لامیوودین زوال شناختی را در موش‌های SAMP8 بهبود می‌بخشد: ادغام ارزیابی فارماکولوژیک و فارماکولوژی شبکه در Vivo

خلاصه

مهارکننده های ترانس کریپتاز معکوس مانند لامیوودین (3TC) نقش مهمی در این امر ایفا می کنندضد پیری، اما اثرات آنها بربیماری های عصبی ناشی از افزایش سنمشخص نیست، به خصوص در مورد توابعسیستم عصبی مانند شناخت. در این مطالعه، ما 3TC را به موش های مستعد پیری 8 (SAMP8) با پرفیوژن معده (100 میلی گرم بر کیلوگرم) به مدت 4 هفته تجویز کردیم. نتایج ما نشان داد که 3TC به طور قابل توجهی بهبود یافته استوضعیت پیری موش SAMP8به ویژه کاهش توانایی شناختی که توسط آزمون ماز آبی موریس ارزیابی شد. برای بررسی بیشتر مکانیسم های مولکولی ازبهبود وضعیت پیریاز موش‌های SAMP8 توسط 3TC، qPCR، و روش‌های رنگ‌آمیزی بافت برای مطالعه بافت‌های مغز (به عنوان مثال، هیپوکامپ و قشر) موش‌ها استفاده شد، در حالی که تجزیه و تحلیل فارماکولوژی شبکه برای بررسی اهداف بالقوه 3TC استفاده شد. نتایج نشان داد که سطوح mRNA ژن‌ها مربوط به عنصر پراکنده طولانی{3}}، پاسخ اینترفرون نوع 1، فنوتیپ ترشح مرتبط با پیری وبیماری آلزایمردر هیپوکامپ و قشر موش SAMP8 به دلیل افزایش یافتپیری، اما این روند تا حدی توسط 3TC معکوس شد. نتایج مطالعات بافت شناسی نشان داد که 3TC مرگ نورون های هیپوکامپ را کاهش می دهد، در حالی که نتایج تجزیه و تحلیل فارماکولوژی شبکه نشان می دهد که 3TC ممکن است تأثیر خود را از طریق مسیرهای متعدد، از جمله سیگنال دهی استروژن و PI3K/Akt و مسیرهای سیگنالینگ تعامل لیگاند-گیرنده عصبی، اعمال کند. که ما از طریق آزمایش های آزمایشگاهی تأیید کرده ایم. این یافته‌ها شواهدی برای پتانسیل درمانی 3TC در درمان بیماری‌های نورودژنراتیو ارائه می‌دهند.

کلید واژه هاسالخورده، توانایی شناختی، لامیوودین، لعنصر پراکنده-1, بیماری های عصبی

گیاهان چینی اثر سیستانچ درمهارکننده های ترانس کریپتاز معکوس بر ضد پیری

1|معرفی

تا به امروز، پیری و بیماری های عصبی، مانندآلزایمر (AD) یا بیماری پارکینسونبا افزایش سن، به دلیل تغییرات جمعیتی جهانی، همواره در حال افزایش هستند. زوال شناختی مانعی جدی برای دستیابی به زندگی طولانی و سالم است. برای دهه‌ها، تلاش‌های قابل توجهی برای جستجوی داروهایی که می‌توانند برای درمان انحطاط شناختی با افزایش سن مورد استفاده قرار گیرند، انجام شده است. در سال‌های اخیر، عنصر متلاشی طولانی مدت (L1) به عنوان یک رمان بالقوه توجه فزاینده‌ای را به خود جلب کرده است. هدف برای مطالعه پیری.4 L1 متعلق به فراوان‌ترین خانواده رتروترانسپوزون‌های تکراری غیرطولانی با 500،{10}} نسخه است که 17 درصد از ژنوم انسان را شامل می‌شود. ژن L1 شامل یک اپرون با دو قاب خواندن باز (ORF1 و ORF2) است که هر دوی آنها برای انتقال مجدد مورد نیاز هستند. لامیوودین (2'-3'-deoxy-3'-thiocytidine, 3TC).8

L1 فعال می تواند cDNA را در خارج از کروماتین سنتز کند و سپس آن را دوباره به ژنوم کاتالیز شده توسط ORF1p وارد کند، در نهایت بیان ژن های دیگر را تغییر داده و منجر به بیماری های مرتبط با بی ثباتی ژنومی می شود. از مقررات، مانند اصلاح اپی ژنتیک و تنظیم عامل محدود کننده میزبان. 11،12 انتقال L1 به طور کلی فقط در سلول‌های زایا یا سرطانی رخ می‌دهد، در حالی که مطالعات اخیر نشان داده‌اند که L1 در سیستم عصبی مرکزی یا سلول‌های پیر نیز بسیار فعال است. مکانیسم‌های عصبی اساسی L1 نامشخص است. مطالعات نشان داده‌اند که عوامل (به عنوان مثال، TREX1، RB1 و FOXA1) مربوط به مکانیسم نظارت L1 در پیری سلولی ناکارآمد هستند و منجر به فعال شدن L1 می‌شوند. TREX1 یک اگزونوکل آاز 3' است که DNAهای مهاجم خارجی را تجزیه می کند و از بین رفتن آن با تجمع cDNA L1 سیتوپلاسمی مرتبط است. نشان داده شده است که RB1 به عناصر تکراری از جمله عناصر L1 متصل می شود و هتروکروماتین شدن آنها را ترویج می کند.15 و FOXA1 در سلول های پیر13 تنظیم می شود و به ناحیه مرکزی UTR L1 5 متصل می شود. L1 فعال شده بیشتر پاسخ اینترفرون نوع I (IFN-I) را فعال می کند که از طریق cDNA رونویسی معکوس باعث التهاب می شود و فنوتیپ ترشح مرتبط با پیری (SASP) را حفظ می کند. بنابراین، به عنوان یک عامل مهم در التهاب آسپتیک ناشی از افزایش سن، L1 به عنوان یک هدف مهم برای درمان بیماری های مرتبط با افزایش سن در نظر گرفته می شود. در موش‌های مسن تحت درمان با 3TC، تجمع عوامل التهابی با مهار رونویسی خارج سلولی L1 در بافت‌های عضلانی و سایر بافت‌ها بهبود می‌یابد. اخیراً هزاران گونه از cDNA ژنومی (gencDNA) در مغز بیماران متوفی مبتلا به AD یافت شده است که ناشی از قرار دادن مجدد واریانت‌های مشخصه پیوند RNA در ژنوم است. این پدیده به عنوان یکی از علل مهم AD در نظر گرفته می‌شود. عوامل ایجاد ژنcDNA شامل رونویسی، تخریب DNA، ترانس کریپتاز معکوس و پیری است.

مطالعات نشان داده‌اند که فرآیند تشکیل ژن‌DNA با استفاده از مهارکننده‌های نوکلئوزیدی رونویسی معکوس در رده‌های سلولی تخمدان همستر چینی (CHO) با فعالیت‌های درون‌زای رونوشت معکوس مسدود می‌شود. بنابراین، ما حدس می زنیم که 3TC، به عنوان یک مهارکننده ترانس کریپتاز معکوس، ممکن است یک داروی بالقوه برای درمان اختلالات شناختی و بیماری های عصبی ناشی از افزایش سن باشد. نشان داده شد که موش‌های مستعد پیری 8 (SAMP8) به‌عنوان مدلی برای مطالعه پیری انسان و بیماری‌های مرتبط با افزایش سن، ویژگی‌های بسیاری را نشان می‌دهند که در مراحل اولیه بیماری‌های عصبی رخ می‌دهند، مانند افزایش استرس اکسیداتیو، التهاب عصبی و شناختی. بنابراین، در این مطالعه، موش‌های SAMP8 به عنوان یک مدل حیوانی ایده‌آل برای بیماری‌های نورودژنراتیو ناشی از افزایش سن انتخاب شدند. ما بر روی اثرات شناختی 3TC بر روی موش‌های پیری زودرس و مسیرهای مولکولی مرتبط با پیری تمرکز کردیم و شواهدی برای نقش مهارکننده‌های رونوشت معکوس در درمان بیماری‌های عصبی ناشی از افزایش سن ارائه کردیم. ما بیشتر از روش فارماکولوژی شبکه برای پیش‌بینی اهداف 3TC، ساخت شبکه‌ها و تجزیه و تحلیل عملکردها و مسیرهای بیولوژیکی مرتبط با 3TC استفاده کردیم.

2|بخش تجربی 2.1 |

حیوانات نر SAMP8 یک هفته‌ای و موش R1 (SAMR1) که توسط دانشگاه طب سنتی چینی تیانجین ارائه شده بود، پس از یک دوره سازگاری 1- هفته‌ای مورد استفاده قرار گرفتند. پروتکل آزمایشی حیوانی توسط کمیته اخلاق حیوانات بیمارستان استانی شاندونگ تایید شد و بر اساس راهنمای موسسه ملی بهداشت (NIH) برای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام شد. موش ها در قفس های اتوکلاو شده نگهداری شدند و به آنها غذا و آب استریل داده شد. وزن بدن موش ها هر روز ثبت می شد. نمودار جریان آزمایش های انجام شده در این مطالعه در شکل 1A آورده شده است. پس از اتمام آزمایش ها، موش ها با استنشاق دی اتیل اتر معدوم شدند.

2.2|تهیه و درمان 3TC

داروها در روز هر آزمایش تازه تهیه می شدند. 3TC خریداری شده از MCE (شانگهای، چین) در DMSO به غلظت نهایی 2 میلی مول در لیتر حل شد. سپس محلول استوک با استفاده از آب آشامیدنی با غلظت نهایی DMSO کمتر از 0.1 درصد رقیق شد. سه گروه از موش ها ایجاد شدند: یک گروه کنترل تحت درمان با محلول وسیله نقلیه (آب آشامیدنی)، یک گروه آزمایشی تحت درمان با 3TC، و گروه SAMR1 که وسیله نقلیه دریافت کردند به عنوان گروه کنترل دیگری برای پیری استفاده شد. گروه آزمایش به صورت خوراکی 3TC با دوز 100 میلی گرم بر کیلوگرم در روز دریافت کردند. همه موش ها به مدت 4 هفته با تزریق داخل معده تغذیه شدند (شکل 1B).

شکل 1 طراحی آزمایشی و اثرات 3TC بر بهبود کاهش وزن نسبی به دلیل نمرات درجه بندی پیری و پیری. (الف) نمودار جریان آزمایش‌های دارویی برای مطالعه تأثیر 3TC بر توانایی شناختی موش‌های SAMP8. (ب) ارائه شماتیک برنامه آزمایش حیوانات. (C) گردش کار مفهومی برای پیش‌بینی تعاملات دارو-هدف با استفاده از Pharmmapper که از چپ به راست، ساختار مولکولی 3TC، نمودار ساختاری 3 بعدی 3TC و مدل فارماکوفور پیش‌بینی‌شده با اتصال 3TC به گیرنده استروژن با بالاترین نرمال‌سازی را نشان می‌دهد. نمرات مناسب (د) الگوی رشد وزن بدن در هر گروه از موش ها. (E) تغییرات در نمرات درجه بندی قبل و بعد از درمان 3TC. SAMR1 plus Vehicle: 44-موش یک هفته‌ای SAMR1 به مدت 4 هفته تحت درمان با خودرو قرار گرفتند. SAMP8 plus Vehicle: 44-موش‌های هفتگی SAMP8 به مدت 4 هفته تحت درمان با خودرو قرار گرفتند. SAMP8 plus 3TC: 44-موش‌های هفتگی SAMP8 تحت درمان 3TC به مدت 4 هفته. آزمون t دانش آموز: *p < 0.05، **p < 0.01 و ***p < 0.001. ns: از نظر آماری معنادار نیست. ستاره های سیاه نشان دهنده مقایسه با گروه خودروهای SAMR1 پلاس است. ستاره های قرمز نشان دهنده مقایسه با گروه خودروهای SAMP8 پلاس است. خط آبی گروه SAMP8 پلاس 3TC را در سن 44 و 48 هفتگی نشان می دهد.

2.3|سیستم نمره دهی

درجه پیری در موش‌ها با استفاده از یک سیستم نمره‌بندی که قبلاً توضیح داده شد، ارزیابی شد. هر دسته از نمرات شامل پنج سطح است که از 0 تا 4 متغیر است که بالاترین امتیاز درجه نشان‌دهنده بالاترین درجه پیری حیوان است. . نمرات هر دسته به طور جداگانه توسط چهار آزمایشگر با تجربه که نسبت به شرایط درمان کور شده بودند، ارزیابی شد (جدول تکمیلی S1).

.2.4|تست ماز آبی موریس

مطالعات ماز آبی موریس بر اساس پروتکل موریس، شامل آزمایش جهت‌یابی جهت‌یابی و آزمایش‌های کاوشگر انجام شد. ماز آبی یک حوضچه دایره‌ای بود (به قطر 120 سانتی‌متر مجهز به سکوی به قطر 10 سانتی‌متر) و با آب در دمای 25 پر شده بود. ± 1 درجه به موش ها آموزش داده شد که ظرف یک دقیقه سکوی زیر سطح آب را پیدا کنند. اگر ماوس ظرف 60 ثانیه سکو را پیدا نمی کرد، به سمت سکو هدایت می شد و اجازه داشت 20 ثانیه در آنجا بماند. هر یک از موش ها پنج بار در روز با فاصله هر یک از یکدیگر به مدت 15 دقیقه آموزش دیدند. در هر آزمایش، موقعیت شروع متفاوت بود، به ترتیب شبه تصادفی. در روز ششم آزمایش، سکو برداشته شد و حیوان از نقطه ای روبروی ربع ماز که سکو در آن زمان تمرین قرار داشت، وارد پیچ ​​و خم آبی شد و به مدت 60 ثانیه اجازه یافت که ماز را کاوش کند. مسیر شنا و مدت زمانی که موش ها برای جستجوی ماز صرف کردند توسط دوربین فیلمبرداری ثبت شد و با استفاده از EthoVision XT (نرم افزار Noldus) آنالیز شد. هر گروه حداقل از هشت حیوان تشکیل شده بود.

2.5|استخراج RNA و PCR کمی

RNA کل از بافت هیپوکامپ و کورتیکال موش ها پس از درمان با استفاده از معرف TRIzol (Invitrogen) طبق پروتکل سازنده استخراج شد. هر نمونه RNA (1 میکروگرم) برای تولید cDNA با استفاده از کیت رونویسی معکوس cDNA (Takara) به طور معکوس رونویسی شد و سپس با استفاده از کیت TaKaRa Taq (Takara) با PCR تقویت شد. مجموعه پرایمرها در جدول تکمیلی S2 توضیح داده شده است.

2.6|آماده سازی بافت

حیوانات با دی اتیل اتر بیهوش شدند و مغز آنها پس از پرفیوژن ترانس کاردیال با سالین بافر فسفات (PBS) و محلول پارافورمالدئید 4 درصد جمع آوری شد. بافت های مغز برداشته شدند و به مدت بیش از 2 روز در پارافورمالدئید ثابت شدند. مغزهای ثابت در پارافین با بافت هیپوکامپ به ضخامت 5 میکرومتر برش داده شدند.

2.7|رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H & E).

مورفولوژی مغز با استفاده از روش‌های رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H & E) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. بخش‌های پارافینی بافت‌های هیپوکامپ موم‌زدایی و با یک گرادیان الکل از یک سری غلظت‌ها آب‌گیری شدند. رنگ‌آمیزی HE با استفاده از کیت رنگ‌آمیزی H&E (Solarbio) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. پس از غوطه ور شدن در اتانول و زایلن، مقاطع با رزین سوار شده و در زیر میکروسکوپ نوری (Olympus) مشاهده شدند.

2.8|رنگ آمیزی نیسل

از روش رنگ آمیزی Nissl (Biyuntian) برای تشخیص آسیب عصبی در بخش های بافت هیپوکامپ استفاده شد. مقاطع با رنگ‌آمیزی نیسل به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند و با اتانول 95 درصد شسته شدند. سلول های رنگ آمیزی شده شمارش و در زیر میکروسکوپ نوری (Olympus) عکسبرداری شد. سلول ها بر روی سه میدان غیرهمپوشانی تصادفی انتخاب شده در هر اسلاید بافت هیپوکامپ با شاخص بقا به عنوان تعداد نورون های بازمانده / تعداد کل نورون ها شمارش شدند.

2.9|رنگ آمیزی TUNEL

بخش هایی از بافت هیپوکامپ با محلول پروتئیناز K به مدت 15 دقیقه و سپس با مخلوط واکنش TUNEL (Beyotime) انکوبه شدند. پس از سه بار شستشو با PBS، بخش ها با محلول نصب حاوی رنگ هسته ای DAPI سوار شدند و با استفاده از یک میکروسکوپ فلورسانس معمولی یا یک میکروسکوپ فلورسانس لیزری کانفوکال مشاهده شدند.

2.10|ساخت پایگاه داده هدف 3TC

پایگاه داده هدف 3TC بر اساس دو پایگاه داده ساخته شد. ابتدا، اهداف بالقوه 3TC با استفاده از نقشه ژن فارماکودینامیک معکوس بر اساس پایگاه داده Pharmmapper (http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/{3}}.html) شناسایی شدند. همه اجزای شیمیایی توسط Chembiodraw به فرمت '.mol2' تبدیل شدند و در پایگاه داده Pharmmapper بارگذاری شدند (شکل 1C). مولکول‌هایی با امتیاز تناسب عادی بزرگتر از 4.{7}} به عنوان اهداف بالقوه 3TC شناسایی شدند. دوم، پایگاه داده ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound{9}}report{10}}card/CHEMBL141/) برای پرس و جو در مورد فعالیت های بیولوژیکی اهداف یا ترکیبات استفاده شد. پروتئین‌هایی که به‌عنوان مشتق شده از هومو ساپینس تأیید شده‌اند، به عنوان اهداف بالقوه 3TC شناسایی شدند.

2.11|تجزیه و تحلیل تعامل پروتئین هدف و ساخت شبکه

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >0.4 در تنظیمات طراحی شده پس از حذف موارد تکراری انتخاب شدند.

برای بررسی جامع مکانیسم‌های مولکولی 3TC، شبکه‌های PPI با استفاده از نرم‌افزار Cytoscape نسخه 3.6 ساخته شدند.{3}}.(http://www.cytoscape.org/). تجزیه و تحلیل درجه گره‌ها با Centiscape 2.2 (http:// apps.cytoscape.org/apps/centiscape) برای نمایش ژن‌های هاب در شبکه‌ها با مقدار مرکزیت نزدیکی، ارزش مرکزیت بین و مقدار مرکزیت درجه تنظیم شده روی {{6 انجام شد. }}.2، 450 و 50 به ترتیب.

2.12|غنی سازی و غربالگری مسیرهای سیگنالینگ برای 3TC

تجزیه و تحلیل غنی سازی هستی شناسی ژن (GO) با فرآیندهای بیولوژیکی، اجزای سلولی و عملکردهای مولکولی اهداف بالقوه برای حاشیه نویسی عملکرد بیولوژیکی بر اساس پایگاه داده بیوانفورماتیک DAVID (https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp) انجام شد. مسیرهای متابولیک KEGG بر اساس پایگاه داده های کیوتو دایره المعارف ژن و ژنوم (KEGG) با استفاده از سرور حاشیه نویسی خودکار KEGG (http://www.genome.jp/ kegg/) حاشیه نویسی شد.

2.13|اتصال 3TC به اهداف پیش بینی شده

فایل های ساختار SDF ترکیب 3TC توسط وب سایت Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) به دست آمده است. فایل SDF توسط نرم افزار OpenBabel2.3.2 به فایل PDB تبدیل شد و پروتئین های گیرنده ADRB2 (PDBID:3KJ6)، AKT1 (PDBID:4EKL) و EGFR (PDBID:6S9C) از پایگاه داده بانک داده پروتئین (www.wwpdb) به دست آمدند. .org). از نرم افزار PYMOL2.3.4 برای حذف آب و لیگاندها از پروتئین های گیرنده استفاده شد. مطالعه اتصال با استفاده از AutoDock Vina (1.1.2) انجام شد که یک نرم‌افزار اتصال مولکولی منبع باز است که توسط Scripps توسعه یافته است. از نرم افزار Tools برای اصلاح چهار پروتئین گیرنده استفاده شد و از دستور Grid Box تحت برنامه Grid برای باز کردن ابزار Grid Option برای تجزیه و تحلیل هر پروتئین گیرنده استفاده شد. فاصله شبکه روی 1 تنظیم شد و مرکز جیب به عنوان مرکز محل اتصال قرار گرفت.

2.14|کشت و درمان سلولی

رده های سلولی عصبی هیپوکامپ موش HT22 از شرکت بیوتکنولوژی سلولی شانگهای خریداری شد. سلول های HT22 در DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) کشت داده شدند. سلول ها 1 روز قبل از تیمارهای آزمایشی در 6-صفحه های چاهک کاشته شدند. پیری سلول ها توسط فرمالدئید (FA)، خریداری شده از Sigma-Aldrich، همانطور که قبلاً توضیح داده شد، القا شد. 24 سلول HT22 به سه گروه تقسیم شدند، از جمله گروه FA که با 30 میکرومول در لیتر FA به مدت 24 ساعت تیمار شده بود، FA/3TC گروه تحت تیمار با 30 میکرومول در لیتر FA و 50 میکرومول در لیتر FA و گروه کنترل بدون FA یا 3TC کشت داده شدند.

2.15|ایمونوفلورسانس و میکروسکوپ

محیط برداشته شد و سلول ها با استفاده از محلول پارافورمالدئید 2 درصد به مدت 1 ساعت در دمای اتاق ثابت شدند. آزمایش ایمونوفلورسانس همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد. 25 آنتی بادی های مورد استفاده در این مطالعه شامل آنتی بادی ضد LINE-1 ORF1p (1:1000؛ Sigma-Aldrich) با آنتی بادی ثانویه Alexa Fluor 594 (1:1000؛ Invitrogen) بود. . سلول ها با DAPI (رقت 1:500؛ Thermo Fisher Scientific) به مدت 1 دقیقه برای برچسب زدن هسته ها انکوبه شدند. پس از افزودن ماده ثابت کننده ضد فلورسانس، سلول ها با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال (Nikon) مشاهده شدند. 2.16|تجزیه و تحلیل وسترن بلات

بیان EGFR، p-AKT1 (Active Akt1: فسفریله در S473) و ADRB2 با آنالیز وسترن بلات اندازه‌گیری شد. پروتئین کل پس از تیمارهای مختلف از سلول ها جمع آوری شد. وسترن بلات همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد. 26 آنتی بادی های مورد استفاده در این مطالعه شامل یک آنتی بادی ضد EGFR (1:500؛ Sigma-Aldrich)، یک آنتی بادی ضد pAKT1 (1:1000؛ Sigma-Aldrich) بود. و یک آنتی بادی ضد ADRB2 (1:200؛ Sigma-Aldrich) با آنتی بادی ثانویه ضد خرگوش (1:1000؛ Invitrogen). پس از شستشو، بلات ها با سیستم تشخیص وسترن بلات ECL (Amersham, Aylesbury, UK) ساخته شدند.

2.17|تجزیه و تحلیل داده ها و آمار

هر آزمایش حداقل سه بار تکرار شد و با کارآزمایی‌ها که نتایج مشابهی را نشان می‌داد معتبر تلقی شد. نتایج به عنوان میانگین ± انحراف معیار (SD) ارائه شد. تفاوت معنی داری با استفاده از آزمون t-student با p < 0.05 تعیین شد.

بیشتر بخواهید:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950