MiR-214 آسیب حاد کلیه ناشی از سپسیس را از طریق اتوفاژی تنظیم شده با PTEN/AKT/mTOR بهبود می بخشد.

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصه. مطالعات قبلی نشان داده اند که استرس اکسیداتیو و اتوفاژی منجر به حاد می شودآسیب کلیه (AKI) در طول سپسیس و microRNA (miR)-214 نقش حیاتی در محافظت ازکلیه هاتحت استرس اکسیداتیو قرار می گیرند. هدف مطالعه حاضر بررسی اینکه آیا محافظت مجدد miR-214 با اتوفاژی در سپسیس مرتبط است یا خیر. نقش اتوفاژی در مدل موش بستن و سوراخ کردن سکوم (CLP) مورد بررسی قرار گرفت. واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی رونویسی معکوس (RT-qPCR) برای تجزیه و تحلیل بیان miR-214 استفاده شد. ساختار و عملکردکلیه هابرداشت شده از موش ها مورد ارزیابی قرار گرفت.کلیهسطوح اتوفاژی با ایمونوهیستوشیمی، ایمونوفلورسانس و وسترن بلات تشخیص داده شد. مشخص شد که miR-214 می‌تواند AKI را در موش‌های سپتیک با مهار سطح آن کاهش دهد.کلیهخویشتن خواری. علاوه بر این، miR-214 با خاموش کردن بیان PTEN در بدن، اتوفاژی را مهار کرد.کلیهبافت موش های سپتیک این یافته‌ها نشان داد که miR-214 AKI ناشی از CLP را با کاهش استرس اکسیداتیو و مهار اتوفاژی از طریق تنظیم مسیر PTEN/AKT/mTOR بهبود می‌بخشد.

کلید واژه ها:microRNA-214، سپسیس، آسیب حاد کلیه، اتوفاژی، کلیه

مقدمه  حادآسیب کلیه(AKI) یکی از شایع ترین عوارض سپسیس است و در 40 تا 50 درصد از بیماران سپتیک رخ می دهد و میزان مرگ و میر آن به 60 درصد می رسد (1). با این حال، پاتوژنز AKI ناشی از سپسیس نامشخص است. گزارش شده است که اتوفاژی نقش کلیدی در AKI ناشی از سپسیس دارد و مهار اتوفاژی منجر به ایجاد AKI در طول سپسیس می شود (2،3). مطالعات قبلی (4،5) تایید کرده اند که سپسیس باعث اتوفاژی در اندام های متعدد از جملهکلیه(6) و فرآیندهای اتوفاژی در حذف میتوکندری های آسیب دیده و استرس اکسیداتیو نقش دارند (7). با این حال، اتوفاژی بیش از حد می تواند باعث مرگ سلولی ناخواسته و مضر شود (8). بنابراین، سطح متوسط ​​اتوفاژی کلید کاهش AKI ناشی از سپسیس است. مطالعات قبلی گزارش کرده‌اند که miR-214 با مهار آپوپتوز (9) AKI ناشی از ایسکمی-پرفیوژن مجدد را بهبود می‌بخشد و miR-214 استرس اکسیداتیو را در نفروپاتی دیابتی از طریق گونه‌های اکسیژن فعال (ROS)/AKT/mTOR0 سرکوب می‌کند. مطالعه حاضر نشان داد که miR-214 می تواند با مهار اتوفاژی، اختلال عملکرد میوکارد ناشی از سپسیس را در موش کاهش دهد (11). با این حال، اینکه آیا miR-214 می تواند AKI ناشی از سپسیس را بهبود بخشد، هنوز مشخص نیست. در مطالعه حاضر، فرض بر این بود که miR-214 با کاهش استرس اکسیداتیو و مهار اتوفاژی از طریق تنظیم مسیر PTEN/AKT/mTOR، AKI ناشی از CLP را کاهش می‌دهد.

سیستانچ بیماری کلیوی/کلیوی را بهبود می بخشد

مواد و روش ها

حیوانات.در مطالعه حاضر از 100 موش نر کونمینگ (وزن، 2.92±20.40 گرم؛ سن، 6 تا 8 هفته) تهیه شده توسط مرکز حیوانات آزمایشگاهی پزشکی دانشگاه پزشکی هبی (Shijiazhuang، چین) استفاده شد. همه موش‌ها با چرخه نور/تاریکی 12 ساعته در دمای 24 درجه سانتی‌گراد با رطوبت 50 درصد سازگار شدند و بیش از 1 هفته قبل از آزمایش به آب و غذا دسترسی آزاد داشتند. تمام مراحل آزمایشی مطابق با دستورالعمل‌های مؤسسه ملی بهداشت (نشریه NIH شماره 85-23، بازبینی شده در سال 1996) و تأیید کمیته‌های مراقبت و استفاده از حیوانات بیمارستان مرکزی Cangzhou (تصویب شماره 2017-020-2017) انجام شد. 01). تمام جراحی ها تحت بیهوشی انجام شد و تمام تلاش ها برای به حداقل رساندن رنج انجام شد.

بستن و سوراخ کردن ساکال (CLP).CLP بر روی موش ها برای ایجاد یک مدل سپسیس موش، همانطور که قبلا توضیح داده شد، انجام شد (12). پس از بیهوشی با استنشاق ایزوفلوران (القا شده در 3 درصد و حفظ در 0.5 درصد)، یک برش خط وسط 1 سانتی متر برش داده شد. سکوم در معرض (فاصله 1 سانتی متر از انتها) با دو سوراخ با استفاده از یک سوزن گیج 23 بسته شد. سکوم به آرامی مقدار کمی از مدفوع را خارج کرد و در موقعیت آناتومیک خود قرار گرفت. دیواره شکم به صورت لایه ای با قیطان ابریشم 3 تا 0 بخیه زده شد. پس از عمل، 1 میلی‌لیتر سرم نمکی 0.9 درصد به صورت زیر جلدی تزریق شد. موش ها فقط به آب دسترسی آزاد داشتند. موش های مدل شم به همان روشی که مدل CLP بدون CLP عمل کردند.

طراحی تجربی. موش‌ها (n{0}} برای جراحی ساختگی و CLP) به‌طور تصادفی به هفت گروه تقسیم شدند: گروه شم، گروه CLP، آدنوویروس (Ad) - پروتئین فلورسنت سبز (GFP) به‌علاوه گروه CLP، Ad-miR-214 به علاوه گروه CLP. ، گروه anti-miR-214 به علاوه CLP، بازدارنده PTEN به علاوه گروه CLP و Ad-miR-214 به علاوه بازدارنده PTEN به اضافه گروه CLP. موش های گروه شم در معرض همان روش اما بدون بستن و سوراخ شدن سکوم قرار گرفتند. موش‌های گروه‌های دیگر بستن و سوراخ شدن سکوم را دریافت کردند. همه موش ها به سرعت با استنشاق ایزوفلوران بیهوش شدند تا خون، ادرار وکلیهنمونه ها 24 ساعت پس از آخرین درمان.

Ad-miR-214، anti-miR-214 یا Ad-GFP با واسطه آدنوویروسانتقال ژن in vivo و تزریق مهارکننده PTEN.  Ad-miR-214، anti-miR-214، یا Ad-GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) 4 روز قبل از CLP در حفره شکمی موش ها تحویل داده شد. به طور خلاصه، موش ها با استنشاق ایزوفلوران بیهوش شدند. یک کاتتر حاوی 200 میکرولیتر آدنوویروس (Pfu 2x1011، بیان کننده miR-214، anti-miR-214، یا Ad-GFP) از طریق تزریق داخل صفاقی به موش های سالم تزریق شد. مهارکننده PTEN (VO-OHpic، داخل صفاقی، Sigma-Aldrich؛ Merck KGaA) به موش های CLP که آنتی miR-214 را از طریق تزریق داخل صفاقی با دوز 10 میکروگرم بر کیلوگرم قبل از تجویز 30 دقیقه ویروس دریافت کرده بودند، تجویز شد. .

ارزیابی عملکرد کلیه. نمونه‌های خون از قلب موش‌ها جمع‌آوری شد و سپس برای جمع‌آوری سرم سانتریفیوژ شد (در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه در دمای 3،{2}} xg). سطوح سرمی نیتروژن اوره خون (BUN) و کراتینین سرم (Cr) با استفاده از یک آنالایزر خودکار Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.) تعیین شد. برای تجزیه و تحلیل سطوح از ELISA استفاده شدآسیب کلیهmolecule-1 (KIM-1; cat. no. RKM100; R&D Systems, Inc.) و لیپوکالین مرتبط با ژلاتیناز نوتروفیل (NGAL; cat. no. DY3508; R&D Systems, Inc.) در نمونه های ادرار.

سنجش سیتوکین التهاب سرم.سرم TNF (شماره گربه H052) و IL-6 (شماره گربه H007) با استفاده از کیت های تجاری ELISA (موسسه مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ) طبق دستورالعمل سازنده مورد بررسی قرار گرفتند.اندازه گیری نشانگرهای استرس اکسیداتیو. کیت سنجش مربوطه (موسسه مهندسی زیستی Nanjing Jiancheng، نانجینگ، چین) برای اندازه‌گیری سطوح مالون دی‌آلدئید (MDA) و آزمایش فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (SOD) مطابق با دستورالعمل‌های سازنده استفاده شد.

نمره بافت شناسی و آسیب لوله ای همه موش ها تحتکلیهپرفیوژن تحت بیهوشی 24 ساعت پس از CLP. راکلیهنمونه ها در پارافورمالدئید 4 درصد به مدت 72 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد تثبیت شدند. سپس نمونه‌های بافت در مجموعه‌ای از محلول‌های اتانول درجه‌بندی شده، که در بخش‌های 4 میکرومتری پارافین و برش جاسازی شده بودند، آبگیری شدند. برش‌های (4 میکرومتر) با استفاده از میکروتوم برش داده شد و برش‌های بافت با هماتوکسیلین (5 دقیقه) و ائوزین (1 دقیقه) در دمای اتاق برای بررسی بافت‌شناسی رنگ‌آمیزی شدند. اسلایدها با استفاده از میکروسکوپ (BX51، Olympus Corporation) ارزیابی و درجه بندی شدند.کلیویtissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 درصد (13).

میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM).تازهکلیه هادر سالین بافر فسفات شسته و به مکعب های 1 میلی متری برش داده شدند و به طور متوالی در گلوتارآلدئید 2.5 درصد به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی گراد ثابت شدند. مقاطع به مدت 2 ساعت در تتروکسید اسمیم 1 درصد در دمای 4 درجه سانتیگراد غوطه ور شدند، در اتانول درجه بندی شده آبگیری و در اپوکسی رزین جاسازی شدند. در نهایت، مقاطع بسیار نازک (60 نانومتر) با اورانیل استات و سیترات سرب در دمای 20 درجه سانتیگراد به مدت 60 دقیقه دو برابر رنگ آمیزی شدند. مشاهده بر روی یک میکروسکوپ الکترونی عبوری (Tecnai؛ Hitachi، Ltd.) در 80 کیلوولت با استفاده از فیلم میکروسکوپی الکترونی 4489 (پایه ضخیم ESTAR؛ کداک) انجام شد.

ایمونوهیستوشیمی (IHC).تازهکلیهبافت ها در پارافورمالدئید 4 درصد (به مدت 72 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد) تثبیت و در پارافین جاسازی شدند. نمونه ها به ضخامت 4 میکرومتر بریده شدند و در زایلن پارافین زدایی شدند. پس از شستشوی مقاطع بافتی با PBS، در بافر سیترات 1{6}} میلی مولار (pH 6.{25}}) به مدت 4 دقیقه برای بازیابی آنتی ژن جوشانده شدند و سپس با سرم 10 درصد بز در PBS در دمای اتاق مسدود شدند. به مدت 1 ساعت آنتی بادی اولیه (anti-LC3B؛ 1:400؛ cat. no. 4412; Cell Signaling Technology, Inc.) مطابق دستورالعمل اضافه شد و در دمای 4 درجه سانتی گراد به مدت 12 ساعت انکوبه شد. آنتی بادی ثانویه (HRP ضد خرگوش بز؛ 1:2،{18}}؛ cat. no. BS13278; Bioworld Technology, Inc.) اضافه شد و در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه انکوبه شد. DAB (100 میکرولیتر) اضافه شد و به مدت 5 دقیقه با رنگ‌آمیزی که در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده شد (Model CX31‑P؛ Olympus Corporation) رنگ‌آمیزی شد. شدت رنگ آمیزی مثبت، که قهوه ای به نظر می رسید، با استفاده از نرم افزار تجزیه و تحلیل تصویر Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.) تعیین شد. چگالی نوری انتگرال (IOD) برای نشان دادن شدت محاسبه شد. با افزایش بیان پروتئین، مقادیر IOD افزایش یافت.

رونویسی معکوس کمی(RT‑q) PCR. RNA کل از آن استخراج شدبافت کلیهبه دنبال القای مدل با استفاده از معرف TRIZol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). طبق دستورالعمل کیت رونویسی معکوس TaqMan (شماره گربه N8080234؛ Invitrogen؛ Thermo Fisher Scientific, Inc.)، RNA به cDNA معکوس رونویسی شد. شرایط ترموسایکلینگ زیر استفاده شد (miR‑214): دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه. به دنبال آن 40 چرخه دناتوراسیون در دمای 95 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، بازپخت در دمای 60 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و افزایش طول در دمای 72 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه انجام می شود. RT-qPCR با استفاده از یک سیستم تشخیص توالی ABI Prism 7500 (PerkinElmer, Inc.) و یک کیت استاندارد SYBR Green PCR (Toyobo Life Science) انجام شد. U6 به عنوان کنترل داخلی برای miR-214 استفاده شد. توالی پرایمر به شرح زیر بود: miR-214، جلو، 5'-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3' و معکوس، 5'-AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCTCAC-3'. U6، جلو، 5'‑ATTGGAACGATACAGAGAAGATT‑3' و معکوس، 5'‑GGAACGCTTCACGAATTTG‑3'. این آزمایش ها شش بار تکرار شد. نتایج با استفاده از روش 2-ΔΔCq تجزیه و تحلیل شد (14). سطوح بیان mRNA LC3، p62، PTEN، AKT و mTOR از طریق RT-qPCR ارزیابی شد. با اکتین به عنوان مرجع داخلی این ژن ها، از 2-ΔΔCq برای اندازه گیری بیان نسبی ژن های هدف استفاده شد. توالی های آغازگر نشان داده شده در جدول I توسط Sangon Biotech Co., Ltd سنتز شدند.

وسترن بلاتینگ کلیهبافت با لیزات RIPA (موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) مخلوط شد تا همگن شود و زمانی که هیچ بافت قابل مشاهده ای مشاهده نشد، لیز متوقف شد. نمونه ها در دمای 13 xg به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند و مایع رویی برای آنالیز وسترن بلات بازیابی شد. به طور خلاصه، غلظت پروتئین با استفاده از کیت سنجش پروتئین میکرو BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) تعیین شد. نمونه های پروتئینی (80 میکروگرم در هر نمونه) با کاهش 12 درصدی الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات-پلی آکریل آمیدژل جدا شدند و سپس به مدت یک شب روی غشاهای پلی وینیلیدین دی فلوراید در دمای 4 درجه سانتیگراد منتقل شدند. پروتئین های جدا شده به غشاهای PVDF منتقل شدند. پس از مسدود شدن در شیر بدون چربی 5 درصد در دمای اتاق به مدت 2 ساعت، غشاها یک شبه (در دمای 4 درجه سانتیگراد) با آنتی بادی های اولیه انکوبه شدند. آنتی بادی های اولیه زیر (همه Cell Signaling Technology, Inc.) مورد استفاده قرار گرفتند: زنجیره سبک 3B (1:1،{13}}؛ گربه شماره 4412)، p62 (1:1،{18}}؛ گربه . no. 4412), Anti-PTEN (1:1,000; Cat. No. 9188), anti-phosphorylated (p)‑AKT (Ser473) (1:1,000; cat. . no. 4060), anti-AKT (1:1,{31}}; cat. no. 9272), anti-p‑mTOR (Ser 2448) (1:1,000; cat. no. . 5536)، anti-mTOR (1:1،000؛ cat. no. 2972) and -actin (1:2،000؛ cat. no. 4970). پس از شستشو، غشاها (در دمای اتاق به مدت 2 ساعت) با آنتی بادی های ثانویه ضد خرگوش کونژوگه HRP (1:3،{49}}؛ شماره گربه A0208؛ موسسه بیوتکنولوژی Beyotime) انکوبه شدند. باندهای پروتئینی با Immobilon Western (MilliporeSigma) شناسایی و با استفاده از نرم افزار Total-Lab TL120 آنالیز شدند (Nonlinear Dynamics، 2.01). بیان پروتئین به اکتین نرمال شد.

تحلیل آماری. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از GraphPad Prism 9 انجام شد.{1}} (GraphPad Software, Inc.). همه داده ها به عنوان میانگین ± انحراف استاندارد یا میانه (محدوده های بین چارکی) برای متغیرهای پیوسته، بسته به توزیع آنها، ارائه شد. ویژگی‌های پایه و پیامدها با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه و سپس آزمون پس‌هوایی توکی، یا آزمون کروسکال-والیس و سپس آزمون دان در صورت لزوم، مقایسه شدند. پ<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

نتایج

نقطه زمانی 24 ساعت پس از CLP. مطالعات قبلی گزارش کرده اند (6،15،16) که تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی (یعنی LC3 و p62) نشان می دهد که شار اتوفاژی با پیشرفت سپسیس به دنبال 6 تا 8 ساعت CLP سرکوب می شود. در مطالعه حاضر، تعداد اتولیزوزوم ها درکلیهدر موش های تحت درمان با CLP ظرف 24 ساعت پس از جراحی افزایش یافت. علاوه بر این، تجزیه و تحلیل نشانگرهایآسیب کلیهنشان داد کهعملکرد کلیه24 ساعت پس از CLP به شدت آسیب دید. بنابراین، نقطه زمانی 24 ساعت پس از CLP برای آزمایش‌های زیر انتخاب شد.

اثر تنظیمی بر miR-214 در بافت کلیه. تجزیه و تحلیل RT-qPCR برای تشخیص بیان miR-214 در موش های تحت درمان با CLP استفاده شد. مشخص شد که بیان miR-214 کمی افزایش یافته استکلیهبافت ها پس از جراحی CLP 24 ساعت، در مقایسه با گروه شم (1.47 برابر، P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">کلیهبافت، در مقایسه با گروه شم (هر دو P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

اثر miR-214 بر اختلال عملکرد کلیه در موش‌های سپتیک.تمام موش ها برای جمع آوری خون، ادرار وکلیهنمونه ها 24 ساعت پس از جراحی CLP. BUN و Cr شاخص های مهمی از شدت بیماری هستندکلیهنقصان (17). علاوه بر این، NGAL و KIM-1 به عنوان نشانگرهای زیستی خاص شناسایی شده‌اندآسیب کلیهو افزایش بیان آنها با زودرس همراه استکلیهآسیب لوله ای در AKI (17). همانطور که در شکل 2A-D نشان داده شده است، سطوح BUN، Cr، KIM-1 و NGAL به طور قابل توجهی پس از جراحی CLP در مقایسه با گروه شم افزایش یافت. با این حال، Ad-miR-214 به طور قابل توجهی سطوح BUN، Cr، KIM-1 و NGAL را در مقایسه با گروه CLP کاهش داد (همه P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">عملکرد کلیهمولفه های. با این حال، پس از پیش درمانی با مهارکننده PTEN، اثرات محافظتی Ad-miR-214 افزایش یافت. نتایج نشان می‌دهد که miR-214 اختلال عملکرد کلیه را در موش‌های سپتیک کاهش می‌دهد.

اثر miR-214 بر التهاب کلیه و استرس اکسیداتیو.همانطور که در شکل 3A و B نشان داده شده است، CLP به طور قابل توجهی سطوح TNF- و IL-6 را افزایش داد، در حالی که Ad-miR-214 به طور قابل توجهی سطوح این نشانگرها را کاهش داد. در مقایسه با

اثر miR-214 بر اتوفاژی کلیه در موش های سپتیکمطالعه حاضر به بررسی تغییرات LC3 درکلیهبافت ها از طریق رنگ آمیزی IHC همانطور که در شکل 6 نشان داده شده است، شدت LC3 رنگ آمیزی مثبت به طور قابل توجهی در گروه CLP در مقایسه با گروه شم افزایش یافت (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">

miR-214 مسیر AKT/mTOR را برای مهار فعال می کنداتوفاژی با خاموش کردن PTEN در بافت کلیه.تاثیر CLP بر اتوفاژی درکلیهبافت ها با ارزیابی سطوح LC3-II/I و p62 مورد بررسی قرار گرفتند. مسیر سیگنالینگ PTEN/AKT/mTOR نقش مهمی در اتوفاژی دارد (18). برای بررسی اثر miR-214 بر مسیر PTEN-AKT/mTOR، سطوح پروتئین LC3-II/I، p62، AKT، p-AKT، mTOR، p-mTOR و PTEN از طریق وسترن بلات و RT- تجزیه و تحلیل شد. آنالیز qPCR. همانطور که در شکل 7A-C نشان داده شده است، تغییر در این پروتئین ها به سرعت رخ می دهد، با افزایش نرخ LC3-II/LC3-I، و کاهش سطح p62 (هر دو P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">کلیه tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). این نتایج نشان داد که اتوفاژی توسط CLP القا شده است و بیان بیش از حد miR-214 می تواند تا حدی آن را مهار کند.

همانطور که در شکل 7A و D-F نشان داده شده است، سطح بیان PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">کلیه tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). این یافته ها نشان می دهد که CLP القا می کندکلیهاتوفاژی بافت با مهار مسیر AKT/mTOR. Ad‑miR‑214 مسیر AKT/mTOR را با خاموش کردن PTEN درکلیهبافت ها با این حال، در مقایسه با گروه CLP، anti-miR-214 به طور قابل توجهی بیان mTOR را مهار نکرد. بنابراین، RT-qPCR بیشتر برای تعیین بیان mRNA ژن های مربوط به مسیر سیگنالینگ PTEN/AKT/mTOR مورد استفاده قرار گرفت. با توجه به نتایج RT-qPCR (شکل 8)، در مقایسه با گروه شم، سطوح بیان mRNA p62، LC3 و PTEN به طور قابل توجهی افزایش یافت، در حالی که بیان mRNA AKT و mTOR در گروه CLP کاهش یافت. در مقایسه با گروه CLP، Ad‑miR‑214، PTEN

بازدارنده و گروه های بازدارنده Ad-miR-214 به علاوه PTEN بیان mRNA LC3 و PTEN را کاهش دادند، اما بیان mRNA p62، AKT و mTOR را افزایش دادند (همه P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). بنابراین، تأثیر p62 بر اتوفاژی ممکن است در سطح رونویسی رخ دهد تا در سطح پس از رونویسی. نتایج فعلی نشان داد که miR-214 بیان PTEN را کاهش داد و مسیر سیگنالینگ AKT/mTOR را فعال کرد.

بحث

مطالعه حاضر نشان داد که اتوفاژی بیش از حد برای آن مضر استعملکرد کلیهدر موش های سپتیک مطالعات قبلی نشان داده اند که miR-214 با افزایش تکثیر، متاستاز، تهاجم و عملکرد به عنوان یک انکوژن برای سلول ها و بافت ها همراه است (19-22). مطالعات گزارش می دهند که miR-214 از طریق کاهش آپوپتوز، استرس اکسیداتیو و کاهش عوامل التهابی، نقش محافظتی در برابر AKI دارد (21،23). مطالعه حاضر با تمرکز بر درگیری بالقوه miR-214 در مدولاسیون اتوفاژی، مکانیسم‌های اساسی اثر محافظتی miR-214 بر AKI ناشی از سپسیس را بررسی کرد. نتایج نشان داد که استرس اکسیداتیو در منطقه رخ داده استکلیهپس از تجویز جراحی CLP. در همین حال، فعال شدن اتوفاژی در بدن رخ می دهدکلیهافزایش LC3 II/I و کاهش p62 درکلیهپس از درمان با جراحی CLP مشاهده شد. همانطور که انتظار می رفت، بیان بیش از حد miR-214 به طور قابل توجهی کاهش یافتکلیهآسیب های پاتولوژیک وکلیهاختلال عملکرد ناشی از سپسیس با این حال، مهار miR-214 تمایلی مخالف به محافظت مجدد را نشان داد. علاوه بر این، اثر محافظتی Ad-miR-214 توسط مهار کننده PTEN افزایش یافت.

در یک سپتیککلیهالتهاب بیش از حد با افزایش شدید تولید ROS همراه است و تعداد زیادی از ROS باعث ایجاد تغییراتی در ساختار میتوکندری می شود و عملکرد میتوکندری را مختل می کند که باعث می شود بدن وارد یک چرخه معیوب شود که تشدید می شود.کلیهخسارت (24،25). بنابراین، استرس اکسیداتیو ممکن است یکی از مکانیسم های پاتولوژیک اصلی AKI ناشی از سپسیس باشد. مطالعه حاضر شواهد بیشتری برای نشان دادن استرس اکسیداتیو بیش از حد ارائه کرد که با افزایش تولید MDA و کاهش فعالیت SOD درکلیهبافت ها پس از جراحی CLP علاوه بر این، مشخص شد که بیان بیش از حد miR-214 می تواند از آن محافظت کندکلیهدر برابر آسیب اکسیداتیو ناشی از CLP، که در مهار اتوفاژی نقش دارد. این با مطالعات قبلی که miR-214 سلول ها و بافت های مختلف را در برابر استرس اکسیداتیو محافظت می کند مطابقت دارد (26،27).

اتوفاژی به عنوان یک "شمشیر دولبه" در ایجاد سپسیس عمل می کند: اتوفاژی پایه می تواند با حذف پروتئین های اکسیداتیو سمی اثرات محافظتی داشته باشد، اما اتوفاژی بیش از حد ممکن است منجر به مرگ سلولی اتوفاژیک تحت استرس شدید، مانند فوران ROS شود (28،29). . نشان داده شده است که اتوفاژی در ابتدا در سپسیس فعال می شود و به دنبال آن یک مرحله بعدی از اختلال عملکرد ناشی از مرگ سلولی اتوفاژیک (30)، که آسیب اکسیداتیو ناشی از سپسیس را تشدید می کند، فعال می شود. در مطالعه حاضر، مهارکننده PTEN یا بیان بیش از حد miR-214 محافظت مجدد آنتی اکسیدانی را در موش های تحت درمان با CLP نشان داد. با این حال، مهار miR-214 تمایلی مخالف به محافظت مجدد آنتی اکسیدانی نشان داد. بنابراین اتوفاژی بیش از حد یا ناکافی می تواند باعث شودآسیب کلیه; هر دو ناسازگار هستند و در نهایت باعث مرگ سلولی می شوند. از این رو، حفظ سطوح متوسط ​​اتوفاژی کلید کاهش آسیب اکسیداتیو در شرایط سپتیک است.

سیستانچ درد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

شواهد انباشته نشان داده است که miR-214 اتوفاژی را در سلول ها و بافت های مختلف مهار می کند (31-33). در مطالعه حاضر، بیان بیش از حد miR-214 برای مهار اتوفاژی ناشی از CLP دربافت کلیه،همانطور که با تغییرات در نشانگرهای پروتئین، مانند LC3-II/I و p62 نشان داده شده است. علاوه بر این، نتایج نشان داد که بیان بیش از حد miR-214 با مهار اتوفاژی بیش از حد، آسیب اکسیداتیو ناشی از CLP را کاهش می‌دهد. مطالعه حاضر همچنین مکانیسم‌های مولکولی را که توسط miR-214 تعدیل می‌کند، بررسی کردکلیهاتوفاژی در AKI ناشی از سپسیس PTEN/AKT/mTOR یک مسیر سیگنالینگ مهم است که تنظیم می کندکلیهاتوفاژی (34،35) و نقش کلیدی در AKI ناشی از سپسیس دارد و PTEN یک مهارکننده منفی مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT/mTOR است. مطالعات قبلی گزارش کردند که miR-214 می تواند اتوفاژی را از طریق مسیر سیگنالینگ PI3K/AKT/mTOR در مدل های مختلف تنظیم کند (36-38). Ma و همکاران (39) دریافتند که miR-214 می تواند اتوفاژی را در کلیه های دیابتی کاهش دهد. بنابراین، فرض شد که اثرات miR-214 بر AKI ناشی از CLP ممکن است در تنظیم مسیر PTEN/AKT/mTOR دخیل باشد. قابل ذکر است، نتایج مطالعه حاضر نشان داد که جراحی CLP به طور قابل توجهی سطوح PTEN را افزایش داد اما سطوح p-AKT و p-mTOR را کاهش داد، که نشان می دهد جراحی CLP مسیر AKT/mTOR را غیرفعال می کند. علاوه بر این، بیان بیش از حد miR-214 مسیر AKT/mTOR را با خاموش کردن PTEN در اتوفاژی ناشی از CLP فعال کرد.کلیهبافت ها با این حال، anti-miR-214 به طور قابل توجهی بیان mTOR را در تجزیه و تحلیل وسترن بلات مهار نکرد. بنابراین، RT-qPCR بیشتر برای تعیین بیان mRNA ژن های مربوط به مسیر سیگنالینگ PTEN/AKT/mTOR مورد استفاده قرار گرفت. مطالعه حاضر مشخص کرد که miR-214 بیان PTEN را کاهش داد و مسیر سیگنالینگ AKT/mTOR را برای مهار اتوفاژی فعال کرد. با این حال، مطالعات جامع بیشتری باید برای به دست آوردن جزئیات بیشتر مربوط به مکانیسم انجام شودکلیهاتوفاژی در شرایط سپتیک

برای نتیجه گیری، نتایج مطالعه حاضر نشان داد که miR-214 نقش محافظتی در برابر سپسیس ناشی از سپسیس دارد.آسیب کلیهبا کاهش استرس اکسیداتیو و مهار اتوفاژی از طریق تنظیم مسیر PTEN/AKT/mTOR. یافته های حاضر نشان می دهد که miR-214 ممکن است یک هدف درمانی بالقوه برای AKI ناشی از سپسیس باشد. با این حال، مطالعه حاضر از موش‌های 6 تا 8 هفته استفاده کرد، بنابراین تحقیقات بیشتری در مورد مکانیسم miR-214 در موش‌های بالغ مورد نیاز است.