واکسیناسیون ویروس غیرفعال خودزای مادر ایمنی را نسبت به PRRSV در خوکچه ها تقویت می کند قسمت 1

خلاصه:

ایمنی مشتق شده از مادر یک جزء حیاتی برای بقا و موفقیت فرزندان در خوک ها برای محافظت در برابر پاتوژن های در گردش مانند ویروس نوع 2 خوک تولیدمثلی و سندرم تنفسی (PRRSV-2) است.

هدف از این مطالعه بررسی انتقال ایمنی ضد PRRSV به خوکچه‌هایی است که ویروس زنده اصلاح‌شده (MLV) را به تنهایی دریافت کرده‌اند (درمان (TRT) 0)، یا در ترکیب با یکی از دو غیرفعال شده خودزاد. واکسن ها (AIVs، TRT 1 به علاوه 2). خوکچه‌های این گیلت‌ها در سن دو هفتگی با سویه PRRSV{5}} خودزاد به چالش کشیده شدند و پاسخ ایمنی تطبیقی ​​(IR) آنها تا 4 هفته پس از تلقیح (dpi) ارزیابی شد.

IR هومورال و سلولی سیستمیک در گیلت‌های قبل از فارو، در خوک‌ها، قبل از تلقیح، و در 2 و 4 wpi مورد بررسی قرار گرفت. هر دو AIV تا حدی از خوک‌ها با کاهش آسیب‌شناسی ریه و افزایش وزن محافظت کردند. TRT 1 همچنین ویرمی خوک‌ها را کاهش داد، که به بهترین وجه با تولید آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده در گیلت‌ها و انتقال آن‌ها به خوک‌ها توضیح داده می‌شود. در خوک‌ها، قبل از تلقیح، تولیدکنندگان اصلی IFN سیستمیک سلول‌های CD21 به علاوه B بودند. از 0 به 4 wpi، نقش این سلول‌های B کاهش یافت و سلول‌های CD4 T تولیدکنندگان اولیه IFN سیستمیک شدند.

ویروس‌های زنده خوب به ویروس‌هایی اطلاق می‌شوند که باعث بیماری نمی‌شوند و ارتباط خاصی با ایمنی بدن انسان دارند. ویروس‌های زنده می‌توانند سیستم ایمنی بدن انسان را تحریک کنند تا پاسخ ایمنی ایجاد کند و در نتیجه ایمنی انسان را تقویت کند. مطالعات نشان داده است که بدن انسان پس از آلوده شدن به ویروس زنده، برخی واسطه‌ها و سیتوکین‌ها را آزاد می‌کند که می‌توانند سلول‌های ایمنی را فعال کنند، عملکرد سیستم ایمنی را تقویت کنند و توانایی بدن برای مقاومت در برابر ویروس‌ها را افزایش دهند.

علاوه بر این، ویروس‌های خوش‌خیم و زنده نیز می‌توانند به‌طور رقابتی سلول‌ها را اشغال کنند و حمله و تولید مثل را برای پاتوژن‌ها دشوار می‌کنند و در نتیجه بدن انسان را از سایر عفونت‌ها محافظت می‌کنند. بنابراین، عفونت ویروسی خوش خیم و زنده مناسب می تواند ایمنی انسان را بهبود بخشد، اما عفونت بیش از حد ممکن است منجر به بیماری شود. بنابراین در زندگی روزمره افراد باید به کنترل عفونت ویروس های زنده و بهبود ایمنی از طریق سبک زندگی سالم توجه کنند. از این منظر، ما نیاز به بهبود ایمنی داریم. سیستانچ می تواند به طور قابل توجهی ایمنی را بهبود بخشد. خاکستر گوشت حاوی انواع مواد فعال بیولوژیکی مانند پلی ساکاریدها، دو قارچ و Huangli و غیره است. این مواد می توانند عملکردهای مختلف سیستم ایمنی را تحریک کنند. سلول های سلول مانند، فعالیت ایمنی خود را افزایش می دهد.

روی فواید سلامتی سیستانچ کلیک کنید

در ریه‌ها، سلول‌های CD8 T اولیه و سلول‌های CD4 T تولیدکنندگان ثانویه IFN بودند، از جمله زیرمجموعه‌ای جدید از سلول‌های CD8-CCR7-CD4 T خوک، سلول‌های CD4 TEMRA بالقوه تمایز یافته. به طور خلاصه، این مطالعه نشان می‌دهد که واکسیناسیون AIV مادر می‌تواند حفاظت از خوک‌های قبل از شیرگیری را در برابر PRRSV بهبود بخشد. این اهمیت انتقال آنتی بادی های خنثی کننده به خوکچه ها را نشان می دهد و دو زیر مجموعه سلول ایمنی جدید را در خوک ها معرفی می کند - سلول های CD21 بعلاوه B تولید کننده IFN و سلول های T CD8 - CCR7 - CD4.

کلید واژه ها:

واکسیناسیون مادر؛ واکسن غیر فعال اتوژن؛ انتقال مصونیت؛ پاسخ ایمنی هومورال؛ پاسخ ایمنی سلولی؛ سلول های T؛ PRRSV; گراز؛ سلول های B تولید کننده IFN. سلول های CD4 TEMRA

1. معرفی

ایمنی ناشی از مادر (MDI) در پستانداران یک سمفونی الهام‌بخش است ("پیچیدگی هماهنگ"-[1]). در این سیستم یا سمفونی، یک مادر حفاظت ایمنی (موقت و/یا پایدار) را به فرزندان خود در طول بارداری از طریق جفت، پس از تولد از طریق ترشحات پستانی یا هر دو منتقل می‌کند [2]: انسان در طول بارداری و در نهایت از طریق پستان، ایمونوگلوبولین‌ها را دریافت می‌کند. ترشحات [3]; سگ ها و جوندگان در طول بارداری و از طریق ترشحات پستانی ایمونوگلوبولین ها را دریافت می کنند و خوک ها و سایر دام ها فقط از طریق ترشحات پستانی ایمونوگلوبولین ها را دریافت می کنند.

مشابه سایر گونه ها، خوکچه ها این MDI را به شکل ایمونوگلوبولین ها، سلول های ایمنی و سایر مولکول های مرتبط با ایمنی دریافت می کنند [4،5]. در حالی که ایمونوگلوبولین ها را می توان از خروس های مختلف دریافت کرد (= پرورش متقابل)، فقط مادران بیولوژیکی می توانند سلول های ایمنی را با موفقیت به فرزندان خود انتقال دهند [5]، و مقدار مصرف آغوز در خوکچه ها به طور قابل توجهی مرگ و میر را کاهش می دهد و عملکرد را بهبود می بخشد [6] ]. این سلول‌های ایمنی شامل سلول‌های B [7] و همچنین زیر مجموعه‌های مختلف سلول T-CD4، CD8 و عمدتاً گیرنده سلول T (TCR) - سلول‌های δ T هستند [8].

سپس این زیرمجموعه‌های سلول T را می‌توان بر اساس مرحله تمایز و الگوی خانه‌سازی بیشتر متمایز کرد. در خوک‌ها، زنجیره CD8 برای افتراق CD8 - ساده از CD8 به علاوه سلول‌های CD4 T تجربه شده با آنتی‌ژن یا حافظه استفاده می‌شود [9-11]. بیان گیرنده کموکاینی (CCR) 7 CCR7 به اضافه غدد لنفاوی را از سلول‌های T محل سکونت بافت محیطی CCR7- متمایز می‌کند [12]. با تجزیه و تحلیل ترکیبی CD8 / CCR7، سپس می‌توانیم چندین زیرمجموعه سلول T مختلف را تشخیص دهیم: CD8 - CCR7 به علاوه سلول‌های CD4 T ساده، سلول‌های CD8 به علاوه CCR7 به علاوه حافظه مرکزی (TCM) CD4 T، و CD8 به علاوه CCR7 - حافظه مؤثر (TEM). ) سلول های CD4 T. بافت محیطی خانه CCR7- و غدد لنفاوی خانه CCR7 به علاوه سلول های T CD8، و CD8 -CCR7-، CD8 به علاوه CCR7-، و CD8 به علاوه CCR7 به علاوه سلول های TCR-δ T.
در حالی که قبلاً گزارش دادیم که سلول‌های TCR-δ T خوک دارای الگوی معکوس خانگی در مقایسه با همتایان TCR- خود هستند، نقش ویژه این زیر مجموعه‌های مختلف هنوز توضیح داده نشده است [13]. هر دو، زیرمجموعه های سلول های ایمنی و آنتی بادی ها به فرزندان منتقل می شوند تا از آنها در برابر پاتوژن های مختلف محافظت کنند [4،5].

برای دهه‌ها، فاجعه‌بارترین پاتوژن برای خوک‌ها، ویروس‌های سندرم تنفسی و تولید مثل خوک بوده است (PRRSV، [14،15]). دو نوع اصلی PRRSV وجود دارد - نوع 1 و 2 (PRRSV-1 و 2). تنوع بالا و ظرفیت های سرکوب کننده سیستم ایمنی آنها، PRRSV را به یک بیماری مشکل ساز تبدیل می کند که منجر به خسارات اقتصادی عظیمی برای صنعت خوکی می شود [16] و تاکنون، در حالی که واکسن ها محافظت نسبی در برابر PRRSV ارائه می دهند، قادر به کنترل کامل این بیماری نبوده اند.

دو نوع واکسن اصلی برای محافظت در برابر PRRSV موجود است: واکسن‌های ویروس زنده اصلاح‌شده (MLV) و واکسن‌های غیرفعال، عمدتاً واکسن‌های غیرفعال خودکار (AIVs). با این حال، هر دو نوع با چالش های خود روبرو هستند.

زمان طولانی برای تولید واکسن‌های MLV بسیار ایمنی‌زا به این معنی است که آنها معمولاً نسبت به سویه‌های PRRSV رایج در مزرعه هترولوگ‌تر هستند، و در حالی که AIVs علیه این سویه‌های رایج در مزرعه هدایت می‌شوند، ماهیت غیرفعال آنها باعث می‌شود که عموماً ایمنی کمتری داشته باشند.

این چالش ها منجر به عدم حفاظت به خصوص در خوک های جوان می شود که می تواند به سه عامل نسبت داده شود: اول، نرخ بالای جهش PRRSV حفاظت هترولوگ را محدود می کند، بنابراین کارایی واکسن MLV را کاهش می دهد. دوم، ظرفیت سرکوب کننده سیستم ایمنی آن، واکسن‌های ضعیف‌تر (مانند AIVs) را محدود می‌کند و تأخیر در القای پاسخ ایمنی محافظتی، خوک‌های جوان را به‌ویژه حساس می‌کند [17]. و سوم، درک ما از پاسخ ایمنی به PRRSV، به ویژه در خوک‌ها، محدود است. Loving و Lunney یک بررسی خوب در رابطه با درک کلی از پاسخ ایمنی به PRRSV ارائه کردند [18،19].

عمدتاً بر اساس زمان طولانی برای ایجاد مصونیت ناشی از واکسن در برابر PRRSV، تولیدکنندگان خوک اغلب گیلت‌ها و خروس‌ها را برای انتقال ایمنی به خوک‌ها واکسینه می‌کنند. تحقیقات در مورد واکسیناسیون مادر با استفاده از یک MLV تجاری علیه نوع PRRSV-1 مانعی برای واکسیناسیون 2 یا {3}} خوکچه‌های هفتگی نشد و تا حدی از خوک‌ها در برابر چالش هترولوگ محافظت کرد [20]. این استراتژی واکسیناسیون همچنین سلول‌های ترشح کننده IgG، IgA و اینترفرون (IFN) اختصاصی PRRSV-1- را در آغوز و شیر خروس‌های واکسینه شده القا کرد. این سلول های تولید کننده IFN در پاسخ های ضد ویروسی از جمله در PRRSV بسیار مهم هستند [19،21].
این واکسیناسیون همچنین ضد PRRSV IgG سرم را القا کرد که پس از شش هفتگی برای خوک‌های واکسینه نشده قابل تشخیص بود و قبل از چالش در خوک‌های واکسینه شده ثابت باقی ماند. با این حال، سلول‌های ترشح‌کننده IFN را نمی‌توان از سطوح پس‌زمینه در خوک‌های از شیر گرفته تشخیص داد [22]. در حالی که استفاده از MLV ها یک استاندارد صنعتی است، یک رژیم واکسیناسیون ترکیبی واکسیناسیون تقویت کننده MLV و AIV امیدوارکننده به نظر می رسد برای غلبه بر هر یک از جنبه های منفی استفاده مستقل از MLV و AIVs.

بنابراین، هدف اصلی این مطالعه تعیین این بود که نه تنها، بلکه چگونه واکسیناسیون مادر با دو AIV مختلف (درمان (TRT) 1 به علاوه 2) می‌تواند واکسیناسیون استاندارد MLV را به تنهایی تقویت کند (TRT 0) ، برای محافظت بهتر از فرزندان در برابر چالش اولیه PRRSV2. برای این منظور، ما پاسخ ایمنی هومورال و سلولی (CMI) ناشی از واکسن را در این گیلت‌ها مورد مطالعه قرار دادیم و در سن 2 هفتگی، شیردهی‌های اولیه را از گیلت‌ها در هر یک از این گروه‌ها به چالش کشیدیم. پاسخ ایمنی سیستمیک و موضعی این خوک‌ها به مدت 2 تا 4 هفته پیگیری شد.

ما نشان می‌دهیم که واکسیناسیون تقویت‌کننده AIV می‌تواند محافظت از خوک‌ها را در برابر چالش PRRSV در ۲ هفتگی بهبود بخشد و همچنین مکانیسم‌های ایمنی اساسی را شناسایی کرده و پاسخ هومورال و CMI ضد PRRSV را در این خوک‌های جوان مشخص می‌کنیم. علاوه بر این، ما دو نوع سلول جدید را در خوک ها شناسایی کردیم: (1) سلول های CD8 - CCR7 - CD4 T که به شدت در تولید IFN- در لاواژ برونش آلوئولار (BAL) کمک می کنند - سلول های CD4 TEMRA بالقوه، و (2) منبع اصلی از پاسخ ضد PRRSV به ویژه در خوکچه ها - سلول های B تولید کننده IFN.

2. مواد و روشها

2.1. طراحی مطالعه، حیوانات، و پردازش نمونه

هدف از این مطالعه بررسی تأثیر سری های مختلف واکسیناسیون PRRSV2 مادری بر ایمنی حفاظتی خوکچه های شیر گرفته در برابر PRRSV{1}} بود. قبل از مطالعه، یک سویه PRRSV{2}} در گردش (چند شکلی طول قطعه محدود (RFLP)، 1-7-4) از یک شرکت گوشت خوک کارولینای شمالی توسط دو شرکت مستقل علوم زیستی جدا و تکثیر شد. آنها دو واکسن خودزای مجزا تولید کردند. هر دو واکسن حاوی اجزای اختصاصی متفاوتی بودند اما دارای سویه غیرفعال شده 1-7-4 PRRSV-2 یکسانی بودند. طرح این مطالعه در شکل 1 نشان داده شده است.

هر دو واکسن به صورت داخل عضلانی در یک سری از چهار دوز قبل از زایمان انجام شد: توسط برنامه واکسیناسیون شرکتی شرکت گوشت خوک کارولینای شمالی، 46 PRRSV{1} گیلت منفی در یک مزرعه تجاری خروس با واکسن Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheimtme) واکسینه شدند. GmbH، آلمان) نه هفته قبل از تولید مثل. برای حفظ اصطلاحات سازگار در سراسر این مطالعه، خوک‌های ماده بالغ از نظر جنسی ثبت‌نام شده (در اینجا به عنوان gilts تعریف می‌شوند) حتی پس از پرورش و زایمان (که معمولاً به آنها خروس گفته می‌شود) به عنوان gilts نامیده می‌شوند. چهار هفته قبل از تولید مثل، نمونه‌های خونی از همه گیلت‌ها برای سرم جمع‌آوری شد و سپس گیلت‌ها به سه تیمار تقسیم شدند: TRT 0 (فقط واکسیناسیون MLV). TRT 1 (واکسیناسیون MLV به اضافه 4 دوز واکسن اتوژن ({5}}) غیرفعال 1). یا TRT 2 (واکسیناسیون MLV به اضافه 4 دوز واکسن اتوژن ({9}}) غیرفعال 2).

Gilts that did not breed were dropped from the study. 3 weeks before farrowing, blood was collected from pregnant gilts for the isolation of serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). At this point, five gilts remained in both TRT 0 and TRT 2; nine gilts remained in TRT 1. Within these gilts, we selected three gilts per group to provide the piglets for the challenge study. The selected gilts had an adequate litter size (>7) و بالاترین تیتر خنثی سازی کانونی فلورسنت سرم (FFN) (معیارهای ایمنی اولیه) و بالاترین پاسخ IFN سلول T CD4 (معیارهای ایمنی ثانویه) در برابر سویه چالشی AIV در گروه خود. برای TRT 1 به علاوه 2، این تیترهای FFN از 1:4 تا 1:128 متغیر بودند. از آنجایی که TRT {{10}} هیچ تیتری در برابر سویه AIV نداشت، ما گیلت‌هایی را با بالاترین تیتر ضد MLV انتخاب کردیم. این تیترها از 1:16 تا 1:32 متغیر بودند. پاسخ IFN در همه گیلت‌های انتخاب شده از 0.09-0.21 درصد از کل سلول‌های CD4 T متغیر بود.

هر کدام از این گیلت ها چهار خوکچه را برای مطالعه چالش فراهم کردند. در سن 2 هفتگی (= 0 هفته پس از عفونت، wpi)، چهار خوکچه با میانگین وزن بستر برای مطالعه چالش انتخاب شدند و به امکانات مسکن سطح 2 امنیت زیستی دانشگاه ایالتی کارولینای شمالی منتقل شدند. NCSU) منابع حیوانی آزمایشگاهی (LAR) (رالی، کارولینای شمالی). در اینجا، آنها به طور تصادفی به یکی از شش قلم در همان اتاق اختصاص داده شدند. دو خوک در هر تیمار در هر قلم قرار گرفتند (یکی در هر گیلت). به طور خلاصه، در مجموع 36 بچه خوک در این مطالعه با 12 خوک در هر گروه درمانی وجود داشت.

During the study, four piglets died before the end of the study: three piglets from one gilt (TRT 0) died within 30 h of arrival at LAR and were dropped from the study. Additionally, one pig (TRT 2) was euthanized between weeks three and four of the study due to high fever (>106◦ F) و عدم پاسخ به تحریک فیزیکی. این خوک در تمام آنالیزها تا هفته 3 وارد شد و ریه های آن از نظر آسیب شناسی مورد ارزیابی قرار گرفت. هیچ تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری (FCM) برای این حیوان در کالبدگشایی رخ داده است.

یک روز پس از از شیر گرفتن و ورود به NCSU، همه خوک‌ها با 1 × 105.5 PRRSV{3}} ذرات ویروسی (سویه خودکار 1-7-4) در 1 میلی‌لیتر سالین بافر با فسفات 1X (PBS، Corning، Corning،) داخل بینی تلقیح شدند. NY، ایالات متحده) (500 میکرولیتر در سوراخ بینی)، به مدت 30 ثانیه در وضعیت خوابیده قرار گرفتند و به قلم خود بازگشتند. نیمی از حیوانات در dpi 2 و بقیه حیوانات با dpi 4 قربانی شدند. در کالبدگشایی، BAL، ریه ها و غدد لنفاوی تراشهئوبرونشیال (TrBr LNs) جمع آوری و همانطور که قبلا توضیح داده شد پردازش شدند [13].

نمونه برداری قبل از تلقیح (0 wpi) و سپس به صورت هفتگی، همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، انجام شد. سرم در لوله های جداکننده سرم (SST) جمع آوری شد (Becton Dickinson (BD) Biosciences, San Jose, CA, USA) و خون برای جداسازی PBMC در لوله های هپارین (BD Biosciences) جمع آوری شد. اسکان حیوانات توسط راهنمای مؤسسه ملی بهداشت برای حیوانات تحقیقاتی انجام شده است. خوک‌ها دسترسی نامحدودی به آب داشتند، با یک رژیم غذایی انتقالی از شیر گرفتن، سپس یک رژیم غذایی منظم دو بار در روز تغذیه شدند و در دمای 83 درجه فارنهایت با چرخه نور/تاریکی 12-ساعت نگهداری شدند. روش‌های آزمایشی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات نهادی دانشگاه ایالتی NC (IACUC) ID# 17-166A (29 نوامبر 2017) تأیید شد.

2.2. انتشار، تیتراسیون و ارزیابی ویروس

ایزوله ویروسی PRRSV-2 (سویه، 1-7-4) روی ماکروفاژهای آلوئولی خوک منفی PRRSV (PAMs) در RPMI{3}}، 1× با ال-گلوتامین (Corning، Corning، NY) تکثیر شد. ، ایالات متحده آمریکا) همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) (VWR, Radnor, PA, USA) و 1X آنتی بیوتیک-ضد قارچ (Corning) (به عنوان RPMI-کامل) به مدت تقریباً 30 ساعت در فلاسک های T{11}} (Sarstedt، Nümbrecht، آلمان) تا زمانی که یک اثر سیتوپاتیک مشاهده شد. فلاسک ها یک بار منجمد و ذوب شدند و مایع رویی در 2200 گرم در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه چرخانده شد. برای تغلیظ ویروس، مایع رویی سپس به لوله های سانتریفیوژ 36 میلی لیتری Nalgene (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) منتقل شد و در یک اولتراسانتریفیوژ Sorvall 100S (Sorvall, Thermo Fisher Scientific), Newtown, CT, USA) در 73 چرخانده شد. ,000 گرم در 4 ◦C به مدت 2 ساعت.

مایع رویی دور انداخته شد و گلوله مجدداً در محیط کشت (RPMI کامل) معلق شد و در مقادیر 100 میکرولیتری در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیره شد. تیتر دوز عفونی کشت بافت 50 (TCID50) محلول‌های استوک ویروسی با استفاده از PAMها همانطور که قبلاً توضیح داده شد (روش Spearman-Karber TCID50 مطابق دستورالعمل آزمایش‌های تشخیصی OIE [سازمان جهانی بهداشت حیوانات، سابقاً دفتر بین‌المللی Epizooties (OIE) تعیین شد. ), "فصل 2.8.7 سندرم تناسلی و تنفسی خوک"، Terr. Man.، شماره می 2015، 2015].

2.3. ویرمی

سرم جدا شده توسط آزمایشگاه تشخیصی شرکت گوشت خوک کارولینای شمالی با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی با رونویسی معکوس (RT qPCR) با کیت RNA/DNA پاتوژن MagMAX 5X (Thermo Fisher Scientific) و کیت VetMAX PRRSV qPCR (Thermo Fisher Scientific) آنالیز شد. همانطور که آزمایشگاه تشخیص دامپزشکی دانشگاه ایالتی آیووا (ISU VDL، Ames، IA، ایالات متحده آمریکا) تعیین شد، سرم گیلت واکسینه شده PRRSV منفی (qPCR) در زمان زایمان بود. مقادیر ΔCt با کم کردن مقدار Ct یک نمونه از مقدار Ct در نظر گرفته شده به عنوان PRRSV منفی (Ctneg=37) برای PRRSV محاسبه شد: ∆Ct=37 - Ctx.

2.4. اعتبارسنجی آنتی بادی خنثی کننده و تعیین نمونه های مثبت

نمونه‌های سرمی از گیلت‌ها و خوک‌ها به آزمایشگاه تحقیقاتی و تشخیصی حیوانات دانشگاه ایالتی داکوتای جنوبی (بروکینگز، SD) فرستاده شد. یک نتیجه مثبت، بالاترین رقت سرم با کاهش 90 درصدی یا بیشتر در تعداد واحدهای کانونی فلورسنت است [23].

2.5. مراحل کالبدگشایی، نمره گذاری، و جداسازی سلول های بافتی

در کالبدگشایی (2 یا 4 wpi)، حیوانات با استفاده از تزریق داخل وریدی کشنده یوتازول (Covetrus، MW، 390 میلی گرم در میلی لیتر پنتوباربیتال، 50 میلی گرم فنی توئین در میلی لیتر) قربانی شدند. سپس ریه ها، تیموس و LN های TrBr برداشت شدند.

برای ریه ها، عکس های پشتی و شکمی گرفته شد. ریه ها با 1 × PBS برای جمع آوری لاواژ آلوئولی برونش (BAL) شسته شدند و پنج نمونه برای بافت شناسی گرفته شد: هر کدام از لوب های دمی راست و چپ، لوب میانی راست و چپ و سپس یک نمونه از لوب جانبی. نمونه های بافت شناسی در فیکساتور فرمالدئید/روی (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) به مدت 24 ساعت تثبیت شدند، به اتانول 70 درصد منتقل شدند و با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شدند. اسلایدهای رنگ‌آمیزی (بافت‌شناسی) و عکس‌های ریه (آسیب‌شناسی ناخالص) به ISU VDL فرستاده شد و توسط یک پاتولوژیست تشخیصی دامپزشکی که از درمان‌ها و تاریخ کالبدگشایی نابینا بود، نمره‌گذاری شد. امتیازدهی ضایعه ریه و پنومونی بینابینی همانطور که قبلاً توضیح داده شد [24] انجام شد.

نماهای پشتی و شکمی عکس های ریه برای درصد ریه مبتلا به پنومونی ارزیابی شد. به طور خاص، درصد پنومونی به صورت بصری برای هر لوب ریه برآورد شد و درصد کل برای کل ریه بر اساس نسبت وزنی هر لوب نسبت به حجم کل ریه محاسبه شد. هر یک از چهار لوب جمجمه ای 10 درصد، لوب جانبی 5 درصد و هر یک از دو لوب دمی 27.5 درصد از کل ریه را تشکیل می دادند.

بخش‌های هیستوپاتولوژی ریه کورکورانه از نظر ضایعات میکروسکوپی مورد بررسی قرار گرفتند و به هر لوب یک امتیاز تخمینی بر اساس شدت پنومونی بینابینی به شرح زیر داده شد: 0=بدون ضایعات میکروسکوپی. 1=حداقل پنومونی بینابینی؛ 2=پنومونی بینابینی خفیف. 3=پنومونی بینابینی متوسط؛ 4=پنومونی بینابینی فراوان. 5=پنومونی بینابینی چند کانونی شدید. 6=پنومونی بینابینی منتشر شدید. برای تمام بافت‌های جمع‌آوری‌شده (ریه‌ها، تیموس، و TrBr LN)، بافت به قطعات کوچک بریده شد و از طریق صافی‌های تخلیه گرد فولادی ضد زنگ (Grainger, Lake Forest, IL, USA) در لوله‌های 50 میلی‌لیتری با PBS سرد یخی برای شستشو فشار داده شد. سوسپانسیون های تک سلولی توده های فیبری با فیلترهای 40 میکرومتری (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) فیلتر شدند.

2.6. جداسازی خون محیطی، تحریک ویروسی و رنگ‌آمیزی/آنالیز IFN-FCM

جداسازی PBMC با استفاده از سانتریفیوژ دانسیته Ficoll-Paque (GE Healthcare، اوپسالا، سوئد) و لوله‌های SepMate{1}} ml (STEMCELL Technologies، ونکوور، BC، کانادا) توسط پروتکل سازنده انجام شد. PBMC و تعداد سلول‌های تعلیق تک سلولی روی یک سیستم شمارش سلولی CASY تکمیل شد (سیستم Schärfe، اکنون: Roche Innovatis AG، Bielefeld، آلمان). برای سنجش تولید IFN، 5 × 105 PBMC و لنفوسیت از ریه‌ها و TrBr LNs در هشت تکرار در یک صفحه ته گرد خوب (کورنینگ) در 100 میکرولیتر RPMI-کامل کاشته شدند و یک شب در یک ظرف استراحت کردند. انکوباتور در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2. صبح روز بعد 100 میکرولیتر RPMI-complete حاوی سویه PRRSV 1-7-4 (Multiplicity of Infection, MOI=0.1) به هر چاهک اضافه شد. صفحات برای 24 ساعت تحریک ویروسی به انکوباتور بازگردانده شدند.

برای 4 ساعت آخر کشت، موننسین (5 میکروگرم در میلی لیتر، آلفا ایزار، هاورهیل، MA، ایالات متحده آمریکا) برای جلوگیری از انتشار IFN از سلول ها اضافه شد. پس از اتمام 24 ساعت جوجه کشی، تکرارها ادغام و رنگ آمیزی شدند که در جدول 1 بیان شده است. به طور متوسط ​​276756 لنفوسیت زنده مجرد (SLLs) بر روی Cytoflex با استفاده از نرم افزار CytExpert (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ثبت شد. تجزیه و تحلیل داده ها با FlowJo نسخه 10.6.1 (FLOWJO LLC) انجام شد. سلسله مراتب دروازه ای برای تجزیه و تحلیل پاسخ IFN- در شکل های 4 و 5 برای PBMC و در شکل تکمیلی S1 و شکل 7 برای BAL، بافت ریه و LN های TrBr نشان داده شده است.

2.7. تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از Graphpad Prism 8 (نرم افزار Graphpad، San Diego، CA، USA) انجام شد. داده‌ها با مجموعه داده‌های کامل با استفاده از آنالیز واریانس دو طرفه (در طول مطالعه) یا یک طرفه (در کالبدگشایی) تجزیه و تحلیل شدند. داده‌های دارای نقاط داده از دست رفته (عمدتاً به دلیل کالبدگشایی 50 درصد خوک‌ها در dpi 2) با یک مدل اثرات مختلط (حداکثر احتمال محدود، REML) تجزیه و تحلیل شدند. تمام مقایسه های چندگانه با آزمون مقایسه چندگانه دانت انجام شد. تصویرسازی داده‌ها با استفاده از نمودارهای ویولن انجام شد که توزیع، نقاط منفرد، میانه (در صورت لزوم، خط سیاه چین) و فواصل 25/75 (به عنوان یک خط رنگی قابل اجرا) را نشان می‌دهد. تجزیه و تحلیل همبستگی بین سطوح nAb طلایی و خوکچه با استفاده از ضرایب همبستگی پیرسون و فاصله اطمینان 95 درصدی دو دنباله انجام شد.

3. نتایج

3.1. طراحی مطالعه و اثربخشی واکسن - علائم بالینی، ویرمی، افزایش وزن و آسیب شناسی ریه

این مطالعه همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است انجام شد. پس از تلقیح PRRSV، خوک ها علائم خفیف PRRSV را نشان دادند که در عرض 3 تا 4 روز پس از عفونت شروع می شد - تب [عمدتا در 1 wpi، dns]، بی حالی، کاهش مصرف غذا، سرفه/عطسه خفیف. هیچ تفاوت معنی داری برای این علائم مشاهده نشد و تا زمان کالبدگشایی به درجات مختلف ادامه داشت. شکل 2 ویرمی، افزایش وزن هفتگی بدن و همچنین نمرات ناخالص و هیستوپاتولوژی را نشان می دهد.

همانطور که در شکل 2 الف نشان داده شده است، همه خوک ها در هنگام از شیر گرفتن PRRSV-2 منفی بودند و تلقیح داخل بینی با PRRSV-2 باعث ایجاد ویرمی شد که در wpi 2 به اوج خود رسید. در حالی که هیچ تفاوتی در ویرمی بین TRT 0 و TRT 2 وجود نداشت، TRT 1 در دو هفته اول ویرمی کمتری نسبت به گروه کنترل TRT 0 داشت. افزایش وزن خوک ها در تمام گروه ها برای سه هفته اول بسیار مشابه بود. با این حال، در پایان مطالعه - و در مقایسه با TRT 0 - TRT 2 و TRT 1 به طور قابل توجهی افزایش وزن هفتگی بالاتری داشتند - شکل 2B. مهمتر از همه، در حالی که آسیب شناسی ریه به طور کلی در عفونت PRRSV حل می شود و بنابراین بین گروه ها در 4 dpi (dns) مشابه بود، هر دو واکسن AIV مادر، بنابراین TRT 1 به علاوه 2، آسیب شناسی ریه را به طور قابل توجهی در 2 wpi کاهش داد: هر دو سطح درصد را کاهش دادند. ضایعات ماکروسکوپی و/یا پنومونی بینابینی (شکل 2C، D). شیوع ضایعات ریوی ماکروسکوپیک در ریه ها از TRT 0 بین 20-70 درصد بود. در مقابل، اکثر خوکها در TRT 1 به علاوه 2 شیوع ضایعه ریوی زیر 20 درصد داشتند - شکل 2C. به طور مشابه، در حالی که میانگین امتیاز هیستوپاتولوژی برای پنومونی بینابینی در ریه ها از خوک های TRT 0 سه بود، برای TRT 1 به ترتیب 1.8 و برای TRT 2 1.2 بود. در مقایسه با TRT 0، این نشان دهنده تمایل به اهمیت (p=0.07) و کاهش قابل توجهی در هیستوپاتولوژی ریه در خوک ها از گیلت های واکسینه شده با AIV است - شکل 2D. این داده ها نشان می دهد که واکسیناسیون AIV می تواند به طور قابل توجهی ویرمی و آسیب شناسی ریه را کاهش دهد، علاوه بر این، آنها همچنین نشان می دهند که واکسیناسیون AIV مادر در برابر PRRSV{36}} می تواند ایمنی خوکچه های یک هفته ای را تقویت کند.

3.2. القای آنتی بادی های خنثی کننده مادر و انتقال آنها به خوکچه ها

القای پاسخ ایمنی هومورال در گیلت ها و فرزندان آنها با تعیین تیترهای NA FFN مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (شکل 3).

واکسیناسیون همه گروه‌ها با MLV باعث ایجاد تیتر NA در گیلت‌های بین 4 تا 64 شد، بدون اینکه تفاوت معنی‌داری بین سه گروه (dns) وجود نداشت. در مقابل، در حالی که واکسیناسیون MLV به تنهایی (TRT 0) شامل NA در برابر سویه هترولوگ 1-7-4 نمی‌شود، هر دو واکسیناسیون تقویت کننده AIV تیترهای NA را تا 1:16 (برای TRT 2) و حتی 1 القا کردند. :128 (برای TRT 1) - شکل 3A.

این NAهای سرم از طریق مادر به خوک‌ها منتقل شدند (شکل 3B): در حالی که خوک‌های TRT 0 هیچ تیتر NA را در 0 wpi نشان ندادند، خوک‌های TRT 1 و TRT 2 دارای NA سرم برای کرنش کردن 1-7-4 قبل از آن بودند. عفونت که مستقیماً با سطوح NA مادر مرتبط است (شکل 3C, r=0.886, p < 0.0001). این تیترهای NA طی دو هفته اول کاهش یافت، قبل از اینکه با 4 wpi تثبیت شوند. با این حال، در مقایسه با TRT 0، خوکچه‌هایی از گیلت‌های واکسینه شده با AIV (TRT 1 به علاوه 2) از قبل از چالش، تیتر NA سرم به‌طور قابل‌توجهی بالاتری داشتند و این افزایش تیتر تا 2-3 wpi ادامه داشت، بنابراین تا سن 4-5 هفتگی - شکل 3B.

For more information:1950477648nn@gmail.com