متفورمین از طریق فعال سازی مسیر AMPK/BDNF/PI3K، اختلالات عصبی در پیری را کاهش می دهد، قسمت 1

کاهش سرعت اختلالات عصبی شناختی مرتبط با سن یک چالش بوده است. ما اثرات درمانی متفورمین را در پیری ناشی از دی گالاکتوز ارزیابی کردیم. علاوه بر این، ما مکانیسم‌های مولکولی بالقوه‌ای را که می‌توانند مسئول اثرات ضد پیری متفورمین باشند، مطالعه کردیم. 30 موش صحرایی نر به طور مساوی به 1 گروه کنترل، که محلول نمکی دریافت کردند، گروه 2-d-گالاکتوز (D-gal) که d-گالاکتوز (100 میلی گرم/کیلوگرم در روز) را به مدت هشت هفته با شستشوی معده دریافت کردند، تقسیم شدند. و گروه تحت درمان با 3-d-گالاکتوز به علاوه متفورمین (D-gal plus Met)، که دی گالاکتوز به علاوه متفورمین (200 میلی گرم/کیلوگرم در روز) را به مدت هشت هفته با شستشوی معده دریافت کردند. یک ارزیابی عصبی-شناختی انجام شد. اندازه گیری بیومارکرهای التهابی، استرس اکسیداتیو و BDNF انجام شد. بیان ژن AMPK و PI3K مورد بررسی قرار گرفت. بافت هیپوکامپ برای مطالعات هیستوپاتولوژیک و ایمونوهیستوشیمی تشریح شد. D-gal منجر به اختلالات عصبی شناختی، افزایش بیومارکرهای التهابی، تغییر نشانگرهای استرس اکسیداتیو، کاهش BDNF و کاهش بیان سیناپتوفیزین و Bcl2 با افزایش بیان کاسپاز{18}} و کاهش ژن‌های AMPK و PI3K شد. تغییرات نورودژنراتیو در هیپوکامپ وجود داشت. متفورمین به طور قابل توجهی تغییرات نورودژنراتیو ناشی از D-gal را بازسازی کرد. ما به این نتیجه رسیدیم که متفورمین می تواند نقص عصبی شناختی ناشی از افزایش سن را از طریق بهبود التهاب عصبی، کاهش استرس اکسیداتیو، کاهش آپوپتوز و همچنین ارتقای شکل پذیری سیناپسی کاهش دهد. این مکانیسم‌ها می‌توانند از طریق فعال‌سازی مسیر AMPK/BDNF/PI3K واسطه شوند.

گلیکوزید سیستانچ همچنین می تواند فعالیت SOD را در بافت های قلب و کبد افزایش دهد و به طور قابل توجهی محتوای لیپوفوسین و MDA را در هر بافت کاهش دهد و به طور موثر رادیکال های مختلف اکسیژن فعال (OH-، H2O2 و غیره) را از بین ببرد و از آسیب DNA ناشی از آن محافظت کند. توسط رادیکال های OH گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید سیستانچ دارای توانایی مهار قوی رادیکال های آزاد، توانایی کاهش بالاتری نسبت به ویتامین C، بهبود فعالیت SOD در سوسپانسیون اسپرم، کاهش محتوای MDA و اثر محافظتی خاصی بر عملکرد غشای اسپرم هستند. پلی ساکاریدهای سیستانچ می توانند فعالیت SOD و GSH-Px را در گلبول های قرمز و بافت ریه موش های آزمایشگاهی مسن ناشی از D-گالاکتوز افزایش دهند و همچنین محتوای MDA و کلاژن را در ریه و پلاسما کاهش دهند و محتوای الاستین را افزایش دهند. اثر پاک کنندگی خوب بر روی DPPH، طولانی شدن زمان هیپوکسی در موش های پیر، بهبود فعالیت SOD در سرم، و به تاخیر انداختن انحطاط فیزیولوژیکی ریه در موش های آزمایشگاهی پیر. و این پتانسیل را دارد که دارویی برای پیشگیری و درمان بیماری های پیری پوست باشد. در عین حال، اکیناکوزید موجود در سیستانچ توانایی قابل توجهی در از بین بردن رادیکال های آزاد DPPH دارد و می تواند گونه های فعال اکسیژن را از بین ببرد، از تخریب کلاژن ناشی از رادیکال های آزاد جلوگیری کند و همچنین اثر ترمیم خوبی بر آسیب آنیون رادیکال آزاد تیمین دارد.

در مورد ضد پیری روی Cistanche در اردو کلیک کنید

【برای اطلاعات بیشتر: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

اختصارات

دی گال دی گالاکتوز

ROS گونه های اکسیژن فعال

IL-1 اینترلوکین-1

IL-1 اینترلوکین-1

IL-6 اینترلوکین-6

IL-10 اینترلوکین-10

TNF- فاکتور نکروز تومور

فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز BDNF

پروتئین کیناز فعال شده با AMPK AMP

PI3K/Akt فسفاتیدیلینوزیتول 3-کیناز/پروتئین کیناز B

RT-PCR واکنش زنجیره ای پلیمراز ترانس کریپتاز معکوس

پیچ و خم EPM Eleved Plus

تأخیر انتقال TL

MDA مالون دی آلدئید

SOD سوپراکسید دیسموتاز

MPTP منفذ انتقالی نفوذپذیری میتوکندری

H&E هماتوکسیلین و ائوزین

نیتریک اکسید سنتاز القایی iNOS

NF-kB فاکتور هسته ای-κB

LTP تقویت طولانی مدت

از دست دادن مداوم عملکرد فیزیولوژیکی، چابکی ذهنی و حافظه که با افزایش سن اتفاق می‌افتد، فرآیندی چندوجهی است که ممکن است با مرگ سلول‌های عصبی آغاز شود. پیش بینی می شود که امید به زندگی در بسیاری از کشورها تا سال 20302 از 85 سال فراتر رود. به دلیل کاهش کیفیت زندگی سالمندان و هزینه های اقتصادی و شخصی مرتبط با آن، آسیب های شناختی مرتبط با افزایش سن به عنوان یک موضوع اجتماعی مهم ظاهر شده است. علاوه بر این، پیری مغز علت اصلی ایجاد بیماری های عصبی است که اغلب به طور غیر قابل برگشت پیشرفت می کنند. در حال حاضر درمان‌های مؤثر کمی وجود دارد یا هیچ درمان مؤثری برای اختلالات عصبی-شناختی مرتبط با افزایش سن وجود دارد.

دی گالاکتوز (D-gal)، یک مونوساکارید فراوان در محصولات شیر، معمولاً توسط آنزیم ها به گلوکز تبدیل می شود. با این حال، تجویز طولانی مدت سیستمیک D-gal می تواند خطرات بهداشتی قابل توجهی ایجاد کند. تحقیقات قبلی نشان داد که تحویل سیستمیک D-gal به موش‌ها می‌تواند آنها را به مدل‌هایی از پیری و اختلالات عصبی مرتبط با سن تبدیل کند. مدل پیری D-gal دارای چندین مزیت نسبت به مدل پیری طبیعی است، از جمله توانایی تمرکز صرفاً بر روند پیری. در مدل پیری طبیعی، بیماری‌های همراه از جمله دیابت و فشار خون بالا متغیرهای پیچیده‌کننده هستند.

تصور می شود که D-gal ناهنجاری های بیوشیمیایی مشابه آنچه در مغز انسان سالخورده دیده می شود، مانند کاهش فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی و تضعیف نورون های کولینرژیک ایجاد می کند. محصولات نهایی گلیکاسیون پیشرفته که هم با پیری طبیعی و هم با پاتوفیزیولوژی بسیاری از بیماری ها مرتبط هستند، از تعامل D-gal با گروه های آمینه پروتئینی تولید می شوند. حیواناتی که D-gal ارائه کردند باعث التهاب عصبی، آسیب میتوکندری و آسیب اکسیداتیو ناشی از توسعه گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) همراه با مشکلاتی در عادت‌سازی جدید، کمبودهای یادگیری فضایی و عملکردهای شناختی شدند.

التهاب می تواند یک عامل کلیدی در زوال شناختی در میان سالمندان باشد. سطوح بالای اینترلوکین-6، IL-1، فاکتور نکروز تومور، و پروتئین واکنش‌گر C با افزایش خطر ابتلا و مرگ و میر در سالمندان مرتبط است. درمان مزمن دی گالاکتوز در موش‌ها باعث فعال‌سازی مسیرهای سیگنالینگ آپوپتوز عصبی و التهاب عصبی در قشر مغز و هیپوکامپوس شد.

افزایش سن منجر به کاهش فاکتور نوروتروفیک مشتق از مغز (BDNF) می‌شود که پروتئینی حیاتی است که در تغییرات پلاستیک مرتبط با یادگیری و حافظه و همچنین واسطه‌ای حیاتی برای تکثیر و یکپارچگی عصبی نقش دارد.

کشف ترکیبات جدیدی که پیری را به تاخیر می اندازد و از عملکرد شناختی حمایت می کند به یکی از بزرگترین چالش ها تبدیل شده است. متفورمین به سرعت به سد خونی مغزی نفوذ می کند و در چندین ناحیه مغز از جمله غده هیپوفیز و هیپوکامپ 11 تجمع می یابد. نشان داده شده است که تجویز طولانی مدت متفورمین شروع عوارض پاتولوژیک مرتبط با افزایش سن را کاهش می دهد و طول عمر را در انسان افزایش می دهد. علاوه بر این، متفورمین برای بهبود اختلالات شناختی و اختلالات رفتاری مانند اضطراب در افراد دیابتی و غیر دیابتی 13،14 و بیماران مبتلا به بیماری‌های عصبی 15 نشان داده شده است. با این حال، مکانیسم های اساسی اثرات متفورمین در بهبود اختلالات عصبی شناختی مرتبط با سن پیچیده است و هنوز کاملاً شناخته نشده است.

اثرات محافظت عصبی متفورمین ممکن است در درجه اول به فعال شدن مسیر سیگنالینگ پروتئین کیناز فعال شده با AMP (AMPK) نسبت داده شود. فعال‌سازی AMPK بیان BDNF را تنظیم می‌کند، که نقش مهمی در انتقال سیناپسی و تثبیت حافظه دارد. علاوه بر این ویژگی ثابت شده فعال سازی AMPK، نتایج قبلی نشان داده اند که متفورمین می تواند حافظه را از طریق بازیابی استرس اکسیداتیو، کاهش التهاب عصبی و مهار آپوپتوز تقویت کند، که ممکن است نشانه های بالینی آن را در زمینه اختلالات عصبی گسترش دهد. متفورمین یک فعال کننده قوی مسیر فسفاتیدیل 3-کیناز/پروتئین کیناز B (PI3K/Akt) است که یک مسیر سیگنالینگ مهم در مهار آپوپتوز و ارتقاء بقای سلولی است.

با در نظر گرفتن مزایای متفورمین، که شامل ایمنی، مقرون به صرفه بودن و قابلیت استفاده است. ما اثرات محافظت عصبی تجویز متفورمین را در برابر اختلالات عصبی شناختی ناشی از پیری ناشی از دی گالاکتوز در موش‌ها مطالعه کردیم. علاوه بر این، مکانیسم‌های مولکولی اساسی این اثرات محافظتی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش ها

حیوانات.سی موش صحرایی نر آلبینو ویستر با وزن 200 تا 250 گرم پس از اخذ تأییدیه های لازم از کمیته اخلاقی پژوهش در دانشکده پزشکی دانشگاه منوفا مصر (شماره ثبت 10/2022 PHYS 9) در آزمایش مورد استفاده قرار گرفتند. روش‌های آزمایشی دستورالعمل‌های ARRIVE را دنبال کردند. موش ها در قفس های مش سیمی (80×40×30 سانتی متر) قرار گرفتند. همه حیوانات در طول دوره مطالعه پس از تهویه کردن آنها به مدت 2 هفته در شرایط محیطی ثابت و چرخه نور/تاریکی 12:{10}} ساعت به غذا و آب دسترسی کامل داشتند.

طراحی تجربی.حیوانات به طور تصادفی به سه گروه (10/گروه) تقسیم شدند:

1. گروه کنترل: محلول نمکی را از طریق گاواژ خوراکی دریافت کردند.

2. گروه d-گالاکتوز (D-gal): دریافت d-گالاکتوز (سیگما-آلدریش سنت لوئیس، ایالات متحده آمریکا) محلول در محلول نمکی با دوز 100 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن از طریق شستشوی معده به مدت هشت هفته متوالی17

3. d-گالاکتوز به علاوه متفورمین (D-gal plus Met) گروه تیمار شده: d-گالاکتوز (با همان دوز در گروه D-gal) به همراه متفورمین (Sigma-Aldrich سنت لوئیس، ایالات متحده) را دریافت کردند که در محلول نمکی حل شده بود. در دوز 200 میلی گرم بر کیلوگرم در روز از طریق شستشوی معده به مدت هشت هفته متوالی 16

پس از اتمام هشت هفته، یک ارزیابی عصبی رفتاری از همه موش‌ها انجام شد. پس از آن، موش ها بیهوش شدند و با کشیدگی و دررفتگی دهانه رحم قربانی شدند. مغز استخراج و با بافر فسفات سالین (pH 7.4) شسته شد. نیمکره چپ وزن شد و به دو نیمه تقسیم شد. یکی از آنها برای آنالیز بیوشیمیایی و نیمی دیگر برای مطالعات RT-PCR استفاده شد. نیمکره راست برای ارزیابی هیستوپاتولوژیک و ایمونوهیستوشیمی بافت هیپوکامپ در فرمالین سالین 10 درصد تثبیت شد.

تست های عصبی رفتاریتشخیص شی بدیع تست تشخیص شی جدید برای ارزیابی ظرفیت موش ها برای تشخیص یک شی جدید در یک محیط آشنا مورد استفاده قرار گرفت. هر موش سه روز آزمایش داشت که شامل سه مرحله بود: عادت کردن، آموزش و آزمایش. موش‌ها در مرحله عادت‌دهی در یک دستگاه میدان باز (50 × 50 سانتی‌متر × 40 سانتی‌متر) قرار داده شدند و 10 دقیقه برای سازگاری بدون هیچ آیتمی به آنها فرصت داده شد. هر موش در طول مرحله تمرین به مدت پنج دقیقه در محفظه ای با دو جسم یکسان نگهداری شد. پس از بیست و چهار ساعت، هر موش در مرحله آزمایشی به مدت پنج دقیقه در محفظه قرار داده شد که شامل جایگزینی یکی از اشیاء قدیمی با یک شی جدید بود. کرونومتر برای زمان‌بندی مدت زمان اکتشاف شی مورد استفاده قرار گرفت. شاخص تمایز [=(زمان اکتشاف شی جدید-زمان اکتشاف شیء خانوادگی)/زمان کل اکتشاف×100 درصد] برای ارزیابی عملکرد شناختی موش‌ها استفاده می‌شود. برای تمیز کردن زمین باز و اجسام بین موش‌ها از الکل استفاده شد.

پیچ و خم آبی موریس ماز آبی موریس برای بررسی تاثیر متفورمین بر یادگیری و حافظه فضایی استفاده شد. یک استخر از فولاد ضد زنگ ساخته شده بود که قطر آن 210 سانتی متر و ارتفاع 50 سانتی متر بود که شامل یک سکوی فرار غوطه ور در عمق 1 سانتی متری زیر سطح آب بود. آب در دمای 1±24 درجه نگهداری شد. کار اکتساب در طول پنج روز آزمایش با چهار آزمایش در هر روز مورد آزمایش قرار گرفت. زمان مورد نیاز برای رسیدن به سکوی مخفی در طول هر آزمایش به عنوان تاخیر فرار ثبت شد. حداکثر 60 ثانیه به موش ها داده شد تا سکوی مخفی را پیدا کنند. حداکثر محدودیت زمانی 60 ثانیه تعیین شد و موش به صورت دستی به سکوی پنهان هدایت شد. یک آزمایش تک پروب 24 ساعت پس از آخرین آزمایش در روز پنجم انجام شد. سکو برداشته شد و موش از ربع مقابل به ربع آموزشی در استخر قرار گرفت. سپس به موش اجازه داده شد تا به مدت 60 ثانیه آزادانه شنا کند. زمان صرف شده در ربع هدف 19 ثبت شد.

تست ماز بعلاوه بالا (EPM). EPM یک تکنیک تثبیت شده برای ارزیابی رفتار شبه اضطرابی در موش است. از چوب ساخته شده بود و شامل بازوهای باز و بسته (50 سانتی متر طول در 10 سانتی متر عرض) بود. دو بازوی بسته با دیوارهایی به ارتفاع 40 سانتی متر محصور شده بودند. بازوها توسط یک سکوی مربعی مرکزی (10×10 سانتی متر) به هم متصل می شدند. ارتفاع دستگاه 50 سانتی متر از زمین بود. هر موش در مرکز دستگاه رو به بازوی بسته قرار داده شد و اجازه داده شد تا به مدت پنج دقیقه آزادانه حرکت کند. زمان صرف شده در آغوش باز و بسته ثبت شد. همچنین، ورودی های باز در 20 ثبت شد. ما همچنین تأخیر انتقال (TL) را اندازه گیری می کنیم که برای ارزیابی حافظه و یادگیری استفاده می شود. در روز اول (جلسه اکتساب)، هر موش به مدت 90 ثانیه در معرض EPM قرار گرفت. زمانی که موش به بازوی بسته رسید به عنوان TL ثبت شد. موش هایی که در دهه 90 نتوانستند با آغوش بسته وارد شوند از مطالعه حذف شدند. در روز دوم (جلسه حفظ)، هر موش در بازوی باز قرار داده شد و TL برای حداکثر 90 s21 ثبت شد.

تجزیه و تحلیل بیوشیمیاییبافت مغز با محلول PBS پرفیوژن شد، سپس در یک بافر سرد 5 میلی لیتری در هر گرم بافت همگن شد. سانتریفیوژ بافت مغز در 4000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه انجام شد، سپس مایع رویی برداشته شد و در دمای 80- درجه تا اندازه گیری مالون دی آلدئید (MDA) و سوپراکسید دیسموتاز (SOD) با استفاده از رنگ سنجی معمولی (QuantiChrom™, BioAssay Systems) ذخیره شد. ایالات متحده آمریکا)، فاکتور نکروز تومور سرم (TNF-)، اینترلوکین 10 (IL-10) و فاکتور نوروتروپیک مشتق از مغز (BDNF) با استفاده از کیت الایزا (Quantikine، شرکت Abcam، کمبریج، انگلستان) طبق دستورالعمل سازنده دستورالعمل ها.

سنجش کمی بیان ژن‌های AMPK و PI3K با استفاده از تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونوشت معکوس (RT-PCR).بافت های مغز برای جداسازی RNA کل با استفاده از کیجن RN Easy plus Universal از ایالات متحده آمریکا آماده شدند. سپس کیفیت و خلوص RNA تضمین شد. RNA تا زمان استفاده در 8-0 درجه ذخیره شد. سپس، اولین مرحله سنتز cDNA با استفاده از کیت رونویسی معکوس QuantiTect، Qiagen از ایالات متحده، با استفاده از سیکلر حرارتی Applied Biosystems 2720 (سنگاپور) برای تنها یک چرخه بود. پرایمرهای GAPDH در واکنش های RT-PCR به عنوان کنترل بارگذاری RNA مورد استفاده قرار گرفتند. مرحله دوم تقویت cDNA بود: cDNA در SYBR سبز-پایه کمی PCR زمان واقعی برای تعیین کمیت نسبی (RQ) بیان ژن های AMPK و PI3K توسط SensiFASTTMSYBR Lo-ROX Kit، ایالات متحده، با استفاده از پرایمرهای طراحی شده زیر (میدلند، تگزاس) استفاده شد. ): پرایمر فوروارد برای AMPK (TGCGTGTACGAAGGAAGAATCC) بود. و پرایمر معکوس (TGTGACTTCCAGGTCGGGAGTT) بود. آغازگر رو به جلو برای PI3K (AGCTGGTCTTCGTTTCCTGA) و پرایمر معکوس (GAAACTTTTTCCCACCACGA) بود. در نهایت، تجزیه و تحلیل داده ها با نرم افزار Applied Biosystems 7500 نسخه 2.0.1 انجام شد. RQ بیان ژن‌های AMPK و PI3K با استفاده از روش مقایسه‌ای ∆∆Ct انجام شد، که در آن مقدار ژن‌های هدف (AMPK و PI3K) mRNA به یک ژن مرجع درون‌زا (GAPDH) و نسبت به یک شاهد نرمال می‌شود.

ارزیابی هیستوپاتولوژیک بافت مغز.بررسی بافت شناسی بافت مغز در محلول فرمالین 10 درصد تثبیت شد و در پارافین جاسازی شد و مقاطع تاجی سریالی به ضخامت 5 میکرومتر به دست آمد. سپس مقاطع هیپوکامپ مغز با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) برای بررسی با میکروسکوپ نوری رنگ‌آمیزی شدند.

رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی هیپوکامپ. رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی کاسپاز{0} (شماره CAT: ab32351، شرکت Abcam 152 Grove Street Waltham، M02453، USA) و سیناپتوفیزین (شماره CAT: ab32127، شرکت Abcam 152 Grove Street Waltham، M02453، USArabbit) انجام شد. آنتی بادی های مونوکلونال برای Bcl{7}} (شماره CAT: ab59348, شرکت Abcam 152 Grove Street Waltham, M02453, USA) با استفاده از آنتی بادی های پلی کلونال خرگوش انجام شد. آنها در یک ویال حاوی 1 میلی لیتر آنتی بادی دریافت شدند. آنتی کاسپاز{13}}، آنتی سیناپتوفیزین و آنتی Bcl-2 به ترتیب در مقادیر رقیق 1:50، 1:400 و 1:100 استفاده شد. برش ها در 5 میکرومتر برش داده شدند و توسط یک رنگ آمیزی ایمنی خودکار LINK 48 (داکو، Agilent Technologies Inc، سانتا کلارا، ایالات متحده آمریکا) رنگ آمیزی شدند. برای بازیابی حرارت از بافر سیترات توسط ایمونوهیستوشیمی استفاده شد. اسلایدها به طور خودکار توسط آنتی بادی های رقیق شده اولیه رنگ آمیزی شدند. کنترل مثبت واکنش با استفاده از مقاطع خاص پارافینی از لوزه طبیعی انسان، پانکراس انسان و آدنوم فولیکولی به ترتیب برای کاسپاز{26}}، سیناپتوفیزین و Bcl{27}} انجام شد. کنترل های منفی با جایگزینی آنتی بادی های اولیه با سرم غیر ایمنی ساخته شد.

ارزیابی هیستوپاتولوژی و نشانگرهای ایمونوهیستوشیمی (کاسپاز{0}}، سیناپتوفیزین و Bcl-2) در نواحی مختلف هیپوکامپ شامل CA1، CA2 و CA3 انجام شد.

تحلیل آماری.نتایج به صورت میانگین ± انحراف استاندارد (SD) بیان می شوند. برای تجزیه و تحلیل آماری گروه‌های مختلف با استفاده از نرم‌افزار Origin® و احتمال شانس (p values) از آنالیز واریانس (ANOVA) استفاده شد. مقادیر P<0.05 were considered significant.

تایید اخلاق و رضایت برای شرکت.این کار توسط و توسط دستورالعمل های کمیته اخلاقی دانشکده پزشکی، دانشگاه منوفا، مصر تایید شده است.

نتایج

تست های عصبی رفتاریبا توجه به آزمون شی جدید، درصد شاخص تمایز در گروه D-gal در مقایسه با گروه کنترل به طور معنی‌داری کمتر بود (به ترتیب 3.31±.16.-37 در مقابل 2.92±30.16 درصد، P.<0.05). The percentage of discrimination index was significantly higher in the D-gal+Met group  (16.66±4.67%, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, this percentage is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 1).

در مورد آزمون ماز موریس، میانگین مدت زمان تاخیر فرار در روزهای اول، دوم، سوم، چهارم و پنجم در گروه D-gal در مقایسه با گروه کنترل به طور معنی‌داری بیشتر بود (94/1±16/58، 4{ {19}}.62±1.33، 32.75±1.10، 1.58±24.37، و 0.98±15.29 ثانیه در مقابل 2.92±40.16، 1.15±25.16، 1.15±25.16، 1.08±1.37، 1.08±17.04 و 1.08±17.04 86 به ترتیب، P<0.05). The means value of the duration of escape latency was significantly lower in the D-gal+Met group in the five training days (50±1.41, 34.08±1.15, 25.16±1.31, 16.04±1.75,   and 10.25±1.01 s, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean values of the durations of escape latency in the five training days in the D-gal+Met group were still significantly higher when compared with the control group. The means value of the duration that the rats spent in the target quadrant were significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 23.50±1.87 s,   respectively, P < 0.05). However, the mean value of the duration that the rat spent in the target quadrant was significantly higher in the D-gal+Met group (19.66 ± 2.16 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group.  However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 2).

در آزمون ماز بعلاوه بالا، میانگین مدت زمانی که موش ها در بازوهای باز سپری کردند در گروه D-gal در مقایسه با گروه کنترل به طور قابل توجهی کمتر بود (به ترتیب 6.54±60 ثانیه در مقابل 3.48±90.83 ثانیه. ، پ<0.05). On the other hand, the mean value of the duration that the rats spent in the open arms was significantly higher in the D-gal+Met group (73.83±5.41 s, P < 0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly lower when compared with the control group. On the contrary, the mean value of the duration that the rats spent in the closed arms was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (107.33±3.07 s vs. 57.66±5.12 s respectively, P<0.05). The means value of the duration that the rats spent in the closed arms were significantly lower in the D-gal+Met group (74.66±2.58 s, P<0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group. The mean value of the number of open-arm entries was significantly lower in the D-gal group when compared with the control group (12.50±1.87 vs. 32.33±3.07, respectively, P<0.05). On the contrary, the mean value of the number of open-arm entries was significantly higher in the D-gal+Met group (21.66±2.16,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group. The mean value of the duration of the transfer latency was significantly higher in the D-gal group when compared with the control group (48.33 ±6.88 s vs. 25 ±1.87 s, respectively, P < 0.05). While the mean value of the duration of the transfer latency was significantly lower in the D-gal+Met group (34.66±3.77 s,  P<0.05) when compared with the D-gal group. However, its level was still significantly higher when compared with the control group (Fig. 3).

آزمایشات بیوشیمیاییمیانگین مقدار MDA مغز به طور معنی‌داری بالاتر بود، در حالی که میانگین مقدار SOD مغز در گروه D-gal در مقایسه با گروه کنترل (70±3.23 نانومول بر میلی‌گرم پروتئین و 1±13.05 به طور معنی‌داری کمتر بود). }} U/mg پروتئین در مقابل 33.76±2.13 نانومول در میلی گرم پروتئین و 29.11±4.34 U/mg پروتئین، P<0.05). The mean value of brain MDA level was significantly lower, while the mean value of brain SOD level was significantly higher in the D-gal+Met group (50.02±4.26 nmol/mg protein and  21.90±2.33 U/mg protein, respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. However, the mean value of MDA is still significantly higher, and the mean value of SOD is significantly lower when compared with the control group (Fig. 4a,b).

میانگین سطح TNF- مغز به طور معنی‌داری بالاتر بود، در حالی که میانگین سطح IL مغز در گروه D-gal در مقایسه با گروه کنترل به طور معنی‌داری کمتر بود (03/10 ± 50/67 pg/mg پروتئین و 91/72 pg/mg پروتئین). P<0.05). The mean value of brain TNF-α level was significantly lower, while the mean value of brain IL-10 level was significantly higher in the D-gal+Met group (49.83±1.89 pg/mg protein and 131.67±4.54 pg/mg protein,   respectively, P<0.05) when compared with the D-gal group. But, the mean value of TNF-α was still significantly higher, and the mean value of IL-10 was significantly lower when compared with the control group (Fig. 4c,d).

میانگین سطح BDNF مغز در گروه D-gal در مقایسه با گروه کنترل به طور قابل توجهی کمتر بود (به ترتیب 125.72±4.17 pg/mg پروتئین در مقابل 225.20±5.52 pg/mg پروتئین، P.<0.05). The mean value of brain BDNF level was significantly higher in the D-gal +Met group (215.03±3.65 pg/mg protein, P < 0.05)   when compared with the D-gal group. However, its level is still significantly lower when compared with the control group (Fig. 5).

RT-PCR کمی (qRT-PCR). بیان ژن های AMPK و PI3k (به ترتیب 0.52±0.11 و 0.37±0.03، به ترتیب، P<0.05) was significantly down-regulated in the D-gal group when compared with the control group (1). However, the expression of AMPK and PI3k genes was significantly up-regulated in the  D-gal+Met group (0.95±0.08 and 0.98±0.04, respectively, P<0.05), when compared with the D-gal group, but it was insignificantly changed (P>0.05) در مقایسه با گروه کنترل (شکل 6).

هیستوپاتولوژی.رنگ آمیزی H&E بافت هیپوکامپ در گروه کنترل تغییرات پاتولوژیک غیرقابل توجهی را نشان داد. گروه D-gal انحطاط عصبی و اجسام آپوپتوز با ادم و گلیوز عظیم را نشان داد. با این حال، بخش های گروه D-gal به علاوه Met انحطاط عصبی اندکی و اجسام آپوپتوز کمی با ادم خفیف و گلیوز کانونی خفیف را نشان دادند (شکل 7).

ایمونوهیستوشیمی. نتایج ایمونوهیستوشیمی نشان داد که مقدار H نمره بیان سیناپتوفیزین در بافت هیپوکامپ به طور قابل توجهی کمتر بود (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (100±5.78 vs. 260±4.03). However, the expression of synaptophysin (180±5.26) in hippocampal tissue in the D-gal+Met group was significantly higher when compared with the D-gal group. However, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 8).

ارزش نمره H بیان کاسپاز{0}} در بافت هیپوکامپ به طور قابل توجهی بالاتر بود (P<0.05) in the  D-gal group when compared with the control group (279±5.35 vs. 89±3.54). On the other hand, the H score value of the caspase-3 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (151±4.73) was significantly lower when compared with the D-gal group, but still significantly higher when compared with the control group  (Fig. 9). 

ارزش نمره H بیان Bcl{0}} در بافت هیپوکامپ به طور قابل توجهی کمتر بود (P<0.05) in the D-gal group when compared with the control group (161±4.36 vs. 301±6.11). While the H score value of Bcl-2 expression in hippocampal tissue in the D-gal+Met group (179±7.48) was significantly higher when compared with the D-gal group, it was still significantly lower when compared with the control group (Fig. 10).

بحث

افزایش میانگین امید به زندگی خطر ابتلا به بیماری را در سالمندان افزایش می دهد، به ویژه در عرصه شناختی که ممکن است حداقل تا حدی به دلیل از دست دادن نورون ها در مغز باشد. به خوبی پذیرفته شده است که تزریق طولانی مدت دی گالاکتوز به پیشرفت پیری و آسیب خفیف عصبی و نقص حافظه کمک می کند. از آنجایی که پیری ناشی از D-galined با تخریب عصبی همراه است، می‌تواند یک مدل ایده‌آل برای مطالعه مکانیسم‌های مولکولی مرتبط با تخریب عصبی مرتبط با سن و برای آزمایش رویکردهای درمانی جدید باشد.

مطالعه ما نشان داد که تجویز مزمن D-gal باعث اختلال در رفتارهای اکتشافی ناشی از تازگی و حافظه کاری در موش‌ها می‌شود. این در نتایج شی جدید، پیچ و خم آبی موریس، و آزمایش‌های ماز مرتفع به علاوه آشکار بود. این نتایج با سایر مطالعات گزارش شده مطابقت داشت23. از سوی دیگر؛ درمان با متفورمین در مقایسه با گروه D-gal، حافظه کاری و اولویت را برای تازگی بهبود بخشید. در حمایت از نتایج ما، یک مطالعه قبلی گزارش داد که متفورمین حافظه کوتاه مدت را در موش های دیابتی ناشی از استرپتوزوتوسین بهبود می بخشد. به خوبی مستند شده است که پیری نه تنها با کاهش عملکردهای شناختی، بلکه با تغییرات عاطفی از جمله رفتارهای شبه اضطرابی که منجر به اختلال عملکردی می شود، مرتبط است. در مطالعه حاضر، نتایج آزمون EPM افزایش رفتار شبه اضطرابی را در گروه D-gal در مقایسه با گروه کنترل نشان داد. در حالی که درمان با متفورمین رفتار شبه اضطرابی را کاهش داد.

مطالعه حاضر نشان داد که تغییرات عصبی رفتاری ناشی از تجویز خوراکی D-gal با اختلال در نشانگرهای استرس اکسیداتیو مغز همراه است. میانگین مقدار MDA در هموژن بافت مغز به طور قابل توجهی بالاتر بود، در حالی که فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانی SOD در گروه D-gal به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل بود. نتایج مشابهی قبلاً 23،26 گزارش شده بود. D-gal با آمین‌های آزاد مختلف در معماری پروتئین از طریق گلیکاسیون غیر آنزیمی برهم‌کنش می‌کند و منجر به تولید محصولات گلیکاسیون پیشرفته می‌شود. این منجر به تولید ROS می شود که پیری مغز را از طریق آسیب اکسیداتیو به DNA، لیپیدها و پروتئین ها افزایش می دهد. از دست دادن حافظه و اختلال یادگیری ناشی از تجویز مزمن D-gal را می توان به تولید رادیکال های آزاد نسبت داد که منجر به اختلال در نوروژنز و در نهایت تخریب عصبی می شود. علاوه بر این، نورون‌های مغز به دلیل وجود محتوای لیپید بالا و مصرف اکسیژن بیشتر، مستعد استرس اکسیداتیو هستند.

در مقابل، تجویز متفورمین به طور قابل توجهی تعادل ردوکس را بازیابی کرد. شواهد نشان داد که متفورمین می تواند منافذ انتقالی نفوذپذیری میتوکندری (mPTP) را مهار کرده و تولید ROS و پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش دهد. بنابراین، این نشان می‌دهد که اثر ضد پیری متفورمین احتمالاً به واسطه دفاع آنتی‌اکسیدانی آن است.

علاوه بر استرس اکسیداتیو، التهاب همچنین یک مکانیسم مهم القا کننده پیری در درمان D-gal است. D-gal باعث تولید ROS می شود که مسیرهای التهابی را فعال می کند. التهاب عصبی مزمن و ترشح سیتوکین های پیش التهابی از علائم بارز پیری است. توافقی وجود دارد که سیتوکین های التهابی در استرس اکسیداتیو نقش دارند. TNF-، IL-6، و IL-1 در ایجاد و پیشرفت استرس اکسیداتیو ضروری هستند. این سیتوکین ها با ROS مرتبط هستند و فاکتور هسته ای-κB (NF-kB) را برای انتقال به هسته و تنظیم بیان ژن های پیش التهابی مانند iNOS و COX2 فعال می کنند که در پاسخ های التهابی و ایمنی نقش دارند و در نتیجه منجر به فیبروز، آپوپتوز و پاسخ های فاز حاد که باعث آسیب اندام می شود. داده های فوق با نتایج ما مطابقت داشت، زیرا سطح TNF-آلفا به طور معنی داری بالاتر بود و IL{15}} در گروه D-gal به طور قابل توجهی کمتر از گروه کنترل بود.

از سوی دیگر، درمان با متفورمین منجر به کاهش قابل توجهی در نشانگرهای التهابی در مقایسه با گروه D-gal شد. اثرات ضد التهابی متفورمین را می توان به فعال شدن سیگنالینگ AMPK نسبت داد که از طریق مهار NF-κB29 واکنش های التهابی را سرکوب می کند. همچنین باعث کاهش تولید سیتوکین های پیش التهابی و فعال شدن میکروگلیال در مغز می شود که به نوبه خود استرس اکسیداتیو را کاهش می دهد.

برای درک بیشتر مکانیسم‌های مولکولی زیربنای اعمال متفورمین، بیان پروتئین AMPK و PI3k را بررسی کردیم. مطالعه ما نشان داد که بیان AMPK در گروه D-gal در مقایسه با گروه کنترل به طور قابل توجهی کاهش یافت، در حالی که سطح آن در گروه تحت درمان با متفورمین در مقایسه با گروه D-gal به طور قابل توجهی تنظیم شد. مطالعات قبلی گزارش دادند که فعال‌سازی AMPK و پاسخ‌دهی به AMPK با افزایش سن کاهش می‌یابد، که ممکن است تنظیم متابولیک تغییر یافته را توضیح دهد، که منجر به کاهش اتوفاژی و افزایش استرس اکسیداتیو می‌شود. متفورمین با افزایش فسفوریلاسیون AMPK در Tr{7}} AMPK را فعال می‌کند. AMPK هدف اصلی متفورمین برای عملکرد محافظتی آن در برابر اختلالات شناختی است. قادرنژاد و همکاران گزارش داد که فعال‌سازی AMPK ناشی از متفورمین منجر به فعال‌سازی مسیر BDNF/P70S6K در نورون‌های هیپوکامپ برای افزایش شکل‌گیری حافظه در کار اجتنابی غیرفعال در یک مدل موش‌های ایسکمی/خونرسانی مجدد مغزی جهانی شد. فعال سازی BDNF نقش حیاتی در تنظیم عملکردهای عصبی شناختی مانند یادگیری، حافظه، انتقال سیناپسی، و انعطاف پذیری دارد. . بنابراین، بهبود حافظه ناشی از متفورمین در مطالعه ما می تواند از طریق فعال سازی سیگنالینگ AMPK واسطه شود.

【برای اطلاعات بیشتر: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】