هورمون رشد موضعی غیر هیپوفیز با افزایش سن القا می شود و آسیب اپیتلیال را تسهیل می کند.

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه

عوامل ریزمحیطی تعدیل کننده آسیب DINA مربوط به سن نامشخص است. هورمون رشد غیر هیپوفیز (np) در کولون انسان، سلول‌های کولون تبدیل نشده انسانی و فیبروبلاست‌ها و در 3-ارگانوئیدهای بعدی روده با آسیب DNA مرتبط با سن القا می‌شود. اتوکرین/پاراکرین npGH p53 را سرکوب می کند و با القای TRIM29 و کاهش فسفوریلاسیون ATM، پاسخ آسیب DNA (DDR) را کاهش می دهد که منجر به کاهش ترمیم DNA و تجمع آسیب DNA می شود. ارگانوئیدهای کشت شده تا 4 ماه نشانگرهای پیری، p16 و SA{9}}گالاکتوزیداز و کاهش طول تلومر، و همچنین تجمع آسیب DNA، با افزایش npGH، سرکوب p53 و DDR ضعیف را نشان می‌دهند. سرکوب GH در ارگانوئیدهای مسن باعث افزایش p53 و کاهش آسیب DNA می شود. موش‌های WT تجمع آسیب DNA کولون وابسته به سن را نشان می‌دهند، در حالی که در موش‌های مسن فاقد سیگنال‌دهی GH کولون، آسیب DNA کم باقی می‌ماند، با p53 بالا. از آنجایی که القای npGH مرتبط با سن یک ریزمحیط پرولیفراتیو را قادر می‌سازد، سیگنال‌دهی npGH لغو می‌تواند به عنوان درمان ضد پیری با ممانعت از آسیب DNA و آسیب‌شناسی‌های مرتبط با سن مورد هدف قرار گیرد.

مقدمه

عملکردهای بیولوژیکی با افزایش سن و همزمان با افزایش بیماری های مرتبط با افزایش سن کاهش می یابد.فلاونوئیدهاآسیب شناسی های مرتبط با سن ناشی از آسیب انباشته DNA و کمبود در ترمیم DNA است که باعث جهش و ناهنجاری های کروموزومی مرتبط با سن می شود. آسیب مداوم DNA همچنین ممکن است تکثیر سلولی را مسدود کند و منجر به پیری و آپوپتوز شود و در نتیجه روند پیری را بیشتر کند (Ou and Schumacher, 2018). آسیب DNA با افزایش سن در سلول‌های نوع وحشی (WT)، تبدیل‌نشده انسان و موش تجمع می‌یابد، همانطور که با افزایش نوع هیستون 2A فسفریله (yH2AX)، نشانگر شکست‌های DNA دو رشته‌ای (DSBs) مشهود است (Sedelnikova و همکاران، 2004) و آسیب DNA ترمیم نشده (دال و همکاران، 1997؛ هاستی و همکاران، 2003؛ لومبارد و همکاران، 2005؛ پتر و همکاران، 2020). بی ثباتی ژنومی ناشی از ترمیم آسیب ناقص DNA ممکن است به تغییر سلولی کمک کند (نگرینی و همکاران، 2010). آسیب DNA باعث فسفوریلاسیون ژن های جهش یافته آتاکسی-تلانژکتازی (ATM) می شود که مسئول ترمیم شکستگی های DNA تک رشته ای و DSB ها هستند. ATM سرکوبگر تومور p53 را فسفریله و تثبیت می کند، بنابراین با تسهیل چندین مسیر ترمیم DNA، ترمیم آسیب DNA را تضمین می کند. بنابراین، ATM نقش کلیدی در فعال کردن پاسخ آسیب DNA (DDR) و تعمیر DNA ایفا می کند (Ou and Schumacher, 2018).

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

بیان و فعالیت ATM با افزایش سن بدتر می شود (Feng et al.. 2007; Gutierrez-Martinez et al., 2018)، احتمالاً منجر به از دست دادن عملکردی P53 مرتبط با سن و منجر به آسیب انباشته DNA و بی ثباتی کروموزومی می شود (Simon et al, 2009). پاسخ‌های .p53 به عوامل استرس‌زا مانند تشعشع در موش‌های مسن‌تر (فنگ و همکاران، 2007) و در فیبروبلاست‌های پوستی انسان مشتق‌شده از افراد مسن کمتر است (Goukassian و همکاران، 2000). بنابراین، علائم بارز پیری شامل کاهش فعالیت DDR و سرکوب p53 با آسیب DNA ترمیم نشده انباشته شده است، که همگی محیط مطلوبی را برای تکثیر اپیتلیال فراهم می‌کنند (لوپز- اوتین و همکاران، 2013).

از آنجایی که ترشح هورمون رشد هیپوفیز (GH) با افزایش سن کاهش می‌یابد، سیگنال‌های GH تغییر یافته در فرآیند پیری نقش دارند (هو و هافمن، 1993). و مدل های بیماری انسانی (براون-بورگ و همکاران، 1996؛ جونیلا و همکاران، 2013)، مزایای کمبود GH در درجه اول از مشاهداتی ناشی می شود که به دنبال عوامل ثانویه هستند که طول عمر را افزایش می دهند، از جمله افزایش حساسیت به انسولین، کاهش اکسیداسیون پروتئین کبدی. کاهش بروز سرطان و کاهش التهاب مرتبط با سن (Aguiar-Oliveira and Bartke, 2019; Bartke, 2016; Junnila et al., 2013; Spadaro et al., 2016; Spadaro et al., 2016). فرزندان لیدن خانواده هایی با طول عمر خانوادگی و مرگ و میر کمتر مطالعه کردند. نسبت به گروه کنترل همسان با محیط، سطوح GH در گردش یکپارچه پایین تری دارند (van der Spoeletal.، 2016)، در حالی که GHexcess طول عمر را همانطور که در بیماران مبتلا به آکرومگالی مشاهده می شود کاهش می دهد (Chesno-kova و همکاران، 2019a؛ Melmed، 2020؛ Waters and Barclay، 200). 7) و در مدل های موش تراریخته که GH را بیش از حد بیان می کنند (Bartke, 2003).هسپریدین استفاده می کندبرخی همبستگی منفی بین قد و طول عمر در انسان ها را پیشنهاد کرده اند (هی و همکاران، 2014؛ ساماراس و استورمز، 1992) و در سگ ها (گریر و همکاران، 2007)، ما فرض کردیم که اثرات نامطلوب GH بر افزایش سن ممکن است حداقل تا حدی به آسیب DNA انباشته نسبت داده می شود (Ches-nokova و Melmed، 2020). در حمایت از این فرض، لنفوسیت های مشتق شده از بیماران آکرومگالی آسیب DNA را با افزایش انحرافات کروموزومی نشان می دهند (Bayram et al, 2014)، در حالی که آسیب DNA ترمیم نشده در کبد مدل آکرومگالی گورخرماهی تجمع می یابد (Elbialy و همکاران، 2018). سطوح بالای GH در گردش، ترمیم DNA کولون موش را تضعیف می‌کند و باعث تجمع آسیب DNA می‌شود، در حالی که آسیب DNA پس از مسدود کردن گیرنده GH (GHR) در سلول‌های کولون انسانی و در موش‌ها با سیگنال‌دهی GHR منسوخ کاهش می‌یابد (Chesnokova و همکاران، 2019a).

GH غیر هیپوفیز (np) که به صورت موضعی در بافت های محیطی سنتز می شود با GH1 غدد درون ریز تولید شده توسط هیپوفیز یکسان است و از طریق مکانیسم های اتوکرین/پاراکرین از طریق GHR (Ballesteros و همکاران، 2000) که هم GH و هم لیگگان هیپوفیز (nGH) را شناسایی می کند عمل می کند. واترز و بارکلی، 2007؛ واترز و همکاران، 2006).سیستانچ امپراتوری از دست رفتهاز آنجایی که فعال‌سازی DDR باعث npGH می‌شود (Chesnokova و همکاران، 2013)، ما فرض کردیم که آسیب DNA کولون انباشته شده مرتبط با سن باعث بیان npGH می‌شود، که به نوبه خود، ترمیم آسیب DNA را محدودتر می‌کند.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

با استفاده از مدل‌های انسانی in vitro و ex vivo که منعکس‌کننده پیری هستند، در اینجا نشان می‌دهیم که npGH القا می‌شود و آسیب DNA در بافت‌های انسان مسن تجمع می‌یابد، همانطور که با افزایش فسفوریلاسیون H2AX (yH2AX) مشهود است. علاوه بر این، آسیب DNA کولون در موش‌های WT مسن به طور قابل‌توجهی افزایش می‌یابد، در حالی که آسیب DNA اپیتلیال در موش‌های GHR همسان با سن بدون سیگنال‌دهی GH و در موش‌های حذفی GHR اختصاصی کولون (GHRcolKO) کم است.

npGH محلی همچنین در ارگانوئیدهای 3-بعدی (3 بعدی) درون روده‌ای که از سلول‌های بنیادی پرتوان انسانی القایی (iPSCs) تولید شده‌اند، القا شد (Barett et al, 2014; Chesnokova et al, 2019a). npGH ارگانوئیدی، به نوبه خود، p53 را سرکوب کرد و ترمیم آسیب DNA را ضعیف کرد.کسری فلاونوئید خالص میکرونیزه 1000 میلی گرم استفاده می کنداثرات npGH به احتمال زیاد پاراکرین بود، زیرا کشت همزمان فیبروبلاست‌های بیانگر GH با دستگاه‌های میکروسیال روده-تراشه روده تعبیه‌شده با کلونوئیدهای انسانی برای سرکوب p53/p21 و افزایش آسیب DNA. در مقابل، سرکوب GH در ارگانوئیدهای مسن از آسیب DNA جلوگیری کرد.

بنابراین، ما نشان می دهیم که npGH اپیتلیال به شدت در طول پیری القا می شود و npGH ترمیم DNA را کاهش می دهد و تجمع آسیب DNA مرتبط با سن را تسهیل می کند. به طور کلی، نتایج نشان می‌دهد که npGH اپیتلیال کولون موضعی باعث تغییر میدان مخاطی می‌شود و محیطی از بی‌ثباتی کروموزومی ایجاد می‌کند که برای توسعه نئوپلاستیک در بافت پیری مطلوب است.

نکته مهم، اگرچه استفاده نامناسب گسترده ای از GH به عنوان یک هورمون "ضد پیری" علیرغم عدم تاثیر قانع کننده بر روند پیری وجود دارد (Blackman et al.,2002; Clemmons et al..2014; Lieut al.,2007; Melmed، 2019)، نتایج ما نشان می‌دهد که سیگنال‌دهی محلی GH به ریزمحیط بافت کمک می‌کند و به توسعه آسیب‌شناسی‌های مرتبط با سن کمک می‌کند. بنابراین سرکوب سیگنال دهی موضعی npGH برای محدود کردن آسیب نامطلوب DNA اپیتلیال ممکن است یک هدف درمانی بدون تخمک گذاری را ارائه دهد. نتایج این مطالعات یک رویکرد نوآورانه برای افزایش طول عمر (به عنوان مثال، سرکوب به جای القای سیگنال دهی محلی GH) را نشان می دهد. نتایج

آسیب DNA کولون انسان و npGH با افزایش سن انباشته می شود

آسیب DNA مرتبط با سن در نمونه‌های بافت پارافینی کولون انسانی غیر توموری که از گروه‌های بیماران در 3 گروه سنی مشتق شده بود، ارزیابی شد: جوان ({3}} سال)، میانسال (40-60 سال) و سالمند ( 61-88 سال). هنگامی که برای yH2AX امتیازدهی شد، 3 نمونه از 11 نمونه (27 درصد) در گروه جوان آسیب DNA، 8 مورد از 16 (50 درصد) آسیب DNA در میانسالی، و 8 نمونه از 18 (45 درصد) نمونه مسن آسیب DNA را نشان دادند (شکل ها). 1A-1C و 1J).

همانطور که قبلا نشان دادیم که آسیب DNA باعث ایجاد npGH می شود (Chesnokova و همکاران، 2013)، ما به دنبال تعیین اینکه آیا تجمع آسیب DNA وابسته به سن با بیان GH در بافت روده غیر توموری مرتبط است یا خیر. از آنجایی که هیچ در سلول های روده بزرگ عصبی غدد بیان می شود (Chesnokova و همکاران، 2016)، ما این سلول ها را از تجزیه و تحلیل حذف کردیم.

بیان GH اپیتلیال در 16 درصد -17 درصد نمونه‌های کولون طبیعی مشتق شده از گروه‌های میانسال و مسن (به ترتیب 38 و 42 نمونه) تشخیص داده شد، اما تنها در 2 درصد از گروه‌های جوان (37 نمونه) نمره بیان GH در گروه میانسال افزایش یافته و در نمونه های گروه مسن بیشتر افزایش یافته است (p<0.01) (figures="" 1d-1f="" and="" 1k).="" furthermore,="" colon="" mrna="" gh="" expression="" increased="" in="" both="" middle-aged="" (30%="" of="" 10="" samples)="" and="" aged="" (26%="" of="" 14="" samples)="" versus="" young="" cohort="" samples(17%="" of9=""><0.01 and=""><0.05, respectively)(figures="" 1g-1).="">اوتفلاوونوئیدبه طور خلاصه، این نتایج به تجمع آسیب DNA بدون القای در روده بزرگ اشاره دارد.

فعال سازی DDR باعث ایجاد npGHin موضعی کولون موش و انسان می شود

بعداً بررسی کردیم که آیا DDR فعال باعث بیان موضعی npGH کولون می‌شود یا خیر و موش‌ها را با nutlin3 برای تثبیت p53 درمان کردیم (Vassilev و همکاران، 2004) و کولون p53 و بالاتر را مشاهده کردیم (شکل 2A). قبل و بعد از درمان‌های آسیب‌رسان به DNA (جدول S1)، ما بیان npGH اپیتلیال پایه قبل از درمان و افزایش بیان npGH بعد از درمان را در هر 6 نمونه بیمار مورد مطالعه مشاهده کردیم (p<0.01) (figure="" 2b).="" enhanced="" gh="" expression="" was="" also="" observed="" in="" tumor-associated="" fibroblasts="" after="" dna="" damage(figure="" 2c),="" indicating="" that="" these="" findings="" are="" likely="" not="">

DDR بیان GH را در شرایط آزمایشگاهی فعال می کند

ما از اتوپوزید مهارکننده توپوایزومراز Il برای تولید شکستگی های DNA تک رشته ای و DSBs استفاده کردیم (والز و همکاران، 1996) و تعیین اینکه آیا DDR GH را در شرایط آزمایشگاهی فعال می کند یا خیر. npGH ناشی از آسیب DNA در سلول‌های آدنوکارسینومای کولون انسانی NCC، hNCF و HCT116 (شکل‌های 3A و S1A-S1C). در ارگانوئیدها، mRNA ژن GH و GH توسط اتوپوزید (شکل 3B و S1D)، در حالی که سطوح mRNA IGF1 و پرولاکتین بدون تغییر بود (شکل S1E). فسفوریلاسیون STAT5، یک سیگنال GH پایین دست (واترز، 2016)، در همه انواع سلول القا شد (شکل 3A-3C و S1A-S1C). در مقابل، لغو npGH با RNA مداخله گر کوچک GH (siRNA) مانع از القای pSTAT5 توسط اتوپوزید شد (شکل 3C و S1F)، که شواهدی را ارائه می دهد که npGH کولون ناشی از آسیب DNA از نظر عملکردی فعال است. تصویربرداری از NCC تیمار شده با اتوپوزید به مدت 24 ساعت، بیان همزمان GH و yH2AX را در سلول های متعدد نشان داد (شکل 3D).

سلول‌های اپیتلیال که تحت آسیب DNA قرار می‌گیرند GH ترشح می‌کنند برای تعیین اینکه آیا npGH درون سلولی القا شده اثرات اتوکرین/پاراکرین را اعمال می‌کند، ما سطوح GH ترشح شده در NCC و محیط کشت ارگانوئید را پس از درمان با اتوپوزید ارزیابی کردیم. محیط جمع آوری شده از ANCC در 8 و 24 ساعت پس از درمان و از ارگانوئیدها در 4-48 ساعت پس از درمان، افزایش GH وابسته به زمان را پس از فعال سازی DDR نشان داد (شکل 3E). از آنجا که NCC و ارگانوئیدها گیرنده های GH را مانند بافت کولون انسانی بیان می کنند (Chesnokova و همکاران، 2016)، این نتایج نشان می دهد که GH موضعی ناشی از آسیب DNA ممکن است بافت پیری را در معرض اقدامات اتوکرین/پاراکرین قرار دهد.

GH اتوکرین/پاراکرین سلول p53 کولون انسانی را سرکوب می کند

از آنجایی که GH غدد درون ریز p53 کولون موش را سرکوب می کند (Chesnokova و همکاران، 2016)، ما تعیین کردیم که آیا GH موضعی اثرات مشابهی در سلول های کولون اپیتلیال انسان اعمال می کند یا خیر. تجزیه و تحلیل دو خط NCC جداگانه مشتق شده از دو بیمار مختلف پس از نوکلئوفکشن با hGH یا عفونت با GH بیانگر لنتی ویروس (لنتی-GH) (شکل های 4A، 4B، و S2) و همچنین ارگانوئیدهایی که به طور پایدار hGH را بیان می کنند (شکل 4C) سرکوب شده را نشان داد. p53 و بیان بیش از حد همزمان. سلول های مشتق شده از ارگانو id های آلوده به lenti-GH یا ناقل خالی (lenti-V) پالس شده با برمودئوکسی یوریدین (BrdU) سرکوب p53 را نشان دادند و به دنبال آن ادغام BrdU متوسط ​​اما به طور قابل توجهی افزایش یافت که توسط مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس (FACS) تعیین شد (شکل) S3A). در مقابل، سرکوب GH با لنتی ویروس بیانگر سنجاق سر کوچک GH (GH) منجر به کاهش تشکیل کلنی و اندازه کلنی در NCC شد (شکل‌های S3B و S3C)، که نشان‌دهنده اقدامات npGH طرفدار ادبیات است.

اثرات پاراکرین GH در روده-تراشه کولون انسان برای ارزیابی اثرات پاراکرینی npGH بر سلول های اپیتلیال مخاط روده، UNCF آلوده به دستگاه های میکروفلوئیدی لنتی-GH و کولون روده-تراشه (Kasendra et al, 2020) را با بذر سالم کشت کردیم. سلول های اپیتلیال مشتق از ارگانوئید به مدت 8 روز. ترشح موضعی GH از hNCF به محیط توسط ELISA (سلول‌های 338ng/mL/1×10 درجه) تایید شد. تراشه‌ها 24 ساعت بعد تثبیت شدند و برای هسته‌های EdU، H2AX و EdU پلاس در سلول‌های اپیتلیال رنگ‌آمیزی شدند. یک مجموعه جداگانه از چیپس بذر

با سلول های اپیتلیال برای ارزیابی p53/p21 توسط وسترن بلات استفاده شد. تکثیر سلول های اپیتلیال تراشه افزایش یافت (ص<0.05), likely="" due="" to="" decreased="" p53="" and="" p21="" (figures="" 4d="" and="" 4e).="" moreover,="" dna="" damage="" accumulation="" was="" evident,="" with="" increased="" numbers="" of="" cells="" expressing="" γh2ax="" （p=""><0.01） （figure="">

GH اتوکرین/پاراکرین DDR را سرکوب می کند

فعال‌سازی ATM بر اثر آسیب DNA، H2AX را فسفریله می‌کند، که مکان‌های DNA آسیب‌دیده را برای فعال کردن DDR و ارتقای ترمیم علامت‌گذاری می‌کند (Turinetto and Giachino، 2015). در hNCC و همچنین در ارگانوئیدهای آلوده به pIRES2-ZsGreen1hGH یا با عدس-GH، بیان بیش از حد GH فسفوریلاسیون ATM و DNA پروتئین کیناز (PK)cs را که هر دو در ترمیم DNA نقش دارند، سرکوب کرد (بلکفورد و جکسون). 2017)، و کاهش فسفوریلاسیون پروتئین هدف p53 (شکل 5A{11}}C).

هیستون استیلاز Tip60 ATM را فعال می کند (جکسون و بارتک، 2009) و به طور منفی توسط TRIM29 تنظیم می شود (شو و همکاران، 2011؛ ​​سان و همکاران، 2005). ما مشاهده کردیم که بیان بیش از حد GH در NCC و در ارگانوئیدها نیز منجر به القای TRIM29 شد که به نوبه خود Tip60 را سرکوب کرد (شکل 5A-5C). نتایج مشابهی در خط دوم NCC 48 ساعت پس از نوکلئوفکشن با پلاسمید بیان کننده GH و در 6 روز پس از آلودگی با لنتی-GH مشاهده شد (شکل S4A و S4B).

GH اتوکرین/پاراکرین ترمیم DNA را کاهش می دهد

ما بعداً تأثیرات را روی مکانیسم‌های تعمیر DSB، به‌ویژه اتصال انتهای غیرهمولوگ مستعد خطا (NHEJ) (Jackson and Bartek, 2{18}}09) و نوترکیبی همولوگ ضد خطا (HR) (Beucher et al.,2009) اندازه‌گیری کردیم. ؛ بلکفورد و جکسون، 2017؛ چپمن و همکاران، 2012). ما NCC را که به طور پایدار بیان کننده NHEJ و HR کاست با pcDNA3 را تحت تأثیر قرار می‌دهند.1-پلاسمیدهای GH1 انسانی (hGH1)، DSB‌ها را با ترانسفکت کردن همزمان با پلاسمید کدکننده‌ی اندونوکلئاز I-Excel القا کردند و پیوستن مجدد گزارش‌دهنده‌های تعمیر DSB را اندازه‌گیری کردیم. کارایی ترانسفکشن با ترانسفکشن همزمان با پلاسمید رمزکننده DsRed کنترل شد (Seluanov و همکاران، 2010). راندمان NHEJ بعد از pcDNA3.{16}}هسته‌ای hGH1 0.{19}}.83 بود و در 48 ساعت کاهش یافت (p<0.05)(figure5d), and="" hr,while="" low(0.05),="" consistent="" with="" other="" reports="" (chitnis="" et="" al,2014;gatei="" et="" al.,2011),showed="" consistently="" decreased="" efficiency="" by="" up="" to="" 38.7%±3.5%="" (n="4" independent=""><0.05) at="" 72="">

GH اتوکرین/پاراکرین آسیب DNA ترمیم نشده را افزایش می دهد

با بررسی اینکه آیا npGH آسیب DNA را افزایش می دهد، مشاهده کردیم که NCC و ارگانوئیدهای ترانسفکت شده پایدار با lenti-GH افزایش آسیب DNA ترمیم نشده درون زا را با سنجش Comet نشان دادند (p< 0.05)="" (lee="" and="" paull,="" 2007)(figures="" 5e="" and="" 5f).="" levels="" of="" unrepaired="" dna="" were="" also="" markedly="" increased="" in="" a="" second="" ncc="" line="" in="" cells="" nucleofected="" with="" a="" plasmid="" expressing="" gh="" or="" infected="" with="" lenti-gh="" (figures="" s4c="" and="" s4d).="" overall,="" these="" results="" show="" that="" npgh="" is="" induced="" in="" response="" to="" dna="" damage="" and="" enhances="" dna="" damage="" accumulation="" by="" interfering="" with="" both="" ddr="" and="" dna="" repair="">

GH در ارگانوئیدهای روده سه بعدی انسان القا می شود و DDR را کاهش می دهد

به دنبال افزایش بیان GH و آسیب DNA در نمونه‌های کولون سالخورده انسان، شناسه‌های ارگانیک تولید شده از سه خط مستقل iPSC را برای بازنویسی مدلی از بافت انسان پیر تولید کردیم. این ارگانوئیدها از انتروسیت ها، سلول های جامی، سلول های Paneth و سلول های انترو غدد درون ریز تشکیل شده اند و هومئوباکس 2 (CDX2) از نوع دمی را بیان می کنند (بارت و همکاران 2014؛ گائو و همکاران، 2009؛ ورکمن و همکاران، 2017). دو تا از سه خط iPSC (خطوط 1 و 3) از افراد مسن تر از 60 سال به دست آمد و سومین خط iPSC (خط 2) از فیبروبلاست های یک فرد 30- ساله مشتق شد. ارگانوئیدهای تولید شده از خطوط 1 و 3 تا 2 ماه کشت داده شدند، در این مرحله تکثیر سلولی به طور قابل توجهی کاهش یافت. در مقابل، ارگانوئیدهای تولید شده از خط 2 تا 4 ماه به شدت در کشت تکثیر شدند. پیری سلولی در هر 3 خط با افزایش p16 و همچنین با کاهش طول تلومر تایید شد (p<0.05)(figures 6a="" and="" 6b).="" in="" aged="" organoids,="" we="" also="" found="" increased="" senescence-associated="" β-galactosidase="" (sa-β-galactosidase)="" activity,="" which="" has="" been="" shown="" to="" increase="" with="" age="" (kurz="" et="" al.,="" 2000;="" lee="" et="" al.,="" 2006),="" as="" well="" as="" increased="" β-galactosidase="" protein="" expression,="" which="" correlates="" with="" sa-β-galactosidase="" enzymatic="" activity(figures="" 6a="" and="">

از آنجایی که به نظر می‌رسد این ویژگی‌های ارگانوئیدی در شرایط آزمایشگاهی تغییرات سلولی مطابق با پیری بافت انسان را به طور صادقانه بیان می‌کنند (Baker et al.,2011; Lieut al.,2019; Lopez-Otin et al.,2013)، ما از این استفاده کردیم. مدلی برای مطالعه بیشتر مکانیسم های سیگنالینگ زیربنای پیری اپیتلیال کولون انسان. در خط 1، سطوح mRNA GH بعد از 1 ماه در کشت القا شد و بعد از 2 ماه بیشتر افزایش یافت (05/0p<) (شکل="" 6c)،="" که="" با="" افزایش="" قابل="" توجهی="" npgh="" که="" در="" ارگانوئیدهای="" مسن="" در="" هر="" دو="" روش="" وسترن="" بلات="" و="" ایمونوهیستوشیمی="" (ihc)="" مشاهده="" می‌شود،="" مطابقت="" دارد.="" (شکل="" های="" 6d،="" 6e="" و="" s5b).="" yh2ax="" نیز="" به="" شدت="" با="" کشت="" طولانی="" مدت="" القا="" شد،="" که="" نشان="" دهنده="" آسیب="" dna="" درون="" زا="" انباشته="" با="" پیری="" در="" شرایط="" آزمایشگاهی="" است.="" مطابق="" با="" نتایج="" نشان‌دهنده="" سرکوب="" p53="" در="" ncc="" و="" ارگانوئیدهای="" ترانسفکت‌شده="" با="" gh="" (شکل="" 4a{17}}c)،="" ما="" p53="" سرکوب‌شده="" را="" در="" 1="" و="" 2="" ماه="" کشت="" مشاهده="" کردیم،="" مطابق="" با="" افزایش="" npgh="" (شکل‌های="" 6e="" و="" s5b).="" نتایج="" مشابه="" (="" الف="" و="" ب)="" وسترن="" بلات="" (a)="" سلول="" های="" ancc،="" hncf،="" و="" hct116="" و="" (b)="" ارگانوئیدها.="" سلول="" ها="" با="" دوزهای="" مشخص="" شده="" اتوپوزید="" تحت="" درمان="" قرار="" گرفتند="" و="" 24="" ساعت="" بعد="" آنالیز="" شدند.="" ارگانوئیدها="" با="" 3="" میکرومولار="" اتوپوزید="" (etop)="" تیمار="">

(C) NCC نوکلئوفکت شده با GH siRNA (siGH RNA) یا اسکرامبل RNA (Scr RNA) به عنوان شاهد به مدت 24 ساعت با دوزهای مشخص شده اتوپوزید (Etop) درمان شد و 24 ساعت بعد آنالیز شد. کمیت ImageJ وسترن بلات در شکل S1 نشان داده شده است.

(D) تصویر نماینده NCC تحت درمان با اتوپوزید 20 میکرومولار به مدت 24 ساعت. GH، قرمز؛ yH2AX، سبز؛ فالویدین، خاکستری؛ DAPI، آبی. هسته سبز روشن نشان دهنده آپوپتوز است. نوار مقیاس، 20 um. سلول های کنترل، درمان نشده

(E) وسترن بلات GH در محیط کشت ANCC و ارگانوئیدهای تیمار شده به ترتیب با 20 یا 5 میکرومولار اتوپوزید. محیط از حرارت 8 و 24 ساعت و از ارگانوئیدها در 4-48 ساعت پس از تیمار جمع آوری شد. Ponceau به عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد. لکه های نماینده حداقل 3 آزمایش مستقل نشان داده شده است.

با کشت ارگانوئیدهای تولید شده از خطوط iPSC 2 و 3 به ترتیب به مدت 4 و 2 ماه به دست آمد (شکل S6A-S6D).

علاوه بر این، افزایش npGH در ارگانوئیدهای مسن با DDR ضعیف، با سرکوب فسفوریلاسیون هر دو ATM و DNA-PKcs و سطوح پایین تر p53 فسفریله همراه بود (شکل 6E و S5B). این نتایج نشان می دهد که فعالیت سرکوب شده DDR منجر به آسیب DNA ترمیم نشده انباشته می شود، همانطور که توسط القای yH2AX نیز مشهود است (شکل 6E و S5B). پس از 2 ماه در کشت، ارگانوئیدهای مسن آلوده به GH shRNA p53 افزایش یافت (شکل 6F و S7A) و کاهش آسیب DNA اندازه‌گیری شده با روش Comet (p<0.01)(figure 6g),="" indicating="" a="" requirement="" for="" npgh="" in="" age-related="" dna="" damage="" accumulation="" in="" this="">

کمبود سیگنالینگ GH آسیب DNA کولون را در داخل بدن در موش های پیر کاهش می دهد

برای تأیید نتایج به‌دست‌آمده در ارگانوئیدهای مسن، موش‌های WT و GHR{0}} مسن را در داخل بدن مورد مطالعه قرار دادیم. آسیب DNA کولون در موشهای WT مسن (24-ماهه) نسبت به موشهای WT جوان ({3}}ماهه) به طور قابل توجهی افزایش یافته است.<0.01), but,="" strikingly,="" was="" not="" increased="" in="" aged="" ghr-mice="" (figures="" 7a="" and="" s7b),="" likely="" due="" to="" p53="" in-duction.="" we="" also="" generated="" transgenic="" mice="" with="" colon-specific="" ghr="" excision="" (car1-cre/ghr"loxmox,="" ghrcolko)(figure="" s7d).="" control="" mice="" were="" derived="" from="" the="" same="" breeding,="" but="" they="" did="" not="" harbor="" the="" cre="" enzyme.="" colon="" dna="" damage="" was="" much="" reduced="" in="" 20-month-old="" male="" ghrcolko="" mice="" with="" ghr="" excision="" compared="" to="" control="" mice,="" but="" not="" in="" the="" small="" intestine="" with="" intact="" ghr(figure="" 7d).="" thus,="" it="" appears="" that="" dna="" is="" repaired="" more="" efficiently="" in="" mice="" devoid="" of="" gh="" signaling,="" likely="" due="" to="" the="" higher="" colon="" p53="" expression="" we="" observed="" in="" both="" ghr-/-and="" in="" ghrcolko="" animals(figures="" 7b,7c,="" 7e,="" s7c,="" and="" s7e).="" these="" in="" vivo="" results="" buttress="" our="" hypothesis="" that="" npgh="" en-hances="" age-associated="" colon="" dna="" damage="">

بحث

ما در اینجا نشان می دهیم که npGH با افزایش سن در بافت روده بزرگ انسان و در ارگانوئیدهای روده ای سه بعدی انسان افزایش می یابد. چندین خط شواهد نشان می‌دهد که در بافت کولون انسان مسن، npGH توسط آسیب DNA القا می‌شود، همانطور که در مدل‌های انسانی مشاهده شد، از جمله سلول‌های غیر توموری اپیتلیال، فیبروبلاست‌های طبیعی کولون، ارگانوئیدها و بافت سرطان کولون بیمارانی که تحت درمان‌های آسیب‌رسان به DNA هستند. ; ما همچنین یافته های مشابهی را در داخل بدن در کولون موش هایی با DDR فعال نشان می دهیم.

با استفاده از ارگانوئیدهای سه بعدی روده انسان، افزایش p16، پیری و کوتاه شدن تلومر را مشاهده کردیم که همگی با تغییرات مرتبط با سن در بافت انسان مطابقت داشت (بیکر و همکاران، 2011؛ ​​لیو و همکاران، 2019؛ لوپز-اوتین و همکاران، 2013). ). علی‌رغم محدودیت‌های مدل ارگانوئید، نتایج ما از ارگانوئیدهای روده‌ای به‌عنوان یک جمع‌بندی وفادار انسانی برای مطالعه مکانیسم‌های سیگنال دهی زمینه‌ای تغییرات کولون مرتبط با سن پشتیبانی می‌کند (Hu et al., 2018).

ما دریافتیم که npGH محلی، که به روش اتوکرین/پاراکرین عمل می‌کند، p53 را سرکوب می‌کند و تکثیر سلول‌های همسایه را افزایش می‌دهد. GH القایی همچنین DDR و ترمیم DNA را سرکوب می کند و تجمع آسیب DNA را بیشتر افزایش می دهد. نتایج همچنین با اثرات مشاهده شده بر تجمع آسیب DNA در تومورهای هیپوفیز انسانی ترشح کننده GH مطابقت دارد (بن-شلومو و همکاران، 2020).

اقدامات GH در بافت نرمال روده بزرگ به نفع ایجاد یک محیط پرولیفراتیو است که ممکن است زمینه ساز افزایش نرخ پولیپ های روده بزرگ مرتبط با سن باشد، که نمونه آن آسیب DNA مرتبط با سن و بی ثباتی کروموزومی به عنوان محرک های شیوع سرطان روده بزرگ در بیماران مسن تر است. 50 سال (Aunan و همکاران، 2017). افزایش آسیب DNA مرتبط با سن که در اینجا نشان می‌دهیم با گزارش‌هایی که نشان می‌دهد yH2AX به صورت خطی با افزایش سن در نمونه‌های کولون نرمال افزایش می‌یابد نیز مطابقت دارد (Risques et al., 2008). تنظیم مثبت مشاهده شده ما از yH2AX در ارگانوئیدهای پیر نشان دهنده تجمع آسیب DNA است، زیرا yH2AX مکان های آسیب DNA را برای جذب پروتئین های ترمیم DNA نشان می دهد (Turinetto و Giachino، 2015). این نتایج ممکن است ظاهراً با این واقعیت که GH القا شده در سلول های پیری فسفوریلاسیون H2AX را سرکوب می کند، ناسازگار باشد. با این حال، ما این مشاهدات را تفسیر می کنیم تا نشان دهیم که GH با کاهش فسفوریلاسیون ATM، فعالیت DDR را کاهش می دهد، که به نوبه خود، فسفوریلاسیون پروتئین های پایین دست از جمله H2AX را کاهش می دهد (اما به طور کامل لغو نمی شود). هنگامی که DDR به درستی فعال نمی شود، ترمیم DNA تغییر می کند، اما yH2AX همچنان انباشته می شود زیرا مکان های آسیب DNA ترمیم نشده را مشخص می کند. بنابراین، سطوح yH2AX مشاهده شده در بافت انسان پیر و ارگانوئیدها منعکس کننده یک نتیجه خالص از فعالیت DDR و مقدار DNA ترمیم نشده است.

آسیب DNA ممکن است به دلیل از دست دادن ترمیم برش پایه، احتمالاً از از دست دادن پاسخ p53 به آسیب DNA، در بافت پیر تجمع یابد (Cabelof و همکاران، 2006؛ سیمون و همکاران، 2009، 2012). در آزمایش‌های ما، p53 در سلول‌های کولون و ارگانوئیدهایی که npGH را افزایش می‌دهند کاهش یافت، که مطابق با یافته‌های قبلی در مورد سرکوب کننده p53 GH بود (Chesnokova و همکاران، 2016). در مقابل، موش‌های مسن GHR-/- که به سرطان مقاوم هستند و طول عمر بیشتری دارند (Basu et al., 2018)، و همچنین موش‌های GHRcolKO مخصوص کولون، بیان بیشتری از کولون p53 را نشان می‌دهند که احتمالاً ترمیم DNA را افزایش می‌دهد. از آنجایی که GH p53 را سرکوب می کند (Chesnokova و همکاران، 2013)، القای npGH ممکن است منجر به تغییرات در ریزمحیط محلی مطابق با کاهش p53 مرتبط با سن شود (Feng et al., 2007; Goukassian et al., 2000). پروموتر GH حاوی محل اتصال p53 است (Chesnokova و همکاران، 2013)، و p53 ناشی از آسیب DNA، بیان GH را فعال می کند (Chesnokova et al. 2013,2019a). بنابراین، نتایج ما نشان می‌دهد که در ارگانوئیدهای مسن، تجمع آسیب DNA باعث npGH می‌شود، که به نوبه خود، p53 را کاهش می‌دهد.

نکته مهم، از آنجایی که npGH به صورت موضعی از سلول های آسیب دیده با DNA ترشح می شود، یک عمل پاراکرین برای GH ترشح شده در سلول های همسایه می تواند عملی باشد. در حالی که کشت همزمان hNCF بیانگر GH با روده-تراشه کولون، آسیب و تکثیر DNA را افزایش دادیم و p53/p21 را در سلول های اپیتلیال تعبیه شده در تراشه که در معرض اثرات پاراکرین مشتق از فیبروبلاست قرار داشتند، کاهش دادیم. این نتایج نشان می‌دهد که پیری غیرالقای موضعی در بافت انسان با سرکوب پروتئین‌های سرکوب‌کننده تومور و افزایش تکثیر اپیتلیال و آسیب DNA، ریزمحیط بافت را تغییر می‌دهد.

نتایج با مشاهداتی که نشان می‌دهد درمان GH اگزوژن ظرفیت تکثیر، تشکیل کلنی و متاستاز را در موش‌های DJ-1 KO افزایش می‌دهد (Chien et al., 2016) و با شواهدی که القای GH در سلول‌های تومور انسانی مرتبط است، مطابقت دارد. پیشرفت چندین سرطان (پری و همکاران، 2017)؛ این نتایج با نتایج ما نشان می دهد که تشکیل کلنی کمتر و اندازه کلنی کوچکتر با سرکوب GH نشان می دهد.

مسیرهای ترمیم آسیب DNA در برابر بی ثباتی کروموزومی که باعث دگرگونی سلولی می شود محافظت می کند (نگرینی و همکاران 2010). به عنوان مثال، Tip60 ATM را فعال می کند (Jackson and Bartek, 2009) و ATM، تنظیم کننده مرکزی DDR، فسفریله و تثبیت p53 را انجام می دهد. سلول های پیری کاهش ATM و سرکوب p53 و همچنین اختلال در ترمیم DNA با آسیب DNA ترمیم نشده بعدی را نشان می دهند (Lan et al., 2019). بنابراین، در سلول‌های کولون، آسیب DNA با افزایش سن انباشته می‌شود (Risques et al., 2008; Schu-macher et al., 2008)، حداقل تا حدی به دلیل کاهش کارایی DDR (Jackson and Bartek, 2009) و p53 سرکوب شده در پاسخ به تابش y در موش‌های پیر به کاهش وابسته به سن در دستگاه‌های خودپرداز تثبیت‌کننده P (فنگ و همکاران، 2007) نسبت داده شد. در آزمایش‌های ما، عدم ایجاد در پاسخ به آسیب DNA، Tip60 را نیز سرکوب کرد، که احتمالاً منجر به به کاهش ترمیم DNA که به ترتیب توسط ATM ضعیف و فسفوریلاسیون p53 مشهود است. این نتایج نشان می‌دهد که بیان موضعی npGH ممکن است به ترمیم DDR و DNA بی‌نظم مرتبط با سن کمک کند. در ارگانوئیدهای مسن، القای GH DDR را ضعیف می کند، در حالی که سرکوب GH DDR را فعال می کند، همانطور که با کاهش آسیب DNA مشهود است. این نتایج توسط مشاهدات قبلی ما پشتیبانی می شود که مسدود کردن سیگنال دهی GH در ANCC منجر به کاهش آسیب DNA می شود (Chesnokova و همکاران، 2019a). علاوه بر این، ما نشان می‌دهیم که آسیب DNA کولون در موش‌های GHRcolKO هدف‌دار کولون با GHR بریده شده جمع نمی‌شود، اما در روده کوچک، جایی که GHR دست نخورده بود، تجمع می‌یابد. این نتایج، همراه با اثبات ما مبنی بر اینکه موش‌های مسن{20}GHR آسیب DNA کولون را جمع نمی‌کنند، در شرایط in vivo از این فرضیه حمایت می‌کند که القای موضعی npGH با سلول‌های سنی مایرندر مستعد تبدیل و احتمالاً در مقاومت به درمان سرطان نیز نقش دارد. پیشنهاد شده است (Basu and Kopchick, 2019).

نتایج نشان داده شده در اینجا همچنین این احتمال را افزایش می دهد که اثرات GH ممکن است توسط فاکتور رشد شبه انسولین 1 (IGF1) واسطه شود. برخلاف GH، سیگنال دهی IGF1 ترمیم DNA را در سلول های غیر توموری و توموری فعال می کند (Chesnokova و Melmed، 2020؛ Chitnis و همکاران، 2014؛ Turney و همکاران، 2012)، و ما نشان داده ایم که سرکوب GH p53 و القای DNA آسیب مستقل از IGF1 در بافت طبیعی کولون رخ می دهد (Ches-nokova و همکاران، 2019a، 2019b). با این حال، در سلول‌ها و بافت‌هایی که GH IGF1 را فعال می‌کند، فاکتور رشد دوم ممکن است به شیوه‌ای خاص سلولی برای خنثی کردن عملکرد GH بر پایداری ژنوم سیگنال دهد.

یافته ها نشان می دهد که npGH القا شده در بافت کولون پیر در پاسخ به آسیب DNA انباشته شده، آسیب بیشتر به DNA را تسهیل می کند و به نظر می رسد یک عامل نامطلوب در ترمیم آسیب DNA باشد. برون یابی این یافته ها بستری را برای چندین کاربرد بالینی بالقوه فراهم می کند. از آنجایی که تجمع آسیب DNA مشخصه بیماری‌های مرتبط با سن است، هدف قرار دادن سیگنال‌های GH برای مسدود کردن اتوکرین/پاراکرین، ممکن است برای جلوگیری از آسیب DNA اپیتلیال مرتبط با سن و در نهایت بهبود پیشرفت آسیب‌شناسی اپیتلیال مرتبط با سن مفید باشد (Miman et al. 2016) چنین رویکردی ممکن است به نفع بیماران سرطانی باشد که تحت درمان‌های آسیب‌رسان به DNA قرار می‌گیرند، که در آن‌ها تغییرات میدان اپیتلیال ناشی از اتوکرین/پاراکرین، هیچ اقدامی ممکن است به بافت طبیعی همسایه آسیب برساند. در این رابطه، اختلال در سیگنال دهی GH با یک آنتاگونیست تایید شده GHR (List et al., 2011; Trainer et al., 2000) ممکن است مزایای بالینی داشته باشد. مهمتر از همه، GH انسان به‌طور نامناسبی به‌عنوان یک درمان ضد پیری و تقویت‌کننده غیرمجاز معرفی شده است (جوردانو و همکاران، 2008؛ هولت و هو، 2019؛ مدیروس و سیگل واتکینز، 2018؛ ملمد، 2019). با توجه به اثرات مضر پاراکرینی npGH که در اینجا گزارش می‌کنیم، تجویز طولانی‌مدت نامناسب GH به عنوان یک اکسیر ضد پیری ممکن است سیگنال‌دهی GHR را برانگیزد و خطر ایجاد آسیب DNA سلول‌های اپیتلیال و همچنین فعال‌سازی بالقوه ضایعات تکثیری پنهان را به همراه داشته باشد.

این مقاله از Cell Reports 37، 110068، 14 دسامبر 2021، ª 2021 نویسنده(های) استخراج شده است. 1 این یک مقاله با دسترسی آزاد تحت مجوز CC BY-NC-ND است (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)