شواهد مولکولی پتانسیل مهاری ملاتونین در برابر NaAsO2-پیری القا شده در موش‌های صحرایی نر قسمت 2

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

3. بحث

همچنین به دلیل خواص ضد قارچی، ضد باکتریایی، علف کشی و جونده کشی به طور گسترده در کشاورزی استفاده می شود. در نتیجه استفاده گسترده از علف کش ها، آفت کش ها و آنتی بیوتیک های دامی مبتنی بر آرسنیک [28]. از سوی دیگر، MLT اثرات ضد التهابی، آنتی اکسیدانی و ضد رادیکال های آزاد را نشان داده است [29]. حذف گونه های فعال اکسیژن و نیتروژن و تقویت دفاع آنتی اکسیدانی از آسیب بافتی جلوگیری می کند و عوامل رونویسی سیتوکین های پیش التهابی را مسدود می کند [30]. همانطور که در این مطالعه نشان داده شده است MLT به به حداقل رساندن استرس اکسیداتیو ناشی از آرسنیک کمک می کند. قرار گرفتن در معرض the÷، 1/3، و 1/10 LD50 NaAsO، باعث افزایش غلظت کل بافت As در هر دو بافت قلب و ریه به صورت وابسته به دوز شد. از سوی دیگر، تیمار MLT غلظت As بافتی را کاهش داد.ساقه سیستانچMDA یک نشانگر پراکسیداسیون لیپیدی است که با افزایش ROS و نشانگرهای التهابی در مراحل اولیه مانند TNF-o، نقش کلیدی در افزایش استرس اکسیداتیو ایفا می کند [31،32]. برخلاف گروه کنترل و MLT، ما دریافتیم که قرار گرفتن در معرض NaAsO2 باعث افزایش قابل توجه وابسته به دوز در MDA و متعاقباً سطوح ROS می شود. نشان داده شد که درمان MLT سطوح MDA و ROS ناشی از NaAsO{6}} را در هر دو نمونه قلب و ریه معکوس می کند. نتایج ما مشابه نتایج تایسی و همکاران است که مشخص کردند MLT می تواند آسیب اکسیداتیو ناشی از تابش را معکوس کند [33]. HMGB1 یک سیتوکین التهابی است که در طول فاز تاخیری التهاب آزاد می شود. ما بالاترین سطح HMGB1 را در هر دو بافت قلب و ریه در معرض 1/2 LD50 NaAsO2، حتی پس از استخراج بافت در روز 30 تجزیه و تحلیل، پیدا کردیم. از سوی دیگر، درمان MLT منجر به سطوح پایین تر HMGB1 شد.

به طور مشابه، نمونه‌های پلاسمایی که در معرض 1/2، 1/3 و 1/10 LD50 NaAsO2 قرار گرفتند، سطوح بالایی از TNF- و 8OHdG را نشان دادند که توسط MLT جلوگیری شد، که نقش آن را به عنوان محافظ در برابر آسیب اکسیداتیو DNA نشان می‌دهد [34]. سطوح بالای لاکتات به عنوان یک نشانگر زیستی برای هیپوپرفیوژن بافتی و نارسایی میتوکندری استفاده می شود [35]. پس از 30 روز، افزایش سطح لاکتات در بافت‌های قلب و ریه مشاهده شد که نشان می‌دهد NaAsO اثر مخربی بر میتوکندری دارد. از سوی دیگر، مشخص شد که MLT در برابر این اثر دفاع می کند و سطح لاکتات را در هر دو بافت کاهش می دهد.

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا کلیک کنید

اثر محافظتی MLT نیز با ارزیابی سطوح بیان mRNA ژن KL، TERT و TRADD تایید شد. KL به عنوان ژنی که در روند پیری نقش دارد شناسایی شده است [36]. در موش‌ها، آرسنیت KL گردش خون و کلیوی را کاهش می‌دهد و باعث آسیب لوله‌ای می‌شود [37]. در بافت قلب در معرض NaAsO2، کاهش قابل توجهی وابسته به دوز را کشف کردیم (ص<0.0001) in="" the="" expression="" of="" mrna="" kl,="" which="" was="" recovered="" after="" mlt=""><0.0001). our="" results="" were="" similar="" to="" those="" of="" a="" study="" conducted="" on="" kl="" mutant="" mice,="" a="" genetic="" model="" of="" aging,="" in="" which="" mlt="" minimized="" oxidative="" stress="" and="" memory="" loss="" associated="" with="" kl="" deficiency="" [38].="" the="" counteracting="" effect="" of="" mlt="" on="" aging="" was="" further="" confirmed="" in="" our="" study="" by="" the="" mrna="" tert="" gene="" expression="" level.="" in="" telomeres,="" which="" are="" strongly="" conserved="" and="" susceptible="" to="" age-dependent="" gradual="" attrition="" [39],="" naaso2="" effectively="" doubled="" tert="" gene="" mrna="" expression="" in="" a="" dose-dependent="" manner.="" at="" the="" same="" time,="" mlt="" appeared="" to="" reduce="" and="" normalize="" tert="" overexpression="" in="" the="" treatment="" groups,="" indicating="" that="" mlt="" counteracts="" naaso2-induced="" heart="" tissue="" aging.="" tradd="" is="" a="" cell="" death="" gene="" that="" contributes="" to="" tissue="" aging="" by="" activating="" nf-kb="" and="" inducing="" apoptosis="" [4041].="" the="" apoptosis-inducing="" effect="" of="" naaso,="" on="" heart="" tissues,="" was="" confirmed="" by="" a="" significant="" increase="" in="" tradd="" gene="" mrna="" expression,="" which="" was="" decreased="" by="" mlt="" treatment.="" this="" indicates="" that="" mlt="" treatment="" restores="" regular="" tradd="" gene="" mrna="" expression="" and="" thus="" prevents="" heart="" tissue="" injury="" (figure="" 5).="">مزایا و عوارض جانبی cistanche tubulosaدر این مطالعه، تجویز IP هر دو دارو به روش خوراکی برای جلوگیری از تغییر و تخریب احتمالی دستگاه گوارش ترجیح داده شد. علاوه بر این، تجویز IP جذب سریع‌تر و مطمئن‌تری نسبت به خوراکی فراهم می‌کند و از فراهمی زیستی بهینه عوامل کوچک و بزرگ در مطالعات تجربی جوندگان اطمینان حاصل می‌کند [42].

چندین مطالعه و بررسی نشان می دهد که ملاتونین اثرات محافظتی قابل توجهی بالاتری نسبت به آنتی اکسیدان های کلاسیک دارد [43]. در این مطالعات، ملاتونین موثرتر از ویتامین E[44-46]، بتاکاروتن [47l و اسید اسکوربیک[48،49] بود. علاوه بر این، در محیط های بالینی، از جمله بیماری های مزمن مانند آرتریت روماتوئید [50]، فشار خون [51] و ایسکمی [52]، اثرات آنتی اکسیدانی مفید ملاتونین در مقایسه با ویتامین ها گزارش شده است. به طور مشابه، ما دریافتیم که قرار گرفتن در معرض NaAsO2 باعث استرس اکسیداتیو در ریه‌ها و بافت‌های قلب می‌شود که وابسته به دوز دارو و سمیت شیمیایی است. در سطح بالا، LD50 NaAsO2 قرار گرفتن در معرض، TNF- و 8OHdGin پلاسما و MDA، ROS، و HMGB1 در قلب و بافت ریه بالا بود. این حقایق نشان می دهد که قرار گرفتن در معرض NaAsO با تولید MDA و ROS و افزایش گردش سیتوکین های پیش التهابی مانند TNF- باعث ایجاد استرس اکسیداتیو در بافت های ریوی و قلب می شود. هیپوپرفیوژن بافتی، نارسایی میتوکندری و التهاب ممکن است به دلیل سطوح بالای لاکتات بافتی و HMGB1 ایجاد شود. افزایش سطح 8OHdG پلاسما نشان می دهد که NaAsO2 باعث آسیب DNA می شود. با توجه به تجزیه و تحلیل بافت‌شناسی، دوز 1/2 NaAsO2 در بافت‌های قلب موش‌های صحرایی باعث نکروز سلولی می‌شود که با نتایج بیان ژن TERT و TRADD همبستگی دارد و افزایش قابل‌توجهی در اثرات القای آپوپتوز آرسنیک بر بافت‌های قلب را نشان می‌دهد (شکل‌ها). 4 و 5). با این حال، با استفاده ترکیبی از MLT و NaAsO2، پاکسازی نکروز در حضور MLT بسیار قوی‌تر و سریع‌تر از غیاب آن بود. این پاکسازی با کاهش سطح بیان mRNA ژن‌های TERT و TRADD مشهود است. به طور مشابه، MLT اثرات سمی آرسنیک را در نمونه‌های ریه بررسی شده از نظر بافت‌شناسی کاهش داد، که با نتایج به‌دست‌آمده از بیومارکرهای استرس اکسیداتیو و التهابی و کاهش امتیاز پرخونی، ادم و سلول‌های التهابی همبستگی داشت (جدول 4). علاوه بر این، قرار گرفتن در معرض NaAsO2 منجر به بیان کمتر mRNA KL و بیان mRNA ژن TERT و TRADD بالاتر شد که نشان دهنده خطر پیری بافت قلب و مرگ سلولی است.

از سوی دیگر، درمان MLT باعث کاهش سطح MDA، ROS، HMGB1 و لاکتات در بافت‌های ریه و قلب و همچنین سطوح TNF-c و 8OHdG در پلاسما شد. همچنین بیان mRNA ژن KL را افزایش داد و در عین حال بیان mRNA ژن های TERT و TRADD را سرکوب کرد. این نشان می دهد که MLT با معکوس کردن خطر پیری ناشی از استرس اکسیداتیو ناشی از NaAsO از بافت های ریه و قلب محافظت می کند. با این حال، تحقیقات بیشتری برای کشف نقش محافظتی MLT در برابر پیری ناشی از آرسنیک در بافت‌های دیگر مانند کبد و کلیه و اثربخشی MLT در کاهش سطوح آرسنیک بافت مورد نیاز است.

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

4. مواد و روش ها

4.1.مواد شیمیایی

MLT (شماره CAS 73-31-4)، NaAsO2 (شماره CAS 7784-46-5)، سوپراپور HNO3 (Merck، دارمشتات، آلمان) و سایر مواد شیمیایی مورد استفاده در این مطالعه از Sigma-Aldrich (GmbH، مونیخ) خریداری شدند. ، آلمان). کیت جداسازی لاکتات و کیت ELISA برای آنالیز جعبه ۱ (HMGB1) گروه تحرک بالا از ZellBio GmbH (Ulm، مونیخ، آلمان) خریداری شد و کیت آنالیز TNF از Diaclone (Besancon Cedex، فرانسه) تهیه شد. کیت سنتز cDNA رشته اول Thermo Scientific Revert Aid از Thermo Fisher (ویلنیوس، لیتوانی) تهیه شد.

4.2. تایید اخلاقی

دست زدن به حیوانات، مراقبت، کشتن، و سایر روش‌های مربوط به حیوانات مطابق با دستورالعمل‌های Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (AR-RIVE) انجام شد. تحقیقات و آزمایش‌های بیوشیمیایی و آزمایشگاهی طبق رویه‌های آزمایشگاهی خوب انجام شد.عصاره cistanche tubulosaکمیته تحقیقاتی در موسسه ملی توسعه تحقیقات پزشکی (NIMAD) تاییدیه اخلاقی را برای این مطالعه شامل استفاده و درمان حیوانات تحت شماره کد: IR.NOMAD.REC.1397.542 ارائه کرد.

4.3. طراحی مطالعه

در این مطالعه، ما از موش‌های نر استفاده کردیم، نه ماده، زیرا تغییرات چرخه‌ای در سطح هورمون‌های ماده می‌تواند بر مطالعات سم‌شناسی تأثیر بگذارد. بنابراین، موش‌های نر بالغ سالم و بدون بیماری 30-35 گرم NMRI 7 تا 8 هفته‌ای از خانه حیوانات دانشکده داروسازی دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران تهیه شدند. آنها تحت شرایط محیطی کنترل شده از جمله دمای اتاق 20 تا 25 درجه، رطوبت نسبی 50 تا 55 درصد و دوره نور و تاریکی 12- ساعت نگهداری شدند. آنها به رژیم غذایی استاندارد و آب دسترسی آزاد داشتند. موش ها به هشت گروه شش تایی تقسیم شدند. گروه 1 یک رژیم غذایی معمولی استاندارد دریافت کرد. گروه 2 تزریق داخل صفاقی (IP) mg/kg/day 10 MLT، گروه 3، 4 و 5 1.5 (1/10 LD50)، 5 (1/3 LD50) و 7.5 (1/2 LD50) mg/kg دریافت کردند. NaAsO2 به ترتیب. گروه های 6، 7 و 8 به صورت داخل صفاقی 1.5 (1/10 LD50)، 5 (1/3 LD50) و 7.5 (1/2LD50) mg/kg NaAsO به همراه 10 mg/kg/day MLT تزریق شدند. به ترتیب در ده روز آخر آزمایش. پس از یک ماه درمان، تزریق IP 100 میلی گرم بر کیلوگرم کتامین و 10 میلی گرم بر کیلوگرم زایلازین برای کشتن موش ها استفاده شد. نمونه های خون در لوله های جداکننده EDTA و سرم جمع آوری شد. قلب‌ها و ریه‌ها فوراً برداشته و در درجه {50}} برای تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی منجمد شدند. بافت از نمونه های قلب و ریه برای بررسی پاتولوژی جمع آوری شد. پس از شستشو با بافر فسفات استریل (pH 7.4)، آنها در 10 میلی لیتر فرمالین 10 درصد نگهداری شدند (شکل 6).

4.4. ارزیابی آرسنیک کل بافت با استفاده از طیف سنج جرمی پلاسمای جفت القایی

آرسنیک کل در بافت‌های نمونه با استفاده از طیف‌سنج جرمی پلاسمای جفت القایی (ICP-MS) (Perkin Elmer ELAN 6100 DRC-e) تعیین شد. پارامترهای ابزار در جدول تکمیلی S1 ذکر شده است. دو میلی لیتر بافر فسفات به 0.20 گرم از هر نمونه اضافه شد و بافت ها کاملاً همگن شدند.بررسی cistanche tubulosaبافت های هموژن شده به لوله های آزمایش شیشه ای منتقل و در حمام ماسه در دمای 12{1} درجه (تقریباً یک شب) خشک شدند. پس از رسیدن نمونه ها به دمای اتاق، هر لوله با 0.5 میلی لیتر HNO3 غلیظ پر شد و به مدت دو روز حرارت داده شد. دما در طول فرآیند گرمایش از 120 درجه تجاوز نمی کند. سپس 0.5 میلی لیتر HNO3 غلیظ به هر لوله آزمایش اضافه شد تا خاکستر سفید باقی بماند. پس از اتمام هضم و سرد شدن محلول ها، 1 میلی لیتر HNO 10 درصد به هر لوله شیشه ای اضافه شد و به مدت 30 دقیقه در دمای 50 درجه سونیک شد. محتویات لوله های شیشه ای به یک فلاسک حجمی 5 میلی لیتری منتقل و به علامت با 10 درصد HNO3 کالیبره شد. 10 درصد HNO3 برای ساخت محلول های استاندارد با غلظت های 1، 5، 10 و 15 میکروگرم در لیتر As استفاده شد. و محلول استاندارد ژرمانیوم (5 گرم در لیتر) به عنوان محلول استاندارد داخلی استفاده شد [53].

4.5. ارزیابی بیومارکرهای استرس اکسیداتیو

سنجش ماده واکنش دهنده اسید تیوباربیتوریک (TBARS) برای اندازه گیری فعالیت پراکسیداسیون لیپیدی (LPO) با محاسبه سطوح مالون دی آلدئید (MDA) در بافت های قلب و ریه مورد استفاده قرار گرفت. نمونه‌های بافت قلب یا ریه به میزان 0.15 گرم هر کدام در بافر فسفات سالین (PBS) همگن شدند، با 800 میلی‌لیتر تری کلرواستیک اسید مخلوط شدند و به مدت 40 دقیقه در 3000 گرم سانتریفیوژ شدند. سپس 150 میلی لیتر تیوباربیتوریک اسید 1 درصد وزنی به 600 میلی لیتر رویی اضافه شد و به مدت 15 دقیقه در آب جوش قرار گرفت. در نهایت، 400 میلی لیتر n-بوتانول اضافه شد و یک اسپکتروفتومتر برای گزارش جذب در 532 نانومتر استفاده شد [54].

4.6. ارزیابی گونه های فعال اکسیژن

سطوح ROS در نمونه‌های قلب و ریه طبق پروتکلی که قبلاً شرح داده شد محاسبه شد [55]؛ 100 میلی‌گرم از هر نمونه بافت تازه قلب و ریه با محلول بافر استخراج حاوی HEPES (5 میلی‌مولار)، KCl همگن شد. (20 میلی‌مولار)، EDTA، (1 میلی‌مولار)، و ساکارز (25/0 مولار)، pH{7}}.4 در هر ویال بافر فسفات و سانتریفیوژ در 10000 گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه پس از افزودن DL-dithiothreitol. DTT، 50 میکرومولار). در مرحله بعد، مایع رویی نمونه های بافت قلب و ریه با 80 میکرولیتر بافر سنجش و 5uLof DCFH-DA(5uM) به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه 2',7'-دی کلروفلورسین مخلوط شد. دی استات (DCF-DA) یک عامل فلوروژنیک نفوذگر در سلول است که به 2'،{26}}دی کلرودی هیدروفلورسئین (DCFH) تبدیل می شود. سپس DCFH به صورت درون سلولی با استراز کاتالیز شد و ROS به 2'7'-dichlorofluorescein (DCF) اکسید شد. در نهایت، جذب DCF هر 5 دقیقه توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوان چند حالته میکروپلیتی (BioTek⑧, SynergyM HT, Winooski, VT, USA) به مدت 60 دقیقه با طیف های تحریک و انتشار به ترتیب 488 نانومتر و 525 نانومتر اندازه گیری شد. برای استانداردسازی داده‌های به‌دست‌آمده از روش ROS، هر گروه از نمونه‌های بافت رقیق‌شده برای تعیین سطح پروتئین استفاده شد. به طور خلاصه، 10 میکرولیتر معرف برادفورد به 100 uL نمونه رقیق شده اضافه شد و پس از انکوباسیون در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه، جذب هر نمونه در 595 نانومتر خوانده شد.

4.7. ارزیابی سیتوکین های پیش التهابی

سطوح سیتوکین های پیش التهابی، به عنوان مثال، TNF- در پلاسما و HMGB1 در نمونه های قلب و ریه مورد بررسی قرار گرفت. اینها به عنوان واسطه اولیه سپسیس در مراحل اولیه و اواخر شناخته می شوند [56]. سطح HMGB1 برای بافت قلب و ریه انجام شد که در دمای 80 درجه نگه داشته شدند. مقدار 100 میلی گرم از بافت قلب و ریه هر حیوان جداسازی و در بافر فسفات سالین (PBS) همگن شد. سطوح TNF- و HMGB1 طبق پروتکل سازنده اندازه‌گیری شد. میزان جذب 450 نانومتر برآورد شد.cistanche انگلستانسطوح TNF- و HMGB1 به ترتیب در pg/mg پروتئین و ng/mg پروتئین ثبت شد.

4.8. ارزیابی آسیب DNA

هشت هیدروکسی{1}دئوکسی گوانوزین (8OHdG) محصول آسیب اکسیداتیو DNA است. این یک نشانگر زیستی ضروری برای آسیب DNA است. سطوح پلاسمایی {{3}هیدروکسی{4}دئوکسی گوانوزین (8OHdG) با توجه به کیت الایزا 8OHdG (ZellBio GmbH [Ulm، آلمان]) تعیین شد.

4.9. ارزیابی سطح لاکتات

سطوح لاکتات نمونه بافتی با استفاده از کیت سنجش لاکتات رنگ سنجی مطابق پروتکل ارائه شده (ZellBio GmbH[Ulm، آلمان]) اندازه گیری شد. به طور خلاصه، 10 میلی لیتر پرکلریک اسید 8 درصد با 100 میلی گرم نمونه قلب و ریه همگن شد. منحنی استاندارد اعمال شد و به صورت mmol/mg پروتئین بافتی برای اندازه گیری سطوح لاکتات ثبت شد.

4.10. PCR رونویسی معکوس در زمان واقعی برای بیان ژن

برای تشخیص عملکرد MLT و NaAsO2 در بیان ژن در سطح mRNA، از PCR رونویسی معکوس در زمان واقعی (qRT-PCR) استفاده شد. سه ژن مرتبط با مسیرهای مولکولی مختلف، TERT، گیرنده عامل نکروز تومور دامنه مرگ مرتبط با نوع 1 (TRADD)، و KL (مربوط به فعالیت Klotho)، در این رابطه مورد ارزیابی قرار گرفتند. RNA بافت با استفاده از پروتکل محلول RNX-Plus (SinaClon، ایران) از نمونه‌های قلب منجمد استخراج شد. خلوص RNA به روش اسپکتروفتومتری توسط Thermo Scientific NanoDrop (Thermo Scientific, Boston, MA, USA) محاسبه شد. از کیت DNase I بدون RNase برای حذف DNA ژنومی استفاده شد، سپس یک میکروگرم از RNA استخراج شده به cDNA رونویسی معکوس شد. ژن های هدف با ژن گلیسرآلدئید 3-فسفات دهیدروژناز (GAPDH) به عنوان یک کنترل داخلی نرمال شده اند. سیستم LightCycler③96 (روش، ایندیاناپولیس، IN، ایالات متحده آمریکا) برای تجزیه و تحلیل qRT-PCR استفاده شد. از میکس اصلی SYBRgreen استفاده شد و qRT-PCR تحت شرایط یک سیکل در دمای 94 درجه به مدت 10 دقیقه، 40 سیکل در دمای 95 درجه به مدت 15 ثانیه و دمای بازپخت 30 و سپس 72 درجه به مدت 25 ثانیه انجام شد. نتایج بر اساس روش Pfaffle [57] گزارش شد. پرایمرهای اختصاصی مورد استفاده در مطالعه حاضر در جدول 5 نشان داده شده است.

4.11. بافت شناسی Ex Viro Evaluations

نمونه‌های بافت قلب و ریه پس از قربانی کردن حیوانات در روز سوم 0 برداشت شد، در حالی که نمونه‌های بافتی در 10 میلی‌لیتر محلول NaCl 0.9 درصد ذخیره شدند. نمونه ها به مدت 48 ساعت در فرمالین بافر خنثی 10 درصد (NBF, PH.7.26) ثابت شدند و در پارافین جاسازی شدند و به بخش های 5 میکرونی برش داده شدند. مقاطع با هماتوکسیلین-ائوزین رنگ آمیزی شدند و توسط یک معاینه کننده مستقل با استفاده از میکروسکوپ نوری (Olympus BX51؛ Olympus، توکیو، ژاپن) ارزیابی شدند.

4.12. تحلیل آماری

نتایج به صورت میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM) ارائه شد. معنی‌داری آماری با استفاده از تحلیل واریانس یک‌طرفه (ANOVA) با معنی‌داری آماری در p بررسی شد.<>

5. نتیجه گیری ها

نتیجه می‌گیریم که درمان MLT می‌تواند به کاهش پیری ناشی از استرس اکسیداتیو2-به کاهش NaAsO کمک کند. NaAsO2 با افزایش سطوح MDA، ROS، لاکتات، HMGB1، TNF-x و 8OHdG باعث استرس اکسیداتیو، التهاب، آسیب DNA و مرگ سلولی در بافت‌های ریه و قلب می‌شود که ممکن است منجر به پیری و آسیب بافت شود، همانطور که با کاهش mRNA مشهود است. سطوح بیان KL ناشی از NaAsO و افزایش بیان ژن‌های TERT و TRADD (شکل 7). درمان MLT، از سوی دیگر، سمیت وابسته به دوز NaAsO2 را کاهش داد. نشان داده شده است که MLT با کاهش خطر استرس اکسیداتیو، التهاب، آسیب DNA و عادی سازی سطوح بیان mRNA ژن های KL، TERT و TRADD، از ریه ها و قلب در برابر آسیب بافتی ناشی از NaAsO{9} و پیری محافظت می کند.

این مقاله از Molecules 2021, 26, 6603 استخراج شده است. https://doi.org/10.3390/molecules26216603 https://www.mdpi.com/journal/molecules