بیماری کلیه پلی‌کیستیک

ali.ma@wecistanche.com

بخش Ⅱ: ارگانوئیدهای کلیه تولید شده از سلول های پیش ساز اریتروئید بیماران مبتلا به بیماری کلیه پلی کیستیک اتوزومال غالب

روبرتا فاسیولیو، فرناندو هنریکه لوژودیس و همکاران.

زمینه:کلیهارگانوئیدها به طور گسترده از سلول‌های بنیادی القایی پرتوان (iPSCs) به‌دست آمده‌اند. با این حال، تولید موثر مدل‌های ارگانوئید کلیوی از بیماران مبتلا به پلی کیستیک اتوزومال غالب یک چالش بزرگ بوده است.کلیهبیماری (ADPKD) که هم جنین زایی و هم مکانیسم های سیستوژنز را خلاصه می کند.

برای کاهش عوارض جانبی و سودمندی برای کلیه کلیک کنید

روش‌ها: پیش‌سازهای اریتروئیدی خون (EPs) از دو ADPKD (پلی کیستیک غالب اتوزومی)کلیهبیماران بیماری) و یک اهداکننده سالم (HC) به عنوان یک کنترل مقایسه ای برای عادی سازی بسیاری از مراحل فنی برای برنامه ریزی مجدد EP ها و برای تولید ارگانوئیدها استفاده شد. EP ها توسط یک ناقل اپیزومی به iPSCs (سلول های بنیادی پرتوان القایی) مجدد برنامه ریزی شدند. به ارگانوئیدهای توبولار کلیوی تمایز داده شدند و سپس توسط فورسکولین برای ایجاد کیست تحریک شدند.

یافته‌ها: سلول‌های بنیادی پرتوان القایی شده از EPs تمام ویژگی‌های پرتوانی را نشان دادند و قادر به تمایز در هر سه لایه زاینده بودند. ارگانوئیدهای لوله‌ای 3 بعدی از سلول‌های منفرد پس از 28 روز در ماتریژل تولید شدند. HC و ADPKD (پلی کیستیک اتوزومال غالبکلیهبیماری) ارگانوئیدها خود به خود کیست تشکیل ندادند، اما با تحریک فورسکولین، ساختارهای کیست مانند در ADPKD (پلی کیستیک اتوزومی غالب) مشاهده شد.کلیهبیماری) ارگانوئیدها اما نه در ارگانوئیدهای مشتق از HC.

نتیجه گیری: یافته های این مطالعه نشان داد کهکلیهارگانوئیدها با موفقیت از سلول های EP خون ADPKD (پلی کیستیک غالب اتوزومی) تولید شدند.کلیهبیماری) بیماران و یک اهداکننده کنترل سالم. این رویکرد باید به عنوان یک ابزار قدرتمند برای جنین کمک کندکلیهمدل توسعه، که می تواند مکانیسم های پاتوفیزیولوژیکی بسیار اولیه درگیر در سیتوژنز را خلاصه کند.

برای قسمت اینجا را کلیک کنیدⅠ

بحث

در مطالعه حاضر، ما به طور مفصل روشی را برای تولید ارگانوئیدهای کلیوی از iPSCهای انسانی (سلول های بنیادی پرتوان القایی) که از سلول های پیش ساز اریتروئید خون بیماران مبتلا به ADPKD (بیماری کلیه پلی کیستیک اتوزومی غالب) به دست آمده است، شرح دادیم. بسیاری از انواع سلول های سوماتیک با موفقیت به iPSC ها (سلول های بنیادی پرتوان القایی)، از جمله سلول های خونی [Z] برنامه ریزی مجدد شده اند. در اینجا، ما ترجیح دادیم از اجداد اریتروئید خون به عنوان نوع سلول اولیه استفاده کنیم، به دلایلی مانند یکپارچگی ژنومی، حافظه اپی ژنتیکی، و برنامه ریزی مجدد کارآمد [11،17،18]. بازده تبدیل اجداد اریتروئیدی به iPSCها به اندازه دو مرتبه بزرگتر (7 درصد -28 درصد) از کارآیی انواع سلول‌های خونی متمایز (0) بود.0 2 درصد -0.60 درصد )یا فیبروبلاست (0.74 درصد)[Z]. علیرغم فراوانی کم این سلول ها در خون محیطی، می توان آنها را به راحتی جدا کرد و در شرایط آزمایشگاهی گسترش داد تا تعداد کافی برای برنامه ریزی مجدد تولید شود. یکی از مهم ترین چالش ها در ایجاد iPSC های مناسب، تنوع ژنوتیپ و فنوتیپی آنها است [6]، اما برخی از استراتژی های فنی برای دور زدن یا کاهش چنین تنوعی پیشنهاد شده است. در آزمایش‌های حاضر، ما از یک سیستم اپیزومی غیر یکپارچه برای برنامه‌ریزی مجدد استفاده کردیم که نیازی به ادغام ژنومی برای بیان ژن‌های برنامه‌ریزی مجدد ندارد [10]، اجازه می‌دهد ایمنی کمتری داشته باشد و سلول‌های ژنتیکی پایدارتری را ارائه دهد [19،20]. علاوه بر این، همه نمونه‌ها از یک منبع مشتق شده‌اند، که به به حداقل رساندن تنوع اپی ژنتیکی [12] کمک می‌کند با این فرض که تمایز سلول شروع ممکن است بر کارایی نتایج نهایی تأثیر بگذارد. تجزیه و تحلیل نشانگرهای پرتوانی و توانایی iPSCها (سلول های بنیادی پرتوان القایی) برای تمایز به هر سه لایه زایا در کنار یکدیگر مقایسه شدند و همچنین با رده سلولی جنینی H9 مقایسه شدند که به عنوان یک کنترل مثبت استفاده شد. . همه این مقایسه ها تفاوت معنی داری را بین بیماران ADPKD (بیماری کلیه پلی کیستیک اتوزومال غالب)، HCs و سلول های H9 نشان نداد.

چندین پروتکل برای القای تمایز iPSCs (سلول های بنیادی پرتوان القایی) به ارگانوئیدهای کلیه توسعه یافته است [13،21]. بر اساس پروتکل های توصیف شده توسط کروز و همکاران. [6]، ما ساختارهایی با ویژگی های لوله های پروگزیمال، از جمله بیان NHE3 و AOP1 به دست آوردیم. علاوه بر این، ارگانوئیدها NPHS2 را بیان کردند، که نشان دهنده حضور سلول های پودوسیت مانند است.

در مقابل، AQP2 در این ارگانوئیدهای لوله ای بیان نشد. این یافته با مطالعات قبلی مطابقت دارد که به چندین محدودیت در ایجاد ساختارهای مشتق شده از جوانه حالب (UB) در شرایط آزمایشگاهی اشاره می کند، با توسعه UB که نیاز به پروتکل های خاصی دارد، زیرا پنجره زمان بندی برای افزودن القاگر خاص بسیار محدود است. 6،22،23].

در فرآیند تولید ارگانوئیدهای کلیه از iPSCs (سلول های بنیادی پرتوان القایی)، تمام جنین زایی کلیه در شرایط آزمایشگاهی خلاصه می شود، که در ابتدا شامل تشکیل کروی های حفره دار از سلول های منفرد می شود [14]. در واقع، ما متوجه شدیم که iPSCs تمایز نیافته (سلول‌های بنیادی پرتوان القایی) هم از بیماران ADPKD (بیماری کلیه پلی کیستیک غالب اتوزومی) و هم از افراد سالم، ساختارهای کروی شبیه اپی بلاست را تشکیل می‌دهند که از نظر مورفولوژیکی مشابه بودند. اگرچه تعیین توالی DNA ژن‌های PKD1 و PKD2 در مطالعه حاضر انجام نشد، یافته‌های کنونی نشان می‌دهد که نوع جهش انجام شده توسط بیماران تأثیری بر مورفوژنز اپی بلاست معمولی ندارد. هنوز مطالعات بیشتری برای ارزیابی دقیق‌تر بیان مولکول‌های محوری درگیر در این مرحله از رشد جنینی مورد نیاز است.

طبق پروتکل توسعه یافته توسط Freedman و همکاران. [14]، مشاهده کردیم که کروییدها 26 روز پس از القای تمایز به ارگانوئیدهای لوله‌ای تمایز می‌یابند، و زمان‌بندی برای بیماران ADPKD (بیماری کلیه پلی کیستیک غالب اتوزومی) و HC (شکل ③) مشابه بود. با این وجود، ما متوجه تغییراتی در مورد جدول زمانی بیان و سطوح نشانگرهای تمایز شدیم. از سوی دیگر، مورفولوژی ساختارهای لوله‌ای در بین نمونه‌های بیماران ADPKD و HC مشابه و قابل مقایسه بود. در مقابل، با استفاده از iPSCs (سلول‌های بنیادی پرتوان القایی) که از بیوپسی‌های کلیوی بیماران ADPKD (بیماری کلیه پلی کیستیک غالب اتوزومی) نشات می‌گیرند، گروه کروز و همکاران تنوع بیشتری در توانایی این سلول‌ها برای تشکیل ارگانوئیدها پیدا کردند. علاوه بر تنوع عظیم جهش‌های ذاتی این بیماری، این تفاوت‌ها در کارایی به دست آوردن ارگانوئیدها ممکن است با انواع سلول‌های ناهمگن موجود در نمونه‌های بیوپسی توضیح داده شود، برخلاف پیش‌سازهای اریتروئید، که جمعیت سلولی همگن‌تری را تشکیل می‌دهند. روی هم رفته، این نتایج نشان می‌دهد که علی‌رغم تنوع و تفاوت در کارایی کلون‌های iPSC مختلف برای تشکیل ارگانوئیدهای کلیوی، به‌دست آوردن مورد دوم از بیماران ADPKD (بیماری کلیه پلی‌کیستیک اتوزومی غالب) ممکن است یک مدل منحصر به فرد برای مطالعه اشکال متعدد تظاهرات فنوتیپی باشد. از این بیماری علاوه بر این، توجه به این نکته مهم است که اگر تنوع قابل توجهی از جهش‌ها در جمعیت مبتلا به ADPKD وجود داشته باشد، سلول‌های بنیادی پرتوان القایی خاص بیمار، که کاملاً با ایمنی سازگار هستند، ممکن است برای درمان‌های احیاکننده فردی در آینده استفاده شوند. ، علاوه بر اجازه توسعه یک مدل آزمایشگاهی برای تأیید اینکه آیا تظاهرات فنوتیپی اولیه نیز به اندازه تظاهرات بالینی متنوع هستند یا خیر.

ارگانوئیدهای تحریک نشده مشتق شده از بیماران HCor ADPKD (بیماری کلیه پلی کیستیک اتوزومال غالب) به طور خود به خود کیست تشکیل نمی دهند. مورفولوژی معمولی کیست ها و بیان نشانگرهای سیستوژنز در هیچ نمونه قابل تشخیص نبود، حتی تمایز ارگانوئیدی در کشت را تا 35 روز تکمیل کرد. ثابت شده است که تکثیر سلولی به تنهایی باعث تولید کیست نمی شود[24]. علاوه بر این، یک رویداد مستقل سوم (معروف به سومین ضربه) برای تسریع تشکیل و رشد کیست در داخل بدن مورد نیاز است [23]. برعکس، تشکیل کیست ناشی از فورسکولین در ارگانوئیدهای بیماران ADPKD اتفاق افتاد اما در بیماران HC رخ نداد. نکته قابل توجه، اگرچه وجود دارد، اما کیست‌ها با درصد پایینی در نمونه‌های ADPKD حتی در حضور فورسکولین مشاهده شدند، همانطور که فریدمن و همکاران نیز مشاهده کردند. [14] در ارگانوئیدهای تشکیل شده از مدل CRISPR/Cas9 بیماری ADPKD. برخی فرضیه ها را می توان برای توضیح فراوانی کم کیست های موجود در مدل حاضر مطرح کرد. 1) ارگانوئیدهای کشت شده در محیط تعلیق سه بعدی در مقایسه با ارگانوئیدهای چسبنده [6] کارایی سیستوژنز بسیار بالاتری را نشان دادند، که نشان می‌دهد ریزمحیط مستقیماً در سیستوژنز دخالت دارد. بخش های دیستال نفرون [23]. اگرچه همه بخش‌های نفرون می‌توانند کیست‌هایی از جمله توبول‌های پروگزیمال [25] را ایجاد کنند، ظاهراً آن‌هایی که از مجاری جمع‌آوری می‌شوند بزرگ‌تر و در تعداد بیشتری نسبت به بخش‌های دیگر هستند [26]، 3) در نهایت، اخیراً نشان داده شد که منشاء کیست‌ها ممکن است با وجود جهش های متعدد PKD1 که شدت بیماری را تعیین می کند و تشکیل کیست در مجاری جمع کننده با شدت بیماری مرتبط باشد [27، 28] مرتبط باشد.

در نتیجه، یافته‌های حاضر نشان داد که تولید ارگانوئیدهایی با ساختارهای سه‌بعدی شبیه به معماری پیش‌ساز کلیه با استفاده از iPSCs (سلول‌های بنیادی پرتوان القایی) برنامه‌ریزی‌شده مجدد از اجداد اریتروئیدی که به راحتی از ADPKD (بیماری کلیه پلی‌کیستیک اتوزومال غالب) جدا شده‌اند، امکان‌پذیر است. بیماران و اینکه این ارگانوئیدها می توانند تحت تحریک فورسکولین کیست ایجاد کنند. این روش امیدوارکننده روشی را برای افزایش درک مراحل ژنتیکی، فنوتیپی و فیزیولوژیکی بسیار اولیه در تشکیل کیست در محیط ADPKD (بیماری کلیه پلی کیستیک اتوزومال غالب) معرفی می کند.

منابع

1. Chebib FT, Torres VE: Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease: Core Curriculum 2016.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.201537PM86.07.2015.

2. WatnickTJ، Torres VE، Gandolph MA، Qian F، Onuchic LF، Klinger KW، و همکاران: جهش سوماتیک در کیست های کبدی از مدل دو ضربه ای سیستوژنز در بیماری کلیه پلی کیستیک اتوزومال غالب پشتیبانی می کند.Mol Cell,2:{{ 3}}، 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P, et al.: جهش های جسمی PKD2 در کیست های فردی کلیه و کبد از مدل سیستوژنز "دو ضربه ای" در بیماری کلیه پلی کیستیک اتوزومال غالب نوع 2 پشتیبانی می کند.JAm Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: A Critical Development switch سینتیک تشکیل کیست کلیه را پس از از دست دادن Pkd1.Nat Med, 13: 1490-1495, 2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA، Contrino L، Zhou X، Bonventre JV، Sun Y، Humphreys BD، و همکاران: آسیب کلیوی سومین ضربه ای است که باعث پیشرفت سریع بیماری کلیه پلی کیستیک بزرگسالان می شود. Hum Mol Genet, 18:2523-2531, 2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. کروز NM. Song X، Czerniecki SM، Gulieva RE، Churchill AJ، Kim YK، و همکاران: سیستوژنز ارگانوئیدی نقش حیاتی ریزمحیط را در بیماری کلیه پلی کیستیک انسان نشان می دهد. Nat Mater,16:1112-1119، 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: القای سلول های بنیادی پرتوان از کشت های فیبروبلاست. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS، Lam AQ، SundsbakJL، Latino R، Su X، Koon SJ، و همکاران: کاهش پلی سیستین مژگانی{1}} در سلول های بنیادی پرتوان القایی از بیماران کلیوی پلی کیستیک با جهش PKD1. J Am Soc Nephrol,24:1571-1586,2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: مشتق سلولهای بنیادی پرتوان القایی عاری از ژن از یک قطره خون.Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10,2016https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il, et al.: Human induced pluripotent stemcells free of vector and transgene sequences.Science, 324:797-801,2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: مرحله تمایز پتانسیل سلول های خونساز را برای برنامه ریزی مجدد به سلول های بنیادی پرتوان القایی تعیین می کند. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK، Mali P، Huang X، Ye Z، Dowey SN، Resar LM، و همکاران: اشتقاق سلولی iPS انسانی کارآمد توسط یک پلاسمید غیر یکپارچه از سلول های خونی با امضای بیان ژن و اپی ژنتیک منحصر به فرد. Cel/Res,21:518-529، 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: ارگانوئیدهای کلیه مشتق از سلول های بنیادی پرتوان: یک فناوری in vitro مانند in vivo. Eur J Pharmacol, 790:12-20، 2016 https://ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS، Brooks CR، Lam AQ، Fu H، Morizane R، Agrawal V، و همکاران: مدل سازی بیماری کلیوی با ارگانوئیدهای کلیه جهش یافته CRISPR مشتق شده از کروی های اپی بلاست پرتوان انسانی. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Paterson AD. Magistroni R. Dicks E, et al; معیارهای یکپارچه برای تشخیص اولتراسونوگرافی ADPKD (بیماری کلیه پلی کیستیک اتوزومال غالب). JAm Soc Nephrol، 20:205-212، 2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K، Ueno M، Kamiya D، Nishiyama A، Matsumura M، Wataya T و همکاران: یک مهارکننده ROCK امکان بقای سلول های بنیادی جنینی انسان را فراهم می کند. Nat Biotechnol، 25:681-686، 2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Nuclear Reprogramming and pluripotency.Nature,441:1061-1067,2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N، Ahfeldt T، Rigamonti A، UtikalJ، Cowan C، Hochedlinger K: یک سیستم با کارایی بالا برای تولید و مطالعه سلول های بنیادی پرتوان القا شده توسط انسان. سلول / سلول بنیادی. 3: 340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420