مهارکننده‌های ملانوژنز از ریزوم Ligusticum Sinense در B{0}}سلول‌های ملانوما F10 In vitro و Zebrafish In Vivo

مخاطب: ali.ma@wecistanche.com

مین چی چنگ 1، †، تزونگ-هوی لی 2، یی-تزو چو 3، لی لینگ سیو 3، سو-جونگ هسو 4، چیا-هسیونگ چنگ 5، جندر وو 1* و چینگ کو لی 1،3،6،*

خلاصه:ریزوم Ligusticum sinense، یک گیاه دارویی چینی، از دیرباز به عنوان ماده آرایشی برایسفید کردنو آبرسانی به پوست در چین باستان. به منظور بررسی اجزای ضد ملانوژنیک ریزوم L. sinense، ما یکضد ملانوژنزخالص‌سازی هدایت‌شده با استفاده از HPLC نیمه آماده‌ای همراه با آنالیز طیف‌سنجی برای تعیین اجزای فعال. بر اساس روش هدایت‌شده با سنجش زیستی، 24 ترکیب از لایه اتیل استات عصاره‌های متانولی L. sinense جدا و شناسایی شدند و از این میان،5-[3-(4-هیدروکسی{{{ 7}}متوکسی فنیل)آلیل]فرولیک اسید (1) و سیس-4-پنتیل سیکلوهکس-3-ان-1،2-دیول (2) ترکیبات جدیدی بودند. تمام جدایه‌های خالص با استفاده از سلول‌های B{14}}F10 مورینملانوما تحت آزمایش ضد ملانوژنز قرار گرفتند. ترکیب 1 و (3S،3aR) -neocnidilide (8) به نمایش گذاشته شده استضد ملانوژنزفعالیت هایی با مقادیر IC50 به ترتیب 78.9 و 31.1 میکرومولار بدون سمیت سلولی آشکار. بررسی های بیشتر نشان داد که ترکیب 8 فعالیت ضد رنگدانه قابل توجهی روی جنین های زبرماهی ({7}} میکرومولار) در مقایسه با آربوتین (20 میکرومولار) و بدون هیچ گونه سمیت سلولی در برابر کراتینوسیت های اپیدرمی طبیعی انسان نشان داد. این یافته ها نشان می دهد که (3S,3aR)-neocnidilide (8) یک ترکیب طبیعی ضد ملانوژنیک و غیر سیتوتوکسیک قوی است و ممکن است به طور بالقوه به عنوان آسکین ایجاد شود.سفید کردنعامل برای مصارف آرایشی

کلید واژه ها:Ligusticum sinense; ریزوم؛ضد ملانوژنز; B{0}}سلول ملانوما F10؛ گورخرماهی؛ رنگدانه

کلیک کنید تاپودر سیستانچ توبولوزا برای مهار ملانین

مقدمه

ملانین یک رنگدانه قهوه ای مایل به سیاه است که مسئول اصلی رنگ پوست، مو و چشم است [1]. ملانین یک پلیمر زیستی است و شامل دو دسته اصلی رنگدانه در پوست انسان است، اوملانین قهوه ای مایل به سیاه و فئوملانین زرد متمایل به قرمز [1]. بیوسنتز ملانین یک فرآیند چند مرحله ای پیچیده است که به آن می گویندملانوژنزکه یک پاسخ فیزیولوژیکی پوست انسان برای جلوگیری از اثرات مضر اشعه ماوراء بنفش (UV) و آلاینده های محیطی است. با این حال، ملانوژنز بیش از حد می تواند منجر به تیره شدن پوست شود و هیپرپیگمانتاسیون غیرطبیعی باعث مشکلات پوستی مختلفی مانند کک و مک، ملاسما، لنتیژین های پیر و حتی سرطان پوست می شود [2].

ملانین در اندامک های متصل به غشاء به نام ملانوزوم ها تولید می شود که در سلول های تخصصی به نام ملانوسیت ها وجود دارند. سنتز ملانین از هیدروکسیلاسیون L-تیروزین به L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) شروع می شود و پس از اکسیداسیون به دوپاکینون انجام می شود. این دو واکنش توسط آنزیم محدود کننده سرعت تیروزیناز کاتالیز می شوند. در غیاب مواد تیول، دوپاکینون به لوکودواکروم چرخه می‌شود و به دنبال آن یک سری واکنش‌های کاهش اکسیداسیون که شامل پروتئین مربوط به تیروزیناز (Tyrp-2) می‌شود تا دوپاکروم میانی و 5،6-دی هیدروکسی‌ندیل را تولید کند. {9}}کربوکسیلیک اسید (DHICA). DHICA متعاقباً تحت اکسیداسیون کاتالیز شده توسط Tyrp{10}} و پلیمریزاسیون برای تشکیل اوملانین قرار می گیرد. دوپاکینون همچنین با سیستئین و گلوتاتیون ترکیب می شود تا سیستئینیل دوپا و گلوتاتیونیل دوپا را تولید کند که به تدریج به فئوملانین تبدیل می شوند [1].

سلول های اطراف ملانوسیت ها مانند کراتینوسیت ها و فیبروبلاست ها در تنظیمملانوژنز[3]. قرار گرفتن مداوم در معرض تابش اشعه ماوراء بنفش باعث آسیب DNA به اینکراتینوسیت ها می شود و منجر به تنظیم بالای پروپیوملانوکورتین (POMC) با واسطه p{1} می شود. POMC برای تولید هورمون محرک ملانوسیت (-MSH) و اندورفین دچار شکاف پس از ترجمه می شود. به نوبه خود، -MSH به گیرنده ملانوکورتین 1 (MC1R) روی ملانوسیت های مجاور متصل می شود و در نتیجه cAMP تنظیم مثبت می شود. cAMP بالا بیان عامل رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF) را تحریک می کند. سپس MITF رونویسی آنزیم های رنگدانه، از جمله تیروزیناز، Tyrp{10}} و Tyrp{11}} را تنظیم می کند. مسیر تحریک شده توسط UV در نهایت منجر به سنتز ملانین و انتقال ملانوزوم ها به کراتینوسیت ها می شود [4-6]. علاوه بر محرک های بیرونی، تولید ملانین تحت تأثیر عوامل درونی نیز قرار می گیرد، مانند تغییرات هورمونی، اختلالات ژنتیکی، التهاب و سن [3].

در آسیای شرقی، بیشتر زنان انتظار دارند از رنگدانه های ناهموار پوست خودداری کنند و به دنبال روشن شدن پوست باشند. به عنوان مثال، آربوتین، اسید کوجیک، اسید آزلائیک، اسید اسکوربیک، و عصاره ریشه توت سفید و شیرین بیان به عنوان مثال استفاده می شود.سفید کردنمواد تشکیل دهنده در فرآورده های آرایشی و بهداشتی [7]. بهره برداری از پوست موثر و پیشگیرانهسفید کردنعواملی که از منابع طبیعی به دست می‌آیند، عمدتاً به دلیل عدم سمیت نسبی و عوارض جانبی کمتر، در زمینه آرایشی و بهداشتی بسیار مورد توجه هستند [7،8]. ریزوم Ligusticum sinenseOliv. (Umbelliferae) به مدت 2000 سال به عنوان طب سنتی چینی مورد استفاده قرار می گرفته است و تا به امروز ریشه های آن یک چای گیاهی بسیار توصیه شده است [9]. L. sinense، به نام "Gaoben" در زبان چینی، همچنین به عنوان lovage چینی شناخته می شود، برای دفع باد سرما، تسکین درد و روماتیسم مفصلی، و کاهش سردرد anemofrigid استفاده می شد. کاربرد خارجی اصلی L. sinense برای سفید کردن و آبرسانی پوست است [10]. تا به امروز، ترکیبات شیمیایی گزارش شده موجود در L. sinense شامل ترپنوئیدها، آنالوگ های فتالید و گلیکوزیدهای فنیل پروپانوئید [11-16] است. گزارش شده است که چنین ترکیباتی اثرات فارماکولوژیک متعددی دارند. به عنوان مثال، اسانس های ریشه و ریزوم های L. sinense دارای اثرات ضد درد، آرام بخش و ضد میکروبی گزارش شده است [15،17]. Ligustilide، یک فتالید اصلی که به طور گسترده در گیاه چتر یافت می شود، اثر گشاد کنندگی روی میومتر و کاهش التهاب را نشان داد. و درد نوروژنیک [18]. Cnidilide، یکی دیگر از فتالیدهای فراوان در گیاه Umbelliferae، دارای اثرات ضد اسپاسم و التهابی است [19،20]. مطالعات قبلی نشان داده اند که عصاره L. sinense مهار می کند.ملانوژنزروی سلول‌های ملانومای B{0}F10Murine [21]. با این حال، اجزای فعال برای فعالیت مهاری ملانوژنز هنوز گزارش نشده بود.

مواد تشکیل دهنده طبیعی

در غربالگری بیولوژیکی اولیه ما، مشخص شد که عصاره متانولی L. sinense به نمایش گذاشته شده است.ضد ملانوژنزفعالیت در سلول‌های B{0}F10 با مقدار IC50 50 میکروگرم در میلی‌لیتر [22]، و اصول ضدآلوزایی هنوز تا کنون فاش نشده است. بنابراین ما تصمیم گرفتیم که اصل فعال ریزوم L. sinense را با یک روش مبتنی بر سنجش زیستی بررسی کنیم، و این منجر به جداسازی و شناسایی دو ترکیب جدید 1 و 2 به همراه 22 ترکیب شناخته شده 3-24 شده است. این مقاله همچنین با هدف بررسی اثرات ترکیبات 1 و 8 بر روی سلول‌های ملانوم B{{13}F10 در شرایط آزمایشگاهی و گورخرماهی در شرایط in vivo، ارزیابی ایمنی با روش طبیعی MTT کراتینوسیت اپیدرمی انسانی، و تعیین کمیت 1 و 8 در ریزوم L. sinense انجام شد. .

2. نتایج و بحث

2.1. جداسازی و تبیین ساختاری

در تلاش برای جداسازی و شناساییملانوژنزمهارکننده‌های موثر از فراکسیون‌های فعال، ما از یک استراتژی شکنش هدایت‌شده با سنجش زیستی استفاده کردیم. عصاره متانولی ریزوم L. sinense تقسیم شد تا لایه های اتیل استات، n-بوتانول و لایه های محلول در آب ایجاد کند. سه لایه به دست آمده برای فعالیت ضد ملانوژنز در سلول های ملانوم B16-F10 موش مورد آزمایش قرار گرفتند. سلول ملانوم B16 موش بستری حساس، قابل اعتماد و امکان پذیر برای غربالگری تعداد زیادی از مولکولی های کوچک است.ملانوژنزتنظیم کننده ها [23-25]. در غلظت‌های 25-100 میکروگرم بر میلی‌لیتر، لایه محلول در اتیل استات قوی‌ترین فعالیت بازدارندگی را نشان داد، در حالی که مهار جزئی برای لایه‌های n-بوتانول یا محلول در آب مشاهده شد (شکل 1A) همانطور که محتویات ملانین در لیز نشان می‌دهد. B{8}}سلول های ملانوما F10 (شکل 1B). جداسازی ستون باز لایه اتیل استات بر روی ژل سیلیکا و به دنبال آن خالص سازی HPLC دو موجودیت شیمیایی 1 و 2 (شکل 2A) گزارش نشده را همراه با 22 ترکیب شناخته شده به همراه داشت. }هیدروکسی{18}}متیل استوفنون(4) [27]، 3S*،3aR*،7aS*-3-بوتیل هگزا هیدروفتالید (5) [28]، کارواکرول (6) [29]، اسکوالن (7) [30 ]،(3S,3aR)-neocnidilide (8) [31]، مخروطی الکل 9-متیل استر (9) [32]، برگاپتن (10) [33]، متوکسالن (11) [34]، متیل وانیلات ( 12) [35]، 2،{46}}دی هیدروکسی{47}}متیل استوفنون (13) [36]،{50}}متوکسی{51}}نیتروفنل (14) [37]، 2،{{ 55}}دی متوکسی فنول (15) [38]، فالکاریندیول (16) [39]، (9Z)-هپتادسن-4،6-دیین-1،8-دیول (17) ) [40]، 3-O-(p-coumaroyl) ursolic acid (18) [41]، pregnenolone(19) [42]، (9Z,11E,13R)-13-hydroxyoctadeca{79 }}،{80}}دی‌نوئیک اسید (20) [43]، اسید فرولیک (21) [44]، مخروطی‌فرولات (22) [45]، p-hydroxyphenethyl ferulate (23) [46] و وانیل اسید لیک (24) [47].

ترکیب 1 که به صورت روغن بی رنگ به دست می‌آید دارای فرمول C20H20O6 است که از 13C NMR و HRESI-MS یون مثبت استنباط می‌شود، که یک قطعه یون را در HRESI-MS m/z مثبت 357.1331[M به علاوه H] پلاس (محاسبه برای C20H21O6 نشان می‌دهد، 357.1333). جذب IR آن در 3444، 1633 و 1509 سانتی‌متر به ترتیب نشان‌دهنده وجود ویژگی‌های هیدروکسی، الفینیک و آروماتیک بود. در 1H NMR 1، a 1،3،4،{24}}تتراسجایگزین نصفه معطر [δH 7.07 (d, J=1.8 هرتز، H-6) و 7.22 (d, J=1.8 هرتز، H{-2)]، یک عملکرد معطر از نوع ABX [δH 6.69 (dd, J=7.9، 1.8 هرتز، H-60) ، 6.74 (d، J=7.9 هرتز، H-50) and6.87 (d، J=1.8 هرتز، H-20)]، دو ترانس پروتون های الفینی جفت شده متقابل [δH 6.33 (d, J=15.9 Hz, H{-8) and7.56 (d, J=15.9 Hz, H-7) ]، یک گروه آللیک پایانی [δH 4.99 (ddd, J=17.1, 1.8, 1.8 Hz, H{72}}a), 5.10, (br d,J=7.6Hz ، H-70)، 5.15 (ddd، J=10.1، 1.8، 1.8 هرتز، H-90b) و 6.40 (ddd، J=17.1، 10.1 ، 7.6 هرتز، H-80] و دو رزونانس متوکسیل [δH 3.77 (s، 30-OCH3) و 3.92 (s، 3-OCH3)] مشاهده شد. Twenty carbonresonances, atributable to seven non-protonated aromatic carbons [δC 126.7 (C{107}}), 131.2 (C{110}}), 135.3(C{113}}), 146.1 (C{116}) })، 148.6 (C-3)، 147.2 (C-4) و 148.2 (C{125}})]، یک اسید کربونیل (δC 168.4، C-9)، یک متین (δC 48.2، C{131}})، هشت متین الفینی [δC 108.9 (C{134}})، 113.2 (C{137}})، 115.6 (C{140}})، 116.1 (C -8)، 121.8 (C-60)، 123.8 (C{149}})، 141.5 (C-80) و 146.2 (C-7)]، یک اگزوماتیلن (δC 115.9، C{158}}) و دو متوکسیل [δC 56.4 (30-OCH3) و 56.6 (3-OCH3)]، در طیف NMR 13C همراه با طیف DEPT از 1 مشاهده شدند ( میز 1). اتصال 1 بیشتر با پیک های متقاطع δH5.10 (H{174}})/δC 113.2 (H{177}})، 115.9 (H-90)، 121.8 (H{{{{ 183}})، 123.8 (C-6)، 131.2 (C{189}})، 135.3 (C{192}})، 141.5 (C-80) و 147.2 (C{{{{{{{ 198}})، δH 7.56 (H-7)/δC 108.9 (C{204}})، 116.1 (C{207}})، 123.8 (C-6)، 126.7 (C -1) و 168.4 (C-9)، δH 3.77 (30-OCH3)/δC 148.2 (C-30) و δH 3.92 (3-OCH3)/ δC 148.6 (C{230}}) در طیف HMBC (شکل 2B)، که بیشتر توسط سیگنال‌های همبسته دو طرفه از δH 3.77 (30-OCH3)/δH 6.87 (H{239}} تأیید شد. ) و δH 3.92 (3-OCH3)/δH 7.22 (H{-2) در طیف NOESY (شکل 2B). بر این اساس، 1 همانطور که نشان داده شده است مشخص شد و به عنوان 5-[3-(4-هیدروکسی-3-متوکسی فنیل)آلیل]فرولیک اسید نامگذاری شد. طبق دانش ما، 1 با دو مجموعه از واحد C6-C3 متصل در C{256}} یک نوع اسکلتی جدید از لیگنان بود.

ترکیب 2 به صورت روغن بی رنگ با فرمول مولکولی C11H2{{20}}O2 به عنوان HR-ESIMS یون مثبت استنتاج شد، که یون [M به علاوه H] به علاوه در m/z 185.1501 را نشان می‌دهد (محاسبه برای C11H21O2، 185.1541). جذب های آشکار در 3445 و 1660 سانتی متر-1 در طیف IR 2 نشان دهنده وجود ویژگی های هیدروکسی و الفینی بود. 1H NMR (جدول 2) همراه با طیف COSY 2 دو زنجیره آلیفاتیک را در δH 0.85-1.97 (–H2-7–H3-11) و δH 1.66–5.44 (–H{30}} نشان داد. –H-2–H-1–H2-6–H2-5–). تخصیص فوق همچنین در 13C NMR از 2 پشتیبانی شده توسط طیف DEPT منعکس شده است، که در آن یک متیل (δC 14.2, C-11)، شش متیلن [δC 22.7 (C-10)، 26.3 (C{{{{ 45}})، 27.2 (C-5)، 27.4 (C-8)، 31.8 (C-9) و 37.4 (C-7)]، سه متین [δC 67.1 (C-2)، 69.2 (C{-1) و 121.0 (C-3)] و یک کربن چهارتایی (δC 144.1، C-4) مشاهده شد. در طیف HMBC 2 (شکل 2C)، پیک های متقاطع δH 5.44 (H-3)/δC 27.2 (C-5) و 37.4 (C-7)، δH 1.92– 2.01 و 2.04-2.10 (H2-5)/δC144.1 (C-4) و δH 1.97 (H2-7)/δC 144.1 (C-4) نشان داد {100}}–C{101}} یک قسمت سیکلوهگزن با پیوند مضاعف در ∆3 بود، و C{103}}–C{104}}، یک زنجیره آلیفاتیک خطی اشباع شده، در C{105} متصل شد }}. پیکربندی‌های نسبی کایرال C{107}} و C{108}} که دارای هیدروکسی هستند با مقادیر J کرابینول پروتون‌های H{109}} (9.1، 4.2 هرتز) و H{114}} (4.2 هرتز) نزدیک شدند ) که نشان داد H{117}} و H-2 به ترتیب شبه محوری و شبه استوایی هستند (شکل 2C). بنابراین پیکربندی نسبی 1،{125}}دی هیدروکسی در 2 به cis استنتاج شد. در نهایت، ساختار 2 همانطور که نشان داده شده است روشن شد و سیس-4-پنتیل سیکلوهکس-3-ene-1،2-دیول نامگذاری شد.

2.2. اثرات ترکیبات 1 و 8 بر محتوای ملانین در سلولهای B{6}}F10 تحریک شده با -MSH

برای تعیین ترکیبات دپیگمانتاسیون در ریزوم L. sinense، تمام جدایه های خالص در معرض قرار گرفتند.ضد ملانوژنزسنجش در سلول های ملانوما B16-F10. ملانوم B{2}}سلول‌های F10 موشی یک مدل کاملاً تثبیت شده برای کشف اصول ضد ملانوژنیک هستند و به طور گسترده در مطالعات قبلی مورد استفاده قرار گرفته‌اند [48]. -هورمون محرک ملانوسیت (-MSH) یک هورمون پپتیدی است و مسئول تولید ملانین توسط ملانوسیت ها از طریق فعال کردن گیرنده ملانوکورتین 1 است [49]. در این تحقیق، سلول‌های B{11}F10 با -MSH (100 نانومولار) تحریک شدند و به طور همزمان با هر ترکیب در غلظت‌های 25، 50 یا 100 میکرومولار تیمار شدند. محتوای ملانین سلول های B{18}F10 ملانوم بدون درمان ترکیبی 100 درصد در نظر گرفته شد. آربوتین، یک پوست معمولیسفید کردنعامل در محصولات آرایشی و بهداشتی، به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. از این ترکیبات، 1 و 8 تولید ملانین ناشی از -MSH را به روشی وابسته به دوز مهار می کنند. مقادیر IC50 ترکیبات 1 و 8 به ترتیب 78.9 و 31.1 میکرومولار بود (شکل 3B). ترکیب 1 و 8 در غلظت‌های مؤثر تأثیرات آشکاری بر سنجش MTT نشان ندادند (شکل 3A). نتایج MTT ممکن است از اثرات ترکیبی کاهش تکثیر سلولی و مهار زنده ماندن سلول با توجه به شرایط تجربی ناشی شود. این نتایج نشان داد که اثرات ضد ملانوژنیک ترکیب 1 و 8 به مرگ سلولی یا مهار رشد مربوط نمی شود.

با استفاده از روش HPLC-DAD، اجزای مؤثر اصلی (1 و 8) از عصاره خام (شکل 4) با مقایسه با زمان ماند خالص 1 (از سنتز آزمایشگاهی، داده‌هایی که هنوز منتشر نشده است) و 8 (از سیگما) مشخص شدند. به عنوان استاندارد محلول های ذخیره 1، 10، 20، 40، 60، 80 و 100 میکروگرم در میلی لیتر استفاده شد. هر غلظت در سه تکرار تزریق شد. نسبت های محتوای 1 و 8 در عصاره مواد خشک شده با رگرسیون خطی مناطق اوج مربوطه 0.009 درصد و 0.15 درصد (وزنی/وزنی) تعیین شد.

2.3. سنجش رنگدانه ماهی زبرا در داخل بدن

علاوه بر ارزیابی اثر 8 در شرایط آزمایشگاهیضد ملانوژنز، ضد رنگدانه‌پذیری آن در داخل بدن از طریق سنجش رنگدانه‌سازی گورخرماهی بیشتر مورد بررسی قرار گرفت. گورخرماهی به دلیل جثه کوچک، باروری بالا و توالی‌های ژنی و سیستم‌های اندامی مشابه با انسان، به عنوان یک ارگانیسم مدل مهره‌دار مفید در نظر گرفته شده است. علاوه بر این، فرآیند رنگدانه‌سازی ملانین در سطح آن که امکان مشاهده آسان را فراهم می‌کند، گورخرماهی را به یک مدل مفید خاص برای بررسی در مهارکننده‌ها یا محرک‌های vivomelanogenic تبدیل می‌کند [50]. در این مطالعه از آربوتین 20 میلی مولار به عنوان کنترل مثبت و آربوتین 20 میکرومولار برای مقایسه با ترکیب 8 در سطح غلظت یکسان استفاده شد. پس از انکوباسیون جنین گورخرماهی از 7 hpf تا 72 hpf، ترکیب 8 در غلظت های 10 و 20 میکرومولار در مقایسه با آربوتین (20 میکرومولار) فعالیت بازدارندگی رنگدانه بالاتری از خود نشان داد (شکل 5). پس از تیمار 20 میکرومولار ترکیب 8، سطح رنگدانه گورخرماهی به طور قابل توجهی حدود 31 درصد کاهش می یابد. در حالی که ترکیب 8 در 10 میکرومولار سطح رنگدانه را 26.2 درصد کاهش می دهد.

2.4. سنجش زنده ماندن معادل های پوست اپیدرمی انسان

ایمنی محصولات آرایشی یک نگرانی جدی است. به عنوان مثال، هیدروکینون، یک عامل روشن کننده موثر پوست، به دلیل واکنش های نامطلوب متعدد و بحث بر سر خطر بالقوه سرطان زایی از بازار منع شده است [7]. اسید کوجیک، یک مهارکننده قوی تیروزیناز، ممکن است باعث درماتیت تماسی و سمیت ژنتیکی بالقوه شود [51،52]. به منظور ارزیابی ایمنی ترکیبات 1 و 8 روی پوست انسان، ما یک سنجش زنده‌مانی سلولی را بر روی مدل معادل‌های پوست انسان (HSEs) انجام دادیم. HSE ها سیستم های کشت سه بعدی هستند که با کاشت کراتینوسیت های انسانی بر روی یک بستر پوستی مناسب که از قبل با فیبروبلاست های انسانی کاشته شده اند، تولید می شوند. HSE ها از نظر فیزیولوژیکی با پوست طبیعی قابل مقایسه هستند و جایگزین های مناسبی برای آزمایش حیوانی ارائه می دهند. تحت شرایط کشت کنترل شده، HSE ها شباهت بالایی با بافت بومی از آن مشتق شده نشان می دهند [53]. در این مطالعه، سنجش زنده ماندن روی کراتینوسیت‌های اپیدرمی طبیعی انسان (NHEKs) در مدل‌های اپیدرمی لیدن (LEMs) انجام شد. ترکیبات 1 و 8 روی زنده ماندن سلول در غلظت‌های 100-10 میکرومولار تأثیری نداشتند. قابلیت زنده ماندن سلولی ترکیب 1 به ترتیب 98 درصد و 106 درصد در غلظت های 10 و 100 میکرومولار است. قابلیت زنده ماندن سلولی ترکیب 8 به ترتیب 97 درصد و 92 درصد در غلظت های 10 و 100 میکرومولار است. بر این اساس، ترکیبات 1 و 8 در مدل‌های اپیدرمی لیدن در غلظت‌های کمتر از 100 میکرومولار سمیت سلولی علیه NHEK ها اعمال نکردند (شکل 6). از آنجایی که غلظت موثر 8 کمتر از 100 میکرومولار است، که نشان می دهد که 8 ممکن است برای پوست بی خطر باشدسفید کردنکمتر از غلظت های آزمایش شده با این حال، در عمل، محصولات آرایشی ممکن است برای مدت طولانی روی پوست انسان اعمال شود، بنابراین یک دوره آزمایشی طولانی از ترکیبات آزمایش شده روی HSEs باید بیشتر انجام شود.

2.5. مطالعه اتصال مولکولی B16-Mus Musculus Tyrosinase

کاتالیز تیروزیناز مرحله محدود کننده سرعت بیوسنتز ملانین است. بنابراین، مهار تیروزیناز رایج ترین روش برای دستیابی به سفیدی پوست است [54،55]. به منظور تعیین اینکه آیا L. sinense سرکوب شده استملانوژنزدر سلول‌های B{0}}F10 از طریق مهار تیروزیناز، مدل‌های چوب سه‌بعدی (شکل 7A) و یک نمودار 2 بعدی (شکل 7B) از اتصال مولکولی با استفاده از نرم‌افزار DS انجام شد که مکانیسم مهاری احتمالی ترکیب 8 را بر روی موش نشان داد (Mus) musculus) tyrosinase. نشان داده شد که محل فعال تیروزیناز موش در دامنه ای قرار دارد که توسط آمینواسیدهای His377، Asn378، His381، Gly389، Thr391، Ser394 همراه با دو یون مس احاطه شده است. انرژی برهمکنش CDOCKER بین آنزیم و مهارکننده 0067/46- کیلوکالری در مول بود. نتایج شبیه سازی نشان داد که اسیدهای آمینه آبگریز شامل Gly389، Asn 378، Thr391 Ser394، His 404 و His192 در اطراف محل کاتالیزوری، نیروهای واندروالس را با ترکیب 8 تشکیل می دهند. ، در حالی که گروه کربونیل آن با دو یون مس پیوندهای هماهنگی ایجاد می کند. همچنین مشاهده شد که حلقه سیکلوهگزن و بوتان برهمکنش ضعیف π-آلکیل به ترتیب با His381 و His215 اعمال می‌کنند. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که عصاره L. sinense مهار تیروزیناز قارچ و کاهش بیان mRNA تیروزیناز را در سلول‌های B{30}}F10 نشان می‌دهد [21،56]. از آنجایی که اتصال مولکولی برهمکنش قوی بین حوزه فعال تیروزیناز موش و ترکیب 8 را نشان می‌دهد، بنابراین پیشنهاد شد که (3S,3aR)-neocnidilide (8) به دلیل کاهش فعالیت تیروزیناز و کاهش بیشتر تولید ملانین، فعالیت ضد ملانوژنزی از خود نشان دهد. با این حال، علاوه بر مهار تیروزیناز، سایر مکانیسم های زمینه ایضد ملانوژنزفعالیت (3S,3aR) -neocnidilide (8) همچنان باید بیشتر مورد بررسی قرار گیرد.

3. مواد و روشها

3.1. عمومی

حلال های درجه HPLC، n-هگزان، اتیل استات، متانول و استونیتریل، از JT Baker (Phillipsburg، NJ، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. اتانول از مرک (دارمشتات، آلمان) خریداری شد. -هورمون محرک ملانوسیت (-MSH)، دی متیل سولفوکسید (DMSO)، سالین بافر فسفات (PBS)، 3-(4،{8}}دی متیل تیازول{9}}یل) ،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) از سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. کروماتوگرافی ستون باز بر روی سیلیکاژل (مش 70-230، مرک، دارمشتات، آلمان) انجام شد. صفحات پیش پوشش داده شده سیلیکاژل 60 F254 و ورق آلومینیوم RP{17}} F254S برای TLC از Merck (دارمشتات، آلمان) خریداری شد. چرخش های نوری بر روی یک قطب سنج JASCO P{19}} (جاسکو، توکیو، ژاپن) اندازه گیری شد. 1H و 13C NMR با یک طیف‌سنج Bruker Avance DRX{22}} (Bruker، Rheinstetten، آلمان) به‌دست آمد. طیف جرمی با وضوح پایین و وضوح بالا با استفاده از ABI API 4000 Q-TRAP ESI-MS (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) و Q-Exactive Plus HR-ESI-MS (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) به دست آمد. )، به ترتیب. طیف‌های IR روی طیف‌سنج JASCO FT/IR 4100 (جاسکو، توکیو، ژاپن) ثبت شد.

3.2. مواد گیاهی

ریزوم خشک L. sinense Oliv. از شرکت دارویی شنگ چانگ، با مسئولیت محدود، تائویوان، تایوان خریداری شد.

3.3. جداسازی و تبیین ساختاری

ریزوم خشک شده (9.9 کیلوگرم) L. sinense له شد و با متانول (4{6}} L × سه بار) استخراج شد، که فیلتر و تبخیر شد تا باقیمانده سیاه (1758 گرم) به دست آید. سپس این باقیمانده در H2O (3.{48}} L) تعلیق شد و با حجم مساوی از اتیل استات و n-BuOH سه بار متوالی تقسیم شد. هر لایه تحت فشار کاهش یافته برای به دست آوردن لایه های EtOAc (415 گرم)، n-BuOH (147 گرم)، و H2O (896 گرم) متمرکز شد. پس از آن، لایه اتیل استات خشک شده (25{{1{161}}0}} گرم) با 375 گرم ژل سیلیکا مخلوط شد و بر روی یک ستون باز آماده شده بسته بندی شده با 3550 گرم سیلیکاژل بارگذاری شد و در یک مرحله شستشو داده شد. روش گرادیان عاقلانه با مخلوط n-هگزان، اتیل استات و متانول. هر 500 میلی لیتر برای یک کسر جمع آوری و با TLC آنالیز شد. سپس، تمام فراکسیون ها با توجه به نتایج آنالیزهای TLC در هشت قسمت I-VIII ترکیب شدند، که در حداقل حجم مخلوط n-هگزان-اتیل استات مورد استفاده در سیستم HPLC بعدی، مجدداً حل شدند. بخش II شسته شده توسط n-هگزان-اتیل استات (95:5) توسط HPLC نیمه آماده سازی (Hibar®Fertigäute، 10 × 250 میلی متر) با استفاده از n-هگزان-اتیل استات (96:4) به عنوان شوینده با سرعت جریان خالص شد. از 3 میلی‌لیتر در دقیقه برای ارائه 6 (4.2 میلی‌گرم، tR=19.8 دقیقه)، 3 (6.1 میلی‌گرم، tR=21.2 دقیقه)، 5 (32 میلی‌گرم، tR=23 0.5 دقیقه) و 7 (79 میلی گرم، tR=28.0 دقیقه). همان قسمت با HPLC نیمه آماده سازی (Phenomenex®Luna، 10 × 250 میلی متر) با استفاده از هگزان-اتیل استات (99) خالص شد. :1) به عنوان شوینده با سرعت جریان 3 میلی‌لیتر در دقیقه برای ایجاد 4 (36 میلی‌گرم، tR=32.5 دقیقه). یک HPLC نیمه آماده‌سازی (Phenomenex®Luna، 10 × 250 میلی‌متر) با استفاده از n-هگزان-استون (95:5) به عنوان شوینده با سرعت جریان 3 میلی‌لیتر/minto، 8 (1.7 گرم، tR=19) را فراهم می‌کند. 3 دقیقه). بخش IV شسته شده توسط n-هگزان-اتیل استات (80:20) توسط HPLC نیمه آماده سازی (Phenomenex®Luna، 10×250 میلی متر) با استفاده از n-هگزان-اتیل استات (85:15) به عنوان شوینده با سرعت جریان خالص شد. از 3 میلی‌لیتر در دقیقه برای تأمین 15 (19 میلی‌گرم، tR=24.4 دقیقه)، 12 (11 میلی‌گرم، tR=26.9 دقیقه)، 9 (25 میلی‌گرم، tR=33 0.8 دقیقه)، 10 (31 میلی گرم، tR=37.0 دقیقه)، 11 (24 میلی گرم، tR=42.5 دقیقه). همان قسمت توسط همان ستون با استفاده از n-هگزان-اتیل استات (78:22) به عنوان شوینده با سرعت جریان 3 میلی لیتر در دقیقه خالص شد تا 14 (10 میلی گرم، tR=20.1 دقیقه) و 13 (13) به دست آید. 22 میلی گرم، tR=24.6 دقیقه). همان قسمت توسط همان ستون با استفاده از n-هگزان-اتیل استات-استون (80:10:10) به عنوان شوینده با سرعت جریان 3 میلی لیتر در دقیقه خالص شد تا 20 (25 میلی گرم، tR=13) به دست آید. ), 17 (15 میلی گرم، tR=16.3 دقیقه)، 18 (28 میلی گرم، tR=18.5 دقیقه)، 16 (132 میلی گرم، tR=21}.8 دقیقه) و 19 (39 میلی گرم، tR=25.6 دقیقه). بخش V شسته شده توسط n-هگزان-اتیل استات (60:40) توسط HPLC نیمه آماده سازی (Hibar®Fertigäute، 10×250 میلی متر) با استفاده از n-هگزان-اتیل استات-استون (68:27:5) به عنوان شوینده خالص شد. با سرعت جریان 3 میلی‌لیتر در دقیقه تا 21 (5.3 گرم، tR=10.2 دقیقه)، 23 (63 میلی‌گرم، tR=20.0 دقیقه)، 22 (84 میلی‌گرم، tR { {164}}.0 دقیقه) و 24 (33 میلی گرم، tR=26.5 دقیقه). همان بخش توسط HPLC نیمه آماده‌سازی (Hibar®Fertigäute، 10×250 میلی‌متر) با استفاده از n-هگزان-اتیل استات (72:28) به عنوان شوینده با سرعت جریان 3 میلی‌لیتر در دقیقه خالص شد تا 2 (24 میلی‌گرم، tR) به دست آید.=24.3 دقیقه). بخش شسته شده توسط n-هگزان-اتیل استات (40:60) توسط HPLC نیمه آماده سازی (Hibar®Fertigäute، 10 × 250 میلی متر) با استفاده از n-هگزان-اتیل استات (53:47) به عنوان شوینده با سرعت جریان خالص شد. از 3 میلی‌لیتر/دقیقه برای ارائه 1 (47 میلی‌گرم، tR=13.2 دقیقه).

3.4. داده های طیف سنجی

{{0}}[3-(4-هیدروکسی-3-متوکسی فنیل)آلیل]فرولیک اسید (1): روغن بی رنگ. [ ]25D به علاوه 5.6◦(c 0.12، CH3OH)؛ IR (تمیز) νmax 3444, 2935, 1633, 1509, 1434, 1376, 1267, 1153; ESI-MS m/z مثبت 357.2 [M به علاوه H] به اضافه ؛ HRESI-MS مثبت m/z 357.1331 [M به علاوه H] پلاس (محاسبه برای C20H21O6، 357.1333). داده‌های 1H و 13C NMR را ببینید جدول 1.Cis-4-pentylcyclohex-3-ene-1,2-diol (2): روغن بی رنگ. [ ]22D-20.3◦(c 0.20, CH3OH); IR (تمیز) νmax 3445,2919, 1660, 1455, 1371, 1225, 1084; ESIMS m/z 185.2 [M به علاوه H] plus ; HRESI-MS m/z 185.1501 [M به علاوه H] پلاس (محاسبه برای C11H21O2، 185.1541)؛ داده های 1H و 13C NMR جدول 2 را ببینید.

3.5. تجزیه و تحلیل HPLC-DAD

آنالیزهای کروماتوگرافی بر روی یک سیستم HPLC هیتاچی متشکل از L{{{0}}پمپ، نمونه‌بر خودکار L-7200، آشکارساز L-7455 و نرم‌افزار جمع‌آوری داده‌های مدیریت سیستم D-7000 انجام شد. روی یک ستون XBridgeTM C18 (طول 25{14}} میلی‌متر، قطر داخلی 4.6 میلی‌متر، اندازه ذرات 5 میکرومتر، واترز). فاز متحرک شامل H2O (حلال A) و CH3CN (حلال B) بود. سرعت جریان 1.0 میلی لیتر در دقیقه بود. برنامه شستشو به شرح زیر بود: ایزوکراتیک با 2 درصد B (0-5 دقیقه)، 2-20 درصد B (5-25 دقیقه)، 20-90 درصد B (25-30 دقیقه). و ایزوکراتیک با 90 درصد B (30-35 دقیقه). حجم تزریق 10 لیتر بود. طیف مرئی UV در 240 نانومتر ثبت شد.

3.6. کشت سلولی

سلول‌های ملانوم موشی B{0}F10 (CRL6475) از موسسه تحقیقات و توسعه صنایع غذایی (FIRDI، Hsinchu، تایوان) خریداری شدند. سلول ها در 90 درصد محیط Eagle's Modified Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) همراه با 10 درصد سرم جنین گاو (FBS, Sigma, St. Louis, MO, USA) و 1 درصد کشت داده شدند. فلاسک های محلول پنی سیلین-استرپتومایسین در انکوباتور CO2 با اتمسفر مرطوب حاوی 5 درصد CO2 در هوا در دمای 37 درجه سانتیگراد کشت می شود. محیط کشت هر دو روز یکبار تعویض شد. سلول ها با تریپسینیزاسیون زمانی که حدود 85 درصد به هم پیوستند جمع آوری شدند، با یک هموسیتومتر شمارش شدند (Neubauer Improved., Marienfeld, Germany) و به تعداد مناسب در چاهک های صفحات کشت سلولی برای آزمایش های بیشتر بذر شدند.

3.7. سنجش زنده ماندن سلولی

برای تعیین ایمنی عصاره های مختلف، زنده ماندن سلول ها پس از درمان با عصاره ها با استفاده از روش MTT تعیین شد. این روش مبتنی بر احیای3-(4,5-دی متیل تیازول-2-یل)-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) به فورمازان توسط میتوکندریالنزیم است. در سلول های زنده [57]. مقدار فرمازان تشکیل شده متناسب با تعداد سلول های زنده موجود است و می توان آن را به روش اسپکتروفتومتری اندازه گیری کرد. به طور خلاصه، سلول‌های پیش تیمار شده با هورمون محرک ملانوسیت (-MSH) 100 نانومولار با تراکم 1 × 104 سلول در چاهک در یک صفحه چاهک کاشته شدند تا یک شبه بچسبند. سپس جدایه های خالص یا آربوتین به هر چاهک اضافه شد و 72 ساعت دیگر انکوبه شد. سپس سلول های تیمار شده با معرف رنگی MTT (Applichem، دانمارک) در PBS (2 میلی گرم در میلی لیتر) به مدت 3 ساعت نشاندار شدند. رسوبات فورمازان توسط DMSO حل و غلظت در 570 نانومتر در دستگاه میکروپلیت خوان اندازه گیری شد. زنده ماندن سلول با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد: زنده ماندن سلولی (درصد)=(یک نمونه/یک شاهد) × 100، که در آن یک نمونه و یک شاهد، جذب از مخلوط با یا بدون افزودن نمونه آزمایشی هستند. به ترتیب.

3.8. سنجش محتوای ملانین

محتوای ملانین همانطور که قبلاً توضیح داده شد با تغییرات جزئی اندازه گیری شد [58]. سلول‌های B16-F10 ملانوم با 1 × 104 سلول در چاهک در 3 میلی‌لیتر محیط در 6-صفحه‌های کشت چاهک کاشته شدند و یک شبه انکوبه شدند تا به سلول‌ها اجازه چسبندگی داده شود. سلول ها به مدت 72 ساعت در حضور 100 نانومولار -MSH در معرض غلظت های مختلف (25، 50 و 100 میکرومولار) جدایه های خالص یا آربوتین قرار گرفتند. در پایان تیمار، سلول ها با PBS شسته و با 150 میکرولیتر NaOH 1 N (Merck، آلمان) حاوی 10 درصد DMSO به مدت 1 ساعت در دمای 80 درجه سانتیگراد لیز شدند. جذب در طول موج 405 نانومتر با استفاده از میکروپلیت ریدر اندازه گیری شد. محتوای ملانین سلول‌های ملانوم B{19}F10 بدون تیمار ترکیبی 100 درصد تعیین شد و محتوای ملانین سلول‌های تیمار شده با ترکیب نسبت به گروه کنترل محاسبه شد.

3.9. سنجش رنگدانه ماهی زبرا در داخل بدن

پروتکل استفاده از حیوانات توسط کمیته یا پانل سازمانی مراقبت و استفاده از حیوانات (IACUC/IACUP) دانشگاه پزشکی تایپه (شماره LAC{0}}) بررسی و تأیید شده است. روش‌ها مطابق با قوانین مربوطه و دستورالعمل‌های تایید شده. جنین‌های گورخرماهی نوع وحشی از مرکز مرکزی Zebrafish دانشگاه پزشکی تایپه جمع‌آوری شدند. ارزیابی مبتنی بر فنوتیپ جنین گورخرماهی طبق مطالعه قبلی با تغییرات جزئی انجام شد [50]. جنین ها در دمای 28 درجه سانتیگراد با 1 درصد اتانول به عنوان شاهد و غلظت متفاوتی از ترکیبات از 7 hpf (پس از لقاح) تا 72 hpf انکوبه شدند. برای ارزیابیضد ملانوژنزاثرات تعدیل کننده های ملانوژنیک بر روند رشد گورخرماهی، رنگدانه گورخرماهی در 72 hpf تجزیه و تحلیل شد. جنین ها در آگاروز 1 درصد ذوب پایین (Bioshop Canada، Burlington، ON، کانادا) سوار شدند و تصاویر را با استریومیکروسکوپ ZEISS Stemi508 (ZEISS، Oberkochen، آلمان) ثبت کردند. تجزیه و تحلیل اندازه گیری پیکسل تصاویر توسط بسته Fiji ImageJ انجام شد. کمی سازی داده های رنگدانه (ناحیه زیر چشم گورخرماهی) و با گروه شاهد مقایسه شد.

3.10. سنجش زنده ماندن روی کراتینوسیت های اپیدرمی طبیعی انسان

تمام سلول‌های اولیه پوست انسان از اهداکنندگان سالم که توسط بخش پوست مرکز پزشکی دانشگاه لیدن استفاده می‌شوند، از بافت اضافی جمع‌آوری‌شده بر اساس ماده ۴۶۷ قانون هلند در مورد موافقت‌نامه درمان پزشکی و کد استفاده صحیح از بافت انسانی فدراسیون زیست‌پزشکی هلند جدا می‌شوند. انجمن های علمی طبق ماده 467 در صورت عدم اعتراض بیمار می توان از بافت اضافی استفاده کرد. این بدان معناست که بیماری که تحت جراحی پلاستیک قرار می گیرد به خوبی از تحقیقات مطلع است. هیچ یک از نویسندگان در نمونه برداری از بافت شرکت نداشتند. اصول اعلامیه هلسینکی هنگام کار با بافت های انسانی رعایت شد.

پوست اضافی کاهش دهنده مامای تازه یک فرد زن مجرد برای جداسازی کراتینوسیت های طبیعی اپیدرمی انسانی (NHEKs) همانطور که قبلا توضیح داده شد استفاده شد [59]. NHEK ها در مدل های لیدناپیدرمی (LEMs) یک شبه تحت شرایط غوطه ور در محیط کراتینوسیت انکوبه شدند. در عرض چهار روز، سرم جنین گاوی به تدریج حذف شد و NHEKها در LEMها بدون سرم در سطح مشترک هوا-مایع به مدت هفت روز کشت شدند، در حالی که محیط کشت دو بار در هفته تازه‌سازی می‌شد. سنجش زنده ماندن با افزودن 0.5 میلی‌لیتر از 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر MTT به هر یک از NHEKها در LEMها به مدت 3 ساعت، پس از 24 ساعت قرار گرفتن در معرض ترکیبات آزمایشی 1، 8 و DMSO (کنترل منفی) انجام شد. محصول فرمازان آبی رسوب‌شده طی 2 ساعت با 0.5 میلی‌لیتر چاهک ایزوپروپانولپر از سلول‌ها استخراج شد. غلظت فورمازان با تعیین OD در طول موج 570 نانومتر با استفاده از میکروپلیت خوان aTecan Infinite F50 اندازه گیری شد.

3.11. تحلیل آماری

تمام داده‌های مطالعه ما به‌عنوان میانگین‌های آزمایش‌هایی که حداقل در سه تکرار انجام شده بودند، به‌دست آمدند و به صورت میانگین ± انحراف استاندارد بیان شدند. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آزمون t-test انجام شد. اهمیت آماری نتایج در p < 0="" تنظیم="" شد.05="" (*)="" و="" p=""><0.01>

3.12. مطالعه اتصال مولکولی B16-Mus Musculus Tyrosinase

3.12.1. مدل سازی همسانی

از آنجایی که در حال حاضر هیچ ساختار سه بعدی برای Mus musculus tyrosinase در دسترس نیست، مدل سازی هومولوژی مطمئن ترین روش برای پیش بینی ساختارهای سه بعدی پروتئین ناشناخته بر اساس این فرض است که ساختار پروتئین ناشناخته مشابه ساختارهای شناخته شده برخی از مراجع همولوگ است. پروتئین ها ما توالی آمینواسید تیروزیناز Mus musculus را از مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی به دست آوردیم. پایگاه داده توالی پروتئین یک الگوی پروتئینی همولوگ از پروتئین جستجوی Mus musculustyrosinase توسط Phyre2 (Protein Homology/Analog Y Recognition Engine V 2.{4}}) [60] شناسایی شد. 446 باقیمانده (81 درصد از توالی Musculus Musculus). ) با اطمینان 100.0 درصد توسط تک الگوی با بالاترین امتیاز به عنوان کد PDB مدل‌سازی شده‌اند: c5m8pA به عنوان گیرنده برای مطالعات محاسباتی docking انتخاب شد.

3.12.2. تجزیه و تحلیل برهمکنش لیگاند-پروتئین

محل اتصال Mus musculus tyrosinase بر اساس مرجع هومانتیروزیناز (PDB 5M8M) شش باقی مانده اسید آمینه تعیین شد و پاکت اتصال دارای دو مس است. بنابراین، کره سایت اتصال تعریف شد. متعاقباً، ساختار سه بعدی ترکیب 8 با حداقل سازی انرژی که با استفاده از برنامه CDOCKER در محفظه اتصال Musculus tyrosinase لنگر انداخته شد، تهیه و بهینه شد و تعداد دفعات داکینگ برای بازدارنده روی 5{7}} تنظیم شد. تمام پارامترهای دیگر با استفاده از BioviaDiscovery Studio v.4.0 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA, USA) به عنوان پیش فرض برای تجزیه و تحلیل تعامل لیگاند-پروتئین تنظیم شدند. در نهایت، از بین 50 ترکیب اتصال، بالاترین مورد با بالاترین امتیاز انرژی CDOCKER برای بررسی حالت اتصال ترکیب متصل در سایت فعال Mus musculus tyrosinase انتخاب شد.

4. نتیجه گیری

در مطالعه حاضر، ما یک روش هدایت‌شده با سنجش زیستی را با استفاده از سلول‌های B16-F10 برای جداسازی ترکیبات ضد ملانوژنز از عصاره‌های ریزوم L. sinense اتخاذ کردیم. ترکیبات فعال 5-[3-(4-هیدروکسی-3-متوکسی فنیل)آلیل]فرولیک اسید (1) و (3S,3aR)-neocnidilide (8) تعیین شدند. بر اساس تجزیه و تحلیل HPLC، محتوای ترکیب 8 0.15 درصد از عصاره خام را تشکیل می دهد. راضد ملانوژنزفعالیت 8 توسط هر دو سلول B16-F10 در شرایط آزمایشگاهی و سنجش گورخرماهی in vivo تأیید شد. همه این یافته‌ها نشان می‌دهند که 8 ممکن است، حداقل، منطقی برای پتانسیل L. sinense برای قدرت و کمیت بالای آن باشد. . داده های زنده ماندن سلولی در سلول های B16-F10 و NHEKSimply that 8 را می توان به طور بالقوه به عنوان یک عامل ضد ملانوژنز توسعه داد. نحوه عمل 8 بر ضد ملانوژنز به عنوان مهار فعالیت تیروزیناز بر اساس نتایج حاصل از اتصال مولکولی حدس زده شد. با این حال، باقی مانده است که بیشتر تایید شود. یافته ما نشان داد که ترکیب 8 به نمایش گذاشته شده استضد ملانوژنزاثرات و ایمنی از طریق مطالعات in vitro، in vivo، و ex vivostudios، با این حال، اثربخشی رنگ‌دهی و ایمنی زیستی بر روی پوست انسان باید ارزیابی و توسط آزمایش‌های بالینی در آینده تایید شود.