LIMIT یک LncRNA ایمونوژنیک در ایمنی سرطان و ایمونوتراپی است

خلاصه

MHC-I آنتی ژن های تومور را به سلول های CD{1}} T ارائه می کند و ایمنی ضد تومور را تحریک می کند. انسانها ممکن است 30،{4}}،000 RNA غیرکدکننده طولانی (lncRNA) داشته باشند. با این حال، هنوز مشخص نیست که آیا lncRNA ها ممکن است بر ایمنی تومور تأثیر بگذارند یا خیر. در اینجا، ما یک LncRNA را شناسایی می‌کنیم که قادر به القای MHC-I و ایمنی‌زایی تومور (LIMIT) در انسان و موش است. ما دریافتیم که گروه ژنی LIMIT تحریک شده با IFN، LIMIT خوشه ژنی پروتئین متصل شونده با سیس فعال شده (GBP) و GBPs ارتباط بین HSP90 و فاکتور شوک حرارتی-1 (HSF1) را مختل می کند - در نتیجه منجر به فعال شدن HSF1 و رونویسی MHC-I می شود. ماشین آلات، اما نه PD-L1. فعال‌سازی CRISPR با هدایت RNA LIMIT، GBPs و MHC-I را افزایش داد و ایمنی‌زایی تومور و درمان نقطه بازرسی را تقویت کرد.

Silence LIMIT، GBPs، و/یا HSF1 MHC-I را کاهش داد، ایمنی ضد تومور را مختل کرد، و اثربخشی ایمونوتراپی را کاهش داد. از نظر بالینی، رونوشت‌ها و پروتئین‌های سیگنال‌دهنده LIMIT، GBPs و HSF با MHC-I، سلول‌های T نفوذگر به تومور و پاسخ محاصره ایست بازرسی در بیماران سرطانی ارتباط دارند. در مجموع، نشان می‌دهیم که LIMIT یک lncRNA ایمونوژن سرطانی است که قبلاً ناشناخته است و محور LIMIT-GBP-HSF1 ممکن است برای ایمونوتراپی سرطان قابل هدف باشد.

کلید واژه ها 

RNA غیر کد کننده طولانی؛ حد؛ MHC-I; IFN ; پوند HSF1; HSP90; PD-L1; PD-1; ایمنی سلول T؛ ایمونوتراپی سرطان

معرفی

محاصره ایست بازرسی قدرت ایمنی با واسطه سلول های CD{0}} را در برابر سرطان آزاد می کند. کمپلکس اصلی سازگاری بافتی-I (MHC-I) نقش کلیدی در آغازگرسازی و فعال سازی سلول های T CD{5}} ایفا می کند. با این حال، MHC-I اغلب در سلول‌های سرطانی کاهش می‌یابد که منجر به فرار ایمنی تومور و مقاومت در برابر ایمونوتراپی می‌شود. درک چگونگی بازیابی بیان MHC-I تومور و احیای پاسخ ایمنی ضد تومور بسیار مهم است. LncRNA ها همراه با پیشرفت در توالی یابی RNA عمیق به سرعت در حال ظهور هستند و جایگاه های بسیار بیشتری را در ژنوم انسان نسبت به ژن های کد کننده پروتئین پوشش می دهند. LncRNAها ژن‌های کدکننده پروتئین را در سطوح چندگانه تنظیم می‌کنند{15}} و نقش‌های اساسی در چاپ ژنومی، تمایز سلولی و پیشرفت سرطان ایفا می‌کنند. با این حال، هویت، نحوه عمل، عملکرد و ارتباط بالینی lncRNA های خاص در ایمنی سرطان و ایمونوتراپی ناشناخته باقی مانده است. در اینجا، LIMIT را به عنوان یک lncRNA ایمونوژن سرطانی که قبلاً ناشناخته بود، شناسایی می‌کنیم. LIMIT بر ماشین آلات MHC-I و ایمنی ضد تومور تأثیر می گذارد. ما دریافتیم که LIMIT به صورت محلی GBP ها را هدف قرار می دهد، در نتیجه یک آبشار مولکولی از LIMIT-GBP-HSF{22}}MHC برای تغییر ایمنی ضد تومور و کارایی ایمونوتراپی تومور تشکیل می دهد. کار ما نه تنها زیست شناسی ناشناخته قبلی یک lncRNA ایمنی، LIMIT را نشان می دهد، بلکه نشان می دهد که محور LIMIT-GBP-HSF1 ممکن است برای ایمونوتراپی سرطان قابل هدف باشد.

LIMIT یک lncRNA ایمونوژنیک است

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

برای کشف ژن‌های تنظیم‌کننده ناشناخته در ایمنی تومور، بر اساس نفوذ سلول‌های T CD{0}} تومور، ملانوم انسانی (TCGA، SKCM) را به انواع تومورهای سرد و گرم تقسیم کردیم و همبستگی‌های ژن ایمنی را تجزیه و تحلیل کردیم. علاوه بر رونوشت‌های CD8A، IFN و MHC-I (HLA-ABC)، ما دریافتیم که یک کاندید lncRNA در تومور داغ غنی شده است، در میان 3926 کاندید lncRNA مشروح شده توسط GENCODE13 (شکل 1a؛ جدول تکمیلی 1). بر اساس مطالعات عملکردی در آزمایش‌های زیر، ما این نامزد lncRNA را به عنوان LIMIT تعیین کردیم: lncRNA القا کننده MHC-I و ایمنی‌زایی تومور (LIMIT). در مجموعه داده ملانوم انسانی، سطوح LIMIT با IFN، MHC-I، و CD8 همبستگی مثبت داشت (شکل 1b-d). در راستای این، تجزیه و تحلیل غنی‌سازی مجموعه ژن (GSEA) نشان داد که بیان LIMIT با ژن‌های پاسخ IFN، ارائه آنتی‌ژن از طریق MHC-I و فعال‌سازی ایمنی مرتبط است (شکل 1e-h). علاوه بر این، سطوح LIMIT با افزایش نرخ پاسخ ایمونوتراپی ایمونوتراپی 14-17 (شکل 1) و با بقا در بیماران مبتلا به ملانوم مرتبط بود (شکل 1j). علاوه بر این، بیان LIMIT با IFN، MHC-I، و CD8 در انواع مختلف سرطان همبستگی دارد (داده های توسعه یافته شکل 1a-l). بنابراین، LIMIT یک lncRNA ایمنی بالقوه است.

اگر LIMIT یک lncRNA باشد، اعتبارسنجی کردیم. نورترن بلات نشان داد که LIMIT تقریباً 2 کیلوبایت طول در سلول های ملانوم انسانی A375 دارد (شکل 1k). ما تکثیر سریع انتهای cDNA (RACE) را اعمال کردیم و انتهای cDNA LIMIT را در سلول‌های ملانوم انسان (A375) و موش (B16) مشخص کردیم (شکل 1l, m). در مرحله بعد، ما طول کامل LIMIT را هم در انسان و هم در موش شبیه سازی کردیم و آن را با توالی های ژنومی مربوطه تراز کردیم (داده های توسعه یافته شکل 2a, b). Human LIMIT در کروموزوم 1 با 1967 نوکلئوتید و 6 اگزون قرار داشت (داده های توسعه یافته شکل 2a)، در حالی که حد موش در کروموزوم 3 با 1634 نوکلئوتید و 7 اگزون قرار داشت (داده های توسعه یافته شکل 2b). LIMIT حاوی یک دنباله Kozak معتبر نیست. هنگامی که ما RNA را از بخش های هسته ای و سیتوپلاسمی سلول های A375 تهیه کردیم، LIMIT عمدتاً در بخش هسته ای شناسایی شد (شکل 1n). بنابراین، LIMIT پتانسیل کدگذاری پروتئین ندارد. در مجموع، LIMIT تمام معیارهایی را که به عنوان یک lncRNA تعریف می شود، برآورده می کند. قابل ذکر است، در جایگاه LIMIT، یک کاندید lncRNA، یک شبه ژن GBP1 (GBP1P1) در کارسینوم کبدی (HCC)18 یافت شد. با این حال، LIMIT شباهت های کمی با GBP1P1 یا GBP1 نشان داد (داده های توسعه یافته شکل 2c، جدول تکمیلی 2). بنابراین، LIMIT GBP1P1 نیست. همبستگی بالا بین امضای ژن پاسخگو LIMIT و IFN (شکل 1e) نشان می دهد که IFN ممکن است بیان LIMIT را تحریک کند. در واقع، درمان با IFN بیان LIMIT را القا کرد، همانطور که توسط نورترن بلات (شکل 1k) و RNA-seq در سلول های A375، HT29، Meijuso و A549 نشان داده شده است (شکل 1o). با این حال، درمان با سایر سیتوکین ها، مانند IFN و TNF، نتوانست بیان LIMIT را القا کند (شکل 1k). علاوه بر این، IFN نتوانست LIMIT را در سلول های A375 STAT1 ناک اوت (KO) القا کند (شکل 1p). از این رو، LIMIT یک lncRNA پاسخگو به IFN قبلا ناشناخته در سلول های انسان و موش است.

LIMIT بیان MHC-I را افزایش می دهد

مزایای مکمل سیستانچ-چگونه سیستم ایمنی بدن را تقویت کنیم

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

برای مطالعه عملکرد LIMIT در سلول های تومور، ابتدا LIMIT را با RNA های سنجاق سر کوچک (shLIMIT) کاهش دادیم. ما از ابزار Blast برای انتخاب LIMIT shRNA که هیچ نامزد خارج از هدفی ندارند استفاده کردیم (جدول تکمیلی 3-6). ShLIMIT ژن های کد کننده GBP را هدف قرار نداد (داده های توسعه یافته شکل 3a). در سلول‌های A375، shLIMIT بیان LIMIT را سرکوب کرد (شکل 2a)، اما بر فسفوریلاسیون STAT1 (شکل 2b) در پاسخ به IFN تأثیری نداشت - نشان می‌دهد که LIMIT بر سیگنال‌دهی ژن IFN جهانی تأثیری ندارد. MHC-I و PD-L1 ژن های هدف IFN هستند{11}}. ShLIMIT منجر به کاهش بیان MHC-I (شکل 2c) شد، اما نه PD-L1 (داده های توسعه یافته شکل 3b)، در پاسخ به تحریک IFN. مطابق با این داده های انسانی، محدودیت خاموشی در سلول ملانوم موشی YUMM1.7 یا سلول سرطان روده بزرگ CT26 منجر به کاهش بیان MHC-I در پاسخ به IFN شد (شکل 2d-g). در سلول های A375، shLIMIT نه تنها بیان MHC-I (HLA-ABC، HLA-E، و HLA-F) بلکه بیان MHC-II (HLA-DRA و HLA-DMA) را نیز تحت تاثیر قرار داد. در حالی که LIMIT دیگر بیان ژن سیگنالینگ IFN را تغییر نداد (داده های توسعه یافته شکل 3c). بنابراین، LIMIT در تنظیم بیان MHC-I و MHC-II ناشی از IFN بدون تغییر مسیر سیگنالینگ جهانی IFN شرکت می کند.

LIMIT یک ژن منقطع با اینترون های بزرگ است که حدود 17 کیلوبایت را در ژنوم اشغال می کند. ما نتوانستیم جایگاه LIMIT را با sgRNA های جفت شده و Cas9 حذف کنیم. با توجه به اینکه 5 محل اتصال STAT1/IRF1 پیش‌بینی‌شده در پروموتر LIMIT وجود دارد، ما 4 sgRNA جفت را برای حذف این مکان‌های اتصال در پروموتر LIMIT طراحی کردیم (داده‌های توسعه یافته شکل 3d). ما سلول‌های A375 را با حذف پروموتر LIMIT در هر 4 ترکیب sgRNA تولید کردیم. ما دریافتیم که IFN در مقایسه با سلول های نوع وحشی دیگر برای القای بیان LIMIT و MHC-I در سلول های تومور با حذف پروموتر LIMIT کارآمد نیست (شکل 2h, i). ما علاوه بر این از یک سیستم فعال سازی CRISPR با هدایت RNA برای فعال کردن حد بیان در سلول های تومور22 استفاده کردیم. ما 4 RNA راهنما ایجاد کردیم که ناحیه پروموتور Limit (sgLimit) را هدف قرار می‌دادند، و با dCas{16}}VPR، یک فعال‌کننده رونویسی سه‌جانبه که با Cas9 nuclease-null ترکیب شده بود، به سلول‌های B16 هم بیان شد (داده‌های توسعه‌یافته شکل 4a). همه 4 sgLimit بیان Limit و همچنین MHC-I را افزایش دادند (داده های توسعه یافته شکل 4b, c). هنگامی که سلول‌های B16 را با sgRNAهای ترکیبی و غیرهدف‌گیر (sgNT) ترانسفکت کردیم، sgLimit بیان Limit و MHC-I را القا کرد، اما نه PD-L1 (شکل 2j، k). از این رو، Limit به طور انتخابی MHC-I را هدف قرار می دهد، اما PD-L1 را هدف قرار نمی دهد. در مجموع، آزمایش‌های از دست دادن و افزایش عملکرد نشان می‌دهند که LIMIT می‌تواند بیان MHC-I را 1.{37} برابر در سلول‌های سرطانی متعدد در موش‌ها و انسان‌ها تغییر دهد. ما بعداً بررسی کردیم که آیا بیان MHC-I تغییر یافته LIMIT بر کشتن تومور با واسطه سلول T CD{43} اختصاصی TAA در شرایط آزمایشگاهی تأثیر می‌گذارد. برای این منظور، ابتدا B2M را با shRNA‌های خاص در اووالبومین (OVA){46} که سلول‌های B16 را بیان می‌کنند، از نظر ژنتیکی نابود کردیم. shRNA-B2M منجر به کاهش 1.{51} برابری بیان OVA-H2Kb شد (داده های توسعه یافته شکل 4d). هنگامی که سلول‌های B{55}}OVA حامل shFluc و shB2M با سلول‌های OT-I انکوبه شدند، کاهشی در کشتن سلول‌های OVA با واسطه OT-I در shB2M-B{61}}در مقایسه با shFluc-B مشاهده کردیم{63 }}سلول های OVA (داده های توسعه یافته شکل 4e-g). داده‌ها نشان می‌دهند که تغییرات 1.{67} برابری در بیان MHC-I که توسط LIMIT کنترل می‌شود، می‌تواند از نظر عملکردی در تأثیرگذاری بر فعالیت‌های CTL خاص TAA مرتبط باشد. برای تأیید این موضوع، LIMIT را در سلول‌های B16-OVA که لاک و shB2M را بیان می‌کنند فعال کردیم. همانطور که انتظار می رفت، فعال سازی CRISPR LIMIT حداقل بیان MHC-I را در سلول های shB2M در مقایسه با سلول های کنترل القا کرد (شکل 2l). بر این اساس، سلول‌های OT-I در مقایسه با سلول‌های کنترل، حداقل کشتن تومور را در سلول‌های shB2M-OVA-B16 واسطه کردند (شکل 2m, n). داده ها نشان می دهد که بیان MHC-I ناشی از LIMIT در فعال سازی و عملکرد سلول های T خاص TAA مهم است. سلول‌های ارائه‌دهنده آنتی‌ژن (APCs)، از جمله ماکروفاژها و سلول‌های دندریتیک (DCs)، MHC-I را بیان می‌کنند، آنتی‌ژن‌ها را به سلول‌های T اختصاصی TAA ارائه می‌کنند و آن‌ها را فعال می‌کنند. ما مطالعات خود را از سلول های تومور به APCs گسترش دادیم. IFN به شدت بیان محدودیت را در DCها و ماکروفاژها مشتق از مغز استخوان تحریک می کند (داده های توسعه یافته شکل 4h, i). ماکروفاژها را با حد هدف گذاری siRNA نشاندار شده با 5'FAM (siLIMIT) ترانسفکت کردیم. از بین بردن LIMIT منجر به بیان کمتر MHC-I در پاسخ به تحریک IFN در مقایسه با کنترل شد (داده های توسعه یافته شکل 4j, k). بنابراین، LIMIT یک lncRNA پاسخگو به IFN است و می‌تواند بیان MHC-I را هم در سلول‌های تومور و هم در APCها افزایش دهد.

LIMIT ایمنی ضد تومور را تقویت می کند

فواید سیستانچ توبولوزا-ضد تومور

بیان ناکافی MHC-I باعث فرار ایمنی تومور و مقاومت ایمونوتراپی می شود. برای درک نقش Limit در پاسخ‌های ایمنی ضد توموری در داخل بدن، سلول‌های تومور YUMM1.7 کنترل (shFluc) و Limit-sillencing (shLimit) را به NOD scid c-کمبود (NSG، نقص ایمنی) و نوع وحشی C57BL/6 تلقیح کردیم. موش (صاحب سیستم ایمنی). در مقایسه با تومورهای کنترل، تومورهای shLimit YUMM1.7 در موش‌های NSG به طور قابل مقایسه‌ای رشد کردند (شکل 3a)، در حالی که در موش‌های نوع وحشی سریع‌تر پیشرفت کردند (شکل 3b). علاوه بر این، ما تومورهای shLimit CT26 را به موش‌های نوع وحشی BALB/c تلقیح کردیم. مجدداً، محدودیت خاموشی منجر به افزایش رشد تومور CT26 در مدل دارای صلاحیت ایمنی شد (شکل 3c). داده ها نشان می دهد که محدودیت خاموش کننده ممکن است ایمنی ضد تومور را مختل کند و رشد تومور را به روشی وابسته به ایمنی تسهیل کند. در حمایت از این، ما کاهش سلول‌های CD{21}}، IFN + و TNF + T را در تومورهای shLimit YUMM1.7 شناسایی کردیم (شکل 3d، e). با هم، خاموش کردن Limit ایمنی ضد تومور را مختل می کند. برای تعیین بیان MHC-I و MHC-I: SIINFEKL در داخل بدن، سلول‌های YUMM1.7 را ایجاد کردیم که OVA را بیان می‌کنند (YUMM1.{33}}}OVA) و با shRNA هدف‌گیری Limit یا Fluc تبدیل شدند. پس از درمان IFN، کاهش بیان سطحی OVA-H2Kb را در سلول های shLimit-YUMM1.7 شناسایی کردیم (داده های توسعه یافته شکل 5a). ما سلول‌های shLimit YUMM1.{41}}OVA و shFluc-YUMM1.{44}}سلول‌های OVA را به موش‌های C57BL/6 تلقیح کردیم. سپس، بافت‌های تومور را تشریح کردیم و بیان H2Db و OVA-H2Kb را در سلول‌های تومور شناسایی کردیم. ما کاهش H2Db و OVA-H2Kb را در shLimit-YUMM1 مشاهده کردیم.{55}}سلول های OVA در مقایسه با سلول های کنترل (داده های توسعه یافته شکل 5b-f). داده ها نشان می دهد که Limit ممکن است بر بیان آنتی ژن MHC-I و MHC-I در داخل بدن تأثیر بگذارد. ما علاوه بر این سلول‌های B16 کنترل (sgNT) و فعال‌کننده حد (sgLimit) را به موش‌های نوع وحشی C57/BL6 تلقیح کردیم. همانطور که انتظار می رفت، sgLimit (فعال سازی حد) به طور چشمگیری رشد تومور را کاهش داد (شکل 3f). این با افزایش تعداد سلول های T نفوذ کننده تومور و فعال شدن همراه بود (شکل 3g، h). ملانوم B16 یک مدل تومور نسبتاً غیر حساس به انسداد PD-L123 است. مطابق با این، محاصره PD-L1 نتوانست رشد تومور sgNT B16 را در موش کنترل کند. جالب توجه است، محدود کردن فعال سازی در تومور B16 با پاسخ تومور حساس sgLimit به محاصره PD-L1، همانطور که با کاهش پیشرفت تومور نشان داده شده است (شکل 3i). در مجموع، Limit ایمنی تومور را تقویت می کند و پاسخ ایمونوتراپی تومور را حساس می کند.

LIMIT سیس GBP ها را فعال می کند تا MHC-I و ایمنی تومور را تقویت کند

در ادامه بررسی کردیم که LIMIT چگونه بر MHC-I و ایمنی تومور تأثیر می گذارد. LncRNA ها می توانند به صورت محلی بیان ژن های همسایه را تنظیم کنند24. LIMIT نزدیک به یک خوشه ژنی، پروتئین های اتصال گوانیلات (GBPs)، در ژنوم انسان و موش است (داده های توسعه یافته شکل 2a, b). ما پرسیدیم که آیا LIMIT ممکن است بیان پوند را تنظیم کند یا خیر. خاموش کردن LIMIT سطوح mRNA های GBP پیش ساز و بالغ (شکل 4a) و پروتئین های GBP{4}} (شکل 4b) را در سلول های A375 انسانی در پاسخ به درمان IFN کاهش داد. داده ها نشان می دهد که LIMIT ممکن است رونویسی GBPs در کشورهای مستقل مشترک المنافع را ترویج کند. در حمایت از این امکان، حد خاموش کردن نیز بیان Gbp2 را در سلول‌های YUMM1.7 و CT26 موش کاهش داد (داده‌های توسعه یافته شکل 6a, b). علاوه بر این، فعال سازی Limit CRISPR باعث بیان Gbp2 در سلول های B16 شد (شکل 4c). برای آزمایش اینکه آیا LIMIT می تواند GBP ها را ترانس تنظیم کند، بیان LIMIT cDNA را به سلول های A375 وادار کردیم. ما دریافتیم که GBP1 و چندین فاکتور ایمنی (از جمله IRF1، HLA-ABC، و PD-L1) با بیان بیش از حد LIMIT تغییری نکرده اند (داده های توسعه یافته شکل 6c). بنابراین، LIMIT یک lncRNA با عملکرد cis است که قادر به القای بیان GBP است. در میان اعضای خانواده Gbp، Gbp2 یکی از اعضای خانواده غالب Gbp در سلول های موش است (داده های توسعه یافته شکل 6d). برای آزمایش اینکه آیا LIMIT ممکن است MHC-I را از طریق GBPs تنظیم کند، سلول‌های YUMM1.7 پایداری را ایجاد کردیم که حاوی shellac، shLimit، shGbp2، یا shLimit به علاوه shGbp2 هستند. ما دریافتیم که در پاسخ به تحریک IFN، shLimit و shGbp2 منجر به کاهش قابل مقایسه در بیان Gbp2 و MHC-I شد. خاموش کردن Limit و Gbp2 به طور همزمان نتوانستند بیان Gbp2 و MHC-I را تغییر دهند (شکل 4d، e). علاوه بر این، ما متعجب بودیم که آیا بیان بیش از حد GBP ممکن است بیان MHC-I تنظیم‌شده MHC-I را در محدود کردن سلول‌های تومور نجات دهد. ما بیان GBP1 را در سلول های shLIMIT A375 (GBP1OE) وادار کردیم و این سلول ها را با IFN درمان کردیم. مشاهده کردیم که shLIMIT منجر به کاهش بیان MHC-I در سلول‌های کنترل شد، اما در سلول‌های GBP1OE نه (داده‌های توسعه‌یافته شکل 6e). بیان PD-L1 و IRF1 تحت تأثیر shLIMIT یا GBP1OE قرار نگرفت (داده های توسعه یافته شکل 6e، f). از این رو، Limit ممکن است بیان MHC-I را به روشی وابسته به GBP تنظیم کند. سپس سلول‌های YUMM1.7 را با Limit و/یا Gbp{56}}در موش‌های C57BL/6 تلقیح کردیم. Silencing Limit و GBPs خاموش کردن به طور مشابه منجر به رشد سریعتر تومور در مقایسه با گروه کنترل شدند، در حالی که خاموش کردن LIMIT و GBPs به طور همزمان بر پیشرفت تومور تأثیر بیشتری نداشت (شکل 4f). علاوه بر این، کاهش تعداد سلول‌های T نفوذگر تومور و فعال‌سازی در تومورهای shLimit، تومورهای shGbp2، و تومورهای shLimit به علاوه shGbp2 را شناسایی کردیم (شکل 4g و داده‌های توسعه‌یافته شکل 6g). با هم، LIMIT بیان MHC-I و ایمنی تومور را به روشی وابسته به GBP افزایش می‌دهد. GBP ها ژن های پاسخگو به IFN در فیبروبلاست ها و ماکروفاژها 26 در زمینه دفاع میزبان در برابر پاتوژن ها هستند. با این حال، نقش GBPs در ایمنی سرطان ناشناخته است. با توجه به اینکه خاموش کردن GBP ها بیان MHC-I و فعال سازی سلول های CD{71}} را کاهش می دهد (شکل 4g و داده های توسعه یافته شکل 6g)، ما فرض کردیم که GBPs ممکن است بر اثربخشی ایمونوتراپی سرطان تأثیر بگذارد. برای آزمایش این فرضیه، ما Gbp2 را در سلول‌های MC38، یک مدل تومور حساس به ایمونوتراپی، خاموش کردیم. همانطور که انتظار می رفت، خاموش کردن Gbp2 در سلول های MC38 بیان MHC-I را پس از درمان IFN کاهش داد (شکل 4h)، و تا حد زیادی اثربخشی محاصره PD-L1 را لغو کرد (شکل 4i). این، همراه با داده های فوق الذکر، دخالت LIMIT و GBPs را در کنترل اثربخشی ایمونوتراپی سرطان نشان می دهد. در تأیید این احتمال، تجزیه و تحلیل داده های بالینی نشان داد که سطوح بالای بیان GBP با LIMIT، بیان MHC-I و پاسخ ایمونوتراپی (Extended Data شکل 6h-j) در بیماران مبتلا به ملانوم همبستگی دارد. علاوه بر این، سطوح بیان GBP به طور مثبت با بقای بیمار مرتبط بود (داده های توسعه یافته شکل 6k). برای تأیید اینکه آیا GBP ها ژن های پاسخگو به IFN در سلول های سرطانی هستند، سلول های A375 را با IFN و سایر سایتوکاین ها تحریک کردیم. GBP ها توسط IFN القا می شدند، اما کمتر تحت تأثیر سایر سیتوکین های ایمنی قرار گرفتند (شکل 4j). در مرحله بعد، ما از سیستم CRISPR-Cas9 برای هدف قرار دادن دنباله های مشترک بین GBP1-5 استفاده کردیم و سلول های حذفی GBP{1-5 (KO) A375 (شکل 4k) تولید کردیم. ما مشاهده کردیم که IFN رونوشت‌های دستگاه ژن MHC-I (شکل 4l) و پروتئین‌های سطحی HLA-ABC را در سلول‌های GBP KO A375 (شکل 4m) ضعیف تحریک می‌کند. بنابراین، LIMIT cis GBPs را فعال می کند تا دستگاه MHC-I و ایمنی تومور را تقویت کند.

GBP ها HSF1 را برای تحریک MHC-I و ایمنی تومور فعال می کنند

برای نشان دادن اینکه چگونه GBPs ممکن است بیان MHC-I و ایمنی تومور را تنظیم کند، بیان GBPs را در سلول‌های A375 مجبور کردیم. جالب توجه است، بیان بیش از حد GBPs بیان MHC-I انسانی را افزایش داد - همانطور که توسط qRT-PCR (شکل 5a)، رنگ آمیزی سطح غشاء (شکل 5b) و وسترن بلات (شکل 5c) نشان داده شده است. داده ها نشان می دهد که GBP ها ممکن است MHC-I را در سطح رونویسی فعال کنند. به طور مداوم، بیان بیش از حد Gbp2 بیان MHC-I موش را در سلول های YUMM1.7 و B16 افزایش داد (شکل 5d). برای شناسایی فاکتور(های) رونویسی که MHC-I را از طریق GBPs در پاسخ به IFN تنظیم می کند، پیش بینی بیوانفورماتیک را با PROMO27 انجام دادیم. ما 8 فاکتور رونویسی تغییر یافته توسط IFN را در سلول‌های A375 یافتیم که ممکن است HLA-ABC، HSPA5، CALR و TAP1 را هدف قرار دهند. علاوه بر چندین عامل شناخته شده، فعالیت HSF1 به شدت توسط IFN القا شد (داده های توسعه یافته شکل 7a). با پردازش مجموعه داده‌های ChiP-seq در ENCODE28، دریافتیم که هم STAT1 و هم HSF1 در پروموترهای ژن‌های مرتبط با MHC-I با الگوهای اتصال متفاوت غنی شده‌اند. ما سنجش تراشه را با آنتی بادی ضد HSF1 در سلول‌های A375 تحریک‌شده با IFN انجام دادیم. HSF1 در پروموترهای HLA-ABC، HSPA5، CALR، و TAP1 غنی شد، اما نه HPRT1، یک کنترل منفی (شکل 5e). نتایج نشان می دهد که HSF1 یک فاکتور رونویسی برای MHC-I است. HSF1 معمولاً با قطع پروتئوستاز فعال می شود29. برای آزمایش اینکه آیا فعال‌سازی HSF1 بیان MHC-I را افزایش می‌دهد، سلول‌های A375 را با فهرستی از عوامل استرس‌زا درمان کردیم: شوک حرارتی، استرس اکسیداتیو (لوپراکس)، مهارکننده‌های ترجمه (پورومایسین)، پروتئازوم (MG{50}})، و همراه ({51}}AAG). جالب توجه است، این عوامل استرس زا به طور جهانی بیان MHC-I را تحریک کردند - در حالی که KRIBB11، یک مهارکننده HSF1، این اثر را کاهش داد (شکل 5f و داده های توسعه یافته شکل 7c). بنابراین، فعال سازی HSF1 به طور کلی بیان MHC-I را القا می کند. ما بعداً سؤال کردیم که آیا GBP ها می توانند HSF1 را فعال کنند یا خیر. بیان اجباری GBPs باعث ایجاد فعالیت لوسیفراز HSE-Luc گزارشگر HSF1 (شکل 5g)، و همچنین فسفوریلاسیون HSF1 (شکل 5h) شد. این نشان می دهد که GBP ها می توانند HSF1 را فعال کنند. IFN نتوانست بیان HSPA5 را در سلول های GBP-KO A375 القا کند (شکل 5i). بنابراین، IFN با القای بیان GBP، HSF1 را فعال می کند. علاوه بر این، درمان با KRIBB11، یک مهارکننده HSF1، تنظیم مثبت MHC-I به واسطه بیان بیش از حد GBP1 را لغو کرد (شکل 5j). از این رو، GBP ها بیان MHC-I را به روشی وابسته به HSF{78}} تحریک می کنند. برای تثبیت رابطه مکانیکی بین GBPs و HSF1، Gbp2 و/یا Hsf1 را در سلول‌های MC38 خاموش کردیم (شکل 5k). پس از درمان با IFN، خاموش کردن Gbp2 یا Hsf1 به تنهایی بیان MHC-I را کاهش داد، اما خاموش کردن همزمان Gbp2 و Hsf1 نتوانست بیان MHC-I را تعدیل کند (شکل 5l). برای نشان دادن ارتباط عملکردی فعل و انفعال بین GBPs و HSF1 در ایمنی تومور، سلول‌های تومور MC38 را که پوسته پوسته، shGbp2، shHSF1، یا shGbp2 به علاوه shHSF1 را بیان می‌کنند را به موش‌های C57BL/6 تلقیح کردیم. در مقایسه با کنترل‌های shFluc، خاموش کردن Gbp2 و خاموش کردن Hsf1 رشد تومور را تسریع کرد (شکل 5m)، و تعداد سلول‌های T نفوذگر تومور و فعال‌سازی را کاهش داد (شکل 5n و داده‌های توسعه‌یافته شکل 7d). علاوه بر این، خاموش کردن همزمان Gbp2 و Hsf1 نتوانست بر رشد تومور و سلول‌های T نفوذکننده تومور تأثیر بگذارد (شکل 5m، n و داده‌های توسعه‌یافته شکل 7d). در مجموع، GBP ها بیان MHC-I و ایمنی ضد توموری را با فعال کردن HSF1 تحریک می کنند.

محور LIMIT-GBP-HSF1 ایمنی MHC-I و تومور را تحریک می کند

فواید سیستانچ برای مردان - تقویت سیستم ایمنی بدن

سپس بررسی کردیم که چگونه GBP ها HSF1 را برای تغییر بیان MHC-I و ایمنی تومور فعال می کنند. در شرایط عادی، HSF1 مونومر با افراد همراهی مانند HSP9031 همراه است و توسط آنها سرکوب می شود. قطع برهمکنش آنها اجازه سهیم شدن و تجمع HSF1 در هسته را می دهد که منجر به فعال سازی رونویسی ژن های هدف آن می شود. ما فرض کردیم که GBP ها ممکن است ارتباط بین HSP90 و HSF1 را مختل کنند و در نتیجه HSF1 فعال شود. برای آزمایش این احتمال، سلول‌های A375 را با IFN درمان کردیم و Co-IP را با آنتی‌بادی HSP90 انجام دادیم. ما دریافتیم که GBP های درون زا ناشی از IFN با HSP90 مرتبط هستند (شکل 6a). علاوه بر این، سلول‌های A375 را با Flag-GBP1 اگزوژن ترانسفکت کردیم و آزمایش Co-IP را با آنتی‌بادی پرچم انجام دادیم. HSP90 در محصول IP از سلول های ترانسفکت شده Flag-GBP1، اما نه سلول های کنترل ترانسفکت شده با ناقل شناسایی شد (شکل 6b). رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس نشان داد که GBPs و HSP90 تا حد زیادی در سیتوپلاسم موضعی شده اند (شکل 6c). هنگامی که ما سلول های 293T را با دوزهای افزایشی پلاسمیدهای GBP1 ترانسفکت کردیم، HSP{30} مرتبط HSF1 به روشی وابسته به دوز کاهش یافت (شکل 6d). داده‌ها نشان می‌دهند که GBPs با HSP90 تعامل داشته و این تعامل ارتباط بین HSF1 و HSP90 را مختل می‌کند. HSP90 یک چاپرون برای تا شدن و پایداری پروتئین های متعدد است، ما این سوال را مطرح کردیم که آیا GBPs ممکن است فعالیت چاپرون HSP90 را تغییر دهد. اگرچه بازدارنده HSP90 بیان پروتئین های مشتری HSP90 (مانند RAF1، BCL2، و CDK433) را سرکوب کرد، بیان بیش از حد GBPs نتوانست این کار را انجام دهد (شکل 6e). بنابراین، GBP ها با HSP90 تعامل دارند و HSP{46} مرتبط HSF1 را آزاد می‌کنند، اما فعالیت HSP90 را تغییر نمی‌دهند. سپس به طور مستقیم نقش HSF1 را در بیان MHC-I بررسی کردیم. ما سلول‌های A375 را با IFN در حضور مهارکننده HSF1 KRIBB11 درمان کردیم. همانطور که انتظار می رفت، درمان با KRIBB11 بیان mRNA تحریک شده با IFN ژن های مرتبط با MHC-I، از جمله HLA-ABC، TAP1، HSPA5، و CALR را کاهش داد، اما IRF1 را کاهش داد (شکل 6f). جالب توجه است، KRIBB11 بیان MHC-I ناشی از IFN را کاهش داد، اما تأثیر کمتری بر بیان PD-L1 داشت (شکل 6g). بنابراین، HSF1 می تواند بیان MHC-I ناشی از IFN را بدون تغییر سیگنالینگ جهانی IFN تنظیم کند. برای بررسی اینکه آیا HSF{72}}MHC-I تنظیم‌شده عملکردی دارد، B{74}}OVA را با سلول‌های OT-I در حضور KRIBB11 و IFN کشت دادیم. KRIBB11 از بیان MHC-I متصل به OVA ناشی از IFN جلوگیری کرد (داده های توسعه یافته شکل 8a). در راستای این، KRIBB11 همچنین اثرات سیتوتوکسیک سلولی OT-I را بر روی B{85}}OVA سرکوب کرد (داده های توسعه یافته شکل 8b). برای گسترش مشاهدات خود به تومورهای اضافی، Hsf1 را با shHsf1 در سلول‌های YUMM1.7 و CT26 خاموش کردیم. خاموش کردن Hsf1 منجر به کاهش بیان MHC-I در سلول های YUMM1.7 (شکل 6h، i) و CT26 (داده های توسعه یافته شکل 8c) در پاسخ به تحریک IFN شد. در سلول‌های YUMM1.7، خاموش کردن HSF1 نتوانست بر بیان Gbp2 در پاسخ به IFN تأثیر بگذارد (شکل 6h)، که نشان می‌دهد Gbp2 یک ژن هدف HSF1 نیست. در سلول های shHsf1 YUMM1.7، KRIBB11 نتوانست بیان MHC-I تحریک شده با IFN را سرکوب کند (داده های توسعه یافته شکل 8d). داده ها نشان می دهد که HSF1 بیان MHC-I را در پاسخ به IFN افزایش می دهد و Hsf1 هدف مکانیکی KRIBB11 برای تنظیم MHC-I است. با توجه به اینکه HSF1 بر بیان MHC-I تأثیر می گذارد، ما فرض کردیم که HSF1 ایمنی ضد تومور را در داخل بدن تنظیم می کند. برای آزمایش این فرضیه، سلول‌های تومور کنترل و shHsf1 YUMM1.7 را به موش‌های NSG و C57BL/6 تلقیح کردیم. ما مشاهده کردیم که خاموش کردن HSF1 تا حدی پیشرفت تومور YUMM1.7 را در موش‌های NSG کند می‌کند (شکل 6j)، که نشان می‌دهد Hsf1 به حفظ هموستاز پروتئین و پیشرفت تومور در مدل دارای نقص ایمنی کمک می‌کند. با این حال، خاموش کردن Hsf1 به طور چشمگیری رشد تومور YUMM1.7 را در موش های نوع وحشی C57BL/6 تسریع کرد (شکل 6k). داده ها نشان می دهد که Hsf1 ممکن است به طور شگفت انگیزی یک ایمنی ضد تومور قوی را در مدل دارای صلاحیت ایمنی ایجاد کند. برای حمایت از این، کاهش درصد سلول‌های CD{144}}، Ki{145}}، IFN + و TNF + T (شکل 6l و داده‌های توسعه‌یافته شکل 8e) را شناسایی کردیم. تومورهای shHsf1 YUMM1.7 در مقایسه با کنترل‌های اسکرامبل shFluc. علاوه بر این، سلول‌های shHsf1 CT26 را به موش‌های نوع وحشی BALB/c تلقیح کردیم. دوباره، خاموش کردن Hsf1 منجر به افزایش رشد تومور CT26 شد (داده های توسعه یافته شکل 8f). این با کاهش درصد سلول‌های CD{160}}، Ki{161}}، IFN + و TNF + T نفوذگر تومور همراه بود (داده‌های توسعه یافته شکل 8g، h). در مجموع، داده‌ها نشان می‌دهند که محور GBP-HSF1 بیان MHC-I و ایمنی ضد تومور را هدایت می‌کند. برای اتصال مکانیکی Hsf1 و LIMIT، LIMIT را در سلول‌های A375 خاموش کردیم. خاموش کردن LIMIT فعالیت رونویسی HSF1 را در پاسخ به IFN کاهش داد، همانطور که توسط سنجش گزارشگر لوسیفراز (HSE-luc) تعیین شد (شکل 6m). داده ها نشان می دهد که LIMIT به فعال سازی HSF1 در پاسخ به IFN کمک می کند. برای آزمایش دخالت بالقوه HSF1 در القای MHC-I با واسطه LIMIT، LIMIT را از طریق فعال‌سازی CRISPR در سلول‌های B16، در حضور KRIBB11 تحریک کردیم. ما مشاهده کردیم که تنظیم مثبت MHC-I، ناشی از فعال سازی LIMIT، توسط یک مهارکننده HSF1 لغو شد (شکل 6n). داده‌ها نشان می‌دهند که LIMIT بیان MHC-I را به روشی وابسته به HSF{184} تقویت می‌کند. در نهایت، ما پیوندی را بین LIMIT، GBPs و HSF1 در زمینه بیان MHC-I، ایمنی تومور و ایمونوتراپی در بیماران مبتلا به سرطان تجزیه و تحلیل کردیم. تجزیه و تحلیل بالینی نشان داد که ژن‌های سیگنال‌دهنده HSF با بیان MHC-I، نفوذ سلول‌های T CD{189} و بقای بیمار همبستگی دارند (داده‌های توسعه یافته شکل 9a-c). در یک مطالعه بلوک ایست بازرسی ایمنی در بیماران مبتلا به کارسینوم سلول بازال34، تجزیه و تحلیل توالی RNA تک سلولی 2 خوشه تومور را نشان داد. یک خوشه تومور به درمان ضد PD{197} حساس تر بود، همانطور که جمعیت تومور تا حد زیادی کاهش یافته است (داده های توسعه یافته شکل 9d). جالب توجه است، این خوشه تومور حساس به ایست بازرسی ایمنی، سطوح بالاتری از ژن‌های سیگنال‌دهنده HSF و همچنین دستگاه‌های ژن MHC-I را بیان می‌کند (داده‌های توسعه یافته شکل 9e). علاوه بر این، در یک مطالعه بلوک ایست بازرسی ایمنی در بیماران مبتلا به ملانوم35، تجزیه و تحلیل پروتئومی نشان داد که بیان پروتئین GBPs، ژن های سیگنال دهی HSF1، و MHC-I در پاسخ دهندگان بالینی بیشتر از افراد غیر پاسخ دهنده بود (داده های توسعه یافته شکل 9f). علاوه بر این، ما یک همبستگی مثبت بین ژن‌های سیگنال‌دهنده GBP1 و HSF{208} در سرطان‌های انسانی مشاهده کردیم (داده‌های توسعه‌یافته شکل 9g). داده ها پشتیبانی می کنند که محور LIMIT-GBP-HSF1 ممکن است بیان MHC-I را فعال کند و مصونیت ضد تومور را به نفع خود حفظ کند (داده های توسعه یافته شکل 10).

بحث

گیاه چینی سیستانچ - ضد تومور

انسانها 30،000-60،000 lncRNA دارند. با این حال، هویت و عملکردهای بیولوژیکی اکثریت قریب به اتفاق این lncRNA های بالقوه به خوبی شناخته نشده است. در زمینه زیست شناسی سرطان، lncRNA ها تا حد زیادی در مدل نقص ایمنی مورد مطالعه قرار گرفته اند، و شکاف دانشی از lncRNA ها در زمینه سیستم ایمنی باقی می ماند. گزارش شده است که تعداد انگشت شماری از lncRNA ها بر عملکرد سلول های ایمنی تأثیر می گذارند36،37، پیشرفت سرطان، و اثربخشی شیمی درمانی38،39. با این حال، اینکه آیا lncRNA های خاص در ایمنی ضد توموری و پاسخ ایمونوتراپی دخیل هستند بی پاسخ مانده است. در مطالعه حاضر، ما شناسایی کرده‌ایم که LIMIT یک lncRNA پاسخگو به IFN در سلول‌های انسان و موش است که قبلاً مشخص نشده بود. LIMIT می تواند بیان MHC-I و MHC-II را القا کند، پاسخ ایمنی تومور با واسطه سلول T را تقویت کرده و کارایی ایمونوتراپی را افزایش می دهد. بنابراین، LIMIT یک lncRNA ایمونوژن تومور ناشناخته است. مسیر سیگنالینگ IFN نقش کلیدی در تعیین پاسخ درمانی به ایمونوتراپی سرطان از طریق مکانیسم های متعدد ایفا می کند19،20،41،42. جهش‌های ژنتیکی در ژن‌های سیگنال‌دهنده IFN به مقاومت در برابر انسداد نقطه بازرسی در بیماران مبتلا به سرطان کمک می‌کند{17}}. با این حال، سیگنال دهی IFN می تواند بیان PD-L1 را مهار کند49. از این رو، شناسایی و هدف قرار دادن یک ژن کلیدی سیگنال دهنده IFN که به طور انتخابی ایمنی ضد تومور را میانجی گری می کند، به جای فرار ایمنی تومور، ایده آل است. در راستای این مفهوم، ما نشان می‌دهیم که LIMIT میانجی‌گری MHC-I و MHC-II است، اما بر بیان PD-L1 در پاسخ به IFN تأثیر نمی‌گذارد. بنابراین، LIMIT ممکن است به طور منحصر به فردی به عنوان یک هدف ایمونوژنیک برای ایمونوتراپی سرطان قرار گیرد. چندین استراتژی برای هدف قرار دادن lncRNAs50 بیماری زا پیشنهاد شده است. با این حال، چگونگی افزایش سطوح lncRNA های مفید همچنان چالش برانگیز است. از آنجایی که lncRNA های فعال سیس به صورت محلی عمل می کنند، بیان اجباری این lncRNA ها ممکن است قادر به مکان یابی دقیق نباشد51. در حالی که lncRNA های ترانس عمل ممکن است از طریق ساختارهای ثانویه خاص عمل کنند، بیان بیش از حد این lncRNA ها ممکن است به دلیل از دست دادن چاپرون های مناسب RNA نتواند ساختار طبیعی خود را ایجاد کند. با استفاده از یک استراتژی فعال‌سازی CRISPR با هدایت RNA22، ما مستقیماً بیان LIMIT را در سلول‌های تومور در مدل‌های بالینی فعال کردیم. فعال‌سازی CRISPR LIMIT هدایت‌شده با RNA می‌تواند بیان تومور MHC-I را تحریک کند و درمان مسدود کردن ایست بازرسی را تقویت کند. با توجه به اینکه از دست دادن امضاهای ژن MHC-I و IFN اغلب در تومورهای انسانی رخ می دهد، ما پیشنهاد می کنیم که فعال سازی CRISPR از lncRNA های مفید، مانند LIMIT، می تواند بیان MHC-I تومور را نجات دهد و یک رویکرد درمانی بالقوه باشد. در حالی که در جستجوی مکانیسمی بودیم که LIMIT بر ایمنی تومور تأثیر می‌گذارد، ما روشن کردیم که LIMIT GBPs را به شیوه‌ای Cis هدف قرار می‌دهد. GBP ها در مصونیت ذاتی نقش دارند26،53،54. موش هایی که فاقد کل دسته گیگابیت بر ثانیه هستند، پاسخ ضعیف ضد توکسوپلاسما گوندی را نشان می دهند. با این حال، قبل از کار ما، ارتباط مکانیکی بین LIMIT و GBPs، و عملکرد بیولوژیکی GBPs در ایمنی تومور و ایمونوتراپی نامشخص بود. ما کشف کرده‌ایم که GBP‌ها برای بیان MHC-I تومور ناشی از IFN، کارایی کشتن سلول‌های T CD{46}} و درمان مؤثر نقطه بازرسی مورد نیاز هستند. داده ها نشان می دهد که GBP ها ژن های هدف بالقوه ای برای تقویت ایمنی زایی تومور هستند. ما به طور غیر منتظره ای کشف کردیم که GBP ها HSF1 را برای تحریک بیان ژن مربوط به MHC-I و MHC-I فعال می کنند. فعال‌سازی HSF1 با واسطه مهارکننده‌های HSP90 با کنترل تومور در مدل‌های دارای قابلیت ایمنی مرتبط است. با این حال، علیرغم آزمایش‌های بالینی متعدد با مهارکننده‌های HSP90، هیچ یک از مهارکننده‌های HSP90 ارزیابی‌شده توسط FDA برای درمان سرطان تایید نشده است. این واقعیت ناامید کننده این احتمال را افزایش می دهد که مهارکننده های HSP90 ممکن است برای ایمنی تومور مضر باشند. سمیت این مهارکننده‌های HSP90 ممکن است باعث تخریب چندین پروتئین مشتری HSP90، مانند RAF1 و BCL2 شود، که ممکن است برای تکثیر و بقای سلول‌های T موثر حیاتی باشد59،60. با توجه به اینکه GBP ها با HSP90 تعامل دارند و HSP{63}HSF1 فریب خورده را آزاد می‌کنند، اما فعالیت HSP90 را تغییر نمی‌دهند، داده‌های ما نشان می‌دهد که هدف قرار دادن GBPs ممکن است یک استراتژی بی‌خطر و بی‌خطر برای فعال کردن HSF1 برای ایمونوتراپی سرطان باشد. به طور خلاصه، ما LIMIT را به عنوان یک lncRNA ایمونوژن سرطانی که قبلا ناشناخته بود شناسایی می کنیم. کار ما نشان می دهد که هدف قرار دادن محور سیگنالینگ LIMIT-GBP-HSF1 می تواند بیان و عملکرد MHC-I را نجات دهد، و یک رویکرد ایمنی درمانی سرطان امیدوارکننده را ارائه می دهد.

مواد و روش ها

آزمایشات روی حیوانات

NSG زن شش تا هشت هفته ای (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl/SzJ, Stock# 005557), C57BL/6 (C57BL/6J, Stock# 000664), BALB/c (BALB) /cJ، Stock# 000651)، و موش‌های OT{13}} (C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J، Stock# 003831) از آزمایشگاه جکسون به‌دست آمدند. همه موش ها تحت شرایط عاری از بیماری زا نگهداری شدند. اتاق حیوانات دارای دمای کنترل شده (18-23 درجه)، رطوبت (40-60%)، و چرخه 12 نور/12 تاریکی است. سلول های YUMM1.7 (1 × 105)، CT26 (1 × 105)، MC38 (2.5 × 106)، و B16 (1 × 105) به صورت زیر جلدی به سمت راست موش ها تزریق شدند. برای درمان ضد PD-L1 در مدل MC38، 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) و آنتی بادی کنترل (InVivoMAb, LTF{48}}) به صورت داخل صفاقی در روزهای 6 و 9 تجویز شد. و 12 بعد از تلقیح تومور. برای درمان ضد PD-L1 در مدل B16، 5 mg/kg anti-PD-L1 (InVivoMAb, 10F.9G2) و آنتی بادی کنترل (InVivoMAb, LTF-2) به صورت داخل صفاقی در روز 0 و 3 تجویز شد. 6، 9، 12 و 15 پس از تلقیح تومور. قطر تومور با استفاده از کولیس اندازه گیری شد. حجم تومور با طول × عرض × عرض / 2 محاسبه شد. مطالعات حیوانی تحت تأیید کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات در دانشگاه میشیگان (PRO00008278) انجام شد. این مطالعه با تمام مقررات اخلاقی مربوطه در مورد تحقیقات حیوانی مطابقت دارد. در هیچ یک از آزمایش‌ها اندازه تومور زنوگرافت در هیچ ابعادی از 2 سانتی‌متر فراتر نرفت و هیچ حیوانی اتساع شدید شکم (بیشتر یا مساوی 10 درصد افزایش وزن اولیه بدن) نداشت. حجم نمونه بر اساس داده های اولیه انتخاب شد. پس از تلقیح تومور، موش ها به صورت تصادفی در گروه های مختلف قرار گرفتند.

معرف ها

KRIBB11 و 17-AAG از Cayman Chemical خریداری شدند. MG-132، پورومایسین و لوپراکس از سیگما آلدریچ بودند. IFN نوترکیب انسانی (285-IF)، IFN (8499-IF)، TNF (210-TA)، IL-1 (201-LB)، IL{{ 9}} (206-IL) و IFN موش (485-MI) از تحقیق و توسعه بودند.

پلاسمیدها

برای تولید HSE-LUC، توالی‌های DNA مربوط به عناصر شوک حرارتی (HSE) سنتز، بازپخت و به یک پلاسمید پایه PGL{1}(Promega) متصل شدند. FLAG-HSF1 هدیه ای از استوارت کالدروود (Addgene #32537) بود. برای بیان اجباری GBP1، GBP2، GBP5 و Gbp2 موش، توالی‌های کدکننده مربوطه از cDNA تولید شده از سلول‌های A375 یا سلول‌های B16 پیش تیمار شده با IFN تکثیر شدند و متعاقباً در پلاسمید PCI-Flag قرار گرفتند. پلاسمید PCI-Flag با قرار دادن توالی کوزاک زیر به اضافه برچسب پرچم به اضافه توالی 5 × گلایسین در پلاسمید PCI-neo (Promega) بین NheI و XhoI تهیه شد. برای از بین بردن LIMIT انسان و LIMIT موش، shRNA ها طراحی و در پلاسمید PLKO.1 (Addgene #10879) قرار گرفتند. shRNA که لوسیفراز کرم شب تاب را هدف قرار می دهد (shFluc) به عنوان یک کنترل منفی عمل می کند. برای هدف قرار دادن ناحیه پروموتر Limit برای فعال‌سازی CRISPR، sgRNA‌ها (sgLimit) طراحی و در پلاسمید phU{17}} sgRNA (Addgene #53188) وارد شدند. sgRNA غیر هدفمند (sgNT) به عنوان یک کنترل منفی عمل کرد. برای حذف مکان های اتصال STAT1/IRF1 در پروموتر LIMIT، sgRNA های جفت شده (psgLIMIT) طراحی و در پلاسمید PX459 (Addgene #48139) قرار داده شد. برای از بین بردن Hsf1 و Gbp2 موش، shRNA ها طراحی و در پلاسمید PLKO.1 (Addgene #10879) قرار گرفتند. برای حذف GBP{28}}، sgRNA طراحی و در پلاسمید PX459 (Addgene #48139) قرار داده شد. توالی های هدف در جدول تکمیلی 7 فهرست شده اند. توالی های آغازگر در جدول تکمیلی 8 فهرست شده اند.

کشت سلولی

رده سلولی ملانوم انسانی A375 (CRL-1619)، رده سلولی ملانوم موش، B16-F0 (CRL-6322) و YUMM1.7 (CRL-3362 ) رده سلولی سرطان کولون موش CT26 (CRL-2638) و 293T (CRL-3216) از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (ATCC) خریداری شد. رده سلولی سرطان کولون موش MC38 قبلاً در آزمایشگاه Zou23،48 استفاده شده بود. سلول های B{15} OVA همانطور که قبلاً گزارش شده بود ایجاد شد. رده های سلولی حذف پروموتر A375 STAT1 KO، A375 GBP{20}} KO و A375 LIMIT در این مطالعه تولید شدند. همه رده های سلولی برای آلودگی مایکوپلاسما به طور روتین آزمایش شدند و برای مایکوپلاسما منفی تایید شد. سلول‌ها در محیط RMPI (Gibco #11875) حاوی 10% FBS، به جز سلول‌های A375 و 293T، کشت داده شدند، 2 لاین آخر در DMEM (Gibco #11965) همراه با 10% FBS کشت شدند. تمام سلول ها در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 نگهداری شدند. برای شوک حرارتی، سلول ها به مدت 2 ساعت در انکوباتور با دمای 43 درجه و CO2 5 درصد قرار داده شدند. برای تولید رده‌های سلولی تخریب، ذرات لنتی ویروسی با ترانسفکشن پلاسمید shRNA PLKO.1 با psPAX2 (Addgene #12260) و pMD2.G (Addgene #12259) (4:3:1) به سلول‌های 293T تولید شدند و متعاقباً به تومور تبدیل شدند. سلول ها با پلی برن (Sigma-Aldrich، 8 ug/ml) در طول شب. 48 ساعت پس از ترانسفکشن، سلول‌ها با پورومایسین ({48}} ug/ml) به مدت ۲ هفته دیگر انتخاب شدند. برای ایجاد رده‌های سلولی حذف‌شده، پلاسمیدهای sgRNA PX به مدت 2 روز به سلول‌های تومور ترانسفکت شدند و توسط پورومایسین ({53}} ug/ml) برای ۲ روز دیگر انتخاب شدند. سپس سلول ها به صورت متوالی رقیق شده و در صفحات 96 چاهی کاشته شدند. پس از 2-3 هفته، کلنی های تک سلولی جدا شدند و مجدداً در صفحات 6 چاهک قرار گرفتند. پس از تلاقی سلول، نیمی از سلول‌ها برداشت شدند و از طریق وسترن بلات برای کارایی حذف (KO) تایید شدند. برای اعمال سیستم فعال‌سازی CRISPR برای فعال‌سازی حد موش، phU{60}}sgRNA‌ها همراه با SP-dCas9-VPR (Addgene #63798) به سلول‌های B16 ترانسفکت شدند. همه ترانسفکشن‌ها با لیپوفکتامین 2000 (ترموفیشر) با نسبت 1 میکروگرم پلاسمید: 2 میکرولیتر عامل ترانسفکشن انجام شد. دوز ترانسفکشن با تیتراسیون تعیین شد.

سنجش فعالیت لوسیفراز

سلول های A375 با HSE-LUC و PRL-SV40P (Addgene #27163) به مدت 24 ساعت، همراه با PCI-neo (وکتور) یا GBP1، GBP2 به مدت 48 ساعت ترانسفکت شدند. سلول های A375 shFluc یا A375 shLIMIT با HSE-LUC و PRL-SV40P (Addgene #27163) به مدت 24 ساعت ترانسفکت شدند و سپس به مدت 48 ساعت دیگر با IFN تحت درمان قرار گرفتند. فعالیت لوسیفراز برای لوسیفراز کرم شب تاب (HSE-LUC) و رنیل لوسیفراز (PRL-SV40P) با سیستم سنجش گزارشگر دوگانه لوسیفراز (Promega) اندازه گیری شد. فعالیت نسبی لوسیفراز کرم شب تاب با فعالیت رنیل لوسیفراز نرمال شد.

رنگ آمیزی سطحی و آنالیز فلوسیتومتری (FACS)

سلول ها تریپسینیز شدند و با بافر MACS (PBS، 2% FBS، 1 میلی مولار EDTA) شسته شدند. رنگ‌آمیزی سطحی با افزودن آنتی‌بادی‌های زیر به سوسپانسیون سلولی در بافر MACS 50 میکرولیتر انجام شد: anti-HLA-ABC (G{5}}.6، BD Biosciences)، anti-H{8}}Db (KH95، BD Biosciences)، anti-H2-Dd (34-2-12، BD Biosciences)، anti-OVA-H2-Kb (eBio25-D1.16، eBioscience)، و ضد PD-L1 (MIH1، BD Biosciences). پس از 30 دقیقه انکوباسیون، سلول ها با بافر MACS شسته و بر روی فلوسایتومتر BD Fortessa آنالیز شدند.

تجزیه و تحلیل کمی PCR (qPCR).

RNA کل با خالص سازی ستونی (Direct-zol RNA Miniprep Kit، Zymo Research) با تیمار DNase از سلول ها جدا شد. cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA رشته اول RevertAid (Thermo Fisher Scientific) با پرایمرهای هگزامر تصادفی سنتز شد. PCR کمی (qPCR) بر روی cDNA با استفاده از Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) بر روی یک سیستم Real-Time PCR StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific) انجام شد. بیان ژن با استفاده از آغازگرهای فهرست شده در جدول تکمیلی 8 اندازه گیری شد. تغییرات برابری در بیان mRNA با روش ΔΔCt با استفاده از ACTB به عنوان یک کنترل درون زا محاسبه شد. نتایج به عنوان تغییر برابر با نرمال کردن کنترل ها بیان می شود.

نورترن بلاتینگ

آنالیز نورترن بلات با 10 میکروگرم از RNA های کل تهیه شده از سلول های A375 پیش تیمار شده با IFN، IFN و TNF انجام شد. RNA ها با دناتوره کردن الکتروفورز ژل آگارز (Ambion) حل و فصل شدند و به غشاهای Hybond-XL (GE Healthcare) منتقل شدند. LIMIT با استفاده از پروب های DNA نشاندار شده با دیگوکسین با کیت استارتر DIG Northern (Roche) شناسایی شد. توالی های کاوشگر با هدف LIMIT در جدول تکمیلی 7 فهرست شده اند.

تقویت سریع انتهای cDNA (RACE)

RACE برای شناسایی انتهای cDNA LIMIT انسانی یا Limit موش با کیت تقویت cDNA RACE SMARTer (Clontech) انجام شد. پرایمرهای RACE در جدول تکمیلی 8 فهرست شده است.

کلون تمام طول LIMIT

پس از به دست آوردن توالی های انتهایی cDNA، LIMIT تمام طول PCR تقویت شد و در پلاسمید PCI-neo بین XhoI و NotI قرار داده شد. پرایمرهای کلون برای انسان LIMIT و موش Limit در جدول تکمیلی 8 فهرست شده است.

تقسیم سلولی برای RT-PCR

سلول های A375 پیش تیمار شده با IFN از صفحات 15 سانتی متری با سوهان جمع آوری و یک بار با PBS سرد شسته شدند. سلول‌ها با سانتریفیوژ 0 گرم به مدت 5 دقیقه پلت شدند و با بافر لیز هیپوتونیک (10 میلی‌مولار تریس (pH 7.5)، 10 میلی‌مولار NaCl، 3 میلی‌مولار MgCl2، 0.3 درصد (vol/vol) NP لیز شدند. 12}}، 10% (vol/vol) گلیسرول) برای جمع آوری کسر سیتوپلاسمی. RNA سیتوپلاسمی با رسوب اتانول یک شبه در دمای 20- درجه و به دنبال آن استخراج مجدد با استفاده از معرف TRIZOL بدست آمد. گلوله هسته ای باقیمانده سه بار با بافر لیز هیپوتونیک شسته شد و سپس طبق دستورالعمل سازنده با معرف TRIZOL استخراج شد. RNA های جدا شده از فراکسیون های هسته ای یا سیتوپلاسمی رونویسی معکوس و RT-PCR برای LIMIT با پرایمرهای نشان داده شده انجام شد. ACTB بدون اتصال یا بالغ به عنوان کنترل برای RNA هسته ای یا سیتوپلاسمی استفاده شد. آغازگرهای ACTB در جدول تکمیلی 8 فهرست شده است.

وسترن بلاتینگ

سلول ها در PBS سرد شسته شده و در بافر لیز 1×RIPA (Pierce) با 1×1 بازدارنده پروتئاز (Pierce) لیز شدند. لیزها به مدت 10 دقیقه روی یخ انکوبه شدند و با سانتریفیوژ در 15،{4}} گرم به مدت 15 دقیقه پاکسازی شدند. غلظت پروتئین با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA (Thermo Fisher) تعیین شد. 30 میکروگرم پروتئین با بافر نمونه (Thermo Fisher) با -ME مخلوط و در دمای 95 درجه به مدت 5 دقیقه دناتوره شد. نمونه توسط SDS-PAGE جدا شد و به غشای نیتروسلولزی (Bio-Rad) منتقل شد. غشاها با شیر خشک بدون چربی 5% w/v مسدود شدند و با آنتی بادی های اولیه یک شب در دمای 4 درجه و آنتی بادی های ثانویه کونژوگه با HRP (CST) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. سیگنال با استفاده از زیرلایه‌های Clarity and Clarity Max Western ECL Blotting (Bio-Rad) شناسایی و با استفاده از سیستم تصویربرداری ChemiDoc (Bio-Rad) گرفته شد. آنتی بادی ها به شرح زیر بودند: ضد انسان GBP1-5 (سانتا کروز، 166960، 1: 500)، ضد HSF1 (CST، 12972، 1: 1،000)، ضد فسفو HSF1 (Abcam) , 76076, 1: 1000), anti-GBP1 (Proteintech, 15303, 1: 1,000), anti-Gbp2 (Proteintech, 11854, 1: 1,000) , anti-HSP90 (CST, 4877, 1: 1,000), anti-HSPA5 (CST, 3177, 1: 1,000), anti-STAT1 (CST, 9172, 1: 1 ,000)، anti-Phospho-STAT1 (CST, 9167, 1: 1000), anti-RAF1 (CST, 9422, 1: 1000), anti-BCL2 (CST, 2870, 1) : 1000)، ضد CDK4 (CST، 12790، 1: 1000)، و ضد GAPDH (Proteintech، 60004، 1: 5000). برای وسترن بلات انسانی MHC-I، کل لیزات سلولی در بافر نمونه بدون -ME (غیر احیاکننده) دناتوره شدند تا پل های دی سولفیدی و ترکیب پروتئین ها توسط آنتی بادی ضد HLA-ABC شناسایی شوند (W6/32). ، Novus Biologicals، 64775، 1: 1000).

رسوب ایمنی همزمان (Co-IP)

سلول ها با بافر لیز IP (Pierce, 87787) به همراه مهارکننده پروتئاز جمع آوری شدند. غلظت پروتئین با کیت سنجش پروتئین BCA تعیین شد. 200-500 نمونه‌های پروتئین ug به 1-3 آنتی‌بادی اولیه آنتی‌بادی ضد HSP90 (Proteintech, 13171) یا anti-HSF1 (CST, 12972) اضافه شدند و با تکان دادن ملایم در دمای 4 درجه یک شبه انکوبه شدند. سپس نمونه ها با 20 میکرولیتر پروتئین A/G PLUS-Agarose (Santa Cruz, sc{12}}) به مدت 2 ساعت در دمای 4 درجه انکوبه شدند. و در 7500×g به مدت 30 ثانیه در 4 درجه سانتریفیوژ شد. گلوله های سلولی 4 بار با بافر لیز IP شسته شدند، با 40 ul 2 × نمونه بافر با -ME معلق شدند و به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه حرارت داده شدند. نمونه های پروتئین دناتوره شده با وسترن بلات آنالیز شدند. برای Flag IP، لیزهای سلولی با 20 میکرولیتر EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel (Sigma Aldrich) انکوبه شدند و شسته شدند، دناتوره شدند و همانطور که در بالا توضیح داده شد آنالیز شدند.

رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس

سلول های A375 نصب شده بر روی ورقه های پوششی به مدت 24 ساعت با IFN تحت درمان قرار گرفتند. پس از 2 بار شستشو با PBS، سلول ها با 4% PFA به مدت 15 دقیقه تثبیت شدند و 2 بار با PBS به مدت 5 دقیقه شستشو شدند. سپس سلول‌ها با 0.5% تریتون x-100 به مدت 10 دقیقه در PBS نفوذپذیر شدند و 2 بار با PBS به مدت 5 دقیقه شستشو داده شدند. آنتی ژن ها با 10% سرم طبیعی بز در PBS به مدت 30 دقیقه مسدود شدند. سپس، آنتی‌بادی‌های اولیه در رقت‌های 1:50 آنتی‌بادی ضد انسان GBP1-5 موش (سانتا کروز، 166960) یا آنتی‌بادی ضد انسان HSP90 خرگوش (CST، 4877) اضافه شدند و در دمای 4 درجه یک شبه انکوبه شدند. پس از آن، سلول‌ها شسته و با رقت‌های 1:500 آنتی‌بادی ضد موش ثانویه بز با برچسب Qdot 605 (Thermo Fisher, Q11002) یا آنتی‌بادی ضد خرگوش ثانویه با برچسب AF (Thermo Fisher, A11034) انکوبه شدند. و سپس روی اسلایدهای شیشه ای با معرف ProLong Gold حاوی DAPI نصب می شود. تصاویر فلورسانس هم کانونی با استفاده از یک هدف غوطه ور در روغن 63X (Leica SP5 Inverted 2-Photon FLIM confocal) جمع آوری شد.

رسوب ایمنی کروماتین (ChIP)

تراشه‌ها با کروماتین متقاطع از سلول‌های A375 تیمار شده با IFN و آنتی‌بادی HSF1 (CST, 12972) یا Normal Rabbit IgG (CST, 2729)، با استفاده از کیت IP کروماتین آنزیمی ساده چیپ پلاس (مجوره‌های مغناطیسی) (CST, 90) انجام شدند. DNA غنی شده توسط PCR بلادرنگ با استفاده از پرایمرهای فهرست شده در جدول تکمیلی 8 اندازه گیری شد. مقدار DNA ایمونوفیل شده در هر نمونه به صورت سیگنالی نسبت به مقدار کل کروماتین ورودی نشان داده شد که معادل 1 است.

جداسازی سلول های OT-I و کشت همزمان با سلول های تومور OVA+

موش‌های C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) (JAX stock #003831) از آزمایشگاه جکسون خریداری شدند. طحال هموژنیزه شد و سلول های منفرد در 2 میلی لیتر بافر لیز گلبول قرمز (سیگما آلدریچ) به مدت 1 دقیقه معلق شدند. اسپلنوسیت ها پلت شدند، شسته شدند و مجدداً در 106 × 2 سلول در هر میلی لیتر در محیط کشت RPMI حاوی 1 ug/ml پپتید OVA، 5 ug/ml IL نوترکیب موش و 40 میکرومولار معلق شدند. {15}} مرکاپتواتانول. سلول ها در دمای 37 درجه به مدت 5 روز انکوبه شدند. برای راه‌اندازی کشت مشترک سلول‌های تومور OT-I و OVA+، سلول‌های طحال پس از فعال‌سازی 5-روزه جمع‌آوری شدند. سلول‌های OT-I با استفاده از کیت جداسازی سلول‌های T (Stemcell) CD{23} موس EasySep خالص‌سازی شدند. سلول های B{24} OVA یک شبه کاشته شدند. سپس سلول های OT-I با نسبت های مختلف به کشت اضافه شدند. تمام سلول ها با تریپسینیزاسیون جمع آوری و با فلوسیتومتری (FACS) آنالیز شدند.

سلول های دندریتیک مشتق از مغز استخوان (BMDCs) و ماکروفاژها (BMDMs)

مغز استخوان از استخوان ران موش C57BL/6 جدا شد و در محیط کشت کامل RPMI1640 با ng/ml 20 GM-CSF (R & D) کشت داده شد. سلول ها در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2 انکوبه شدند. 10 میلی‌لیتر محیط اضافی با 20 نانوگرم در میلی‌لیتر GM-CSF در روز 3 اضافه شد. در روز 7، سلول‌های غیرچسبنده و چسبنده شل در مایع رویی کشت با شستشوی ملایم با PBS برداشت شدند و BMDCs در نظر گرفته شدند. سلول های چسبنده BMDM در نظر گرفته شدند.

پروفایل سلول های ایمنی داخل توموری

برای تعیین کمیت سلول‌های T داخل توموری و بیان سیتوکین‌های مؤثر سلول T، سوسپانسیون‌های تک سلولی از بافت‌های تومور تازه با عبور فیزیکی از صافی‌های سلولی 00 تهیه شد. سلول های ایمنی با سانتریفیوژ گرادیان چگالی غنی شدند. برای رنگ‌آمیزی سیتوکین، سلول‌های ایمنی داخل توموری در محیط کشت RPMI حاوی PMA (5 نانوگرم در میلی‌لیتر)، یونومایسین (500 نانوگرم در میلی‌لیتر)، برفلدین A (1: 1،{6}}) و مونسن (1: 1) انکوبه شدند. ,000) در دمای 37 درجه به مدت 4 ساعت. 2-3 ul of Anti-CD45 (30-F11, BD Biosciences), anti-CD90 (53-2.1, BD Biosciences), anti-CD3 (145-2C11, BD آنتی‌بادی‌های Biosciences)، anti-CD4 (RM4-5، BD Biosciences) و anti-CD8 ({30}}.7، BD Biosciences) به مدت 20 دقیقه برای رنگ‌آمیزی سطح اضافه شدند. سپس سلول ها شسته و در 1 میلی لیتر محلول فیکس/پرم تازه تهیه شده (BD Biosciences) در دمای 4 درجه یک شبه معلق شدند. پس از شستشو با بافر Perm/Wash (BD Biosciences)، سلول‌ها با 2-3ul anti-Ki67 (B56, BD Biosciences)، anti-TNF (MP{40}}XT22، BD Biosciences) رنگ‌آمیزی شدند. و ضد IFN (XMG1.2، BD Biosciences) به مدت 30 دقیقه، شسته شده و در فرمالدئید 4 درصد (سیگما آلدریچ) ثابت شد. همه نمونه ها بر روی یک سیتومتر LSR Fortessa خوانده شدند و با نرم افزار FACS DIVA v. 8.0 (BD Biosciences) آنالیز شدند.

محاسبه امتیاز امضا

ما از بیان عادی ژن‌ها برای تعریف امضاهای زیر استفاده کردیم: نفوذ سلول T CD8+ (CD8A، CD8B، PRF1، و GZMB)، بیان MHC-I (HLA-A، HLA-B، و HLA-C) و سیگنال دهی HSF1 (HSPA1A، HSPA1B، HSPA5، و HSP90B1).

تحلیل آماری

برای آزمایش‌های مبتنی بر سلول، سه تکرار بیولوژیکی در هر آزمایش منفرد به طور کلی انجام شد، مگر اینکه خلاف آن ذکر شده باشد. برای مطالعات حیوانی، کمتر از 5 تکرار در هر گروه استفاده شد. حیوانات پس از تلقیح سلول های تومور به طور تصادفی به گروه های مختلف تقسیم شدند. محققین در طول آزمایش‌ها و ارزیابی پیامدها نسبت به تخصیص کور نبودند. داده ها به عنوان مقادیر میانگین با مشتق استاندارد نشان داده می شوند. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism8 (GraphPad Software, Inc.) انجام شد. از آزمون t دو طرفه 2-برای مقایسه گروه‌های درمان با گروه کنترل استفاده شد. تابع بقا با روش کاپلان- مایر برآورد شد و برای محاسبه تفاوت های آماری از آزمون لگ رتبه استفاده شد.

در دسترس بودن داده ها

داده های RNA-seq (GSE99299) و داده های تک سلولی پردازش شده (GSE123814) از Gene Expression Omnibus (GEO) به دست آمد. داده های پروتئومیکس MS (PXD006003) از مخزن PRIDE به دست آمد. مجموعه داده های سرطان TCGA از UCSC Xena (http://xena.ucsc.edu/) به دست آمد. داده های RNA-seq و اطلاعات بالینی برای آزمایشات بالینی ICB توسط نویسندگان مربوطه ارائه شده است. تمام داده های خام حمایت کننده از یافته های این مطالعه در صورت درخواست از نویسنده مربوطه در دسترس است. داده های منبع در این مقاله ارائه شده است.

در دسترس بودن کد

تمام تجزیه و تحلیل های مورد استفاده در این مطالعه با پیروی از کتابچه راهنمای Prism Graphpad نسخه 8.{1}} و وب سایت آنلاین در http://xena.ucsc.edu/ انجام شد. هیچ کد یا الگوریتم جدیدی در طول این مطالعه ایجاد نشد.

داده های توسعه یافته

داده های توسعه یافته شکل 1:

LIMIT با ژن های ایمنی موثر در انواع مختلف سرطان ارتباط دارد.

داده های توسعه یافته شکل 2:

جایگاه ژنتیکی و توالی LIMIT انسان و حد موش.

داده های توسعه یافته شکل 3: LIMIT عبارت MHC{1}} را افزایش می دهد

داده های توسعه یافته شکل 5:

LIMIT بیان MHC{1} بارگذاری شده با آنتی ژن را در داخل بدن افزایش می دهد.

داده های توسعه یافته شکل 6:

LIMIT cis GBP ها را فعال می کند تا MHC-1 و ایمنی تومور را تقویت کند.

داده های توسعه یافته شکل 7:

GBP ها HSF1 را برای تحریک بیان MHC-I فعال می کنند.

داده های توسعه یافته شکل 8:

HSF1 بیان MHC-I و ایمنی تومور را تحریک می کند.

داده های توسعه یافته شکل 9:

ژن های سیگنال دهی HSF1 با MHC-I و ایمنی تومور همبستگی دارند.

داده های توسعه یافته شکل 10: طرحی که نشان می دهد چگونه محور LIMIT-GBP-HSF1 بر MHC-I و ایمنی تومور تأثیر می گذارد

مواد تکمیلی

برای مطالب تکمیلی به نسخه وب در PubMed Central مراجعه کنید.

قدردانی

ما از اعضای آزمایشگاه زو به خاطر مشارکت فکری آنها تشکر می کنیم. این کار تا حدی توسط کمک‌های مالی تحقیقاتی از سوی کمک‌های مالی NIH/NCI R01 ایالات متحده (CA217648, CA123088, CA099985, CA193136, CA152470) (WZ) و (CA216919, CA213564, CA213564, CA213564, CA213564, CA123085, CA193136, CA193136, CA152470) حمایت شده است. کمک هزینه مرکز سرطان روگل میشیگان (CA46592).

منابع

1. محاصره مسیر Zou W، Wolchok JD و Chen L PD-L1 (B7-H1) و PD-1 برای درمان سرطان: مکانیسم‌ها، نشانگرهای زیستی پاسخ، و ترکیبات. Sci Transl Med 8, 328rv324, doi:10.1126/ scitranslmed.aad7118 (2016).

2. Schumacher TN & Schreiber RD Neoantigens در ایمونوتراپی سرطان. Science 348, 69-74, doi:10.1126/science.aaa4971 (2015). [PubMed: 25838375]

3. آنتی ژن های Garcia-Lora A، Algarra I و Garrido F MHC کلاس I، نظارت ایمنی، و فرار ایمنی تومور. J Cell Physiol 195، 346-355، doi:10.1002/jcp.10290 (2003). [PubMed: 12704644]

4. آنتی ژن Festenstein H & Garrido F MHC و بدخیمی. Nature 322, 502–503, doi:10.1038/322502a0 (1986). [PubMed: 3461283]

5. Garrido F، Aptsiauri N، Doorduijn EM، Garcia Lora AM و van Hall T نیاز فوری به بازیابی MHC کلاس I در سرطان ها برای ایمونوتراپی موثر. Curr Opin Immunol 39, 44-51, doi:10.1016/ j.coi.2015.12.007 (2016). [PubMed: 26796069]

6. Hon CC و همکاران. اطلسی از RNA های طولانی غیر کد کننده انسان با انتهای دقیق 5. Nature 543, 199– 204, doi:10.1038/nature21374 (2017). [PubMed: 28241135]

7. Mercer TR، Dinger ME و Mattick JS RNA های طولانی غیر کدکننده: بینش هایی در مورد توابع. Nat Rev Genet 10, 155–159, doi:10.1038/nrg2521 (2009). [PubMed: 19188922]

8. Ponting CP، Oliver PL و Reik W تکامل و توابع RNA های طولانی غیر کد کننده. Cell 136, 629– 641, doi:10.1016/j.cell.2009.02.006 (2009). [PubMed: 19239885]

9. Wilusz JE, Sunwoo H & Spector DL ​​Long noncoding RNA: شگفتی های عملکردی از دنیای RNA. Genes Dev 23, 1494-1504, doi:10.1101/gad.1800909 (2009). [PubMed: 19571179]

10. Kung JT، Colognori D & Lee JT RNA های طولانی غیر کد کننده: گذشته، حال و آینده. Genetics 193, 651-669, doi:10.1534/genetics.112.146704 (2013). [PubMed: 23463798]

11. Flynn RA & Chang HY Long noncoding RNAs در برنامه ریزی سرنوشت سلولی و برنامه ریزی مجدد. Cell Stem Cell 14, 752-761, doi:10.1016/j.stem.2014.05.014 (2014). [PubMed: 24905165]

12. Huarte M. نقش در حال ظهور lncRNA ها در سرطان. Nat Med 21، 1253-1261، doi:10.1038/nm.3981 (2015). [PubMed: 26540387]

13. Frankish A et al. حاشیه نویسی مرجع GENCODE برای ژنوم انسان و موش. Nucleic Acids Res 47, D766–D773, doi:10.1093/nar/gky955 (2019). [PubMed: 30357393]

14. ریاض ن و همکاران. تکامل تومور و ریزمحیط در طی ایمونوتراپی با نیولوماب Cell 171, 934–949 e916, doi:10.1016/j.cell.2017.09.028 (2017). [PubMed: 29033130]

15. هوگو دبلیو و همکاران. ویژگی‌های ژنومی و رونویسی پاسخ به درمان ضد PD{2}} در ملانوم متاستاتیک. Cell 168, 542, doi:10.1016/j.cell.2017.01.010 (2017).

16. Van Allen EM et al. همبستگی ژنومی پاسخ به انسداد CTLA{1}} در ملانوم متاستاتیک. Science 350, 207-211, doi:10.1126/science.aad0095 (2015). [PubMed: 26359337]

17. ناتانسون تی و همکاران. جهش های سوماتیک و همسانی نئواپی توپ در ملانوم های درمان شده با بلوک CTLA-4. Cancer Immunol Res 5, 84-91, doi:10.1158/2326-6066.CIR-16-0019 (2017). [PubMed: 27956380]

18. Sui J et al. تجزیه و تحلیل سیستماتیک یک امضای جدید مرتبط با lncRNA به عنوان نشانگر زیستی پیش آگهی برای کارسینوم کبدی. Cancer Med، doi:10.1002/cam4.1541 (2018).

19. Kaplan DH و همکاران. نمایش یک سیستم نظارت بر تومور وابسته به گاما اینترفرون در موش‌های دارای قابلیت ایمنی Proc Natl Acad Sci USA 95, 7556–7561, doi:10.1073/pnas.95.13.7556 (1998). [PubMed: 9636188]

20. ارائه آنتی ژن Fruh K & Yang Y توسط MHC کلاس I و تنظیم آن توسط اینترفرون گاما. Curr Opin Immunol 11, 76-81 (1999). [PubMed: 10047537]

21. دونگ اچ و همکاران. B{2}}H1 مرتبط با تومور آپوپتوز سلول T را ارتقا می دهد: مکانیزم بالقوه فرار ایمنی. Nat Med 8، 793-800، doi:10.1038/nm730 (2002). [PubMed: 12091876]

22. Perez-Pinera P و همکاران. فعال سازی ژن هدایت شده توسط RNA توسط فاکتورهای رونویسی مبتنی بر CRISPR-Cas{4}. Nat Methods 10، 973-976، doi:10.1038/nmeth.2600 (2013). [PubMed: 23892895]

23. لین اچ و همکاران. بیان میزبان PD-L1 اثربخشی رگرسیون تومور با واسطه انسداد مسیر PD-L1 را تعیین می کند. J Clin Invest 128, 1708, doi:10.1172/JCI120803 (2018). [PubMed: 29608143]

24. Sun Q، Hao Q و Prasanth KV RNA های غیرکد کننده طولانی هسته ای: تنظیم کننده های کلیدی بیان ژن. Trends Genet 34, 142-157, doi:10.1016/j.tig.2017.11.005 (2018). [PubMed: 29249332]

25. Cheng YS، Colonno RJ & Yin FH اینترفرون القای پروتئین های فیبروبلاست با فعالیت اتصال گوانیلات. J Biol Chem 258, 7746-7750 (1983). [PubMed: 6305951]

26. کیم بی اچ و همکاران. پروتئین های متصل شونده به گوانیلات ناشی از اینترفرون در فعال سازی التهاب و دفاع میزبان Nat Immunol 17، 481-489، doi:10.1038/ni.3440 (2016). [PubMed: 27092805]

27. Messeguer X و همکاران. PROMO: شناسایی عناصر تنظیم کننده رونویسی شناخته شده با استفاده از جستجوهای متناسب با گونه ها. Bioinformatics 18, 333-334, doi:10.1093/bioinformatics/18.2.333 (2002). [PubMed: 11847087]

28. کنسرسیوم، EP یک دایره المعارف یکپارچه از عناصر DNA در ژنوم انسان. Nature 489, 57-74, doi:10.1038/nature11247 (2012). [PubMed: 22955616]

29. Dai C & Sampson SB HSF1: نگهبان پروتئوستاز در سرطان. Trends Cell Biol 26, 17-28, doi:10.1016/j.tcb.2015.10.011 (2016). [PubMed: 26597576]

30. West JD، Wang Y & Morano KA فعال کننده های مولکولی کوچک پاسخ شوک حرارتی: خواص شیمیایی، اهداف مولکولی، و وعده های درمانی. Chem Res Toxicol 25، 2036–2053، doi:10.1021/tx300264x (2012). [PubMed: 22799889]

31. Zou J, Guo Y, Guettouche T, Smith DF & Voellmy R سرکوب فعال‌سازی فاکتور رونویسی شوک حرارتی HSF1 توسط HSP90 (کمپلکس HSP90) که یک کمپلکس حساس به استرس با HSF1 تشکیل می‌دهد. سلول 94، 471-480 (1998). [PubMed: 9727490]

32. Dayalan Naidu S & Dinkova-Kostova AT تنظیم فاکتور شوک حرارتی پستانداران 1. FEBS J 284, 1606-1627, doi:10.1111/febs.13999 (2017). [PubMed: 28052564]

33. Whitesell L & Lindquist SL HSP90 and the chaperoning of سرطان. Nat Rev Cancer 5، 761-772، doi:10.1038/nrc1716 (2005). [PubMed: 16175177]

34. Yost KE و همکاران. جایگزینی کلونال سلول های T اختصاصی تومور به دنبال مسدود شدن PD{2}}. Nat Med 25، 1251–1259، doi:10.1038/s41591-019-0522-3 (2019). [PubMed: 31359002]

35. هارل ام و همکاران. پروتئومیکس پاسخ ملانوما به ایمونوتراپی وابستگی میتوکندری را آشکار می کند. Cell 179, 236–250 e218, doi:10.1016/j.cell.2019.08.012 (2019). [PubMed: 31495571]

36. Heward JA & Lindsay MA RNA های غیر کد کننده طولانی در تنظیم پاسخ ایمنی. Trends Immunol 35، 408-419، doi:10.1016/j.it.2014.07.005 (2014). [PubMed: 25113636]

37. Flores-Concha M & Onate AA Long non-coding RNAs در تنظیم پاسخ ایمنی و ایمنی آموزش دیده. Front Genet 11, 718, doi:10.3389/fgene.2020.00718 (2020). [PubMed: 32793280]

38. Schmitt AM & Chang HY Long Noncoding RNAs در مسیرهای سرطان. سلول سرطانی 29، 452-463، doi:10.1016/j.ccell.2016.03.010 (2016). [PubMed: 27070700]

39. Sun TT و همکاران. LncRNA GClnc1 سرطان زایی معده را ترویج می کند و می تواند به عنوان داربست مدولار از مجتمع های WDR5 و KAT2A برای تعیین الگوی اصلاح هیستون عمل کند. Cancer Discov 6, 784–801, doi:10.1158/2159-8290.CD{10}} (2016). [PubMed: 27147598]

40. Sharma P، Hu-Lieskovan S، Wargo JA & Ribas A اولیه، تطبیقی ​​و مقاومت اکتسابی به ایمونوتراپی سرطان. Cell 168, 707–723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017). [PubMed: 28187290]

41. پنگ دی و همکاران. خاموش کردن اپی ژنتیک کموکاین‌های نوع TH{1}}ایمنی تومور و ایمونوتراپی را شکل می‌دهد. Nature 527, 249-253, doi:10.1038/nature15520 (2015). [PubMed: 26503055]

42. وانگ دبلیو و همکاران. سلول های T CD8(+) فروپتوز تومور را در طول ایمونوتراپی سرطان تنظیم می کنند. Nature 569, 270-274, doi:10.1038/s{8}}y (2019). [PubMed: 31043744]

43. گائو جی و همکاران. از دست دادن ژن های مسیر IFN-گاما در سلول های توموری به عنوان مکانیزم مقاومت در برابر درمان ضد CTLA{3}}. Cell 167, 397–404 e399, doi:10.1016/j.cell.2016.08.069 (2016). [PubMed: 27667683]

44. Zaretsky JM et al. جهش های مرتبط با مقاومت اکتسابی به انسداد PD-1 در ملانوما. N Engl J Med 375, 819–829, doi:10.1056/NEJMoa1604958 (2016). [PubMed: 27433843]

45. Manguso RT و همکاران. غربالگری CRISPR در داخل بدن، Ptpn2 را به عنوان یک هدف ایمونوتراپی سرطان شناسایی می کند. Nature 547, 413–418, doi:10.1038/nature23270 (2017). [PubMed: 28723893]

46. ​​Shin DS و همکاران. مقاومت اولیه در برابر محاصره PD{1}} با واسطه جهش های JAK1/2. Cancer Discov 7, 188-201, doi:10.1158/{9}}.CD{10}} (2017). [PubMed: 27903500]

47. مکنده A و همکاران. مقاومت اکتسابی IFNgamma ایمنی ضد تومور را مختل می کند و باعث ایجاد ضایعات ملانوم مقاوم به سلول T می شود. Nat Commun 8, 15440, doi:10.1038/ncomms15440 (2017). [PubMed: 28561041]

48. لی جی و همکاران. جهش‌های محرک اپی ژنتیک در ARID1A فنوتیپ ایمنی سرطان و ایمونوتراپی را شکل می‌دهند. J Clin Invest، doi:10.1172/JCI134402 (2020).

49. Benci JL et al. سیگنال دهی تومور اینترفرون یک برنامه مقاومت چند ژنی را به محاصره ایست بازرسی ایمنی تنظیم می کند. Cell 167, 1540–1554 e1512, doi:10.1016/j.cell.2016.11.022 (2016). [PubMed: 27912061]

50. Arun G، Diermeier SD & Spector DL ​​Therapeutic Targeting of Long Non-Coding RNAs در سرطان. Trends Mol Med 24, 257–277, doi:10.1016/j.molmed.2018.01.001 (2018). [PubMed: 29449148]

51. Gil N & Ulitsky I تنظیم بیان ژن توسط RNA های طولانی غیر کدکننده با اثر سیس. Nat Rev Genet 21, 102–117, doi:10.1038/s{8}} (2020). [PubMed: 31729473]

52. Jones AN & Sattler M چالش ها و دیدگاه ها برای زیست شناسی ساختاری lncRNA ها - مثالی از Xist lncRNA A- تکرار می شود. J Mol Cell Biol 11، 845-859، doi:10.1093/jmcb/mjz086 (2019). [PubMed: 31336384]

53. Shenoy AR و همکاران. GBP5 تجمع التهابی NLRP3 و ایمنی را در پستانداران ترویج می کند. Science 336, 481-485, doi:10.1126/science.1217141 (2012). [PubMed: 22461501]

54. Tretina K، Park ES، Maminska A و MacMicking JD پروتئین های متصل شونده به گوانیلات ناشی از اینترفرون: نگهبانان دفاع میزبان در سلامت و بیماری. J Exp Med 216, 482–500, doi:10.1084/ jem.20182031 (2019). [PubMed: 30755454]

55. یاماموتو ام و همکاران. گروهی از P65 GTPaseهای القایی با اینترفرون گاما نقش مهمی در دفاع میزبان در برابر توکسوپلاسما گوندی ایفا می کند. Immunity 37, 302-313, doi:10.1016/ j.immuni.2012.06.009 (2012). [PubMed: 22795875]

56. Mbofung RM و همکاران. مهار HSP90 با تنظیم مثبت ژن‌های پاسخ اینترفرون، ایمونوتراپی سرطان را افزایش می‌دهد. Nat Commun 8, 451, doi:10.1038/s{6}}z (2017). [PubMed: 28878208]

57. Proia DA و Kaufmann GF هدف قرار دادن پروتئین شوک حرارتی 90 (HSP90) به عنوان یک استراتژی مکمل برای مسدود کردن ایست بازرسی ایمنی برای درمان سرطان. Cancer Immunol Res 3، 583-589، doi:10.1158/{9}}.CIR{10}} (2015). [PubMed: 25948551]

58. Yuno A و همکاران. ارزیابی بالینی و نشانگرهای زیستی مهارکننده‌های Hsp90. Methods Mol Biol 1709, 423-441, doi:10.1007/978-1-4939-7477-1_29 (2018). [PubMed: 29177675]

59. چارو جی و همکاران. بیان بیش از حد Bcl{1}} بقای سلول های T خاص تومور را افزایش می دهد. Cancer Res 65, 2001– 2008, doi:10.1158/{9}}.CAN{10}} (2005). [PubMed: 15753400]

60. اواکی اچ و همکاران. Raf-1 برای تولید IL2 سلول T مورد نیاز است. EMBO J 12, 4367-4373 (1993). [PubMed: 8223446]