.

یک مشاهدات جدید دیگر این است که یون های کلسیم و منیزیم به همان اندازه در حمایت از فعالیت کانال کاتیونی ApoL1 موثر هستند. این قویاً نشان می‌دهد که نقش کاتیون دو ظرفیتی از طریق پیوند با میل ترکیبی بالا توسط پروتئین نیست، بلکه به احتمال زیاد یک اثر پل زدن بار ویژه کمتر است که اجازه می‌دهد پروتئین با بار منفی با سطح بار منفی غشاهای فسفولیپیدی تعامل داشته باشد.

تحقیقات دیگری برای ارزیابی تفاوت در فعالیت کانال یونی ایزوفرم های ApoL1 منتشر شده است. تامپسون و فینکلشتاین (8) از روش‌های الکتروفیزیولوژیک با تکنیک‌های دولایه لیپیدی مسطح برای ارزیابی فعالیت کانال ApoL1 نوترکیب خالص‌شده استفاده کردند و هیچ تفاوتی در ویژگی‌های کانال بین ایزوفرم‌ها گزارش نکردند. توجه به این نکته مهم است که روش‌های دولایه لیپیدی مسطح و سنجش جریان جریان مبتنی بر وزیکول، در حالی که هر دو سنجش کانالی هستند، انواع مختلفی از اطلاعات را ارائه می‌دهند و می‌توان آنها را به عنوان سیستم‌های تجربی مکمل در نظر گرفت. روش‌های دولایه لیپیدی یک رویکرد بی‌نظیر برای تعریف ویژگی‌های تک کاناله پروتئین خالص هستند، اما ابزارهای قدرتمند کمتری برای تعیین کمیت فعالیت خاص هستند، در حالی که سنجش‌های جریان وزیکول می‌توانند داده‌های کمی در مورد فعالیت یک جمعیت ارائه دهند، اما اطلاعات کمی در مورد ویژگی‌های تک کانالی ارائه می‌دهند. بنابراین، مشاهدات پسر تامپ و فینکلشتاین با مشاهدات ما ناسازگار نیست، که همچنین هیچ تفاوت ظاهری را در ویژگی‌های ذاتی کانال نشان نمی‌دهد، بلکه تنها تفاوتی در فعالیت خاص حدود دو برابر دارد، مقیاسی از تفاوت که بسیار دشوار است. شناسایی در سیستم های دولایه لیپیدی

تحقیقات با استفاده از پروتئین و لیپیدهای خالص شده دارای خواص آشکاری است که به وضوح ناشی از خود پروتئین است و توسط هیچ جزء دیگر، سینتیک بیان یا قاچاق غشایی که سیستم های پیچیده تری را به خطر می اندازد تغییر نمی کند. با این حال، آنها لزوماً در مورد تأثیر نهایی این فعالیت ها بر سلول های زنده سکوت می کنند. مطالعاتی با استفاده از سیستم‌های بیانی مبتنی بر سلول برای از بین بردن فعالیت‌های کانال یونی ApoL1 گزارش شده است (در فریدمن و پولاک، 2{9}}19 (3) بررسی شده است). اولابیسی و همکاران (11) ایزوفرم های ApoL1 را در سلول های HEK بیان کردند و غلظت پتاسیم درون سلولی را در حالت پایدار ارزیابی کردند. آنها پتاسیم داخل سلولی کمتری را در سلول‌هایی که G1 و G2 بیان می‌کنند در مقایسه با سلول‌هایی که G0 را بیان می‌کنند، یافتند. در حالی که این مشاهدات می‌تواند با افزایش نفوذپذیری K پلاسماغشایی سازگار باشد، پتاسیم درون سلولی پایین‌تر نیز می‌تواند یک پیامد غیر اختصاصی اثر سیتوتوکسیک بیشتر نوع از طریق هر مکانیسمی باشد که منجر به فعالیت کمتر فعال NaK ATPase و/یا تجزیه یکپارچگی غشای پلاسما می‌شود. اوتول و همکاران (12) به دقت سطوح بیان را در سلول های HEK کالیبره کرد و ظاهر فعالیت کانال کاتیونی غشای پلاسما را ارزیابی کرد و تفاوت بین ایزوفرم ها را پیدا کرد. شاه و همکاران (13) هدف قرار دادن ApoL1 به میتوکندری را گزارش کرد که در آن واریانت های مرتبط با بیماری باعث باز شدن منافذ انتقال نفوذپذیری میتوکندری می شود، مطابق با شواهد اخیر برای سمیت سلولی تریپانوزوم. اینکه آیا این اثر به فعالیت کانال یونی ApoL1 نیاز دارد یا خیر، مشخص نیست. در هر یک از این مطالعات، به دلیل پیچیدگی سیستم‌های بیان مبتنی بر سلول، نمی‌توان مطمئن بود که آیا تفاوت‌های ذکر شده به دلیل ویژگی‌های ذاتی پروتئین است یا سایر اجزای متقابل موجود در سلول‌ها.

جهش های ناشی از عملکرد بیماری زا معمولاً الگوی وراثتی غالب را نشان می دهند، در حالی کهفنوتیپ بیماری کلیویمرتبط با انواع ApoL1 مغلوب است. یک مکانیسمی که توسط آن یک جهش افزایش عملکرد ممکن است ضروری باشد، این است که پروتئین به عنوان یک هممولتیمر عمل کند، و WT بتواند یک اثر منفی غالب بر روی متغیر فعال اعمال کند. اینکه آیا ApoL1 به عنوان یک کانال به عنوان یک مونومر یک مولتیمر عمل می کند در حال حاضر ناشناخته است.

داده‌های ما نشان می‌دهد که افزایش نفوذپذیری کاتیون در سطوح مشابه بیان پروتئین می‌تواند به سمیت سلولی در پودوسیت‌ها یا سایر سلول‌ها کمک کند. با این حال، ممکن است به نظر محتمل باشد که افزایش دو برابری در فعالیت می تواند مولکول به ظاهر خوش خیم را به یک بیماری محرک تبدیل کند. با این وجود، بیماری‌های مرتبط با انواع ApoL1 به تدریج پیشرونده می‌شوند و تفاوت‌های ظریف در یک دوره زمانی طولانی (ماه‌ها تا سال‌ها) می‌تواند تأثیر تجمعی زیادی داشته باشد. سایر مکانیسم های بالقوه ApoL1action مسئولکلیهصدمهارائه شده اند و توسط شواهد (3-5، 11-16)، از جمله اثرات اناپوپتوز، اتوفاژی، عملکرد میتوکندری، قاچاق غشای داخل سلولی، و اثرات واسطه ای مولکول های سیگنال دهنده خارج سلولی، از جمله پشتیبانی می شوند. اهمیت نسبی تفاوت‌ها در فعالیت کانال ApoL1 که در اینجا توضیح داده شده است در مقابل مکانیسم‌های بالقوه عمل در بیماری رانندگی باید مشخص شود.

سیستانچ می تواند درمان کندکلیهمرض

فرایندهای تجربی

سازه های بیانی

pET-ApoWT کد کننده N ترمینال 6His و T7 با برچسب اپی توپ ApoL1 (نسخه G0) قبلا شرح داده شده بود (9). پروتئین کدگذاری شده مشابه پروتئین Genbank accession#BC143{32}}38 (هاپلوتیپ 150K, 228I, 255K) از اسید آمینه 28 تا 398 است و توالی سیگنال در اسیدهای آمینه 1-27 و با افزودن ترمینال N حذف می شود. 17}}برچسب اپی توپ H و T7 توسط پلاسمید pET28a کدگذاری شده است. پلاسمیدهایی که انواع G1 و G2 را کد می‌کنند از pET-ApoWT با جایگزینی قطعه محدود AleI به XhoI با قطعات حاوی توالی‌های متغیر، سنتز شده توسط فناوری‌های DNA یکپارچه، Coralville، IA، و هویت پلاسمیدهای حاصل که با توالی‌یابی مستقیم تأیید شد، تولید شدند. همه سه ساختار یکسان بودند به جز برای جایگزینی اسید آمینه S342G و I384M در ایزوفرم G1 و سپس حذف N{26}}Y389 در ایزوفرم G2. ایزوفرم های ApoL1 نوترکیب در باکتری بیان شده و همانطور که توضیح داده شد خالص شدند، با این تفاوت که بافر ستون S200 حاوی 0.03 درصد n دودسیل- -D-مالتوزید (DDM) (میلیپور-سیگما) بود. برای همه مجموعه‌های آزمایشی که ایزوفرم‌ها را با هم مقایسه می‌کنند، مواد به طور همزمان در شرایط یکسان با استفاده از همان معرف‌ها آماده شدند. غلظت پروتئین با کیت سنجش پروتئین BCA (Thermo Fisher Scientific) با استفاده از استاندارد آلبومین سرم گاوی تعیین شد. برای پروتئین کل مانند شکل 1، ژل ها با آبی فوری (Expedeon Inc) رنگ آمیزی شدند. پروتئین موجود در بافر S200 در نیتروژن مایع منجمد شد و در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیره شد.

یونوفورها

والینومایسین (میلیپور سیگما) در 5{5}} میلی مولار اتانول غیر مطلق حل شد و بلافاصله قبل از استفاده تا 1 میلی مولار در اتانول مطلق رقیق شد. کلرید یونوفور 1 (MilliporeSigma) در 100 میلی مولار در 1-هگزانول حل شد و بلافاصله قبل از استفاده در اتانول مطلق تا 0.2 میلی مولار رقیق شد.

وزیکول های غشایی

آسولکتین (فسفاتیدیل کولین سویا نوع II، سیگما) با وااستون استخراج شد (3{7}})، خشک شد و سپس در کلروفرم حل شد و در دمای 20- درجه سانتیگراد ذخیره شد. مقدار کمی از فسفولیپیدها در کلروفرم تحت جریان نیتروژن خشک و خشک شد در 20 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر در 200 میلی‌مولار KCl، 5 میلی‌مولار HEPES pH8.0 با پنج چرخه انجماد و ذوب و گرداب شدید. این سوسپانسیون در دمای -20 درجه نگهداری شد. برای تولید وزیکول های تک لایه ای با KCl با قطر تقریباً 200 نانومتر، سوسپانسیون لیپیدی 15 بار با استفاده از یک محفظه اکسترودر (Avanti Polar Lipids) و پروتکل ارائه شده توسط سازنده، 15 بار از فیلتر غشایی پورپلی کربنات 200 نانومتری عبور داده شد (17، 18). وزیکول های اکسترود شده روی یخ نگه داشته شدند و در عرض 24 ساعت مورد استفاده قرار گرفتند.

سنجش فعالیت

سنجش فعالیت یون پرماز با استفاده از جریان KCl ناشی از پتانسیل غشایی شناسایی شده با الکترود انتخابی کلرید همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد (9). 20 میکرولیتر ApoL1 در بافر S200 (15{{20}} mM NaCl، 10 mM Tris pH8.3، 0.3 درصد DDM) اضافه می‌شود. مخلوط واکنش به 380 ul شامل 82 میلی‌مولار KCl، 127 میلی‌مولار ساکارز، 42.1 میلی‌مولار بافر در pH نشان‌داده‌شده (MES برای pH 5-6.5، HEPES برای pH 7.0-8.0)، 2.63 میلی‌مولار گلوکونات 2، و 1.84 میلی‌گرم اکسترول اکسترول است. وزیکول ها. مخلوط در دمای اتاق به مدت 4 دقیقه قبل از عبور از یک ستون 3 میلی لیتری Bio-Gel P{29}}DG (Bio-Rad) که در 330 میلی مولار ساکارز متعادل شده است، انکوبه می شود. محلول شستشو بلافاصله به 2 میلی‌لیتر ساکارز 330 میلی‌مولار، 10-5 مولار KCl، 2.5 میلی‌مولار کلسیم (گلوکونات) 2 و بافر 10 میلی‌مولار (MES برای pH 5-6.5؛ HEPES برای pH 7-8) اضافه شد. با نظارت مستمر با یک الکترود انتخابی کلرید و همانطور که توضیح داده شد ثبت شد. پس از 20 ثانیه، جریان ولتاژ محور با افزودن یک یونوفور (2.5 ul یا 1 میلی‌مولار والینومایسین یا 0.2 میلی‌متر کلرید یونوفور 1 در اتانول) آغاز شد و اجازه داده شد تا برای 30 ادامه یابد. به دنبال آن تریتون ایکس{53}} به 0.1 درصد اضافه شد تا کلرید داخل وزیکولار باقی مانده آزاد شود. داده های خام در mV با استفاده از منحنی استاندارد تولید شده برای الکترود تحت شرایط سنجش به غلظت کلر تبدیل شد. نرخ های کسری اولیه انتشار کلرید از 3 ثانیه در طول حداکثر پاسخ فوری به افزودن یونوفور به دست آمد.

همه مقایسه‌های فعالیت با استفاده از مواد آماده‌سازی همزمان سه ایزوفرم که قبل از سنجش به پروتئین ug/ml 100 در بافر S200 رقیق شده بودند، انجام شد.

سنجش ارتباط غشایی

سنجش ارتباط غشایی به طور جداگانه در شرایط بهینه برای فعالیت پرماز کلر و فعالیت پرماز K انجام شد. برای شرایطی که از فعالیت Clpermease حمایت می کند، 5 ul از 100 ug/ml پروتئین در 1{{30}} mM Tris pH8.2، 150 mM NaCl ، 0.03 درصد DDM به 95 ul از مخلوط واکنش (ووزیکول های ایزولکتین 3.4 میلی گرم در میلی لیتر (پر شده با 200 میلی مولار KCl، 5 میلی مولار HEPES pH 8)، 20 میلی مولار MES pH 5.0، 2.5 میلی مولار کلسیم (گلوکونات) اضافه شد. 2، 100 میلی مولار KCl، 100 میلی مولار ساکارز) و در دمای اتاق به مدت 1 دقیقه انکوبه شد. نسبت پروتئین به لیپید در آزمایش 1:680 جرم/جرم است. نمونه بدون تغییر pH با افزودن 200 میکرومولار 60 میلی‌مولار MES pH 5.0، 2.5 mMCa (گلوکونات)2، 100 میلی‌مولار KCl، 100 میلی‌مولار ساکارز رقیق شد و به مدت 20 ثانیه انکوبه شد. 100 میکرولیتر اوره 8 مولار اضافه شد، مخلوط شد و سپس به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. غلظت ساکارز با افزودن 1.6 میلی لیتر ساکارز 50 درصد به 40 درصد رسید. نمونه 2 میلی لیتری زیر 1 میلی لیتر ساکارز 30 درصد در 8 میلی مولار MES pH 5.0 قرار گرفت که به نوبه خود زیر 1.7 میلی لیتر از 8 میلی مولار MES pH 5.0 بدون ساکارز قرار گرفت. شیب های تند در 200 گرم در روتور Beckman Coulter TLA به مدت 90 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. وزیکول ها از سطح مشترک ساکارز 0 تا 30 درصد جمع آوری شدند. بخش های مساوی از نمونه ها 4 برابر رقیق شده و در 100،{64}} گرم به مدت 1 ساعت سانتریفیوژ شدند. گلوله های غشایی خشک شدند، توسط SDS-PAGE جدا شدند، غشای فلوراید توپلی وینیلیدین لکه دار شد و با وسترن بلات با آنتی بادی برای اپی توپ T7 (MilliporeSigmaproduct شماره 69522-3) با تشخیص نورتابی شیمیایی با استفاده از سیستم تصویربرداری دیجیتال کاوش شدند. رقت‌های سریالی پروتئین خالص شده روی ژل گنجانده شد تا یک منحنی استاندارد مخصوص ایزوتیپ و بلات برای هر پروتئین ایجاد شود.

برای شرایطی که فعالیت K permease را پشتیبانی می‌کنند، 5 ul از 100ug/ml پروتئین در 10 میلی‌مولار Tris pH 8.2، 150 میلی‌مولار NaCl، 0.03 درصد DDM به 95 میکرولیتر از پروتئین اضافه شد. مخلوط واکنش (3.4 میکروگرم بر میلی‌لیتر ایزولکتین وزیکول‌ها (با 200 میلی‌مولار KCl، 5 میلی‌مولار HEPES pH 8)، 20 میلی‌مولار MES pH 6.0، 2.5 میلی‌مولار کلسیم (گلوکونات)2، 100 میلی‌مولار KCl، 100 میلی‌مولار ساکارز) و در دمای اتاق انکوبه شدند. دقیقه نمونه با تغییر pH به 7.5 با افزودن 200 میکرومولار 60 میلی مولار HEPES pH 8.0، 2.5 میلی مولار کلسیم (گلوکونات) 2100 میلی مولار KCl، 100 میلی مولار ساکارز رقیق شد و به مدت 20 ثانیه انکوبه شد. صد میکرولیتر 500 میلی مولار Na2CO3 اضافه شد و به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. غلظت ساکارز با افزودن 1.6 میلی لیتر ساکارز 50 درصد به 40 درصد رسید. نمونه 2 میلی لیتری زیر 1 میلی لیتر ساکارز 30 درصد در 8 میلی مولار Tris pH 8.3 قرار گرفت که به نوبه خود زیر 1.7 میلی لیتر تریس بدون ساکارز 8 میلی مولار با pH 8.3 قرار گرفت. بالشتک‌های ساکارز سانتریفیوژ شدند و نمونه‌ای جمع‌آوری و مطابق بالا پردازش شد.

آمار

اهمیت تفاوت بین جفت میانگین مجموعه های درون داده با استفاده از تحلیل واریانس (ANOVA) تعیین شد (19). پارامترهای آماری با استفاده از تابع تعبیه شده در اکسل تعیین شد. مقادیر P با استفاده از socscistatistics.com محاسبه شد. تمام نقاط داده به عنوان میانگین ± انحراف استاندارد (SD) که با تابع STDEV.S اکسل برای هر گروه منفرد از کپی ها تعیین می شود، ارائه می شوند.

در دسترس بودن داده ها همه داده های پشتیبانی کننده از این مقاله بنا به درخواست دکتر جان سی. ادواردز، john.edwards@health.slu.edu به اشتراک گذاشته می شود.

سیستانچ می تواند درمان کندکلیهمرض

قدردانیما از بخش نفرولوژی و بخش داخلی دانشگاه سنت لوئیس برای حمایت ضروری برای انجام این کار تشکر می کنیم.

مشارکت های نویسنده- JCE مطالعه را طراحی و نظارت کرد، بودجه را تأمین کرد، سنجش‌های جریان را انجام داد، داده‌ها را تفسیر کرد و مقاله را نوشت. JB پروتئین ها را خالص کرد، سنجش های ارتباط غشایی را انجام داد، داده ها را تفسیر کرد، شکل ها را آماده کرد، و مقاله را ویرایش کرد.

بودجه و اطلاعات تکمیلیاین کار توسط منابع نهادی دانشگاه سنت لوئیس و توسط مؤسسه ملی بهداشت کمک مالی R01 DK120651 به JCE تأمین شده است.

تضاد منافع-نویسندگان اعلام می‌کنند که هیچ منفعتی با محتوای این مقاله ندارند.

اختصاراتاختصارات استفاده شده عبارتند از: ApoL1، apolipoproteinL1. CI1، یونوفور کلرید 1; DDM، n-dodecyl- -D-maltoside;PVDF، polyvinylidene fluoride. SD، انحراف استاندارد؛ وال، والینومایسین.

از جانب: 'کلیه-مرضانواع مرتبط آپولیپوپروتئین L1 افزایش عملکرد در فعالیت کانال کاتیونی را نشان می دهدجاناتان برونو و جان سی. ادواردز

---جی. Biol. شیمی. (2021) 296 100238

منابع

1. Genovese, G., Friedman, DJ, Ross, MD, Lecordier, L., Uzureau, P., Freedman, BI, Bowden, DW, Langefeld, CD, Oleksyk, TK, Uscinski Knob, AL, Bernhardy, AJ, Hicks، PJ، Nelson، GW، Vanhollebeke، B.، Winkler، CA، و همکاران. (2010) ارتباط انواع تریپانولیتیک ApoL1 باکلیهمرضدر آمریکایی های آفریقایی تبار علوم 329، 841-845
2. پارسا، A.، کائو، WH، Xie، D.، Astor، BC، Li، M.، Hsu، CY، Feldman، HI، Parekh، RS، Kusek، JW، Greene، TH، Fink، JC، اندرسون , AH, Choi, MJ, Wright, JT, Jr., Lash, JP, et al. (2013) انواع خطر APOL1، نژاد و پیشرفت مزمنکلیهمرض. N. Engl. جی. مد. 369، 2183-2196
3. فریدمن، دی جی و پولاک، ام آر (2020) APOL1 وکلیهمرض: از ژنتیک تا زیست شناسی. آنو. کشیش فیزیول. 82، 323-342
4. Bruggeman, LA, O'Toole, JF, and Sedor, JR (2017) شناسایی عملکرد درون سلولی APOL1. مربا. Soc. نفرول. 28، 1008-1011
5. Kopp, JB, Roshanravan, H., and Okamoto, K. (2018) نفروپاتی های آپولیپوپروتئین L1: 2017 در بررسی. کر. نظر. نفرول. فشار خون بالا 27، 153-158
6. پرز مورگا، دی، ونهول بیکه، بی، پاتوریو هانوک، اف، نولان، دی پی، لینز، ال.، هومبل، اف، ونهام، ال.، تبابی، پی. Poelvoorde, P., Jacquet, A., Brasseur, R., and Pays, E. (2005) Apolipoprotein LI لیز تریپانوزوم را با تشکیل منافذ در غشاهای لیزوزومی ترویج می کند. علوم 309، 469-472
7. Harrington, JM, Howell, S., and Hajduk, SL (2009) نفوذپذیری غشا توسط فاکتور لیتیک تریپانوزوم، یک لیپوپروتئین با چگالی بالا انسان سیتولیتیک. جی. بیول. شیمی. 284، 13505-13512
8. Thomson, R., and Finkelstein, A. (2015) فاکتور تریپانولیتیک انسانی APOL1 کانال های انتخابی کاتیونی با pH را در لایه های دولایه لیپیدی مسطح تشکیل می دهد: ارتباط با لیز تریپانوزوم. Proc. Natl. آکادمی علمی USA 112, 2894–2899
9. Bruno, J., Pozzi, N., Oliva, J., and Edwards, JC (2017) آپولیپوپروتئین L1 نفوذپذیری یون قابل تعویض pH را به وزیکول های فسفولیپیدی می دهد. جی. بیول. شیمی. 292، 18344-18353
10. Vanhollebeke، B. و Pays، E. (2006) عملکرد آپولیپوپروتئین L. Cell Mol. زندگی علمی. 63، 1937-1944
11. اولابیسی، OA، Zhang، JY، Verplank، L.، Zahler، N.، DiBartolo، S.، سوم، Heneghan، JF، Schlondorff، JS، Suh، JH، Yan، P.، Alper، SL، Friedman، دی جی و پولاک، ام آر (2016) APOL1کلیهمرضانواع خطر با کاهش پتاسیم سلولی و القاء باعث سمیت سلولی می شوند
پروتئین کینازهای فعال شده با استرس Proc. Natl. آکادمی علمی USA 113, 830–837
12. O'Toole، JF، Schilling، W.، Kunze، D.، Madhavan، SM، Konieczkowski، M.، Gu، Y.، Luo، L.، وو، Z.، Bruggeman، LA، و Sedor، JR (2018) بیان بیش از حد ApoL1 باعث ایجاد سمیت سلولی مستقل از نوع می شود. مربا. Soc. نفرول. 29، 869–879
13. شاه، اس اس، لنون، ​​اچ، دیاس، ال.، ژانگ، جی وای، آلپر، اس ال، پولاک، ام آر، و فریدمن، دی جی (2019) APOL1کلیهانواع خطر مرگ سلولی را از طریق جابجایی میتوکندری و باز کردن منافذ انتقال نفوذپذیری میتوکندری القا می کنند. مربا. Soc. نفرول. 30، 2355-2368
14. هایک، SS، Koh، KH، Grams، ME، Wei، C.، Ko، YA، Li، J.، Samelko، B.، Lee، H.، Dande، RR، Lee، HW، Hahm، E. , Peev, V., Tracy, M., Tardi, NJ, Gupta, V., et al. (2017) یک کمپلکس سه جانبه از suPAR، انواع خطر APOL1 و اینتگرین آلفاوبتا 3 بر روی سلولهای پادوسیت واسطه مزمن است.کلیه مرض. نات. پزشکی 23، 945-953
15. Ma، L.، Chou، JW، Snipes، JA، Bharadwaj، MS، Craddock، AL، Cheng، D.، Weckerle، A.، Petrovic، S.، Hicks، PJ، Hemal، AK، Hawkins، GA، Miller, LD, Molina, AJ, Langefeld, CD, Murea, M., et al. (2017) انواع پرخطر کلیوی APOL1 باعث ایجاد اختلال در عملکرد میتوکندری می شود. مربا. Soc. نفرول. 28، 1093-1105
16. Wan, G., Zhaorigetu, S., Liu, Z., Kaini, R., Jiang, Z., and Hu, CA (2008) Apolipoprotein L1, a novel Bcl-2 homology domain {{4} }}فقط پروتئین اتصال دهنده به لیپید، باعث مرگ سلولی اتوفاژیک می شود. جی. بیول. شیمی. 283، 21540–21549
17. Hope, MJ, Bally, MB, Webb, G., and Cullis, PR (1985) تولید وزیکولهای تک لایه بزرگ با روش اکستروژن سریع: مشخصه توزیع اندازه، حجم محبوس شده و توانایی حفظ پتانسیل غشا. بیوشیم. بیوفیز. Acta 812, 55-65
18. Olson, F., Hunt, CA, Szoka, FC, Vail, WJ, and Papahadjopoulos, D. (1979) آماده سازی لیپوزوم ها با توزیع اندازه تعریف شده توسط اکستروژن از طریق غشاهای پلی کربنات. بیوشیم. بیوفیز. Acta 557, 9-23
19. آرمیتاژ، پی (1971) روشهای آماری در تحقیقات پزشکی، انتشارات علمی بلکول، آکسفورد، انگلستان