مکانیسم ها و اهداف ایمنی با واسطه گیرنده Fc به اسپروزوئیت های مالاریا

یک واکسن بسیار محافظت کننده، دستیابی به مالاریا و حفظ آن را تا حد زیادی تسهیل می کند. درک مکانیسم های ایمنی با واسطه آنتی بادی برای تولید واکسن هایی با کارایی بالا بسیار مهم است. در اینجا، ما نقش های کلیدی در ایمنی هومورال برای فعل و انفعالات گیرنده Fc (Fc R) و فاگوسیتوز اپسونیک اسپروزوئیت ها را شناسایی می کنیم.

ما نقش مهمی را برای نوتروفیل‌ها در میانجی‌گری پاکسازی فاگوسیتیک اسپوروزویت‌ها در خون محیطی شناسایی کردیم، در حالی که مونوسیت‌ها نقش کوچکی دارند. آنتی بادی ها همچنین فعالیت سلول های کشنده طبیعی را تقویت می کنند. از نظر مکانیکی، فعل و انفعالات آنتی بادی با Fc RIII ضروری به نظر می رسد، با Fc RIIa نیز برای حداکثر فعالیت مورد نیاز است. تمام نواحی پروتئین سیرکومسپروزوئیت هدف آنتی‌بادی‌های عملکردی علیه اسپوروزویت‌ها هستند و آنتی‌بادی‌های ترمینال N در برخی از سنجش‌ها فعالیت بیشتری دارند. آنتی بادی های عملکردی به آرامی به دنبال مواجهه طبیعی با مالاریا به دست می آیند که در برخی از بزرگسالان در معرض مالاریا وجود دارد، اما در کودکان غیر معمول است. یافته‌های ما اهداف و مکانیسم‌های ایمنی را نشان می‌دهد که می‌توان از آنها در طراحی واکسن برای به حداکثر رساندن کارایی استفاده کرد.

مالاریا همچنان یک نگرانی عمده برای سلامت جهانی است، به طوری که مالاریا P. falciparum باعث 219 میلیون مورد بالینی و 435،{2}} مرگ سالانه می شود. علیرغم تلاش‌های کنترل بین‌المللی، بار مالاریا در سال‌های اخیر ثابت مانده است. نیاز شدیدی به یک واکسن بسیار کارآمد برای کنترل و از بین بردن مالاریا وجود دارد که با افزایش گزارش‌های مقاومت دارویی ضد مالاریا و مقاومت به حشره‌کش‌ها بر آن تاکید بیشتری می‌شود. سازمان بهداشت جهانی و شرکای مالی، هدفی را برای توسعه واکسنی با اثربخشی بیشتر یا مساوی 75 درصد تا سال 20302 تعیین کرده اند که دستیابی به آن چالش برانگیز است. درک بیشتر از مکانیسم‌هایی که ایمنی را واسطه می‌کنند برای توسعه استراتژی‌هایی که پاسخ‌های ایمنی محافظتی قوی‌تری ایجاد می‌کنند، مورد نیاز است.

بهبود ایمنی در زندگی روزمره مستلزم حفظ عادات خوب زندگی است. ایجاد و حفظ یک جدول زمانی برای رفتن به رختخواب و بیدار شدن از خواب می تواند عملکرد طبیعی ریتم شبانه روزی را بهبود بخشد. از وعده های غذایی پر کالری در تعطیلات خودداری کنید و از خوردن غذاهای اسیدی یا تند که هضم آن را مشکل می کنند، خودداری کنید. یک شام سبک با محصولات تازه را انتخاب کنید. استفاده از وسایل الکترونیکی را محدود کنید. نور صفحه نمایش می تواند ما را فریب دهد تا با تغییر چرخه خواب و کیفیت خواب، چندین بار در شب از خواب بیدار شویم. از انجام ورزش های شدید در اوایل عصر خودداری کنید. حداقل دو ساعت توصیه می شود. ورزش باعث ترشح آدرنالین و افزایش ضربان قلب می شود که خواب ما را فعال می کند. علاوه بر این، ما همچنین می توانیم گیاه سیستانچ دسرتیکولا را بخوریم. پلی ساکاریدها و ورباسکوزید موجود در Cistanche deserticola می توانند ایمنی را تقویت کنند. پلی ساکاریدها و ورباسکوزید Cistanche deserticola می توانند فعالیت آنزیمی قلب و بافت مغز را افزایش دهند و عملکرد فاگوسیتی سلول های صفاقی و پاسخ تکثیر لنفوسیت ها را افزایش دهند.

روی زمان مصرف سیستانچ کلیک کنید

عفونت مالاریا از نیش پشه آنوفل آلوده شروع می شود که طی آن اسپوروزویت ها به درم تلقیح می شوند. سپس اسپروزوئیت ها به یک رگ خونی مهاجرت می کنند، در جریان خون به کبد گردش می کنند و عفونت را در سلول های کبدی ایجاد می کنند. اسپروزوئیت ها هدف اولویت واکسن های مالاریا هستند زیرا پاکسازی اسپوروزوئیت ها عفونت را قبل از شروع مالاریا بالینی متوقف می کند. تحقیقات در مدل‌های حیوانی و آزمایش‌های واکسن نشان داده است که آنتی‌بادی‌ها میانجی کلیدی ایمنی در برابر اسپوروزوئیدها هستند (مرور در مرجع 3). با این حال، نحوه عملکرد مکانیکی آنتی‌بادی‌ها برای پاکسازی اسپروزوئیت‌ها و جلوگیری از عفونت، و اهداف خاص آنتی‌بادی‌های عملکردی، به خوبی شناخته نشده است. برای تسهیل ساخت واکسن‌های مؤثرتر، بینش‌های جدیدی در مورد این سؤالات مورد نیاز است.

پروتئین circumsporozoite (CSP) فراوان ترین پروتئین در سطح اسپوروزوئیت ها و هدف اصلی آنتی بادی های انسانی است. واکسن‌های مبتنی بر CSP تا به امروز از سایر آنتی‌ژن‌های واکسن بهتر عمل کرده‌اند، اگرچه اثربخشی کمتر از حد مطلوب باقی مانده است. پیشرفته ترین واکسن مالاریا، RTS، S، بر اساس شکل کوتاه شده CSP (که فقط شامل ناحیه تکرار مرکزی و ناحیه C ترمینال است) است و در کارآزمایی بالینی فاز III به کارایی متوسطی در برابر مالاریا بالینی (29 تا 36 درصد) دست یافته است. ناحیه تکرار مرکزی CSP به عنوان یک هدف آنتی بادی مهم در نظر گرفته می‌شود و در نتیجه، اهمیت بالقوه آنتی‌بادی‌ها در مناطق غیر تکراری به‌شدت مورد مطالعه قرار نگرفته است، اما ممکن است مهم باشد. آنتی بادی های ناحیه C ترمینال با محافظت در آزمایشات واکسن RTS و S در کودکان مرتبط بود.

از نظر مکانیسم‌های عملکردی آنتی‌بادی، اکثر مطالعات منتشر شده بر فعالیت مهاری مستقیم آنتی‌بادی‌ها در ناحیه تکرار مرکزی CSP متمرکز شده‌اند که می‌تواند تحرک اسپروزوئیت و تهاجم سلول‌های کبدی را در شرایط آزمایشگاهی 10-17 مهار کند. اطلاعات کمی در مورد دیگر مکانیسم ها و اهداف بالقوه مهم ایمنی وجود دارد.

یک مکانیسم ایمونولوژیک کلیدی که به طور فزاینده ای در ایمنی در برابر پاتوژن های ویروسی و باکتریایی شناسایی می شود، توانایی آنتی بادی ها برای تعامل با گیرنده های Fc ​​(Fc R) بر روی انواع مختلف سلول است که منجر به فاگوسیتوز اپسونیک یا سمیت سلولی مستقیم می شود. آنتی‌بادی‌های آنتی‌ژن‌های اسپروزوئیتی معمولاً تحت سلطه زیر کلاس‌های IgG1 و IgG313 هستند که پتانسیل قوی برای تعامل با Fc Rs22 دارند. با این حال، در حال حاضر اطلاعات کمی در مورد این مکانیسم‌های بالقوه در ایمنی به اسپوروزوئیدها وجود دارد. انواع اصلی سلول های فاگوسیتی شامل مونوسیت ها و نوتروفیل ها (به ترتیب 10-2 درصد و 70-45 درصد گلبول های سفید محیطی) هستند.

علاوه بر فاگوسیتوز، نوتروفیل‌ها و سلول‌های کشنده طبیعی (NK) نیز می‌توانند سلول‌ها را از طریق سمیت سلولی وابسته به آنتی‌بادی (ADCC) 23،24 بکشند و مونوسیت‌ها و نوتروفیل‌ها نیز از طریق بیان نشانگرهای فعال‌سازی، سیتوکین‌ها، اثرات ایمنی گسترده‌تری دارند. و کموکاین ها (مرور در مراجع 25-27).

الگوهای بیان Fc R بین مونوسیت ها و نوتروفیل ها متفاوت است، که بر عملکرد آنها در ایمنی تأثیر می گذارد. از آنجایی که اسپوروزویت ها اولین گام در شروع عفونت مالاریا هستند، اسپوروزویت ها معمولاً با سلول های فاگوسیتوز بالقوه در حالت استراحت یا همئوستاتیک به جای حالت فعال مواجه می شوند.

مونوسیت های مرحله استراحت عمدتا Fc RI و Fc RIIa را بیان می کنند، با یک زیر مجموعه کوچک Fc RIIIa28 را بیان می کنند، در حالی که نوتروفیل های مرحله استراحت Fc RIIa و Fc RIIIb29 و سطوح پایین Fc RIIIa30 را بیان می کنند (که از نظر عملکردی مهم است). بنابراین ارزیابی برهمکنش‌های خاص بین آنتی‌بادی‌ها و Fc Rهای مختلف برای درک نقش بالقوه فاگوسیت‌های مختلف در ایمنی مهم است. زیر کلاس IgG، گلیکوزیلاسیون و ویژگی اپی توپ هر کدام می توانند بر تعامل با Fc Rs22 مختلف تأثیر بگذارند.

تعریف مکانیسم‌های Fc ​​R-واسطه‌ای برای هدف قرار دادن اسپوروزوئیت‌ها ممکن است بینش‌هایی را نشان دهد که می‌توان از آنها برای افزایش کارایی محافظتی واکسن‌های مبتنی بر اسپوروزویت استفاده کرد. در این مطالعه، ما مکانیسم‌ها و اهداف مهم ایمنی در برابر اسپروزوئیت‌ها را با واسطه Fc Rs خاص بر روی سلول‌های ایمنی نشان می‌دهیم. ما تکنیک‌هایی را برای اندازه‌گیری برهم‌کنش‌های بین آنتی‌بادی‌ها و Fc Rs خاص و شناسایی ویژگی‌های آنتی‌بادی خاص، اهداف آنتی ژنی و Fc Rs که برای فعالیت عملکردی بهینه مهم هستند، توسعه می‌دهیم. علاوه بر این، ما کسب پاسخ‌های آنتی‌بادی وابسته به Fc R را در کودکان و بزرگسالانی که به طور طبیعی در معرض مالاریا قرار دارند، کمیت می‌کنیم. یافته‌های ما مکانیسم‌های ایمنی مهمی را در برابر اسپروزوئیت‌ها نشان می‌دهد و استراتژی‌ها و اهداف آنتی‌ژنی را برای ایجاد واکسن مالاریا بسیار کارآمد پیشنهاد می‌کند.

نتایج

فاگوسیتوز اپسونیک اسپروزوئیت ها عمدتاً توسط نوتروفیل های خون محیطی انجام می شود.

برای بررسی ارتباط مکانیسم‌های با واسطه Fc R در برابر اسپوروزوئیدها، ابتدا سنجش‌های فاگوسیتوز اپسونیک را با استفاده از رده سلولی تمایز نیافته THP-1 (سلول‌های طرفدار مونوسیتی)، تحت شرایط استاندارد31،32 (شکل تکمیلی 1A) ایجاد کردیم. برای اپسونیزاسیون اسپوروزوئیدها، از آنتی بادی‌های سرمی بزرگسالان کنیایی ساکن در منطقه‌ای با شدت انتقال مالاریا بالا و ایمنی بالینی قابل‌توجهی نسبت به مالاریا و آنتی‌بادی‌های CSP33 استفاده کردیم. اسپوروزوئیدهای اپسونیزه شده P. falciparum به طور موثر توسط سلول های THP-1 به روشی وابسته به غلظت با فاگوسیتوز کمی با استفاده از آنتی بادی های اهداکنندگان ساده مالاریا (ساکنان ملبورن) فاگوسیتوز شدند (شکل تکمیلی 1B). فاگوسیتوز اپسونیک با واسطه سرم های فردی بسیار قابل تکرار بود (r=0.925، P <{13}}.001؛ شکل تکمیلی 1C).

برای غلبه بر چالش‌ها در تولید تعداد زیادی اسپوروزوئیت‌های زنده برای سنجش فاگوسیتوز اپسونیک، استفاده از دانه‌های فلورسنت پوشیده شده با CSP تمام قد، ​​آنتی ژن اصلی بیان شده بر روی اسپوروزویت‌ها، را به عنوان معیاری برای فاگوسیتوز اپسونیک اسپوروزوئیدها ایجاد کردیم. مهره‌های پوشش‌داده‌شده با CSP که با مجموعه‌ای از نمونه‌های آنتی‌بادی از بزرگسالان مختلف کنیایی اپسون‌سازی شده‌اند، به‌طور مؤثر توسط سلول‌های THP{2}} فاگوسیتوز شدند و فاگوسیتوز اپسونیک دانه‌های پوشش‌داده‌شده با CSP به شدت با فاگوسیتوز اپسونیک اسپوروزویت‌های P. falciparum همبستگی داشت (r {{4}). }}.831, P=0.0015, مکمل شکل 1D). بنابراین، دانه‌های CSP یک پلتفرم کارآمد برای مطالعه مکانیسم‌ها و اهداف فاگوسیتوز اپسونیک با واسطه آنتی‌بادی فراهم کردند.

متعاقباً، ما انواع سلولی را بررسی کردیم که فاگوسیتوز اپسونیک را در یک سنجش لکوسیت کامل با خون تازه، در ابتدا با استفاده از مهره‌های CSP که با آنتی‌بادی پلی کلونال خرگوش به CSP اپسونیزه شده بودند، بررسی کردیم. جالب توجه است که میزان فاگوسیتوز (تعداد دانه های فاگوسیتوز شده در هر سلول) توسط نوتروفیل ها بسیار بیشتر از مونوسیت ها بود (شکل 1A, B). از آنجا که ما میزان فاگوسیتوز را تعیین کردیم، فعالیت بالاتر نوتروفیل ها به سادگی با فراوانی بالاتر آنها در مقایسه با مونوسیت ها توضیح داده نمی شود. فاگوسیتوز اپسونیک با افزایش غلظت آنتی‌بادی افزایش یافت و فعالیت نسبی بالاتر نوتروفیل‌ها در مقایسه با مونوسیت‌ها در غلظت آنتی‌بادی و طیف وسیعی از نسبت‌های مهره به سلول مشاهده شد. فعالیت فاگوسیتوز بیشتر نوتروفیل ها با استفاده از اسپوروزوئیدهای زنده تازه جدا شده تایید شد (ما از اسپوروزوئیدهای تراریخته P. berghei استفاده کردیم که P. falciparum CSP را بیان می کند، که جایگزین ژن 12 P. berghei CSP درون زا، به نام PfCSP-P. berghei می شود). فاگوسیتوز اپسونیک اسپوروزوئیت‌هایی که با آنتی‌بادی‌های اهداکنندگان در معرض مالاریا کنیایی اپسونیک شده‌اند، عمدتاً توسط نوتروفیل‌ها با سطوح پایین فاگوسیتوز توسط مونوسیت‌ها و نوتروفیل‌هایی که نرخ فاگوسیتوز بالاتری را نشان می‌دهند، واسطه شد (شکل 1C). ما همچنین سنجش هایی را برای اجازه دادن زمان طولانی برای فاگوسیتوز (تا 60 دقیقه) انجام دادیم، اما همچنان فاگوسیتوز بسیار بیشتری توسط نوتروفیل ها در مقایسه با مونوسیت ها مشاهده کردیم (شکل تکمیلی 2A).

تجزیه و تحلیل بیشتر جمعیت مونوسیت نشان داد که اکثر فاگوسیتوزها توسط زیرمجموعه کلاسیک (CD14بالا CD16-؛ شکل 1D و شکل تکمیلی 2B-D) بود. برای حمایت از یافته‌های خود، ما بیشتر نشان دادیم که نوتروفیل‌های خالص‌شده می‌توانند به‌طور مؤثری اسپوروزوئیدهای P. falciparum را که با آنتی‌بادی اپسونیزه شده‌اند فاگوسیتوز کنند (شکل 1E). کاهش آنتی‌بادی‌های اختصاصی CSP، با پیش انکوباسیون با CSP نوترکیب، فاگوسیتوز اسپوروزوئیت‌ها را تا 70 درصد در مقایسه با نمونه بدون تخلیه کاهش داد (شکل 1F و شکل تکمیلی 3). ما از یک رویکرد اضافی برای به دست آوردن شواهدی مبنی بر اهمیت CSP به عنوان هدف آنتی‌بادی‌های عملکردی اکتسابی در ایمنی انسان با آزمایش یک mAb (MGG4) جدا شده از فردی که در معرض عفونت‌های مکرر اسپوروزوئیتی قرار گرفته بود، استفاده کردیم. بادی‌آب باعث فاگوسیتوز قابل‌توجه اسپروزوئیت‌ها شد، در حالی که فاگوسیتوز کمی با آنتی‌بادی‌های غیرایمن انسانی، یا استفاده از یک MAb ضد CSP (2A10) که در ناحیه Fc جهش یافته بود برای مهار فعل و انفعالات Fc R وجود داشت (شکل 1G).

تعریف گیرنده های Fc ​​درگیر در فاگوسیتوز اپسونیک اسپروزوئیت ها

ما کل اسپروزویت‌های P. falciparum و دانه‌های CSP را با آنتی‌بادی‌های بزرگسالان کنیایی opsonized کردیم و فاگوسیتوز اپسونیک توسط نوتروفیل‌ها را در حضور آنتی‌بادی‌های خاص مسدودکننده Fc R اندازه‌گیری کردیم. نوتروفیل ها فاگوسیتوز اپسونیک به طور قابل توجهی در هر دو مهره CSP و اسپوروزوئیدهای P. falciparum در حضور مسدود کننده های Fc ​​RIIa یا Fc RIII داشتند (شکل 2A، B و شکل تکمیلی 4A)، که نشان می دهد هر دو گیرنده مهم هستند.

قابل ذکر است، محاصره Fc RIII در مهار فاگوسیتوز اسپوروزوئیدهای P. falciparum یا دانه‌های CSP با اثر ضعیف‌تری از محاصره Fc RIIa مؤثرتر بود. فاگوسیتوز اپسونیک توسط نوتروفیل ها تحت تأثیر مسدود کردن Fc RI قرار نگرفت. تیتر کردن غلظت آنتی‌بادی‌های مسدودکننده نشان می‌دهد که ما به حداکثر اثر برای محاصره هر Fc R دست یافته‌ایم (شکل تکمیلی 4B).

بنابراین، ما آنتی‌بادی‌های مسدودکننده Fc RIIa و Fc RIII را ترکیب کردیم و دریافتیم که این باعث مهار فاگوسیتوز بیشتر از استفاده از هر یک از آنتی‌بادی‌های مسدودکننده می‌شود، که بیشتر اهمیت هر دو نوع Fc R را برای فاگوسیتوز بهینه نشان می‌دهد (شکل 2B). این نتایج با بیان Fc Rs روی نوتروفیل‌های در حال استراحت، که عمدتاً Fc RIIa و Fc RIIIa/b را بیان می‌کنند، مطابقت دارند، اما فاقد Fc RI35 هستند (شکل تکمیلی 2C). اهمیت Fc RIII در واسطه فاگوسیتوز اپسونیک دانه‌های CSP و اسپوروزویت‌ها ممکن است تا حدی فعالیت نسبتاً کم مونوسیت‌ها را توضیح دهد زیرا زیر مجموعه‌های اصلی مونوسیت Fc RIIIa کمی را در سطح در حالت غیرفعال بیان می‌کنند و Fc RIIIb35 را بیان نمی‌کنند. سلول‌های THP{5}} به‌طور گسترده به‌عنوان مدل فاگوسیتوز مونوسیتی و Fc RI36 بسیار بیان می‌شوند، که توسط IgG مونومر متصل می‌شود (در حالی که Fc RIIa و Fc RIII بیان‌شده توسط نوتروفیل‌ها فقط به کمپلکس‌های ایمنی متصل می‌شوند).

بر این اساس، ما دریافتیم که فاگوسیتوز اپسونیک توسط سلول‌های THP-1 در شرایط استاندارد (حاوی 10 درصد FCS فقط و بدون سرم انسانی) به شدت توسط مسدودکننده Fc RI با مهار محدود توسط مسدودکننده Fc RIIa و هیچ‌کدام با Fc مهار شد. مسدود کردن RIII (شکل 2C). این نشان می دهد که تعامل بین IgG و Fc RI به ویژه برای سلول های THP{3}} مهم است، نتایج متضادی که با نوتروفیل ها مشاهده می شود. بنابراین، سنجش استاندارد THP-1 را اصلاح کردیم تا با گنجاندن سرم انسانی در محیط سنجش، از نظر فیزیولوژیکی مرتبط‌تر باشد.

در حضور 2.5 درصد سرم انسانی اضافی (همانطور که در کل لکوسیت و سنجش نوتروفیل استفاده می شود)، فاگوسیتوز اپسونیک بسیار کمتری وجود داشت (شکل 2D) که احتمالاً به دلیل اتصال IgG انسانی مونومر غیر ایمنی موجود در سرم انسانی است. به Fc RI. این یافته‌ها ممکن است فعالیت فاگوسیتی کم مونوسیت‌های اولیه مشاهده شده در کل سنجش‌های لکوسیتی را در حضور سرم انسانی توضیح دهد. IgG گاو (موجود در FCS) به Fc RI37 انسان متصل نمی شود.

با توجه به اهمیت آشکار Fc RIII، ما عملکرد آنتی‌بادی‌های CSP را در میان بزرگسالان کنیایی در سنجش ADCC اندازه‌گیری کردیم، زیرا فعل و انفعالات Fc RIII نقش کلیدی در واسطه‌سازی ADCC از طریق سلول‌های NK بازی می‌کند. ما مجموعه‌ای از نمونه‌ها را از گروه بزرگسالان کنیا (کوهورت Kanyawegi) برای نشان دادن پاسخ‌دهندگان بالا، متوسط ​​و پایین (n=31) در سنجشی با استفاده از یک رده سلولی گزارشگر ADCC که فقط Fc RIIIa را بیان می‌کند، آزمایش کردیم. آنتی بادی های به دست آمده به طور طبیعی در میان بزرگسالان کنیایی فعالیت قابل توجهی داشتند، در حالی که آنتی بادی های اهداکنندگان ساده مالاریا در ملبورن این گونه نبودند (شکل 2E، F). این یافته‌ها نشان می‌دهد که آنتی‌بادی‌های CSP ممکن است فعالیت ADCC را از طریق درگیر کردن Fc RIIIa ارتقا دهند. متعاقباً، ما فعالیت سلول‌های NK اولیه را در خون تازه با استفاده از روش ریزدانه‌زدایی تثبیت‌شده 38 آزمایش کردیم. جوجه‌کشی سلول‌های NK با دانه‌های CSP که توسط آنتی‌بادی‌های بالغ کنیایی اپسون‌سازی شده‌اند، منجر به دگرانولاسیون سلول‌های NK اولیه می‌شود (شکل 2G، H). فعالیت در بین نمونه‌های آزمایش‌شده متفاوت بود و به‌طور معنی‌داری با اتصال Fc RIII (r=0.538, P=0.002، شکل 2H) همبستگی داشت، اما با IgG به CSP همبستگی ضعیفی داشت (r {{10} }.127، P=0.489، n=31).

اتصال مستقیم Fc RIII و Fc RIIa توسط کمپلکس های آنتی بادی-آنتی ژن.

ما سنجش‌های اتصال Fc R را با استفاده از Fc RIIa و Fc RIII توسعه دادیم که به‌عنوان دایمر بیان و خالص شدند تا بتوانند با کمپلکس‌های آنتی‌ژن-آنتی‌بادی تعامل داشته باشند. بزرگسالان کنیایی شیوع و میزان بالایی از آنتی بادی‌ها علیه CSP داشتند که می‌توانستند با دایمرهای Fc ​​RIIa و Fc RIII تعامل داشته باشند (شکل 3A). به طور کلی، 67.3 و 61.5 درصد از نمونه ها (n=104) برای اتصال Fc RIIa و Fc RIII مثبت در نظر گرفته شدند. در حالی که اتصال هر دو Fc Rs یک همبستگی قوی و مثبت در بین نمونه ها داشت (r=0.71, P< 0.0001, n = 104) (Fig. 3B), some individual samples demonstrated high binding to one FcγR and low binding to the other. Furthermore, the ability of antibodies to CSP to promote direct binding of FcγRIII was significantly correlated with ADCC tested by the ADCC reporter cell line (r = 0.405, P = 0.022, Fig. 2F) and primary NK cells (r = 0.538, P = 0.002, Fig. 2H). FcγRs occur in populations as different alleles40. 

بنابراین، ما آلل های مختلف Fc RIIa (R131، H131) و Fc RIII (F158، V158) را برای اتصال با واسطه IgG آزمایش کردیم. داده های منتشر شده نشان می دهد که این آلل ها در جمعیت مورد مطالعه ما شیوع دارند41. آنتی بادی به CSP به طور موثر اتصال هر دو آلل Fc RIIa و Fc RIII را ترویج کرد. همبستگی بالایی از اتصال Fc R بین آلل های مختلف وجود دارد. rho=0.8371 برای Fc ​​RIIa، و rho=0.78 برای Fc ​​RIII (شکل 3C، D).

مناطق CSP هدف آنتی بادی های عملکردی.

داده های قبلی ما نشان داد که CSP یک هدف مهم از آنتی بادی های انسانی است که فاگوسیتوز را ترویج می کند (شکل 1F، G). بنابراین، ما در مرحله بعدی مناطق مختلف CSP را به عنوان اهداف آنتی بادی های عملکردی در افراد در معرض مالاریا با استفاده از سه ساختار CSP بررسی کردیم: (i) یک پپتید مصنوعی که نماینده منطقه NT (که در واکسن RTS، S گنجانده نشده است)، (ii) ) یک پپتید مصنوعی به نمایندگی از ناحیه تکرار (تکرار NANP)، (iii) یک پروتئین نوترکیب که نماینده منطقه CT است. هر سازه به طور جداگانه بر روی دانه های فلورسنت (در غلظت های اشباع) پوشانده شد و با استخر سرم های کنیایی اپسونیز شد. آنتی بادی ها به طور موثر فاگوسیتوز نوتروفیلی مهره های پوشش داده شده با هر سازه را ترویج کردند (شکل 4A).

ما متعاقباً آنتی‌بادی‌های به‌دست‌آمده به‌طور طبیعی در مناطق CSP را برای توانایی آن‌ها در ترویج تعامل Fc RIIa و Fc RIII ارزیابی کردیم. آنتی بادی های انسانی هر ناحیه CSP را با چگالی کافی برای ترویج اتصال Fc RIIa و Fc RIII متصل می کنند (شکل 4B). از آنجایی که سطح کل اتصال IgG در بین ساختارهای مختلف CSP متفاوت بود (شکل تکمیلی 5)، ما اتصال Fc RIIa و Fc RIII را نسبت به سطح واکنش‌پذیری IgG استاندارد کردیم (به عنوان راندمان اتصال Fc R). داده‌های ما نشان می‌دهد که آنتی‌بادی‌های ناحیه NT پتانسیل بیشتری برای درگیر شدن با Fc Rs نسبت به نواحی تکرار مرکزی و CT دارند (فعالیت برای مناطق NT در مقابل CT یا NANP به طور قابل‌توجهی بالاتر بود، P <{3}}.001 برای هر مقایسه) .

ما بیشتر اهمیت مناطق مختلف را به عنوان اهداف آنتی‌بادی‌های عملکردی با استفاده از آنتی‌بادی‌های تولید شده علیه مناطق خاص و کل اسپوروزویت‌ها در سنجش فاگوسیتوز ارزیابی کردیم. ما ابتدا تأیید کردیم که آنتی‌بادی‌های ضد CSP خرگوش می‌توانند فاگوسیتوز اسپروزوئیت‌ها را ترویج کنند. اسپوروزوئیدهای P. falciparum که با این آنتی بادی ها اپسونیز شده اند، شاخص فاگوسیتوز بالایی (40.5 درصد) در مقایسه با شاهد (شکل 4C) نشان دادند. متعاقباً، ما ثابت کردیم که یک mAb شناخته شده در برابر ناحیه NANPrepeat مرکزی P. falciparum CSP (mAb 2H8، زیر کلاس IgG2a موش)33 باعث فاگوسیتوز قابل توجهی (17.4 درصد، شکل 4D) شد که بیشتر از مشاهده شده با mAb 3D کنترل منفی بود (111). CSP P. berghei را هدف قرار می دهد که اپی توپ NANPrepeat ندارد (شکل 4D). ناحیه تکرار NANP یک اپی توپ ایمنی غالب را کد می کند، در حالی که اطلاعات کمتری در مورد اهمیت مناطق NT و CT به عنوان اهداف آنتی بادی ها شناخته شده است.

برای تعریف بیشتر نقش آنتی بادی ها در نواحی CT و NT و تکمیل داده ها با استفاده از آنتی بادی های انسانی، آنتی بادی های پلی کلونال خرگوش را برای هر ناحیه تولید کردیم (شکل تکمیلی 6) و از این آنتی بادی ها برای اپسونیزاسیون PfCSPP تراریخته استفاده کردیم. اسپوروزوئیدهای برگهی برای فاگوسیتوز توسط نوتروفیل ها آنتی بادی های پلی کلونال خرگوش به هر دو ناحیه CT و NT به طور موثر فاگوسیتوز PfCSP-P را ترویج کردند. berghei sporozoites (شکل 4E). از آنجایی که غلظت IgG به CT و NT از سرم خرگوش واکسینه شده متفاوت بود (شکل تکمیلی 6)، ما کارایی فاگوسیتوز و آنتی بادی ها را نسبت به سطوح IgG (محاسبه شده به عنوان فعالیت فاگوسیتوز تقسیم بر واکنش IgG تعیین شده توسط ELISA) ارزیابی کردیم. این نشان داد که آنتی بادی های ناحیه N ترمینال کارایی فاگوسیتوز به طور قابل توجهی در مقایسه با آنتی بادی های CT دارند.

از آنجایی که آنتی بادی های ناحیه NT در فعال کردن Fc Rs و ترویج فاگوسیتوز اپسونیک بسیار موثر بودند، ما نقشه برداری اپی توپی از آنتی بادی های پلی کلونال خرگوش را علیه ناحیه NT با استفاده از یک آرایه پپتیدی همپوشانی انجام دادیم (شکل 4F و شکل تکمیلی 6D). یک آرایه پپتیدی برای نقشه برداری اپی توپ مناسب بود زیرا پیش بینی می شود که ناحیه NT بدون ساختار باشد و سیستئین نداشته باشد (PlasmoDB، https://plasmodb.org/plasmo/app/ record/gene/PF3D7_0304600). آنتی بادی ها با پپتیدهایی که یک ناحیه 21-aa (DDGNNEDNEKLRKPKHKKLKQ) را که نزدیک به محل اتصال بین ناحیه N ترمینال و ناحیه تکرار NANP/NVPD پوشش می‌دهند، واکنش نشان دادند.

به دست آوردن آنتی بادی هایی که باعث افزایش فعل و انفعالات Fc R و فاگوسیتوز اپسونیک از طریق قرار گرفتن در معرض طبیعی می شوند.

ما نمونه‌های سرمی جمع‌آوری‌شده از گروهی از کودکان خردسال و بزرگسالان در معرض مالاریا را که در غرب کنیا در منطقه‌ای با شدت انتقال مالاریا بالا زندگی می‌کنند، تجزیه و تحلیل کردیم (از منطقه Chulaimbo، جدول تکمیلی 1). در این شرایط، بخش عمده ای از عوارض و مرگ و میر مالاریا در کودکان در سنین بالا رخ می دهد<5 years. 

در مقابل، بزرگسالان مصونیت قابل‌توجهی دارند که با عدم ایجاد دوره‌های مالاریا علامت‌دار نشان داده می‌شود، اگرچه انگلی بدون علامت ممکن است رخ دهد. ما توانایی آنتی‌بادی‌های اختصاصی CSP را در تعامل با Fc RIIa و Fc RIII و همچنین ترویج فاگوسیتوز اپسونیک دانه‌های CSP توسط نوتروفیل‌ها اندازه‌گیری کردیم (شکل 5A-D). شیوع کلی آنتی بادی ها با هر فعالیت عملکردی فاگوسیتوز نوتروفیل در 16 درصد، (95 درصد CI، 9.19، 26.38 درصد)، اتصال Fc RIIa در 20 درصد (95 درصد CI، 12.28، 30.84 درصد)، و اتصال Fc RIII 7 درصد بود. (95 درصد CI، 8.19، 24.85 درصد). سطح واکنش IgG به CSP، اتصال FcR و فاگوسیتوز اپسونیک توسط نوتروفیل ها در میان کودکان کم سن بود و با افزایش سن به طور قابل توجهی افزایش یافت.

در مقابل، بزرگسالان با قرار گرفتن در معرض مادام العمر آنتی بادی های عملکردی به طور قابل توجهی در مقایسه با کودکان به دست آورده بودند. ما همچنین آنتی‌بادی‌هایی را که فاگوسیتوز مروزوئیت‌های مرحله خونی را ترویج می‌کردند، ارزیابی کردیم، که شیوع و سطح قابل‌توجهی در بین کودکان خردسال در مقایسه با آنتی‌بادی‌های عملکردی CSP داشتند (شکل 5B، E، F). این امر از این مفهوم حمایت می کند که ایمنی اکتسابی طبیعی در برابر اسپوروزوئیت ها بسیار کندتر به دست می آید و در مقایسه با ایمنی مرحله خونی، برای توسعه به قرار گرفتن در معرض قابل توجهی بیشتری نیاز دارد. ما بررسی کردیم که آیا فعالیت عملکردی بالاتر در میان بزرگسالان تنها ناشی از غلظت بالاتر IgG اختصاصی CSP است یا همچنین نشان‌دهنده پتانسیل عملکردی بالاتر آنتی‌بادی‌ها در میان بزرگسالان است. ما فعالیت عملکردی آنتی بادی را نسبت به واکنش IgG در برابر CSP تجزیه و تحلیل کردیم. برای انجام این کار، ما افراد با IgG بسیار پایین به CSP (زیر OD میانه 0.140) را حذف کردیم و فعالیت عملکردی را نسبت به سطح IgG برای هر فرد محاسبه کردیم.

جالب توجه است، این نشان داد که کارایی فاگوسیتوز نسبی در بزرگسالان در مقایسه با کودکان به طور قابل توجهی بالاتر بود (شکل 5G) (آزمون Mann-Whitney, P=0.022). علاوه بر این، ارتباط معنی‌داری بین سن و کارایی اتصال Fc R وجود داشت (r=0.354، P=0.031 برای اتصال Fc RIIa و r=0.572 برای اتصال Fc RIII، P <0.001).

فاگوسیتوز اپسونیک توسط نوتروفیل‌ها با اتصال Fc R و زیر کلاس‌های IgG سیتوفیل در ارتباط است.

ما تجزیه و تحلیل خود را به گروه بزرگتری از بزرگسالان ایمنی در غرب کنیا (همگروهی کانیاوگی، n=104) که در منطقه‌ای با شدت انتقال مالاریا مادام‌العمر در معرض مالاریا بوده‌اند، گسترش دادیم. ما استدلال کردیم که بخش بزرگی از این بزرگسالان احتمالاً آنتی‌بادی‌های عملکردی برای CSP دارند، که تجزیه و تحلیل عوامل آنتی‌بادی و ویژگی‌هایی را که فعالیت فاگوسیتوز اپسونیک عملکردی را تعیین می‌کنند، تسهیل می‌کند. در واقع، بسیاری از نمونه‌ها فاگوسیتوز و فعالیت اتصال Fc R را نشان دادند. شیوع آنتی بادی ها با هر فعالیت عملکردی فاگوسیتوز نوتروفیل 47.1 درصد (95 درصد CI، 37.6، 56.9 درصد)، اتصال Fc RIIa 67.3 درصد، (95 درصد CI، 57.6، 75.8 درصد) و Fc RIII درصد اتصال (59.5 درصد) بود. ، 51.7، 70.5 درصد).

فاگوسیتوز اپسونیک توسط نوتروفیل ها با اتصال Fc RIIa ارتباط معنی داری داشت (r {{0}}.50، P < 0.001) و اتصال Fc RIII (r=0.43، P <0.001) (شکل 6A). تجزیه و تحلیل رگرسیون چند متغیره نشان داد که Fc RIII عامل اولیه مرتبط با فاگوسیتوز اپسونیک نوتروفیل بود (ضریب رگرسیون=10.15، P <0.001، جدول 1)، در حالی که Fc RIIa اهمیت کمتری داشت. قبلاً گزارش داده‌ایم که آنتی‌بادی‌های CSP در این گروه بزرگسال عمدتاً IgG1 و IgG3، با سطوح پایین‌تر IgG2 و IgG433 بسیار کم هستند. IgG1 و IgG3 زیرمجموعه های اصلی هستند که با Fc RIIa و Fc RIII برای ترویج فاگوسیتوز تعامل دارند و IgG2 دارای فعالیت ضعیفی است. در میان بزرگسالان کنیایی، فاگوسیتوز نوتروفیل به طور قابل توجهی با IgG1 (r=0.32، P <0.001)، IgG2 (r=0.26، P=0.007)، و بیشتر همبستگی مثبت داشت. به شدت با IgG3 (r=0.50، P <0.001) (شکل 6B، C، شکل تکمیلی 7 و جدول تکمیلی 2).

هیچ ارتباطی با IgG4 مشاهده نشد (r=0.09، P = 0.365)، اگرچه سطوح IgG4 پایین بود. در رگرسیون چند متغیره، IgG3 به طور قابل توجهی با فاگوسیتوز نوتروفیل مرتبط باقی ماند، که نشان می دهد که واسطه اصلی این فعالیت است (جدول تکمیلی 3). علاوه بر این، هر دو اتصال Fc RIIa و Fc RIII به طور قابل توجهی با سطح کل زیر کلاس های IgG و IgG، در درجه اول IgG1 و IgG3 همبستگی داشتند (جدول تکمیلی 2 و 3). به طور کلی، نمونه‌هایی که به‌عنوان دارای فعالیت فاگوسیتوز بالا (تعریف شده به عنوان بالاتر از میانه) طبقه‌بندی شده‌اند، سطوح اتصال Fc RIIa و Fc RIII و IgG3 به‌طور قابل‌توجهی بالاتر بودند، و سطوح IgG به‌طور قابل‌توجهی در تمام مناطق CSP در مقایسه با نمونه‌های با فاگوسیتوز کم داشتند. فعالیت (شکل 6D، E).

مشاهدات مشابهی در میان گروه چولیمبو از کودکان و بزرگسالان یافت شد. فاگوسیتوز اپسونیک به طور قابل توجهی با اتصال Fc R و IgG1 و IgG3 مرتبط بود، با همبستگی قوی تر برای Fc ​​RIII و IgG3 (جدول تکمیلی 4 و 5). ما این سنجش‌ها را در یک کارآزمایی بالینی فاز 1/2a واکسن RTS، S به کار بردیم. این نشان داد که آنتی‌بادی‌های تقویت‌کننده فاگوسیتوز اپسونیک توسط نوتروفیل‌ها و اتصال Fc RIII و Fc RIIa در بین افراد محافظت‌شده بیشتر از افراد غیر محافظت‌شده بود.

بحث

ما نتایجی را ارائه می‌کنیم که مکانیسم‌ها و اهداف ایمنی ناشی از آنتی‌بادی به اسپوروزویت‌ها را از طریق تعامل با Fc Rs خاص بیان شده روی سلول‌های ایمنی مشخص می‌کند. یافته‌های ما از نقش کلیدی نوتروفیل‌ها در پاکسازی اسپوروزوئیت‌ها در خون حمایت می‌کند که با واسطه برهمکنش‌های Fc ​​RIIa و Fc RIII با IgG1 و IgG3 که آنتی‌ژن اصلی اسپوروزویت، CSP را هدف قرار می‌دهد، با کمک‌های اضافی از مونوسیت‌ها (زیر مجموعه کلاسیک) و سلول‌های NK. با استفاده از اسپوروزویت های دست نخورده و دانه های پوشش داده شده با آنتی ژن، ما ثابت کردیم که فاگوسیتوز، در خون کامل، عمدتاً توسط نوتروفیل ها بود، که در مقابل فعالیت سطح پایین مشاهده شده با مونوسیت ها بود. ما مکانیسم‌های کلیدی را با مسدود کردن Fc Rs خاص روی سطوح سلولی و با استفاده از دایمرهای Fc ​​R به عنوان پروب برای اتصال کمپلکس‌های آنتی ژن-آنتی‌بادی تعریف کردیم.

این اهمیت Fc RIIIa و Fc RIII را مشخص کرد و داده ها به ویژه به اهمیت Fc RIII اشاره می کنند. ما اهداف آنتی‌بادی این مکانیسم عملکردی را با استفاده از آنتی‌بادی‌ها به مناطق مختلف CSP، مناطق مختلف CSP پوشش داده‌شده بر روی مهره‌ها و اسپوروزویت‌های کایمریک P. berghei که P. falciparum CSP را بیان می‌کنند، تعریف کردیم. ما ثابت کردیم که CSP هدف اصلی این آنتی بادی‌های عملکردی است و هر سه ناحیه CSP می‌توانند توسط آنتی‌بادی‌ها برای درگیر شدن با Fc R و ترویج فاگوسیتوز مورد هدف قرار گیرند.

به طور خاص، آنتی‌بادی‌های ناحیه NT در طیف وسیعی از سنجش‌های مختلف فعالیت قابل‌توجهی داشتند، که منجر به تولید واکسن می‌شود، زیرا ناحیه NT در واکسن‌های مبتنی بر CSP RTS، S (اکنون در مطالعات اجرایی)، یا R21 گنجانده نشده است. (در آزمایشات فاز 2). علاوه بر این، ما ثابت کردیم که آنتی‌بادی‌های به‌دست‌آمده به‌طور طبیعی قادر به ترویج فاگوسیتوز اپسونیک اسپروزوئیت‌ها هستند. به دست آوردن آنتی بادی های عملکردی وابسته به سن بود و سطوح بالاتری از فعالیت فاگوسیتوز اپسونیک و اتصال Fc RIIa و Fc RIII تنها با نمونه هایی از بزرگسالان مشاهده شد اما نه کودکان خردسال. فعالیت عملکردی با زیر کلاس های IgG1 و IgG3 در ارتباط است.

فعالیت فاگوسیتوز بالاتر نوتروفیل ها، اما فعالیت سطح بسیار پایین مونوسیت ها، ممکن است به حضور و استفاده از Fc R های مختلف مربوط باشد. نوتروفیل ها نرخ فاگوسیتوز بیشتری داشتند، که به سادگی با فراوانی بیشتر نوتروفیل ها در مقایسه با مونوسیت ها توضیح داده نمی شد. جالب توجه است که مسدود کردن Fc RIIa یا Fc RIIIa/b فعالیت فاگوسیتوز توسط نوتروفیل ها را مهار می کند، که نشان می دهد هر دو گیرنده برای فاگوسیتوز مورد نیاز هستند، که با دستیابی به مهار بیشتر با آنتی بادی های مسدود کننده Fc RIIa و Fc RIII که به صورت ترکیبی استفاده می شوند، پشتیبانی می شود. مسدود کردن Fc RI بر فاگوسیتوز توسط نوتروفیل ها تأثیری نداشت. چندین مشاهدات اهمیت بالاتر Fc RIII را پیشنهاد کردند. به طور کلی مهار فاگوسیتوز اسپروزوئیتی با محاصره Fc RIII بیشتر بود، و اتصال Fc RIII توسط آنتی بادی ها نسبت به Fc RIIa در تجزیه و تحلیل چند متغیره با فاگوسیتوز ارتباط بیشتری داشت.

Fc RIIIb که با GPI لنگر می‌خورد، فراوان‌ترین نوع Fc RIII است که روی نوتروفیل‌ها بیان می‌شود، اما مطالعات اخیر گزارش داده‌اند که نوتروفیل‌ها Fc RIIIa30 را نیز بیان می‌کنند که دارای یک دامنه سیتوپلاسمی و گذرنده برای سیگنال‌دهی داخل سلولی است. برای فاگوسیتوز، سیگنال دهی داخل سلولی ممکن است از طریق Fc RIIIa یا Fc RIIa رخ دهد، همانطور که یافته های ما نشان می دهد، اتصال به Fc RIIIb نیز مهم است. اگر Fc RIII و Fc RIIa به طور مشترک در فاگوسیتوز عمل کنند، این ممکن است توضیح دهد که چرا فعالیت محدود Fc RIIa در فاگوسیتوز توسط مونوسیت ها وجود دارد. سلول‌های NK Fc RIIIa را بیان می‌کنند، و ما ثابت کردیم که آنتی‌بادی‌های CSP می‌توانند فعال‌سازی NK را از طریق تعامل با Fc RIIIa ترویج کنند. این ممکن است منجر به کشتن اسپروزوئیت ها و همچنین آزادسازی سایتوکاین های پیش التهابی شود.

با این حال، سلول‌های NK تنها 1 تا 5 درصد لکوسیت‌های خون را تشکیل می‌دهند که نشان می‌دهد نسبت به نوتروفیل‌ها که 50 تا 70 درصد لکوسیت‌ها را تشکیل می‌دهند، نقش کمتری در ایمنی در برابر اسپوروزویت‌ها دارند. اسپروزوئیت‌ها همچنین در معرض ماکروفاژهای پوستی و سلول‌های کوپفر کبدی قرار می‌گیرند، که می‌تواند مکانیسم‌های اضافی ترخیص کالا از گمرک با واسطه Fc R را در بر داشته باشد و تحقیقات را در مطالعات آینده تضمین کند، اما فراوانی نسبی این سلول‌ها و بیان Fc Rs آنها با فاگوسیت‌ها در خون متفاوت است. .

مطالعات موجود در مورد فاگوسیتوز اپسونیک با واسطه آنتی بادی در مالاریا، تا حد زیادی از رده سلولی THP-1 به عنوان مدل، با استفاده از شرایط استاندارد با FCS (اما شامل سرم انسانی) استفاده کرده است. تحت این شرایط، ما دریافتیم که فاگوسیتوز به طور موثر با محاصره Fc RI مهار شد، اما حداقل مهار با مسدود کردن Fc RIIa یا Fc RIII مشاهده شد. یک مطالعه اخیر گزارش داد که فاگوسیتوز اپسونیک توسط سلول‌های THP-1 با محافظت در کارآزمایی RTS، S فاز I/IIa در بزرگسالان ساده‌لوح مالاریا ارتباطی نداشت. ما نشان دادیم که IgG غیراختصاصی در سرم انسانی همچنین می‌تواند فعالیت فاگوسیتوز سلولی THP{6}} را کاهش دهد زیرا فعل و انفعالات Fc RI توسط IgG مونومر ارائه شده در پلاسمای انسان مهار می‌شود، در حالی که IgG گاوی مونومر به Fc RI انسان متصل نمی‌شود. با هم، این یافته‌ها نشان می‌دهند که سلول‌های THP-1 یک مدل ایده‌آل برای مطالعه فاگوسیتوز اپسونیک علیه اسپروزوئیت‌ها نیستند.

ما ثابت کردیم که هر سه ناحیه CSP می‌توانند توسط آنتی‌بادی‌هایی که Fc RIIa و Fc RIII را برای ترویج فاگوسیتوز اسپوروزویت‌ها توسط نوتروفیل‌ها درگیر می‌کنند، هدف قرار دهند، در نتیجه عملکردهایی را برای آنتی‌بادی‌ها به این مناطق نسبت می‌دهند که قبلاً گزارش نشده‌اند. توجه داشته باشید، فعالیت قابل توجهی از آنتی بادی ها در ناحیه NT وجود دارد که در سنجش فاگوسیتوز با استفاده از آنتی بادی های انسانی با دانه های پوشش داده شده با آنتی ژن، فاگوسیتوز اسپروزوئیت ها توسط آنتی بادی های خرگوش ایجاد شده به مناطق مختلف، و اتصال Fc R توسط آنتی بادی های انسانی دیده می شود. این یافته‌ها نشان می‌دهند که تمرکز بیشتر روی ناحیه NT در طراحی واکسن ممکن است ارزشمند باشد، علاوه بر گنجاندن مناطق تکرار مرکزی و CT. واکسن های پیشرو فعلی شامل منطقه NT3،46 نمی شود. ما اپی توپ های آنتی بادی را به یک منطقه 21-aa که نزدیک به محل اتصال بین نواحی تکراری NT و مرکزی است، نگاشت کردیم، اما شامل اپی توپ 34 پیوندی اخیراً توصیف شده نیست و از اپی توپ منطقه I متمایز است، که محلی برای برش N ترمینال در زمان تهاجم هپاتوسیت47،48.

مشاهدات ما مبنی بر اینکه آنتی‌بادی‌هایی که از طریق قرار گرفتن در معرض مالاریا به دست می‌آیند می‌توانند فاگوسیتوز با واسطه Fc R توسط نوتروفیل‌ها را ترویج کنند، بیشتر از این مفهوم حمایت می‌کنند که این مکانیسمی است که در داخل بدن در میان افرادی که سطوح بالایی از ایمنی را ایجاد می‌کنند، رخ می‌دهد. در شرایط انتقال بالای مالاریا در کنیا، این آنتی بادی های عملکردی در میان کودکان خردسالی که بیشتر در معرض خطر عفونت و مالاریا شدید هستند، اما در بزرگسالان رخ می دهد، بسیار کم است. مطالعات قبلی در این جمعیت نشان داد که سطوح بالای آنتی بادی های CSP در میان بزرگسالان با کاهش خطر عفونت در میان بزرگسالان مرتبط است. در مقابل، گروهی از کودکان عمدتاً هیچ ارتباطی در مالی پیدا نکردند، جایی که شدت انتقال مالاریا کمتر از جمعیت مورد مطالعه ما بود. جالب توجه است، سطوح نسبی فعالیت اتصال با هر Fc R به طور قابل توجهی در بین افراد متفاوت است، که احتمالاً بر فعالیت فاگوسیتوز تأثیر می گذارد. تغییرات در اتصال ویژه Fc R تحت تأثیر پروفایل های زیر کلاس IgG، اپی توپ های هدف قرار گرفته توسط آنتی بادی ها و گلیکوزیلاسیون IgG قرار می گیرد. IgG1 و IgG3 در میان زیر کلاس‌های IgG بدست‌آمده غالب بودند و با فعالیت اتصال Fc R مرتبط بودند.

در این مطالعه، ما استفاده از میکروسفرهای پوشش داده شده با آنتی ژن را برای مطالعه فعالیت فاگوسیتوز اپسونیک آنتی‌بادی‌ها به CSP، هدف ایمنی کلیدی اسپروزوئیت‌های P. falciparum اقتباس کردیم. مزیت این رویکرد این است که بر چالش‌های تولید مقادیر زیادی اسپوروزویت برای سنجش‌های ایمونولوژیک غلبه می‌کند، که دستیابی به آن برای مطالعات جمعیتی بزرگ و آزمایش‌های بالینی دشوار است. سطح فاگوسیتوز اپسونیک اندازه‌گیری شده با استفاده از مهره‌های پوشش‌داده‌شده با CSP بسیار با میزان اندازه‌گیری شده با استفاده از اسپوروزویت‌های دست نخورده همبستگی داشت. این پلت فرم همچنین ما را قادر می سازد تا پاسخ های آنتی بادی عملکردی را به هر ناحیه از CSP تشریح کنیم. ما همچنین فاگوسیتوز را با استفاده از اسپوروزویت‌های منجمد شده (قابلیت زنده ماندن > 85 درصد 51) و اسپوروزویت‌های تازه جدا شده تأیید کردیم.

مطالعات قبلی نشان داده‌اند که آنتی‌بادی‌های اسپوروزوئیت‌ها می‌توانند تحرک اسپروزوئیت، عبور سلولی و تهاجم سلول‌های کبدی را به عنوان مکانیسم‌های ایمنی بالقوه مهار کنند. با این حال، در حال حاضر شواهد ثابتی وجود ندارد که نشان دهد این مکانیسم‌ها با محافظت در برابر عفونت پلاسمودیوم در مطالعات بالینی ارتباط دارند. در مدل‌های ایمن‌سازی غیرفعال در حیوانات، سطوح بالای IgG به CSP می‌تواند در برابر عفونت تجربی محافظت کند. با این حال، سطوح بالای حفاظتی مشابه، که در طول زمان حفظ شده است، هنوز توسط آنتی‌بادی‌های ناشی از واکسن در کارآزمایی‌های بالینی به دست نیامده است52-56. RTS، S سطوح بسیار بالای CSP IgG را القا می کند، اما فقط محافظت متوسطی را ارائه می دهد. داده‌های ما بینش‌هایی را در مورد مکانیسم ایمنی تا حد زیادی مطالعه نشده آنتی‌بادی‌ها در پاکسازی فاگوسیتیک اسپروزوئیت‌ها ارائه می‌کند و نشان می‌دهد که استفاده از مکانیسم‌های Fc ​​Rmediated می‌تواند یک استراتژی برای ایجاد ایمنی قوی‌تر برای سطوح بالاتر حفاظت باشد. این را می توان با استراتژی های واکسنی که پاسخ های زیر کلاس IgG را بهینه می کند، IgM را کاهش می دهد که ممکن است برهمکنش های Fc ​​R را مهار کند و هدف گیری اپی توپ های عملکردی خاص را بهبود بخشد. این پیشرفت ها را می توان از طریق استفاده از کمک های واکسن خاص و طراحی ایمونوژن به دست آورد. فعل و انفعالات Fc R با IgG متصل به آنتی ژن ها نیز می تواند تحت تأثیر چگالی اپی توپ و جهت گیری فضایی و موقعیت اپی توپ ها قرار گیرد57،58. رویکردهای زیست‌شناسی ساختاری ممکن است برای درک این موضوع و اطلاع‌رسانی به طراحی واکسن ارزشمند باشد. همچنین ممکن است که نواحی مختلف CSP از طریق مکانیسم های ایمنی مختلف، ایمنی را واسطه کنند.

این برای هماگلوتینین آنفولانزا نشان داده شده است، با مکانیسم‌های Fc ​​Rmediated برای آنتی‌بادی‌های ناحیه ساقه حفاظت‌شده مهم است، اما برای آنتی‌بادی‌های خاص سویه به ناحیه سر اهمیت کمتری دارد.

مطالعات آتی که القای این آنتی بادی‌های عملکردی و ارتباط آن‌ها با حفاظت را بررسی می‌کنند، در آزمایش‌های فاز II و فاز III RTS، S و سایر واکسن‌های مبتنی بر CSP ضروری هستند. ما یک مطالعه اولیه را در کارآزمایی فاز I/IIa RTS، S56 انجام داده‌ایم. این نشان داد که واکسیناسیون RTS، S در واقع آنتی‌بادی‌هایی را به CSP القا می‌کند که اتصال Fc RIIa و Fc RIII و همچنین فاگوسیتوز توسط نوتروفیل‌ها را تقویت می‌کند. نکته مهم این است که این فعالیت‌های عملکردی در بین افرادی که در برابر عفونت مالاریا محافظت می‌شدند در مقایسه با افرادی که عفونت داشتند، به طور قابل‌توجهی بالاتر بود. در حالی که CSP هدف ایمنی اکتسابی انسان، از جمله آنتی بادی‌های عملکردی است، در حال حاضر درک محدودی از تفاوت‌های بالقوه در ایمنی اکتسابی طبیعی و ناشی از واکسن در برابر اسپروزوئیت‌ها وجود دارد. تحقیقات بیشتر در مورد این تفاوت ها ممکن است بینش های مهمی را برای اطلاع از توسعه واکسن نشان دهد.

به طور خلاصه، مطالعات ما مکانیسم‌ها و اهداف کلیدی ایمنی با واسطه Fc R در برابر اسپروزوئیت‌های خون را تعریف کرده‌اند. یافته‌های ما به نقش عمده نوتروفیل‌ها در پاکسازی فاگوسیتی اسپوروزوئیت‌ها اشاره می‌کند، نقش‌های مهمی را برای Fc ​​RIIa و Fc RIII تعریف می‌کند و CSP را به عنوان یک هدف کلیدی برای این فعالیت عملکردی تعیین می‌کند. مونوسیت ها نیز به فاگوسیتوز کمک می کنند اما فعالیت کمتری دارند و آنتی بادی ها همچنین می توانند فعالیت ADCC سلول NK را از طریق درگیری Fc RIIIa ارتقا دهند. درک و تعریف مکانیسم‌هایی که ایمنی را واسطه می‌کنند برای ایجاد واکسن‌های کارآمدتر بسیار مهم است. مطالعات آینده باید بررسی کنند که چگونه واکسن های فعلی در آزمایشات بالینی به طور موثر آنتی بادی هایی با این فعالیت های عملکردی تولید می کنند. استفاده از این دانش در تولید واکسن ممکن است یک استراتژی موثر برای ایجاد یک پاسخ ایمنی قوی باشد که سطوح بالاتری از محافظت در برابر مالاریا را فراهم می کند.

مواد و روش ها

جمعیت مطالعه و بیانیه اخلاق.

پلاسما از بزرگسالان سالم و بدون علامت در معرض مالاریا ساکن در ناحیه Kanyawegi در شهرستان Kisumu، کنیا (n=104، محدوده سنی 18-79؛ 26.9 درصد مرد) در 2 آگوست جمع آوری شد{12}}07 (کوهورت کانیاویگی)59; هیچ شرکت‌کننده‌ای علائم مالاریا را نداشت و 15/46 درصد پارازیتمی بدون علامت P. falciparum داشتند (با میکروسکوپ تشخیص داده شد). پلاسمای کودکان و بزرگسالان سالم و بدون علامت ساکن در ناحیه چولائیمبو در شهرستان کیسومو، کنیا (n=75، محدوده سنی 0.3-5.9 سال برای کودکان، محدوده سنی 19.6-69.2 سال برای بزرگسالان، 55 درصد زن) بود. جمع آوری شده در فوریه تا مارس 2007 (کوهورت Chulaimbo)42; جزئیات گروه در جدول تکمیلی 1 خلاصه شده است. شدت انتقال در زمان جمع‌آوری خون نسبتاً بالا بود (شیوع انگل‌های بدون علامت در کودکان کمتر یا مساوی 10 سال 70 تا 80 درصد بود). خون از بزرگسالان مرد و زن سالم برای استفاده در سنجش لکوسیت کامل، نوتروفیل، مونوسیت و NK جمع آوری شد.

تأییدیه اخلاقی از کمیته اخلاق و تحقیقات انسانی بیمارستان آلفرد (پروتکل 385-18)، هیئت بازبینی سازمانی برای تحقیقات انسانی در بیمارستان‌های دانشگاهی کلیولند برای دانشگاه کیس وسترن رزرو، ایالات متحده آمریکا (پروتکل 02-04-04) و کمیته بررسی اخلاقی در موسسه تحقیقات پزشکی کنیا، کنیا (پروتکل SSC{2}}). رضایت کتبی آگاهانه از همه شرکت کنندگان در مطالعه یا والدین یا قیم قانونی آنها اخذ شد.

آنتی ژن ها

آنتی ژن های مورد استفاده در این مطالعه همگی بر اساس توالی مرجع 3D7 P. falciparum CSP (شناسه ژن PF3D{3}}؛ www.plasmodb.org) بودند. CSP تمام قد نوترکیب از Sanaria (Sanaria، Rockville، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد.

پروتئین در Pichia pastoris با شروع باقی مانده اسید آمینه 50 بیان شد و حاوی (NANP) 22 تکرار و (NVPD) 4 تکرار است. ناحیه C ترمینال CSP (CT) و تلفیقی از ناحیه N ترمینال و ناحیه C ترمینال CSP (N به علاوه C) به عنوان پروتئین های نوترکیب با استفاده از سلول های HEK293F (خریداری شده از Invitrogen، استرالیا) تولید شد. ناحیه N ترمینال CSP (اسید آمینه 19-104، NT) به عنوان پپتیدهای مصنوعی و ناحیه تکرار مرکزی CSP (NANP) نیز به عنوان پپتیدهای مصنوعی (NANP×15) توسط LifeTein (LifeTein) تولید شد. نیوجرسی، ایالات متحده آمریکا).

تولید آنتی بادی برای پروتئین های مختلف CSP.

توسط مرکز آنتی بادی موسسه Walter Eliza Hall انجام شد. تأییدیه توسط کمیته اخلاق حیوانات مؤسسه والتر و الیزا هال ارائه شد (رجوع به: 2{8}}20.019، 2014.009). به طور خلاصه، خرگوش ها (n=2) با یکی از آنتی ژن های زیر واکسینه شدند: CSP تمام قد، ​​پروتئین نوترکیب N به علاوه C و پپتید NT. هر خرگوش سه دوز آنتی ژن (200 میکروگرم در دوز) را به همراه ادجوانت فروید در روزهای صفر، روز 28 و روز 56 دریافت کرد. سرم خرگوش پس از سومین واکسیناسیون در روز 68 جمع‌آوری شد و IgG خرگوش با پروتئین A خالص‌سازی شد. -انتخاب مثبت خرگوش anti-N به علاوه C IgG در ابتدا مورد آزمایش قرار گرفت و نشان داده شد که عمدتاً ناحیه C ترمینال CSP را تشخیص می دهد و ناحیه N ترمینال را تشخیص نمی دهد (شکل تکمیلی 6A). IgG ضد NT خرگوش برای تشخیص ناحیه N ترمینال CSP تایید شد (شکل تکمیلی 6B). هر دو آنتی بادی NT و CT با CSP تمام قد واکنش نشان دادند (شکل تکمیلی 6C). آنتی بادی مونوکلونال (mAb) MGG434، که پس از عفونت مکرر با اسپوروزوئیدهای ضعیف شده از یک فرد جدا شد، به عنوان یک آنتی بادی IgG1 نوترکیب در سلول های HEK293 با استفاده از روش های ایجاد شده بیان و خالص شد. برای تایید ویژگی، mAb در برابر CSP نوترکیب آزمایش شد. Anti-CSP mAb 2A1061 با جهش LALA در ناحیه Fc62 برای مهار برهمکنش های FcR به عنوان یک آنتی بادی کنترل بیان شد.

جداسازی PBMC، نوتروفیل ها و لکوسیت های کامل از خون محیطی.

سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی (PBMC) و نوتروفیل‌ها با استفاده از روش‌های قبلی ایجاد شده از خون محیطی جدا شدند. به طور خلاصه، خون محیطی از اهداکنندگان سالم با استفاده از سانتریفیوژ گرادیان Ficoll جدا شد. لایه های Buffy که حاوی PBMC ها هستند و گلوله های RBC که حاوی نوتروفیل ها هستند، به طور جداگانه جمع آوری شدند. برای جداسازی PBMC، سلول‌های جمع‌آوری‌شده از لایه Buffy چهار بار با PBS{2}} درصد NCS در دمای 4 درجه شستشو شدند. متعاقباً PBMC ها در سرم جنین گاو (FCS) RPMI{4} درصد مجدداً معلق شدند و روی یخ نگهداری شدند. نوتروفیل‌ها با تقسیم‌بندی دکستران از گلوله‌های RBC پس از سانتریفیوژ شیب Ficoll، و به دنبال آن لیز هیپوتونیک غنی‌سازی شدند.

لکوسیت‌های کامل از خون کامل با غنی‌سازی اولیه با تقسیم‌بندی دکستران و سپس لیز هیپوتونیک جدا شدند. نوتروفیل های جدا شده و لکوسیت های کامل به 5 × 105 نوتروفیل / میلی لیتر یا 5 × 106 فاگوسیت (مونوسیت ها و نوتروفیل ها) / میلی لیتر تنظیم شدند و متعاقباً در RPMI1640 که با 10 درصد FCS و 2.5 درصد سرم سرم فعال شده و 2.5 درصد سرم فعال شده در سرم فعال شده بود، مجدداً معلق شدند. سلول ها برای بیان Fc R با استفاده از آنتی بادی های Fc ​​RI (Clone 10.1 BD Bioscience، 1:50)، Fc RIIa (Clone 8.26، BD Bioscience، 1:25)، و Fc RIII (کلون 3G8 BD Bioscience، 1:50) فنوتیپ شدند. . آنتی بادی برای CD14 (کلون M5E2، BD Bioscience، 1:20) نیز برای تعیین زیر مجموعه های مونوسیت استفاده شد.

نگهداری سلول های THP-1.

سلول‌های رده سلولی پرومونوسیتی THP{{0}} (منبع از ATCC) در RPMI{1}} با 0}.002 mol/L L-گلوتامین، 0.01 mol/L HEPES نگهداری شدند. و 10 درصد سرم جنین گوساله (FCS). تراکم سلولی از نزدیک بررسی شد و بین 1 × 105 و 1 × 106 سلول / میلی لیتر حفظ شد. سلول ها هر 6 روز یا زمانی که تراکم سلولی به 106 × 1 سلول در میلی لیتر رسید، پاساژ شدند.

کشت و جداسازی اسپروزوئیدهای P. berghei.

پشه‌های آنوفل استفنسی روی موش‌های سوئیسی وبستر آلوده به CSP کایمریک که خط انگل P. berghei ANKA را بیان می‌کند تغذیه شدند. غدد بزاقی 18-22 روز پس از وعده غذایی خون عفونی تشریح و در PBS همگن شدند. اسپوروزوئیدها از صافی بافت 70- میکرومتر (Falcon) عبور داده و با استفاده از هموسیتومتر شمارش شدند.

کشت و جداسازی merozoites P. falciparum.

خط D1{2}} P. falciparum در RPMI-HEPES تکمیل شده با 0.5 درصد Albumax (تکنولوژی های زندگی) و 0.18 درصد NaHCO3 حفظ شد. کشت ها زیر 10 درصد پارازیتمی نگهداری شدند و با تیمار سوربیتول هماهنگ شدند. مروزوئیت‌ها با استفاده از روش‌های منتشر شده قبلی 32 جدا شدند. به طور خلاصه، مرحله اسکیزونت گلبول‌های قرمز آلوده با خالص‌سازی مغناطیسی غنی‌سازی شد و در محیطی که با transepoxysuccinyl-L-leucylamido ({11}}guanidino) بوتان (E64, Sigma) کشت شد ادامه یافت. آلدریچ) به مدت 8 ساعت قبل از عبور شیزونت های بالغ از یک فیلتر 1.{16}} میکرومتری برای آزادسازی مروزوئیت ها. مروزوئیت ها به 5 × 107 / میلی لیتر برای سنجش فاگوسیتوز اپسونیک یا 1 × 107 / میلی لیتر برای پوشش به صفحه ELISA برای سنجش Fc R-binding تنظیم شدند.

جفت کووالانسی آنتی ژن ها به دانه های لاتکس فلورسنت.

دانه‌های لاتکس فلورسنت اصلاح‌شده با آمین با اندازه 2.{2}} میکرومتر (سیگما-آلدریچ) دو بار با ۴0{23}} میکرولیتر PBS شسته شدند و در 2000 × گرم به مدت 3 دقیقه سانتریفیوژ شدند. گلوتارآلدئید 8 درصد در PBS به دانه ها اضافه شد و در یک شب در یک غلتک در دمای 4 درجه انکوبه شد. پس از شستشو با PBS، 1 میلی گرم در میلی لیتر CSP نوترکیب به دانه ها اضافه شد و به مدت 6 ساعت روی گرداب انکوبه شد. سپس دانه ها سانتریفیوژ و در 200 میکرولیتر اتانول آمین معلق شدند و به مدت 30 دقیقه روی گرداب انکوبه شدند تا تمام گروه های آمین باقیمانده خاموش شوند. سپس مهره ها در PBS شسته و با 1 درصد BSA در یک شب در دمای 4 درجه مسدود شدند. دانه های پوشش داده شده با آنتی ژن در یک حمام آب فراصوت به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه نگهداری شدند تا تجمع آنها کاهش یابد و متعاقباً به 5 × 107 دانه در میلی لیتر تنظیم شد. دانه ها در حضور 0.1 درصد SDS و 0.02 درصد NaN3 در دمای 4 درجه نگهداری شدند.

سنجش فاگوسیتوز اپسونیک

سنجش فاگوسیتوز اپسونیک در تنظیمات متغیر برای اهداف مختلف همانطور که در زیر و در جدول تکمیلی 6 توضیح داده شده است انجام شد.

برای فاگوسیتوز اپسونیک اسپوروزوئیدهای P. falciparum و P. berghei با استفاده از سلول‌های جدا شده، اسپوروزوئیدهای P. falciparum منجمد شده توسط PATHMVI (ساماریا، راک‌ویل، ایالات متحده آمریکا) تهیه و در نیتروژن مایع ذخیره شدند و در دمای 37 درجه به مدت 40 ثانیه ذوب شدند. دفترچه راهنمای کاربر سازنده اسپوروزوئیدهای تازه جدا شده P. berghei که برای بیان PfCSP12 ترانسفکت شده بودند نیز در این مطالعه استفاده شدند. همین رویکرد برای اسپروزویت های P. falciparum و P. berghei در آزمایش ها استفاده شد. اسپوروزویت ها با 10 میکروگرم بر میلی لیتر اتیدیوم بروماید به مدت 1 ساعت روی یخ رنگ آمیزی شدند و سپس سه بار شستشو با RPMI-HEPES انجام شد. برای اپسونیزاسیون، 50،{7}} اسپروزوئیت با 1 ul سرم آزمایش به مدت 1 ساعت روی یخ، و سپس انکوباسیون همزمان با 5000 نوتروفیل در غلظت 5 × 105 سلول در میلی‌لیتر در RPMI انکوبه شدند{14} مکمل با 10 درصد FCS و 2.5 درصد سرم انسانی غیرفعال شده با حرارت از اهداکنندگان ملبورن ساده لوح به مالاریا. 1 لیتر سرم آزمایشی اضافی نیز اضافه شد تا تغییر حجم ناشی از افزودن نوتروفیل ها را در نظر بگیرد و همان غلظت آنتی بادی تست را در طول فاگوسیتوز حفظ کند.

انکوباسیون همزمان به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه در انکوباتور 5 درصد CO2 برای فاگوسیتوز اجازه داده شد. سلول ها در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند و با PBS سرد -1 درصد NCS–0.04 درصد NaN3 (بافر FACS) شسته شدند تا فعالیت فاگوسیتوز متوقف شود. سطح فاگوسیتوز توسط فلوسیتومتری (FACS CantoII، BD Biosciences) اندازه‌گیری شد و با استفاده از نرم‌افزار FlowJo (نسخه 10) آنالیز شد. داده‌ها به‌عنوان شاخص فاگوسیتوز (PI)، که به‌عنوان نسبت نوتروفیل‌ها (شکل تکمیلی 4A) یا سلول‌های THP{11}} (شکل تکمیلی 1A) که دارای اسپوروزوئیدهای فاگوسیتوز شده بودند، ارائه شد. برای آزمایش‌ها روی کوهورت Kanyawegi و Chulaimbo، PI بیشتر به عنوان شاخص فاگوسیتوز نسبی (RPI) استاندارد شد، که به عنوان درصد PI برای هر نمونه نسبت به کنترل مثبت تعریف شد. اسپوروزویت های بدون اپسونیزه به عنوان کنترل منفی در تمام سنجش ها گنجانده شدند. سنجش فاگوسیتوز نوتروفیل استاندارد شامل 2.5 درصد سرم انسانی از اهداکنندگان غیرمعرض مالاریا بود. سنجش فاگوسیتوز استاندارد THP{16}} با استفاده از روش‌های تعیین‌شده که شامل 10 درصد FCS است، انجام شد.

برای فاگوسیتوز مهره‌ها یا مروزوئیت‌های پوشش‌داده‌شده با آنتی‌ژن با استفاده از سلول‌های جدا شده، سنجش فاگوسیتوز از روش‌های منتشر شده قبلی با تغییرات 32 اقتباس شد. دانه ها یا مروزوئیت ها سه بار با RPMI{6}} قبل از انکوباسیون همزمان با 105×1 نوتروفیل برای فاگوسیتوز شسته شدند. فاگوسیتوز به مدت 20 دقیقه برای دانه ها یا 10 دقیقه برای مروزوئیت ها در دمای 37 درجه رخ داد و سلول ها متعاقباً با بافر FACS در 300 × گرم و 4 درجه به مدت 4 دقیقه شسته شدند. نسبت نوتروفیل‌های حاوی دانه‌های فلورسنت یا مروزوئیت‌ها با فلوسیتومتری (FACS CantoII، BD Biosciences) ارزیابی شد و با استفاده از نرم‌افزار FlowJo آنالیز شد (شکل تکمیلی 4A). در برخی از سنجش‌ها، رده سلولی THP{17}} با شرایط استاندارد که شامل 10 درصد FCS است، استفاده شد. در سنجش های دیگر، 2.5 درصد سرم انسانی اضافی از اهداکنندگان ساده ملبورن مالاریا برای مقایسه استفاده شد.

برای فاگوسیتوز دانه‌های پوشش‌داده‌شده با آنتی‌ژن یا اسپوروزوئیدهای P. berghei با استفاده از آماده‌سازی لکوسیت‌های خون، دانه‌های پوشش‌داده‌شده با CSP با یک آنتی‌بادی پلی کلونال خرگوش که علیه CSP ایجاد شده بود، اپسونیز شدند. فاگوسیتوز با هم‌کوبی دانه‌های اپسونیزه شده با کل لکوسیت کل خون حاوی 106×1 فاگوسیت (مونوسیت و نوتروفیل) به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه در انکوباتور CO2 5 درصد انجام شد. این آزمایش ها با استفاده از غلظت های متغیر آنتی بادی برای اپسونیزاسیون یا نسبت های متغیر مهره به فاگوسیت انجام شد. برای آزمایش فاگوسیتوز اپسونیک اسپوروزوئیدهای P. berghei توسط آماده‌سازی‌های لکوسیتی کامل، 5 × 105 اسپوروزویت با مجموعه‌ای از سرم‌های بالغ کنیایی در معرض مالاریا در رقت 1:100 اپسونیز شدند و به دنبال آن انکوباسیون همزمان با لکوسیت‌های کامل حاوی 5×5 104 فاگوسیت. سلول‌ها در دمای 4 درجه به مدت 4 دقیقه سانتریفیوژ شدند تا فعالیت فاگوسیتی متوقف شود و فاگوسیت‌های مختلف (مونوسیت‌ها و نوتروفیل‌ها) با آنتی‌بادی‌های کونژوگه با فلورس برای تجزیه و تحلیل بیشتر برچسب‌گذاری شدند. مونوسیت‌ها با anti-CD14-Alexa647 (MφP9 BD Bioscience, 1:33) و anti-CD16- BV421 (3G8 BD Bioscience، 1:20) و نوتروفیل‌ها با anti-CD66bAPC برچسب‌گذاری شدند. -H7 (G10F5 BD Bioscience، 1:33).

برای تجزیه و تحلیل FACS، دانه های فاگوسیتوز به عنوان جمعیت PEhigh و FSChigh انتخاب شدند. دانه هایی که توسط مونوسیت ها و نوتروفیل ها فاگوسیتوز شده بودند با استفاده از رنگ آمیزی CD14 و CD66b بیشتر متمایز شدند. تعداد دانه های فاگوسیت شده توسط مونوسیت ها و نوتروفیل ها بر اساس شدت فلورسانس محاسبه شد (شکل تکمیلی 8). این تعداد بیشتر با استفاده از تعداد کل فاگوسیت‌ها (مونوسیت‌ها و نوتروفیل‌ها) استاندارد شد و به صورت مهره‌ها در هر 100 فاگوسیت بیان شد که نشان‌دهنده نرخ فاگوسیتوز انواع سلول‌های مختلف است.

برای مهار فاگوسیتوز اپسونیک با مسدود کردن گیرنده‌های Fc ​​یا کاهش آنتی‌بادی‌های CSP، Fc Rهای مختلف با استفاده از آنتی‌بادی‌های مسدودکننده خاص مسدود شدند. Fc RI با آنتی بادی مسدود کننده 50 میکروگرم بر میلی لیتر (mAb 10.1 Merck)، Fc RIIa با آنتی بادی مسدود کننده 50 میکروگرم در میلی لیتر (mAb IV.3) مسدود شد، Fc RIII با آنتی بادی مسدود کننده 50 میکروگرم در میلی لیتر (mAb 3G8) مسدود شد. . سلول‌های THP-1 و نوتروفیل‌ها به ترتیب با هر بلوکر Fc R در دمای 4 درجه به مدت 30 دقیقه قبل از انکوباسیون همزمان با دانه‌های لاتکس پوشش‌داده‌شده با CSP، که با سرم بزرگسالان ایمنی اپسونیز شده‌اند، تحت درمان قرار گرفتند. سنجش فاگوسیتوز همانطور که در بالا ذکر شد انجام شد. برای ارزیابی نقش آنتی‌بادی‌های CSP در ترویج فاگوسیتوز ناشی از آنتی‌بادی‌های اکتسابی انسانی، مجموعه‌ای از سرم بزرگسالان کنیایی به مدت 30 دقیقه با پپتید نوترکیب CSP و ناحیه NT در غلظت 20 میکروگرم در میلی‌لیتر برای اتصال به CSP اختصاصی از قبل انکوبه شد. آنتی بادی ها، قبل از استفاده در سنجش فاگوسیتوز.

اندازه‌گیری زیر کلاس‌های IgG و IgG کل توسط ELISA.

کل زیر کلاس های IgG و IgG به پروتئین های نوترکیب با روش ELISA اندازه گیری شد. به طور خلاصه، CSP با غلظت 1 میکروگرم در میلی‌لیتر روی صفحات میکروتیتر ماکسیسورپ چاهی (NUNC، Roskilde، دانمارک) پوشانده شد و یک شب در دمای 4 درجه انکوبه شد. پلیت ها با PBS حاوی 0.05 درصد Tween20 (PBS-Tween) شسته و با PBS-1 درصد BSA در دمای 37 درجه به مدت 2 ساعت مسدود شدند. سرم انسان یا IgG خرگوش به غلظت مورد نظر رقیق شد و در دو نسخه به پلیت ها اضافه شد. برای تشخیص کل IgG، IgG ضد انسانی بز با HRP کونژوگه در رقت 1:2500 و پس از آن از بستر ABTS برای توسعه رنگ استفاده شد. واکنش با 1 درصد SDS متوقف شد و جذب در 405 نانومتر اندازه‌گیری شد. برای تشخیص زیر کلاس IgG، باندهای آهنی به IgG1، IgG2، IgG3، و IgG4 انسانی در رقت 1:1000 استفاده شد، و به دنبال آن از HRP کونژوگه بز ضد موش IgG در رقت 1:2500 استفاده شد. در نهایت، از بستر 3،3'، 5،5'-Tetramethylbenzidine (TMB، Life Technologies) برای توسعه رنگ استفاده شد و واکنش با 1 مولار H2SO4 متوقف شد. جذب در طول موج 450 نانومتر اندازه گیری شد. مجموعه ای از سرم بزرگسالان کنیایی با واکنش IgG بالا به CSP به عنوان یک کنترل مثبت استفاده شد.

نقشه برداری اپی توپ های آنتی بادی ناحیه NT

آرایه ای حاوی 7{15}} پپتید مری بیوتینیله شده که نشان دهنده توالی خطی CSP (سویه 3D7/NF54) است (Mimotopes، استرالیا). هر پپتید دارای یک فاصله کوتاه SGSG بین توالی پپتید CSP و برچسب بیوتین (که برای کمک به بیحرکتی اضافه شد) و یک همپوشانی 12 aa بین پپتیدها داشت. سنجش آنتی بادی با استفاده از رویکردهای قبلی ایجاد شده 65،66 انجام شد. 50 میکرولیتر در هر چاهک از پپتیدها به صفحات الایزا که با 1 ug/ml استرپتاویدین (سیگما آلدریچ) از قبل پوشش داده شده بودند، اضافه شد. اشباع اتصال پپتید با تعیین کمیت محل‌های اتصال بیوتین باقی‌مانده روی استرپتاویدین با استفاده از بیوتین-HRP تأیید شد. به دنبال آن بلوک کردن با 10 درصد شیر، و شستشو با PBS با Tween 0.05 درصد. IgG پلی کلونال خرگوش در برابر ناحیه NT CSP با غلظت 1:500 به هر چاهک اضافه شد. سطح اتصال IgG خرگوش توسط HRP کونژوگه بز ضد خرگوش IgG (میلیپور، 1:2500) تشخیص داده شد و با استفاده از بستر TMB اندازه گیری شد.

سنجش اتصال گیرنده Fc

سنجش اتصال گیرنده Fc از روش‌های منتشر شده قبلی با تغییرات جزئی اقتباس شده است. به طور خلاصه، 5{{2{23}}}} ul از CSP نوترکیب در غلظت 1 ug/ml بر روی صفحات Maxisorp™ پوشانده شد و یک شب در دمای 4 درجه انکوبه شد و سپس سه بار شستشو با PBS-Tween انجام شد. سپس پلیت ها با 200 میکرولیتر BSA-PBS 1 درصد در دمای 37 درجه به مدت 2 ساعت و سپس سه بار شستشو با PBS-Tween مسدود شدند. نمونه های سرم در 1:50 در PBS-BSA رقیق شدند و 50 ul از هر نمونه در دو نسخه به پلیت ها اضافه شد و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد و سپس سه بار شستشو در PBS-Tween انجام شد. 50 میکرولیتر دایمرهای اکتودومین محلول Fc RIIa H131 نوترکیب کونژوگه با بیوتین (0.2 میکروگرم بر میلی لیتر) یا دایمرهای اکتودومین Fc RIII V158 (0.1 میکروگرم در میلی لیتر) به هر چاهک اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت و سپس با PBS انکوبه شد. -توئین برای برخی از سنجش‌ها، آلل R131 Fc RIIa و آلل F158 Fc RIII در غلظت یکسان استفاده شد. به دنبال آن یک استرپتاویدین ثانویه با HRP کونژوگه (Thermo Fisher Scientific, 1:10,{33}}) در PBS-BSA در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت و سپس سه شستشو با PBS-Tween دنبال شد.

در نهایت، 50 لیتر از بستر مایع TMB به مدت 20 دقیقه برای اندازه‌گیری واکنش آنزیمی اضافه شد. واکنش با 50 میکرولیتر از محلول 1 مولار H2SO4 متوقف شد. سطح اتصال به عنوان چگالی نوری در 450 نانومتر اندازه‌گیری شد. IgG ادغام شده انسان از بزرگسالان کنیایی در معرض مالاریا (1:100) و IgG پلی کلونال خرگوش به CSP (1:500) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. سرم های فردی از بزرگسالان ساده ملبورن (1:50) به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

سنجش اتصال گیرنده Fc از روش‌های منتشر شده قبلی با تغییرات جزئی اقتباس شده است. به طور خلاصه، 5{{2{23}}}} ul از CSP نوترکیب در غلظت 1 ug/ml بر روی صفحات Maxisorp™ پوشانده شد و یک شب در دمای 4 درجه انکوبه شد و سپس سه بار شستشو با PBS-Tween انجام شد. سپس پلیت ها با 200 میکرولیتر BSA-PBS 1 درصد در دمای 37 درجه به مدت 2 ساعت و سپس سه بار شستشو با PBS-Tween مسدود شدند. نمونه های سرم در 1:50 در PBS-BSA رقیق شدند و 50 ul از هر نمونه در دو نسخه به پلیت ها اضافه شد و به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد و سپس سه بار شستشو در PBS-Tween انجام شد. 50 میکرولیتر دایمرهای اکتودومین محلول Fc RIIa H131 نوترکیب کونژوگه با بیوتین (0.2 میکروگرم بر میلی لیتر) یا دایمرهای اکتودومین Fc RIII V158 (0.1 میکروگرم در میلی لیتر) به هر چاهک اضافه شد و در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت و سپس با PBS انکوبه شد. -توئین برای برخی از سنجش‌ها، آلل R131 Fc RIIa و آلل F158 Fc RIII در غلظت یکسان استفاده شد. به دنبال آن یک استرپتاویدین ثانویه با HRP کونژوگه (Thermo Fisher Scientific, 1:10,{33}}) در PBS-BSA در دمای 37 درجه به مدت 1 ساعت و سپس سه شستشو با PBS-Tween دنبال شد. در نهایت، 50 لیتر از بستر مایع TMB به مدت 20 دقیقه برای اندازه‌گیری واکنش آنزیمی اضافه شد. واکنش با 50 میکرولیتر از محلول 1 مولار H2SO4 متوقف شد. سطح اتصال به عنوان چگالی نوری در 450 نانومتر اندازه‌گیری شد. IgG ادغام شده انسان از بزرگسالان کنیایی در معرض مالاریا (1:100) و IgG پلی کلونال خرگوش به CSP (1:500) به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. سرم های فردی از بزرگسالان ساده ملبورن (1:50) به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

سنجش سمیت سلولی وابسته به آنتی بادی.

فعالیت القای ADCC منتخبی از نمونه‌های سرم با استفاده از کیت ADCC Reporter Bioassay (Promega، Cat. No. G7010) مطابق دستورالعمل سازنده، با تغییرات زیر ارزیابی شد. دانه های پوشش داده شده با CSP با سرم انسانی در رقت 1:50 اپسونیز شدند. سلول های گزارشگر در 72،{6}} سلول در هر چاه همراه با دانه های فلورسنت پوشش داده شده با CSP در نسبت 10:1 اندود شدند. پس از 6 ساعت انکوباسیون، بستر شیمیایی لومینسانس اضافه شد و لومینسانس تشخیص داده شد و تقریباً هر 5 دقیقه به مدت 40 دقیقه اندازه‌گیری شد (CLARIOstar، BMG LabTech). داده های ارائه شده حدود 30 دقیقه پس از افزودن سوبسترای لومینسانس شیمیایی ثبت شد.

سطح ADCC نیز در سلول‌های NK اولیه با استفاده از روشی که قبلاً منتشر شده بود 38 تأیید شد. به طور خلاصه، PBMCs حاوی سلول‌های NK در RPMI1640 همراه با 10 درصد FCS و 100 واحد بین‌المللی در میلی‌لیتر اینترلوکین کشت داده شدند (IL{5). }}) یک شبه. دانه های پوشش داده شده با CSP با سرم انسانی در رقت 1:50 اپسونیز شدند، سپس با PBMC های اولیه در حضور anti-CD107a-AF647 (H4A3، BD Bioscience) به مدت 1 ساعت کشت شدند. متعاقباً برفلدین A (سیگما آلدریچ) و مهارکننده انتقال پروتئین (BD Bioscience) به ترتیب با غلظت ug/ml 5 و 1/1500 به کشت همزمان اضافه شدند و به مدت 3 ساعت به انکوباتور ادامه دادند. پس از انکوباسیون، سلول ها در 300 × گرم به مدت 4 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شدند و با anti-CD{27}}APC-H7 (SK7, BD Bioscience, 1:33), anti-CD رنگ‌آمیزی شدند. PE-Cy7 (B159، BD Bioscience، 1:33) و anti-CD{41}}BV421 (3G8، BD Bioscience، 1:20). سلول‌های NK به‌عنوان لنفوسیت‌های CD3-، CD56 به‌علاوه تعریف شدند و سطح ADCC به‌عنوان درصد سلول‌های NK با رنگ‌آمیزی CD107a توسط فلوسایتومتری (LSR Fortessa X{50}}، BD Bioscience) تعیین شد (شکل تکمیلی 9).

تحلیل داده ها.

تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از Prism نسخه 7 (GraphPad Software Inc) و STATA نسخه 13.1 (StataCorp) انجام شد. آزمون آماری و مقادیر P در افسانه های شکل نشان داده شده است. همبستگی بین فاگوسیتوز، اتصال FcR و سطوح IgG با استفاده از ضرایب همبستگی اسپیرمن و مدل‌های رگرسیون خطی چندگانه ارزیابی شد. تفاوت در سطوح فاگوسیتوز، اتصال FcR و سطوح IgG در گروه‌های سنی و شرایط مختلف اپسونیزاسیون با استفاده از ANOVA یک طرفه با مقایسه‌های چندگانه ارزیابی شد.

برای ارزیابی فعالیت های عملکردی آنتی بادی صرف نظر از تیتر IgG کل به CSP، بازده اتصال FcR و فاگوسیتوز به عنوان سطح اتصال FcR یا سطح فاگوسیتوز اپسونیک نسبت به واکنش IgG به CSP محاسبه شد. برای تجزیه و تحلیل کارایی عملکرد آنتی بادی در کودکان و بزرگسالان از آزمون همبستگی اسپیرمن و من ویتنی استفاده شد. ANOVA دو طرفه برای مقایسه فاگوسیتوز اپسونیک توسط نوتروفیل ها و مونوسیت ها در سنجش کل لکوسیت استفاده شد. برای داده هایی که به طور معمول توزیع نشده بودند، آزمون کروسکال-والیس و آزمون من ویتنی انجام شد. تمامی تجزیه و تحلیل های آماری به صورت آزمون های دو طرفه انجام شد. در صورتی که واکنش پذیری از میانگین به علاوه 3 انحراف استاندارد مقادیر کنترل های مالاریا در معرض مالاریا بیشتر بود، نمونه ها به عنوان آنتی بادی مثبت طبقه بندی شدند.

خلاصه گزارش

اطلاعات بیشتر در مورد طراحی تحقیق در خلاصه گزارش تحقیقات طبیعت مرتبط با این مقاله موجود است.

در دسترس بودن داده ها

داده های مورد استفاده برای تولید ارقام در صورت درخواست از نویسندگان در دسترس است. پایگاه‌های داده‌ای که در تهیه این مقاله تجزیه و تحلیل شده و در شکل‌ها و جداول ارائه شده‌اند، در صورت درخواست معقول و در انتظار موافقت کمیته‌های اخلاق مربوطه (برای داده‌های بالینی) از نویسنده مسئول در دسترس است. توالی P. falciparum از پایگاه داده عمومی در PlasmoDB.org به دست آمد.

دریافت: 2 سپتامبر 2019; پذیرش: 24 فوریه 2021.

منابع

1. سازمان بهداشت جهانی. گزارش جهانی مالاریا 2018 (سازمان بهداشت جهانی، 2018).

2. سازمان بهداشت جهانی، نقشه راه فناوری واکسن مالاریا (سازمان بهداشت جهانی، 2018).

3. بیسون، جی جی و همکاران. چالش‌ها و استراتژی‌ها برای توسعه واکسن‌های موثر و طولانی‌مدت مالاریا. علمی ترجمه پزشکی 11, eaau1458 (2019).

4. Cockburn, IA & Seder, RA پیشگیری از مالاریا: از مفاهیم ایمنی تا واکسن های موثر و آنتی بادی های محافظ. نات ایمونول. 19، 1199–1211 (2018).

5. Choumet, V. et al. تجسم تغذیه خون آنوفل گامبیه غیرعفونی و عفونی در موش های ساده و ایمن شده با بزاق PLoS ONE 7, e50464 (2012).

6. Nussenzweig, V. & Nussenzweig, RS Circumsporozoite پروتئین های انگل های مالاریا. سلول 42، 401-403 (1985).

7. مشارکت، RCT اثربخشی و ایمنی RTS، واکسن مالاریا S/AS01 با یا بدون دوز تقویت کننده در نوزادان و کودکان در آفریقا: نتایج نهایی فاز 3، کارآزمایی تصادفی شده و کنترل شده به صورت جداگانه. Lancet 386, 31-45 (2015).

8. پاسخ های Dups، JN، Pepper، M. & Cockburn، IA آنتی بادی و سلول های B به اسپروزویت های پلاسمودیوم. جلو. میکروبیول. 5, 625 (2014).

9. دوبانو، سی و همکاران. غلظت و تمایل آنتی‌بادی‌ها به اپی‌توپ‌های مختلف سیرکوسپروزوئیت با کارآیی واکسن مالاریا RTS، S/AS01E مرتبط است. نات اشتراک.

10, 2174 (2019). 10. Stewart، MJ، Nawrot، RJ، Schulman، S. & Vanderberg، JP Plasmodium berghei تهاجم اسپوروزویت در شرایط آزمایشگاهی توسط آنتی بادی های بی حرکت کننده اسپوروزویت مسدود می شود. آلوده کردن ایمنی 51، 859-864 (1986).

11. Mishra, S., Nussenzweig, RS & Nussenzweig, V. آنتی بادی های پروتئین پلاسمودیوم circumsporozoite (CSP) فعالیت پیمایش سلولی اسپروزوئیت را مهار می کنند. J. Immunol. Methods 377, 47-52 (2012).

12. تریلر، جی و همکاران. قرار گرفتن در معرض انگل طبیعی باعث ایجاد آنتی بادی های ضد مالاریا در انسان می شود. مصونیت 47، 1197-1209 e1110 (2017).

13. هافمن، اس ال و همکاران. ایمنی در برابر مالاریا و آنتی بادی های به دست آمده به طور طبیعی در برابر پروتئین circumsporozoite پلاسمودیوم فالسیپاروم. N. Engl. جی. مد. 315, 601-606 (1986).

14. Foquet, L. et al. آنتی بادی های مونوکلونال ناشی از واکسن که پروتئین سیرکومسپروزوئیت را هدف قرار می دهند از عفونت پلاسمودیوم فالسیپاروم جلوگیری می کنند. جی. کلین. تحقیق کنید. 124، 140-144 (2014).

15. Przysiecki، C. et al. آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده اسپروزوئیت در موش‌ها و ماکاک‌های رزوس که با یک پپتید تکراری پلاسمودیوم فالسیپاروم کونژوگه به ​​مجتمع پروتئین غشای خارجی مننگوکوک ایمن‌سازی شده‌اند، استخراج شد. جلو. سلول عفونی. میکروبیول. 2, 146 (2012).

16. فلورس گارسیا، ی. و همکاران. محافظت با واسطه آنتی بادی در برابر اسپوروزوئیدهای پلاسمودیوم از محل تلقیح پوستی شروع می شود. mBio 9، e02194–02118 (2018).

17. Aliprandini، E. et al. آنتی بادی های ضد سیرکومسپروزوئیت سیتوتوکسیک، اسپوروزوئیدهای مالاریا را در پوست میزبان هدف قرار می دهند. نات میکروبیول. 3، 1224-1233 (2018).

18. DiLillo, DJ, Tan, GS, Palese, P. & Ravetch, JV آنتی بادی های خنثی کننده گسترده ساقه هماگلوتینین به فعل و انفعالات FcgammaR برای محافظت در برابر ویروس آنفولانزا در داخل بدن نیاز دارند. نات پزشکی 20، 143-151 (2014).

19. هسل، ای جی و همکاران. گیرنده Fc اما نه اتصال مکمل در محافظت آنتی بادی در برابر HIV مهم است. Nature 449, 101-104 (2007).

20. Bournazos، S. et al. آنتی‌بادی‌های ضد اچ‌آی‌وی خنثی‌کننده گسترده به عملکردهای مؤثر Fc برای فعالیت in vivo نیاز دارند. سلول 158، 1243-1253 (2014).

21. Mularkey، CE و همکاران. آنتی بادی های اختصاصی ساقه هماگلوتینین خنثی کننده گسترده، فاگوسیتوز قوی کمپلکس های ایمنی توسط نوتروفیل ها را به روشی وابسته به Fc القا می کنند. mBio 7، e01624–01616 (2016).

22. ایرانی، وی و همکاران. خواص مولکولی زیر کلاس های IgG انسانی و پیامدهای آنها برای طراحی آنتی بادی های مونوکلونال درمانی علیه بیماری های عفونی مول. ایمونول. 67، 171-182 (2015). 23. Nauseef، WM & Borregaard، N. نوتروفیل ها در محل کار. نات ایمونول. 15, 602-611 (2014).

24. Kolaczkowska، E. & Kubes، P. استخدام نوتروفیل و عملکرد در سلامت و التهاب. نات کشیش ایمونول. 13، 159-175 (2013).

25. گوردون، اس. فاگوسیتوز: یک فرآیند ایمونولوژیک. مصونیت 44، 463-475 (2016).

26. Scapini, P. & Cassatella, MA شبکه‌های اجتماعی نوتروفیل‌های انسانی در سیستم ایمنی. Blood 124, 710-719 (2014).

27. Dale, DC, Boxer, L. & Liles, WC فاگوسیت ها: نوتروفیل ها و مونوسیت ها. Blood 112, 935-945 (2008).

28. Ziegler-Heitbrock, L. et al. نامگذاری مونوسیت ها و سلول های دندریتیک در خون. Blood 116, e74–e80 (2010).

29. Rosales، C. ناهمگونی گیرنده Fcgamma در پاسخ های عملکردی لکوسیت. جلو. ایمونول. 8, 280 (2017).

30. Golay, J. et al. نوتروفیل های انسانی سطوح پایین FcgammaRIIIA را بیان می کنند که در فعال سازی PMN نقش دارد. Blood 133, 1395–1405 (2019).

31. فولاد، RW و همکاران. یک سنجش فاگوسیتوز اپسونیک برای اسپروزوئیت‌های پلاسمودیوم فالسیپاروم. کلین. واکسن ایمونول. 24, e00445–00416 (2017).

32. Osier, FH et al. فاگوسیتوز اپسونیک مروزوئیت های پلاسمودیوم فالسیپاروم: مکانیسم در ایمنی انسان و همبستگی محافظت در برابر مالاریا. BMC Med. 12, 108 (2014).

33. Kurtovic، L. و همکاران. آنتی بادی های انسانی مکمل را در برابر اسپروزویت های پلاسمودیوم فالسیپاروم فعال می کند و با محافظت در برابر مالاریا در کودکان مرتبط است. BMC Med. 16, 61 (2018).

34. Tan, J. et al. یک اصل و نسب آنتی بادی عمومی که از طریق اتصال دوگانه به پروتئین circumsporozoite، عفونت مالاریا را به شدت مهار می کند. نات پزشکی 24, 401–407 (2018).

35. Kerntke, C., Nimmerjahn, F. & Biburger, M. قدرت (علمی) در اعداد وجود دارد: یک کمی سازی جامع از اعداد گیرنده گاما Fc بر روی لکوسیت های خون محیطی انسان و موش. جلو. ایمونول. 11, 118 (2020).

36. Fleit, HB & Kobasiuk, CD رده سلولی مونوسیت مانند انسانی THP-1 Fc گاما RI و Fc گاما RII را بیان می کند. J. Leukoc. Biol. 49، 556-565 (1991).

37. Ulfman، LH، Leusen، JHW، Savelkoul، HFJ، Warner، JO & van Neerven، RJJ اثرات ایمونوگلوبولین های گاوی بر عملکرد ایمنی، آلرژی و عفونت. جلو. Nutr. 5, 52 (2018).

38. Lichtfuss, GF et al. HIV رویدادهای انتقال سیگنال اولیه را که توسط پیوند متقابل CD16 روی سلول‌های NK ایجاد می‌شود، مهار می‌کند، که برای سمیت سلولی وابسته به آنتی‌بادی مهم هستند. J. Leukoc. Biol. 89، 149-158 (2011).

39. شراب، BD و همکاران. اکتودومین های دیمری FcgammaR به عنوان پروب های عملکرد گیرنده Fc IgG ویروس ضد آنفلوانزا. J. Immunol. 197، 1507–1516 (2016).

40. لی، ایکس، گیبسون، AW و کیمبرلی، پلی مورفیسم و ​​بیماری RP Human FcR. Curr. بالا. میکروبیول. ایمونول. 382، 275-302 (2014).

41. Munde، EO et al. ارتباط بین پلی مورفیسم های ژنتیکی گیرنده Fcgamma IIA، IIIA و IIIB و استعداد ابتلا به کم خونی شدید مالاریا در کودکان در غرب کنیا. BMC Infect دیس 17, 289 (2017).

42. چلیمو، ک. و همکاران. تفاوت های مرتبط با سن در حافظه سلول T به طور طبیعی اکتسابی به پروتئین سطحی پلاسمودیوم فالسیپاروم merozoite 1. PLoS ONE 6, e24852 (2011).

43. Kurtovic، L. و همکاران. آنتی بادی های چند عملکردی توسط واکسن مالاریا RTS، S القا می شوند و با محافظت در آزمایشات فاز I/IIa همراه هستند. ج. عفونی کردن. Dis, jiaa144 (2020). 44. Abel, AM, Yang, C., Thakar, MS & Malarkannan, S. سلولهای کشنده طبیعی: توسعه، بلوغ و استفاده بالینی. جلو. ایمونول. 9, 1869 (2018).

45. Chaudhury, S. et al. عملکرد بیولوژیکی آنتی بادی های القا شده توسط کاندید واکسن مالاریا RTS، S/AS01 با ویژگی خوب آنها تعیین می شود. مالار. J. 15, 301 (2016).

46. ​​Collins, KA, Snaith, R., Cottingham, MG, Gilbert, SC & Hill, AVS تقویت ایمنی محافظتی در برابر مالاریا با واکسن ذرات ویروس مانند بسیار ایمنی زا. علمی Rep. 7, 46621 (2017).

47. Coppi, A., Pinzon-Ortiz, C., Hutter, C. & Sinnis, P. پروتئین Plasmodium circumsporozoite در طول تهاجم سلولی به صورت پروتئولیتی پردازش می شود. J. Exp. پزشکی 201، 27-33 (2005).

48. Coppi، A. و همکاران. پروتئین circumsporozoite مالاریا دارای دو حوزه عملکردی است که هر کدام نقش‌های مشخصی به عنوان اسپوروزویت‌ها از پشه به میزبان پستانداران دارند. J. Exp. پزشکی 208, 341-356 (2011).

49. جان، سی سی و همکاران. ارتباط سطوح بالای آنتی بادی ها با آنتی ژن های متعدد پلاسمودیوم فالسیپاروم پیش اریتروسیتی و محافظت در برابر عفونت. صبح. جی تروپ. Med Hyg. 73، 222-228 (2005).

50. Tran, TM et al. یک مطالعه کوهورت طولی فشرده روی کودکان و بزرگسالان مالیایی هیچ شواهدی مبنی بر مصونیت اکتسابی نسبت به عفونت پلاسمودیوم فالسیپاروم نشان نداد. کلین. آلوده کردن دیس 57، 40-47 (2013).

51. Epstein, JE et al. محافظت در برابر مالاریا پلاسمودیوم فالسیپاروم با واکسن PfSPZ. JCI Insight 2, e89154 (2017).

52. Sack، BK et al. محافظت شوخ طبعی در برابر عفونت پلاسمودیوم فالسیپاروم منتقل شده از نیش پشه در موش های انسانی. NPJ Vaccines 2, 27 (2017).

53. Stoute, JA et al. ارزیابی اولیه یک واکسن پروتئینی نوترکیب سیرکومسپروزوئیت علیه مالاریا پلاسمودیوم فالسیپاروم RTS، گروه ارزیابی واکسن مالاریا S. N. Engl. جی. مد. 336، 86-91 (1997).

54. Kester، KE و همکاران. اثربخشی رژیم های واکسن پروتئینی نوترکیب سیرکومسپروزوئیت در برابر مالاریا پلاسمودیوم فالسیپاروم تجربی. ج. عفونی کردن. دیس 183, 640-647 (2001).

55. Kester، KE و همکاران. کارآزمایی فاز 2a برنامه‌های ایمن‌سازی 0، 1 و 3 ماهه و 0، 7، و 28-روزه واکسن مالاریا RTS، S/AS02 در بزرگسالان ساده‌لوح مالاریا در والتر رید موسسه تحقیقات ارتش. واکسن 26، 2191-2202 (2008).

56. Kester، KE و همکاران. کارآزمایی تصادفی، دوسوکور، فاز 2a واکسن‌های فالسیپاروم مالاریا RTS، S/AS01B و RTS، S/AS02A در بزرگسالان بی‌تفاوت مالاریا: ایمنی، اثربخشی، و همکاران ایمنی حفاظت. ج. عفونی کردن. دیس 200, 337-346 (2009).

57. Lux, A., Yu, X., Scanlan, CN & Nimmerjahn, F. تأثیر اندازه کمپلکس ایمنی و گلیکوزیلاسیون بر اتصال IgG به FcgammaRهای انسانی. J. Immunol. 190, 4315-4323 (2013).

58. Nesspor، TC، Raju، TS، Chin، CN، Vafa، O. & Brezski، RJ Avidity اتصال FcgammaR و عملکرد عامل ایمنی را به ایمونوگلوبولین G1 گلیکوزیله می دهد. جی. مول. تشخیص دهد. 25، 147-154 (2012).

59. دنت، AE و همکاران. پایداری موقت ایمنی اکتسابی طبیعی نسبت به پروتئین سطحی مروزویت-1 در بزرگسالان کنیایی. مالار. J. 8, 162 (2009).

60. جان، سی سی و همکاران. آنتی بادی های آنتی ژن های پلاسمودیوم فالسیپاروم پیش اریتروسیتی و خطر ابتلا به مالاریا بالینی در کودکان کنیایی ج. عفونی کردن. دیس 197, 519-526 (2008).

61. Zavala, F. et al. منطق توسعه واکسن مصنوعی علیه مالاریا پلاسمودیوم فالسیپاروم Science 228, 1436-1440 (1985).

62. آردوین، ای. و همکاران. اتصال بسیار کاهش یافته به گیرنده های گامای Fc ​​موش با میل ترکیبی بالا و کم توسط جهش های L234A/L235A و N297A Fc مهندسی شده در IgG2a موش. مول. ایمونول. 63، 456-463 (2015).

63. Quinn, MT, DeLeo, FR & Bokoch, GM in Methods Mol Biol, Vol. 412 (ed. Quinn, MT) 13-18 (Springer Science plus Business Media, Springer New York Heidelberg Dordrecht London, 2007).

64. Maueroder, C. et al. توانایی نوتروفیل ها برای تشکیل NET ها مستقیماً تحت تأثیر یک پپتید هدف گیری CMA نیست. جلو. ایمونول. 8، 16 (2017).

65. Feng, G. et al. ایمن سازی انسان با یک نامزد واکسن مالاریا چند شکلی، آنتی بادی هایی را به اپی توپ های حفاظت شده القا کرد که آنتی بادی های عملکردی را به سویه های انگل متعدد ارتقا می دهد. ج. عفونی کردن. دیس 218، 35-43 (2018).

66. بویل، ام جی و همکاران. آنتی بادی های انسانی مکمل را برای مهار تهاجم پلاسمودیوم فالسیپاروم به گلبول های قرمز تثبیت می کنند و با محافظت در برابر مالاریا همراه هستند. مصونیت 42، 580-590 (2015).

قدردانی

ما از شرکت کنندگان در مطالعه و کارکنان موسسه تحقیقات پزشکی کنیا برای نمونه هایی از همگروهی Chulaimbo و Kanyawegi تشکر می کنیم. P. falciparum sporozoites و mAb 2H8 با مهربانی توسط PATH مالاریا واکسن ابتکار (MVI) ارائه شد. mAb 3D11 و هیبریدوم با مهربانی توسط Miguel Prudencio از Instituto de Medicina Molecular ارائه شد. انگل های P. berghei بیان کننده P. falciparum CSP توسط کریس جانس، شهید خان و هانس کروز از مرکز پزشکی دانشگاه لیدن ارائه شد. جفت کووالانسی آنتی ژن به دانه های فلورسنت توسط پل رامسلند از RMIT، پل سندرز از موسسه برنت و جفری پیترز از موسسه قلب و دیابت بیکر حمایت شد.

ما همچنین از میشل وانگ از موسسه Burnet به خاطر اینکه فلبوتومیست ما بود و امیلی لاک برای بازخورد و توصیه مفید تشکر می کنیم. این مطالعه همچنین توسط مرکز اصلی فلوسیتومتری AMREP پشتیبانی شد. این کار توسط شورای ملی تحقیقات بهداشتی و پزشکی استرالیا (NHMRC) پشتیبانی شده است (Grant Program and Senior Research Fellowship to JG Beeson; Project Grants به JGB، GI McFadden و PM Hogarth؛ کمک هزینه توسعه شغلی به MJB)، PATH-MVI (کمک مالی به JGB)، بنیاد CASS (کمک مالی به GF)، بورسیه برنده شورای تحقیقات استرالیا به GI McFadden، و مراکز بین المللی عالی NIH برای تحقیقات مالاریا (U19AI129326). مؤسسه Burnet توسط NHMRC برای طرح حمایت از زیرساخت مؤسسات تحقیقاتی مستقل و پشتیبانی زیرساخت عملیاتی دولت ایالت ویکتوریا پشتیبانی می شود. JGB، GF، MJB، JAC، SC و LK اعضای مرکز تحقیقات تعالی NHMRC استرالیا در رفع مالاریا هستند.

مشارکت های نویسنده

JGB، GF، و BDW طراحی مطالعه را با ورودی PMH، GIM، LK، JAC و سایر نویسندگان رهبری کردند. GF، BDW، LK، PB، DML، SC، VM، و AC آزمایش‌هایی را انجام دادند و نتایج را تفسیر کردند. GF، PB، و JAC تجزیه و تحلیل داده ها را با ورودی JGB، LK، و MJB انجام دادند. JGB، BDW، PMH، JWK، AED، KC، GIM، AC، VM، DRD، و RJC معرف‌ها، داده‌ها و/یا منابع کلیدی را ارائه یا تولید کردند. GF، JGB، LK، JAC، و DRD با نظرات سایر نویسندگان همکار به تهیه مقاله کمک کردند.

منافع رقابتی

نویسندگان اظهار کردند که هیچ علاقه ای به رقابت ندارند.

اطلاعات بررسی همتایان

Nature Communications از Katie Ewer، Photini Sinnis، و داور(های) ناشناس دیگر برای مشارکت آنها در بررسی همتایان این اثر تشکر می کند. گزارش های بازبین همتا در دسترس است.

یادداشت ناشر

Springer Nature در مورد ادعاهای قضایی در نقشه های منتشر شده و وابستگی های سازمانی بی طرف باقی می ماند.

دسترسی آزاد

این مقاله تحت مجوز Creative Commons Attribution 4 مجوز دارد.0 مجوز بین‌المللی، که اجازه استفاده، اشتراک‌گذاری، اقتباس، توزیع، و تکثیر را در هر رسانه یا قالبی می‌دهد، تا زمانی که اعتبار مناسب را به نویسنده (نویسندگان) اصلی بدهید. ) و منبع، پیوندی به مجوز Creative Commons ارائه دهید و نشان دهید که آیا تغییراتی ایجاد شده است یا خیر. تصاویر یا سایر مطالب شخص ثالث در این مقاله در مجوز Creative Commons مقاله گنجانده شده است، مگر اینکه در خط اعتباری مطالب به گونه دیگری ذکر شده باشد. اگر مطالب در مجوز Creative Commons مقاله گنجانده نشده است و استفاده مورد نظر شما توسط مقررات قانونی مجاز نیست یا از استفاده مجاز فراتر می رود، باید مستقیماً از دارنده حق چاپ مجوز دریافت کنید. برای مشاهده یک کپی از این مجوز، به http://creativecommons.org/licences/by/4 مراجعه کنید.0/.

 For more information:1950477648nn@gmail.com