Natalenamides A-C، تری پپتیدهای حلقوی از Actinomadura Sp. مرتبط با موریانه. RB99

خلاصه:

در سال های اخیر، تحقیقات در مورد بیوشیمی باکتری های مرتبط با حشرات افزایش یافته است. هنگامی که این مطالعات با فرآیندهای تجزیه تحلیلی ترکیب شوند، یک استراتژی قدرتمند برای شناسایی ترکیبات جدید از نظر ساختاری و/یا بیولوژیکی ارائه می کنند. پپتیدهای حلقوی غیر ریبوزومی سنتز شده دارای طیف زیست فعالی گسترده با پتانسیل دارویی بالا هستند.

در اینجا، ما کشف سه تری پپتید حلقوی جدید را گزارش می کنیم: ناتالنامیدهای A-C (ترکیبات 1-3). این ترکیبات از براث کشت قارچ در حال رشد موریانه Actinomadura sp شناسایی شدند. RB99 با استفاده از کروماتوگرافی مایع (LC) / اشعه ماوراء بنفش (UV) / طیف سنجی جرمی (MS) روش حذف تکثیر مبتنی بر. ساختارهای شیمیایی ترکیبات جدید (1-3) با تجزیه و تحلیل روش های طیف سنجی جامع، از جمله مغناطیسی هسته ای یک بعدی (1H و 13C) و دو بعدی (1H{13}}H-COSY، HSQC، HMBC) ایجاد شد. طیف‌سنجی رزونانس (NMR)، همراه با داده‌های طیف‌سنجی جرمی یونیزاسیون الکترواسپری با وضوح بالا (HR-ESIMS). پیکربندی مطلق ترکیبات جدید با استفاده از تجزیه و تحلیل Marfey روشن شد. از طریق چندین آزمایش زیست فعالی برای تری پپتیدها، متوجه شدیم که ترکیب 3 اثرات بازدارندگی قابل توجهی بر تولید ملانین ناشی از 3-ایزوبوتیل{19}}متیل گزانتین (IBMX) نشان می‌دهد. اثر ترکیب 3 شبیه به اسید کوجیک بود، ترکیبی که به طور گسترده به عنوان یک ماده آرایشی با اثر سفید کننده پوست استفاده می شود.

پوست روشن، صاف و لطیف همیشه هدف زنان شرقی بوده است. تحقیق و توسعه عوامل سفید کننده برای محصولات مراقبت از پوست عمدتاً بر اساس مهار فعالیت تیروزیناز است.

ترکیبات حاوی حلقه‌های بنزن یا ساختارهای هیدروکسیل فنلی دارای اثرات سفید کنندگی بالقوه هستند، مانند عامل سفیدکننده رایج در حال حاضر آربوتین که می‌تواند با مهار فعالیت تیروزیناز، اثرات سفید کنندگی ایجاد کند.

و ما متوجه شدیم که Cistanche deserticola اثر سفید کنندگی دارد. ماده اصلی فعال گیاه سیستانش دسرتیکولا، گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی، نوعی ترکیب گلیکوزید طبیعی است. مطالعات نشان داده اند که گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی می توانند فعالیت تیروزیناز و تولید ملانین را در ملانوسیت های اپیدرمی انسان مهار کنند و اثر سفید کنندگی دارند. اثر بخشی عامل

پودر عصاره cistanche tubulosa را کلیک کنید

کلید واژه ها:

موریانه رشد قارچ؛ Actinomadura sp.; تری پپتیدها؛ ناتالنامیدهای A-C. اثرات سفید کننده پوست

1. معرفی

تجزیه و تحلیل شیمیایی همزیست‌های باکتریایی محافظ حشرات کشاورزی در سال‌های اخیر توجه زیادی را در بین شیمی‌دانان محصولات طبیعی به خود جلب کرده است [1-5]. با استفاده از پیشرفته‌ترین فرآیندهای رزونانس مغناطیسی هسته‌ای (NMR)/ طیف‌سنجی جرمی (MS) و سنجش‌های زیستی مرتبط با زیست محیطی، مقدار قابل توجهی از محصولات طبیعی ساختاری جذاب، از جمله چندین پپتید حلقوی سنتز شده غیرریبوزومی، کشف شده‌اند. از همزیست های میکروبی [6]. برجسته‌ترین نمونه‌ها عبارتند از دنتی‌گرومایسین ضدقارچی، یک دپسی پپتید حلقوی جدا شده از قارچ‌های قارچ‌کشنده مرتبط با مورچه‌های Pseudonocardia sp. [7]، و ژرومایسین های A-C، دپسی پپتیدهای حلقوی حاوی اسید پیپرازیک شناسایی شده از Pseudonocardia sp. [8].

نشان داده شده است که پپتیدهای حلقوی طیف گسترده ای از فعالیت های بیولوژیکی را نشان می دهند و چندین رویکرد مصنوعی را به سمت این ساختارهای دارویی امیدوارکننده تقویت می کنند [9-12]. بیش از 40 داروی پپتید حلقوی در حال حاضر به بازار عرضه می شود و به طور گسترده در محیط های بالینی مورد استفاده قرار می گیرد و تقریباً یک داروی پپتید حلقوی جدید هر سال به طور متوسط ​​وارد بازار می شود [13].

به عنوان بخشی از تلاش مداوم ما برای شناسایی متابولیت های ثانویه ساختاری جدید و/یا زیست فعال از میکروب های مرتبط با موریانه [14-17]، ما بر روی Actinomadura sp مرتبط با موریانه تمرکز کردیم. RB99، جدا شده از موریانه در حال رشد قارچ، Macrotermes natalensis. استراتژی حذف تکثیر مبتنی بر کروماتوگرافی مایع (LC) / اشعه ماوراء بنفش (UV) / طیف سنجی جرمی (MS) محصولات طبیعی زیست فعال بالقوه جدیدی را به همراه داشت. در این مطالعه، ما جداسازی و شناسایی شیمیایی سه تری پپتید حلقوی جدید، ناتالنامید A-C (ترکیبات 1-3، شکل 1) را با استفاده از روش حذف تکثیر مبتنی بر LC/UV/MS و همچنین ارزیابی‌های بیولوژیکی آنها برای سیتوتوکسیک گزارش می‌کنیم. ، فعالیت های ضد التهابی و سفید کننده پوست.

2. نتایج و بحث

2.1. کروماتوگرافی مایع (LC) / اشعه ماوراء بنفش (UV) / جداسازی بر اساس طیف سنجی جرمی (MS) از ترکیبات 1-3

Actinomadura sp. RB99 از سطح یک موریانه کارگر (M. natalensis) جدا شد. تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک یک توالی تقریباً کامل ریبونوکلئیک اسید ریبوزومی 16S (rRNA) نشان می‌دهد که سویه RB99 متعلق به جنس Actinomadura، با نزدیک‌ترین همسایه Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T است. تجزیه و تحلیل بعدی بر اساس LC/UV/MS عصاره های کشت غنی شده مجموعه ای از جذب های مشخصه UV با پیک های یون مولکولی منحصر به فرد حاوی اتم های نیتروژن را نشان داد.

برای شناسایی متابولیت های مربوطه و بررسی فعالیت آنها، تخمیر در مقیاس بزرگ با استفاده از شرایط رشد بهینه (100 صفحه آگار از 2 لیتر ISP2 آگار، pH 6، 10 روز در دمای 30 درجه سانتیگراد) و یک روش کار و پیش تصفیه ایجاد شد. اعمال شد [17]. شکنش متعاقب آن با هدایت LC-UV/MS و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا نیمه آماده سازی تکراری (HPLC) منجر به جداسازی سه متابولیت با الگوی منحصر به فرد NMR/MS شد. ما مطالعات رشد و رسانه را با استفاده از نمک های مختلف (NaCl، KBr 1-3 درصد) و ترکیبات رسانه ای (ISP{16}} رسانه) برای تقلید از محیط طبیعی و تحریک تولید متابولیت انجام دادیم، که همچنین منجر به حضور سه ماده جدید شد. متابولیت ها (شکل تکمیلی S19 را ببینید).

2.2. توضیح ساختاری ترکیبات

Natalenamide A (1) به عنوان یک پودر آمورف به دست آمد. فرمول مولکولی 1 C19H25N3O5 از یون مولکولی افزوده شده با سدیم در m/z 398.1691 [M به علاوه Na] بعلاوه (محاسبه شده برای C19H25N3O5Na، 398.1692) با استفاده از حالت یون مثبت با وضوح بالا (الکترواسپری اسپری جرمی با وضوح بالا) تعیین شد. داده های ESIMS طیف مادون قرمز (IR) یک باند جذب قوی در 1670 سانتی‌متر-1 نشان داد که نشان‌دهنده وجود گروه‌های آمید در مولکول است. تجزیه و تحلیل دقیق داده‌های 1H NMR از 1 (جدول 1) سیگنال‌های معمولی یک اسکلت پپتیدی را نشان می‌دهد که دو سیگنال متیل را نشان می‌دهد (δH 0.91 (3H, d, J=7).{29} }} هرتز، H-3) و 0.92 (3H، d، J=7.0 هرتز، H{-4))، سه سیگنال متیلن (δH 1.95 (1H، m، H{38}}a)، 2.27 (1H، m، H{42}}a)، 2.36 (1H، m، H{46}}b)، 2.48 (1H , m, H{{50}}b), 2.97 (1H, dd, J=14.0, 8.{0 Hz, H{{58} }a), and 3.20 (1H, dd, J {= 14.0, 5.0 Hz, H{-12}b)), چهار سیگنال متین (δH 2.02 (1H) ، m، H-2)، 4.16 (1H، d، J=7.5 Hz، H-1)، 4.20 (1H، dd، J=8}.5، 4.5 هرتز، H-6)، و 4.63 (1H، dd، J=8.0، 5.0 Hz، H{-11))، و پنج پروتون آروماتیک همپوشانی (δH 7.18 (1H، m، H-16)، 7.23 (2H، m، H{100}}/18)، و 7.24 (2H، m، H{105}}/17)).

طیف 13C NMR (جدول 1)، با کمک طیف‌های HSQC و HMBC، مجموعا 19 تشدید کربن مسئول دو سیگنال متیل (δC 18.9 و 19.9)، سه سیگنال متیلن (δC 27) را نشان داد.{8}}، 30.6، و 38.8)، نه سیگنال متین (δC 32.1، 55.6، 58.0، 60.4، 127.8، 129.5 (×2) و 130.6 (×2))، شامل پنج کربن معطر، یک کاربن اولفینی سیگنال (δC 138.8)، و چهار سیگنال کربن کربونیل (δC 173.2، 173.3، 174.8، و 181.3). همراه با داده های طیف سنجی فوق، بازرسی دقیق NMR دو بعدی (2D) (1H{42}}H COSY، HSQC، و HMBC آزمایشات) حضور سه آمینو اسید را در 1 نشان داد: گلوتامات (Glu)، فنیل آلانین ( Phe) و والین (Val) (شکل 2). اتصال این اسیدهای آمینه با همبستگی HMBC H{45}}/C{46}} و C{47}}، H{48}}/C-10 و C{ تعیین شد. {50}}، و H-6/C-5 و C-10 (شکل 2).

برای شناسایی پیکربندی مطلق 1، از روش مارفی برای تعیین استریوشیمی مضرب -H (C-1، C{3}} و C-11) استفاده شد. هیدرولیزهای اسیدی 1 و اسیدهای آمینه استاندارد (L/D-Glu، Phe و Val) با 1-فلورو-2،{9}}دینیتروفنیل{10}}ال-آلانین مشتق شدند. آمید (L-FDAA). به طور متوالی، مخلوط مشتق شده از 1 و اسیدهای آمینه استاندارد توسط LC/MS برای بررسی زمان ماند آنها تجزیه و تحلیل شد. پیکربندی‌های مطلق بخش‌های Glu، Phe، و Val بر اساس زمان‌های ماند مشتقات L-FDAA 1 در مقایسه با آمینو اسیدهای استاندارد، همگی به شکل L تعیین شدند. بنابراین، ساختار 1 به عنوان سه پپتید حلقوی نشان داده شده در شکل 1 روشن شد.

Natalenamide B (2) به عنوان پودر آمورف جدا شد. فرمول مولکولی آن (C20H27N3O5) از قله های یونی مولکولی هیدروژن و سدیم در 390.2032 [M به علاوه H] به علاوه (محاسبه شده برای C20H28N3O5 ، 390.2029) و 412.1849 [M Plus NA] به علاوه ، 412.1849 [M به علاوه) برای C20H27NO5NA محاسبه شده است (محاسبه شده است) در مقایسه با فرمول مولکولی و داده های طیفی NMR 1، ترکیب 2 به نظر می رسد که دارای یک گروه CH2 اضافی در اسکلت پپتیدی باشد. بررسی جامع طیف های یک بعدی (1D) (1H و 13C NMR) و 2D NMR (1H-1H COSY، TOCSY، HSQC، و HMBC) طیف 2، وجود سه باقی مانده اسید آمینه را نشان داد: Glu، Phe، و Leu. (لوسین). توالی این اسیدهای آمینه بر اساس همبستگی های HMBC H-1/C{34}} و C-20، H-12/C-11 و C ساخته شد. -20، و H-7/C-6 و C-11 (شکل 2). برای تعیین پیکربندی مطلق 2، مشتق‌سازی باقی‌مانده‌های Glu، Phe و Leu با L-FDAA انجام شد و سپس با LC/MS آنالیز شد. در داده‌های LC/MS، L-Glu، L-Phe و L-Leu با مقایسه زمان‌های ماند برای مشتقات L-FDAA 2 با آمینو اسیدهای استاندارد شناسایی شدند. بنابراین، ساختار شیمیایی 2 به عنوان تری پپتید حلقوی نشان داده شده در شکل 1 ایجاد شد.

داده‌های حالت مثبت HR-ESIMS ناتالنامید C (3) یون‌های مولکولی هیدروژن و سدیم القا شده را در 424.1870 [M به علاوه H] به علاوه (محاسبه‌شده برای C23H26N3O5، 424.1872) و 446.1694 [McalH25N3N] به علاوه 446.1694 [McalH25N] به علاوه 3O3 نشان داد. 424.1692). این نشان می دهد که فرمول مولکولی آن C23H25N3O5 است. تجزیه و تحلیل دقیق طیف های 1D و 2D NMR 3 نشان داد که ساختار شیمیایی آن شبیه به 2 است، به جز اینکه Leu با Phe در 3 جایگزین شده است. اتصال سه اسید آمینه شناسایی شده در 3 با استفاده از همبستگی HMBC تأیید شد. H{30}}/C-9 و C-23، H-15/C-14 و C-23، و H-10/ C{37}} و C{38}} (شکل 2). با اعمال روش مارفی در ترکیب 3، پیکربندی مطلق مضرب -H (C-1، C{43}} و C-15) یک L-Glu و دو L مشخص شد. -نقاط Phe. بر این اساس، ساختار کامل 3 مطابق شکل 1 تعیین شد.

Natalenamides A-C پپتیدهای سه حلقه ای هستند که احتمالاً منشأ غیر ریبوزومی دارند. در حال حاضر، چندین تری پپتید حلقوی زیست فعال به عنوان محصولات طبیعی مشخص شده اند: تری پپتیدهای حلقوی عضو سیتوتوکسیک 17- (به عنوان مثال، OF4949 I-IV) جدا شده از Penicillium rugulose [18]. اسکلروتومی های ضد قارچ A-K، شناسایی شده از آبگوشت تخمیر باکتری های هالوتولرانت [10]. و E سایکروفیل ضد تکثیر، جدا شده از کشت مخلوط دو سویه قارچی مشتق از جلبک دریایی از جنس Aspergillus [19].

2.3. فعالیت های بیولوژیکی ترکیبات 1-3

از آنجایی که گزارش شده است که پپتیدهای حلقوی طیف وسیعی از فعالیت‌های بیولوژیکی را نشان می‌دهند، اثرات بیولوژیکی تری پپتیدهای حلقوی جدا شده ({0}}) با استفاده از سه فعالیت زیستی ارزیابی شد. سمیت سلولی ترکیبات 1-3 در برابر چهار رده سلولی سرطانی (سلول‌های سرطان سینه MCE7، سلول‌های سرطان دهانه رحم HeLa، سلول‌های سرطانی ریه انسان A549 و سلول‌های سرطان کبد HepG2) در غلظت‌های مختلف ({31}}، 6.25) مورد بررسی قرار گرفت. ، 12.5، 25، 50 و 100 میکرومولار). ترکیب 1 روی زنده ماندن سلول‌های MCF{14}}، HeLa یا A549 تأثیری نداشت. با این حال، تیمار سلول های HepG2 با 100 مولار از ترکیب 1، زنده ماندن سلول را به 78.5 به علاوه 3.2 درصد کاهش داد (شکل 3). ترکیب 2 قابلیت زیست سلولی سلول های HeLa و A549 را به ترتیب به 82.{27}}.1 درصد و 73.{30}}.0 درصد کاهش داد، اما بر زنده ماندن MCF-7 یا تأثیری نداشت. سلول های HepG2 (شکل 3). ترکیب 3 روی زنده ماندن هیچ یک از رده های سلولی تأثیری نداشت (شکل 3).

در مرحله بعد، ماکروفاژهای RAW264.7 برای بررسی اثرات ضد التهابی ترکیبات جدا شده استفاده شدند. برای حذف خطا در تولید NO ناشی از تغییر نرخ بقای سلول، غلظت غیر سمی هر ترکیب مورد بررسی قرار گرفت. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، ترکیبات 1-3 اثرات سیتوتوکسیک کمی در سلول های RAW264.7 داشتند (شکل 4A-C) و هیچ اثر مهاری بر تولید NO در سلول های RAW264.7 تحریک شده با لیپوپلی ساکارید (LPS) نداشتند (شکل 4D-F). .

اثرات مهاری ترکیبات 1-3 بر روی محتوای ملانین در سلول‌های B16F10 به عنوان شواهدی از فعالیت‌های سفیدکننده پوست مورد بررسی قرار گرفت (شکل 5). از آنجایی که تغییرات در زنده ماندن سلول باعث ایجاد خطا در تولید و اندازه گیری ملانین می شود، ابتدا اثرات ترکیبات 1-3 را بر بقای سلول B16F10 بررسی کردیم. ترکیبات 1-3 هیچ اثر سیتوتوکسیک در سلول های B16F10 در هیچ یک از غلظت های استفاده شده اعمال نکردند (شکل 5A-C). سپس اثرات بازدارندگی ترکیبات را بر تولید ملانین ناشی از 3-ایزوبوتیل{16}}متیل گزانتین (IBMX) در سلول‌های B16F10 ارزیابی کردیم (شکل 5D-F). IBMX، یک محرک شناخته شده ملانوژنز، باعث افزایش قابل توجهی در تولید ملانین به دنبال یک درمان واحد در سلول های ملانوما می شود. در میان ترکیبات ارزیابی شده، ترکیب 3 (در 5-100 میکرومولار) اثرات مهاری قابل توجهی بر سنتز ملانین با واسطه IBMX به روشی وابسته به دوز نشان داد. اسید کوجیک، کنترل مثبت ما، به طور گسترده به عنوان یک ماده آرایشی با اثرات سفید کننده پوست استفاده شده است [20]. اثر مهاری ترکیب 3 بر تولید ملانین ناشی از IBMX شبیه به اسید کوجیک بود (شکل 5F)، که نشان می دهد ترکیب 3 به عنوان یک مهارکننده قوی تولید ملانین ناشی از IBMX در سلول های ملانوما B16F10 عمل می کند.

علاوه بر این، ترکیب 3 با تعداد کمی ناخالصی آلوده شد که با تفسیر داده‌های طیف‌سنجی NMR و آنالیز LC/MS (مواد تکمیلی، شکل‌های S11-S15 و S23) مشخص شد که آنالوگ اسیدهای چرب هستند. برای شناسایی فعالیت ناخالصی‌ها، آزمایش‌های بیشتری با آنالوگ‌های اسید چرب برای اثرات بازدارنده آن‌ها بر تولید ملانین ناشی از IBMX در سلول‌های B16F10 انجام شد که نشان داد ترکیبات آزمایش شده هیچ اثر سفید کنندگی ندارند (مواد تکمیلی، شکل S24). بنابراین، اگرچه نمی‌توانیم ناخالصی‌های ترکیب 3 را رد کنیم که مسئول اثر بازدارندگی بر تولید ملانین ناشی از IBMX هستند، این امر بعید به نظر می‌رسد.

3. مواد و روشها

3.1. رویه های تجربی عمومی

طیف‌های مادون قرمز در طیف‌سنج Bruker IFS-66/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA) به دست آمد. یونیزاسیون الکترواسپری و طیف‌های HR-ESIMS بر روی یک طیف‌سنج جرمی کروماتوگرافی مایع SI{3}}/LCQ DecaXP (LC) اندازه‌گیری شد (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). طیف‌های NMR، شامل آزمایش‌های 1H-1H COSY، HSQC و HMBC، با استفاده از طیف‌سنج Varian UNITY INOVA 800 NMR (Varian، Palo Alto، CA، USA) که در 800 مگاهرتز (1H) و 200 مگاهرتز (13C) کار می‌کند، انجام شد. تغییرات شیمیایی در ppm (δ) داده شده است. HPLC آماده سازی از پمپ HPLC دودویی Waters 1525 با آشکارساز آرایه فتودیود Waters 996 (Waters Corporation، Milford، CT، ایالات متحده آمریکا) استفاده کرد. سیلیکاژل 60 (مش 230-400، Merck، Kenilworth، NJ، ایالات متحده) و ژل سیلیکا RP-C18 (مش 230-400، Merck، برای کروماتوگرافی ستونی استفاده شد. HPLC نیمه آماده از یک سیستم HPLC Prominence Shimadzu با SPD{ {22}}آشکارگرهای پررنگ HPLC سری A/20AV با فرابنفش مرئی (UV-Vis) (Shimadzu، توکیو، ژاپن). تجزیه و تحلیل‌های LC/MS بر روی یک سیستم HPLC Agilent سری 1200 (Agilent Technologies، Santa Clara، CA، ایالات متحده آمریکا) مجهز به آشکارساز آرایه دیود و طیف‌سنج جرمی ESI سری 6130 با کینتکس تحلیلی (4.6 × 100 میلی‌متر، 3.5 میکرومتر). صفحات F254 سیلیکا ژل پیش‌پوشیده مرک و صفحات RP{33}} F254s برای نازک استفاده شدند. کروماتوگرافی لایه ای (TLC) لکه ها بر روی TLC تحت نور UV یا با حرارت دادن پس از پاشش با محلول آنیسالدئید-سولفوریک اسید شناسایی شدند.

3.2. مواد میکروبی

Actinomadura sp. RB99 از سطح یک کارگر موریانه از جنس M. natalensis (مستعمره Mn103، GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) در 2 ژانویه جدا شد. {13}}10. مواد زیستی در کیسه های پلاستیکی تمیز قرار داده شد و ظرف یک روز پس از جمع آوری پردازش شد. موریانه ها در آب استریل دیونیزه شسته شدند و باکتری ها با آبکاری سوسپانسیون های به دست آمده روی محیط های کم مغذی با کیتین (در هر لیتر: 4 گرم کیتین، 0.7 گرم K2HPO4، 0.3 گرم) جدا شدند. KH2PO4، 0.5 گرم MgSO4·5H2O، 0.01 گرم FeSO4·7H2O، 0.001 گرم ZnSO4، 0.001 گرم MnCl2، و 20 گرم آگار) [21]. جدایه های با مورفولوژی شبه اکتینوباکتریا به آگار ISP2 (در هر لیتر: 10 گرم عصاره مالت، 4 گرم عصاره مخمر، 4 گرم گلوکز و 20 گرم آگار) منتقل شدند و تا زمانی که جدایه های خالص به دست آمد، زیر کشت قرار گرفتند.

3.3. استخراج DNA و تقویت واکنش زنجیره ای پلیمراز

Actinomadura sp. RB99 در محیط مایع غنی از مواد مغذی ISP2 به مدت پنج تا هفت روز در دمای 30 درجه سانتیگراد رشد داده شد. سلول ها برداشت شدند و DNA ژنومی با استفاده از کیت خالص سازی DNA ژنومی GenJet (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) با پیروی از دستورالعمل های سازنده با تغییرات زیر استخراج شد: (الف) درمان لیزوزیم تا 40 دقیقه افزایش یافت و (ب) درمان پروتئیناز K به 40 دقیقه افزایش یافت. DNA با استفاده از یک طیف‌سنج Nanodrop Lite (Thermo Scientific) به صورت فتومتریک اندازه‌گیری شد.

برای مطالعات فیلوژنتیک، ژن 16S rRNA با استفاده از مجموعه پرایمر، 1492R/27F تکثیر شد. هر واکنش تقویتی در حجم واکنش نهایی 25 میکرولیتری حاوی 25/7 میکرولیتر آب مقطر، 5 میکرولیتر بافر HF، 5 میکرولیتر از هر آغازگر (2.5 میکرومولار)، {{1{13}}}}}.5 میکرولیتر dNTPs تهیه شد. (10 µM)، 0.25 µL DNA پلیمراز با وفاداری بالا (New England Biolabs، Ipswich، MA، ایالات متحده)، و 2 µL DNA استخراج‌شده (الگو). واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) تحت شرایط زیر انجام شد: 98 ◦C به مدت 38 ثانیه. 32 چرخه 98 ◦ برای 30 ثانیه، 52 ◦C برای 45 ثانیه، 72 ◦C برای 1 دقیقه و 20 ثانیه؛ و تمدید نهایی 72 ◦C به مدت 8 دقیقه. محصول PCR با الکتروفورز ژل آگارز مشاهده شد و واکنش های PCR با استفاده از کیت خالص سازی PCR (Thermo Scientific) خالص شد. قطعات DNA در GATC (کنستانز، آلمان) توالی یابی شدند.

3.4. توالی یابی و شناسایی گونه ها

توالی ها از نظر خلوص و عدم تطابق با استفاده از BioEdit [22] ارزیابی شدند. توالی‌های رو به جلو و معکوس به‌دست‌آمده برای هر سویه با BioEdit مونتاژ شدند و با استفاده از DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html) برای واهی‌ها آزمایش شدند. توالی های حاصل در GenBank (شماره دسترسی: KY558684) سپرده شد. تجزیه و تحلیل انفجار با توالی‌های تقریباً کامل 16S rRNA (1368 جفت باز) با استفاده از پایگاه داده مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (NCBI) (توالی‌های RNA مرجع) انجام شد. نتایج نشان داد که سویه RB99 عضوی از جنس Actinomadura است. دنباله‌های 1{13}} بازدید اول از پایگاه داده NCBI دانلود شد و با توالی 16S rRNA Actinomadura sp. RB99 با استفاده از سرویس همترازی توالی‌های سینا [23]. دو درخت فیلوژنتیک مختلف با الگوریتم‌های همسایه یا حداکثر احتمال با استفاده از نرم‌افزار MEGA نسخه 7.0.26 [24-26] بازسازی شدند. مدل فاصله تکاملی Tamura و Nei برای تولید ماتریس‌های فاصله تکاملی برای الگوریتم‌های حداکثر احتمال و همسایگی، با حذف شکاف‌های کامل و داده‌های از دست رفته استفاده شد [27]. برای الگوریتم حداکثر احتمال، از توزیع گامای گسسته استفاده شد (به علاوه G)، و مدل تغییرات نرخ به برخی از سایت‌ها اجازه داد که از نظر تکاملی تغییر ناپذیر باشند (به علاوه I). برای الگوریتم پیوستن به همسایه، تغییرات نرخ بین سایت‌ها با توزیع گاما (به علاوه G) مدل‌سازی شد. مقادیر اطمینان گره ها با تجزیه و تحلیل بوت استرپ بر اساس 1000 مرحله نمونه گیری مجدد ارزیابی شد [28].

3.5. استخراج و جداسازی

Actinomadura sp. RB99 در 5{55}} میلی‌لیتر براث ISP2 به مدت هفت روز در دمای 30 ◦C (پیش کشت) رشد داده شد و برای تلقیح 1{00 پلیت آگار ISP2 استفاده شد. پلیت ها به مدت 10 روز در دمای 30 درجه سانتیگراد انکوبه شدند، به قطعات کوچک بریده شدند، یکپارچه شدند و یک شب در MeOH غوطه ور شدند. فاز MeOH فیلتر شده و تحت فشار کاهش یافته تبخیر شد. عصاره MeOH (20 گرم) در آب مقطر (700 میلی لیتر) حل شد و سپس با EtOAc (700 میلی لیتر) سه بار با حلال تقسیم شد و 1.1 گرم باقیمانده به دست آمد. کسر محلول در EtOAc (1.1 گرم) از عصاره MeOH برای کروماتوگرافی روی یک ستون سیلیکا ژل (مش 230-400) بارگذاری شد و با یک سیستم حلال گرادیان CH2Cl{21}}MeOH (100:1 تا 1): 1، v/v). این شش بخش (A-F) را ارائه کرد که تحت آنالیز مبتنی بر LC-UV/MS قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل حذف با استفاده از یک کتابخانه طیفی UV داخلی وجود آنالوگ های پپتیدی جزئی را در کسر E نشان داد. این الگوی UV ساده در حدود 220 نانومتر و قله های یون فرمول مولکولی منحصر به فرد حاوی اتم های نیتروژن را نشان می دهد. کسر قطبی E (233 میلی‌گرم) توسط HPLC آماده‌سازی فاز معکوس (Phenomenex Luna C18، 250 × 21.2 میلی‌متر، 5 میکرومتر، Torrance، CA، ایالات متحده آمریکا) با استفاده از CH3CN/H2O (1:9 تا 9:1، v) تکه تکه شد. /v، سیستم گرادیان، سرعت جریان: 5 میلی لیتر در دقیقه) برای تولید پنج بخش فرعی (E1-E5). بخش فرعی E2 (27 میلی گرم) با یک HPLC نیمه آماده سازی فاز معکوس (Phenomenex Luna C18، 250 × 10.0 میلی متر ID، 5 میکرومتر) با 33 درصد MeOH/H2O (سیستم ایزوکراتیک، سرعت جریان: 2 میلی لیتر در دقیقه) خالص شد. ) برای تولید ترکیب 1 (5.8 میلی گرم، tR=57.0 دقیقه). ترکیبات 2 (1.6 میلی گرم، tR=42.0 دقیقه) و 3 (1.5 میلی گرم، tR=55.0 دقیقه) از زیر بخش E3 (15 میلی گرم) با فاز معکوس نیمه آماده سازی جدا شدند. HPLC با شستشوی 43 درصد MeOH/H2O (سیستم ایزوکراتیک، سرعت جریان: 2 میلی لیتر در دقیقه).

3.5.1. ناتالنامید A (1)

3.5.2. Natalenamide B (2)

3.5.3. ناتالنامید C (3)

3.6. هیدرولیز اسیدی ترکیبات 1-3

مقدار کل 0.4 میلی گرم از هر ترکیب (1-3) با 6 N HCl (500 میکرولیتر) به مدت 1 ساعت در دمای 110 درجه سانتیگراد هیدرولیز شد. پس از خنک شدن تا دمای اتاق، هیدرولیزهای 1-3 تبخیر شدند تا اثری از HCl حذف شود. آب مقطر (500 میکرولیتر) به مخلوط های هیدرولیز اضافه شد و سپس برای حذف اثری از HCl تبخیر شد. این فرآیند سه بار انجام شد.

3.7. تعیین پیکربندی مطلق اسیدهای آمینه در 1-3

مخلوط هیدرولیزات (1-3)، و همچنین اسیدهای آمینه استاندارد (L/D-Leu، Glu، Phe، و Val)، در 1 N NaHCO3 (1{21}} 0 µL) حل شده و سپس تیمار شدند. با 50 میکرولیتر L-FDAA (10 میلی گرم در میلی لیتر در استون). هر کدام از هیدرولیزها به مدت 10 دقیقه در دمای 80 درجه سانتیگراد حرارت داده شدند. هر مخلوط با 2 N HCl (50 µL) خاموش شد و در خلاء تغلیظ شد. باقیمانده در 300 میکرولیتر MeOH حل شد. هر مقدار (5 میکرولیتر) به دست آمده از مخلوط های هیدرولیز مستقیماً به LC/MS (Phenomenex Luna C18، 4.6 × 100 میلی متر، 3.5 میکرومتر، سرعت جریان 0.3 میلی لیتر در دقیقه) و یک اسکن کامل در مثبت و منفی تزریق شد. حالت‌های یونی (محدوده اسکن از m/z 100 تا 1000) برای شناسایی زمان‌های ماند اسیدهای آمینه مشتق‌شده از L-FDAA استفاده شد.

فاز متحرک، متشکل از اسید فرمیک در آب مقطر ({{0}}.1 درصد V/V) (A) و استونیتریل (B) با سیستم حلال گرادیان به شرح زیر انجام شد: 20-40 درصد (B) برای 10 دقیقه، 100 درصد (B) ایزوکراتیک برای 5 دقیقه، و سپس 20 درصد (B) ایزوکراتیک به مدت 5 دقیقه، برای انجام یک روش شستشوی پس از اجرا برای ستون. زمان نگهداری اسیدهای آمینه مشتق شده L-FDAA که به عنوان استاندارد استفاده می شوند 16.7 دقیقه (L-Glu، m/z 400 [M به علاوه H] به علاوه)، 18.2 دقیقه (D-Glu، m/z 400 [M به علاوه H] به علاوه)، 22.1 دقیقه (L-Val، m/z 370 [M به علاوه H] پلاس)، 25.1 دقیقه (D-Val، m/z 370 [M به علاوه H] پلاس)، 25.6 دقیقه (L-Phe، m/ z 418 [M به علاوه H] به علاوه)، 27.0 دقیقه (D-Phe، m/z 418 [M به علاوه H] به علاوه)، 25.5 دقیقه (L-Leu، m/z 384 [M به علاوه H] پلاس)، و 28.2 دقیقه (D-Leu، m/z 384 [M به علاوه H] به علاوه). زمان ماند هیدرولیزهای مشتق شده از 1-3 L-Glu (16.9 دقیقه)، L-Phe (25.7 دقیقه)، و L-Val (22.5 دقیقه) از 1 بود. L-Glu (16.7 دقیقه)، L-Phe (25.7 دقیقه)، و L-Leu (25.6 دقیقه) از 2. و L-Glu (16.9 دقیقه) و L-Phe (25.7 دقیقه) از 3.

3.8. سنجش سیتوتوکسیک با استفاده از سلول های سرطانی

سلول های MCF7، HeLa و A549 از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (Rockville، MD، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. سلول های HepG2 از بانک خط سلولی کره (سئول، کره) خریداری شدند. سلول های MCF7 در محیط کشت 1640 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی کشت داده شدند. سلول‌های HeLa و A549 در محیط حداقل ضروری Dulbecco (DMEM، Cellgro، Manassas، VA، USA) همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی کشت داده شدند. سلول های HepG2 در محیط حداقل ضروری حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی کشت داده شدند. شرایط کشت در دمای 37 درجه سانتیگراد در اتمسفر مرطوب حاوی 5 درصد CO2 حفظ شد. سمیت سلولی بر روی این چهار رده سلولی انسانی (MCF7، HeLa، A549، و HepG2) با استفاده از کیت سنجش حیات سلولی EZ-CyTox (آزمایشگاه‌های Dojindo، کوماموتو، ژاپن) آزمایش شد. به طور خلاصه، 5 × 103 سلول / چاه در 96- صفحات چاه کاشته شد. پس از 24 ساعت، سلول ها با ترکیبات در غلظت های نشان داده شده تیمار شدند. پس از 72 ساعت انکوباسیون، کیت سنجش حیات سلولی EZ-CyTox استفاده شد. پس از 2 ساعت انکوباسیون، جذب در 450 نانومتر با مرجع در 620 نانومتر اندازه‌گیری شد. زنده ماندن سلول به عنوان درصد کنترل محاسبه شد.

3.9. فعالیت ضد التهابی

رده سلولی ماکروفاژ موش RAW264.7 از مجموعه کشت نوع آمریکایی خریداری شد. سلول ها در DMEM حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (FBS)، 100 واحد در میلی لیتر پنی سیلین و 100 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین کشت داده شدند و در دمای 37 درجه سانتیگراد در یک اتمسفر مرطوب با 5 درصد CO2 انکوبه شدند. بقای سلولی با استفاده از کیت تشخیص زنده ماندن سلولی Ez-Cytox اندازه گیری شد. سلول ها در صفحات چاهک با غلظت 2500 سلول در هر چاه به مدت 24 ساعت انکوبه شدند و با غلظت های مشخص شده از ترکیبات 1-3 به مدت 24 ساعت تیمار شدند. سپس به هر چاهک، معرف Ez-Cytox اضافه شد. چگالی نوری در 450 نانومتر پس از 1 ساعت با استفاده از یک میکروپلیت خوان (PowerWave XS؛ Bio-Tek Instruments، Winooski، VT، ایالات متحده آمریکا) برای تخمین زنده ماندن سلول اندازه گیری شد. در یک آزمایش جداگانه، سلول‌های RAW264.7 در 96-صفحه‌های چاهک با غلظت 30،000 سلول در هر چاه به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. پس از گرسنگی سرم به مدت 12 ساعت، سلول ها با ترکیبات 1-3 به مدت 1 ساعت پیش تیمار شدند و سپس با 1 میکروگرم در میلی لیتر LPS به مدت 24 ساعت تحریک شدند. جذب محیط کشت در واکنش گریس در طول موج 540 نانومتر با استفاده از یک میکروپلیت خوان PowerWave XS برای تخمین سطح NO اندازه گیری شد.

3.10. اندازه گیری محتوای ملانین

رده سلولی ملانوم موش، B16F10، از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی خریداری شد. سلول ها در DMEM حاوی 10 درصد FBS، 100 واحد در میلی لیتر پنی سیلین و 100 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین کشت داده شدند و در دمای 37 درجه سانتیگراد در یک اتمسفر مرطوب با 5 درصد CO2 انکوبه شدند. سلول‌های B16F10 در ظروف کشت 6 سانتی‌متری در 250 سلول در هر چاهک در DMEM حاوی 10 درصد FBS، 100 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین و 100 واحد بر میلی‌لیتر پنی سیلین به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. سلول ها دو بار با سالین بافر فسفات (PBS) شسته شدند و سپس توسط IBMX تحریک شدند و با غلظت های مختلف ترکیبات 1-3 یا کوجیک اسید (کنترل مثبت) در محیط RPMI عاری از فنل قرمز همراه با 10 درصد FBS، 100 واحد انکوبه شدند. پنی سیلین / میلی لیتر و استرپتومایسین 100 میکروگرم در میلی لیتر به مدت 24 ساعت و 48 ساعت. جذب محیط کشت در طول موج 405 نانومتر با استفاده از میکروپلیت خوان PowerWave XS برای تخمین محتوای ملانین اندازه گیری شد. نتایج به صورت تغییر برابری در مقایسه با شاهد بیان می‌شوند (سلول‌هایی که توسط IBMX تحریک نشده‌اند).

3.11. تحلیل آماری

تمام داده ها شامل زنده ماندن سلولی، NO و تولید ملانین به عنوان مقدار متوسط ​​و انحراف استاندارد (SD) ارائه شد. تمام سنجش ها در سه تکرار انجام شد و حداقل سه بار تکرار شد. در این مطالعه، تنها چند تکرار از هر آزمایش سلولی گنجانده شد، بنابراین روش تجزیه و تحلیل ناپارامتریک برای تجزیه و تحلیل آماری اتخاذ شد. برای تجزیه و تحلیل آماری هر متغیر از آزمون کروسکال-والیس استفاده شد. بسته آماری SPSS برای همه تجزیه و تحلیل ها (International Business Machines Corporation (IBM) SPSS statistics version 21, Boston, MA, USA) استفاده شد. اهمیت آماری در مقدار p کمتر از 05.05 0 در نظر گرفته شد.

4. نتیجه گیری

گزارش ما تجزیه و تحلیل شیمیایی جدایه های میکروبی یک موریانه در حال رشد قارچ را ارائه می دهد. سه تری پپتید حلقوی جدید، natalenamides A-C (1-3)، جدا شد و از نظر ساختاری از براث کشت قارچ در حال رشد - موریانه مرتبط Actinomadura sp. RB99 با استفاده از روش حذف تکثیر مبتنی بر LC-UV/MS. تمام ترکیبات جدا شده از نظر فعالیت های بیولوژیکی با استفاده از روش های مبتنی بر سلول مورد ارزیابی قرار گرفتند. ترکیبات 1 و 2 به ترتیب سمیت سلولی ضعیفی را در برابر سلول‌های HepG2 و HeLa/A549 نشان دادند. هیچ یک از ترکیبات جدا شده اثرات مهاری قابل توجهی بر تولید NO در سلول های RAW264.7 تحریک شده با LPS نشان نداد. ترکیب 3 اثرات مهاری قابل توجهی بر سنتز ملانین با واسطه IBMX به روشی وابسته به دوز نشان داد. این اثر شبیه به اسید کوجیک بود که به عنوان یک ماده آرایشی با اثرات سفید کننده پوست استفاده می شود.

قدردانی ها:

ما عمیقاً از مایکل توماس پولسن (گروه زیست شناسی، دانشگاه کپنهاگ، دانمارک) برای حمایت از کار میدانی ما سپاسگزاریم.

تضاد علاقه:

نویسندگان هیچ تضاد منافع را اعلام نمی کنند.

منابع

1. نیومن، دی جی; Cragg، GM Natural Products به عنوان منابع داروهای جدید از 1981 تا 2014. J. Nat. تولید 2016، 79، 629-661. [CrossRef] [PubMed]

2. مشرا، بی بی; Tiwari، VK Natural products: نقشی در حال تکامل در کشف دارو در آینده. یورو جی. مد. شیمی. 2011، 46، 4769-4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns، C. گوا، اچ. ریشر، ام. پولسن، ام. محصولات طبیعی از میکروب های مرتبط با حشرات. Beilstein J. Org. شیمی. 2016، 12، 314-327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; بیملمانز، سی. کوری، CR; Clardy, J. همزیستی های باکتریایی در سیستم های کشاورزی منبعی استراتژیک برای کشف آنتی بیوتیک فراهم می کنند. جی آنتی بیوت. 2014، 67، 53-58. [CrossRef] [PubMed]

5. هاروی، آل. ادرادا-ایبل، ر. Quinn, RJ ظهور مجدد محصولات طبیعی برای کشف دارو در عصر ژنومیک. نات. Rev. Drug Discov. 2015، 14، 111-129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely، ES; Fischbachb، MA; بیوسنتز توتال والش، CT: بازسازی آزمایشگاهی مسیرهای پپتیدی پلی کتیدی و غیر ریبوزومی. نات. تولید Rep. 2008, 25, 757-793. [CrossRef] [PubMed]

7. اوه، دی. اسکات، جی جی. کوری، CR; Clardy، J. Mycangimycin، یک پلی ان پراکسید از Streptomyces sp. سازمان Lett. 2009، 11، 633-636. [CrossRef] [PubMed]

8. نشستن، CS; Ruzzini، AC; ون آرنام، EB; رامدار، TR; کوری، CR; کلردی، جی. معماری‌های ژنتیکی متغیر، مولکول‌های تقریباً یکسانی را در همزیستی‌های باکتریایی مورچه‌های در حال رشد قارچ تولید می‌کنند. Proc. Natl. آکادمی علمی ایالات متحده آمریکا 2015، 112، 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. کم، KE; لر، اس. چن، کی جی. کمپبل، RL; هیکی، جی ال. تان، جی. اسکالی، CCG؛ دیویس، RL; یودین، AK; Zaretsky، S. طراحی منطقی مهارکننده‌های کالپین بر اساس پپتی‌دوومیمتیک‌های کالپاستاتین. جی. مد. شیمی. 2016، 59، 5403-5415. [CrossRef] [PubMed]

10. ژنگ، ج. خو، ز. وانگ، ی. هونگ، ک. لیو، پی. Zhu، W. تری پپتیدهای حلقوی از قارچ هالوتولرانت Aspergillus sclerotiorum PT06-1. جی. نات. تولید 2010، 73، 1133-1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody، D. موشنیکوا، آ. السید، NS; Adochite، RC; اسلیباگ، جی. گلیجانین، ج. تیواری، RK; آندریف، OA؛ پرنگ، ک. Reshetnyak، YK پپتیدهای حلقوی جدید حساس به pH. علمی Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. ژائو، م. Lin، HC; تانگ، Y. بیوسنتز از -نیترو حاوی سه پپتید حلقوی روان دوست. جی آنتی بیوت. 2016، 69، 571-573. [CrossRef] [PubMed]

13. زورزی، ع. دیل، ک. هاینس، سی. درمان پپتید چرخه ای: گذشته، حال و آینده. Curr. نظر. شیمی. Biol. 2017، 38، 24-29. [CrossRef] [PubMed]

14. کیم، خ. رامدار، TR; بیملمانز، سی. کائو، اس. پولسن، ام. کوری، CR; Clardy، J. Natalamycin A، آنسامایسین از Streptomyces sp. مرتبط با موریانه. شیمی. علمی 2014، 5، 4333-4338. [CrossRef] [PubMed]

15. کانگ، HR; لی، دی. بندورف، آر. یونگ، WH; بیملمانز، سی. کانگ، KS; کیم، KH Termisoflavones A-C، گلیکوزیدهای ایزوفلاونوئید از Streptomyces sp. RB1. جی. نات. تولید 2016، 79، 3072-3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns، C. رامدار، TR; کیم، KH; کلاسن، جی ال. کائو، اس. Wyche، TP; هو، ی. پولسن، ام. Bugni، TS; کوری، CR; و همکاران ماکروترمایسین‌های A-D، ماکرولاکتام‌های گلیکوزیله از Amycolatopsis sp. M39. سازمان Lett. 2017، 19، 1000-1003. [CrossRef] [PubMed]

17. گوا، اچ. بندورف، آر. لیکنیتز، دی. کلاسن، جی ال. ولمرز، جی. گورلز، اچ. استیناکر، ام. وایگل، سی. Dahse، HM; Kaster، AK; د بیر، ZW; و همکاران جداسازی، بیوسنتز و تغییرات شیمیایی روترولون‌های A-F: آلکالوئیدهای تروپولون نادر از Actinomadura sp. 5-2. شیمی. یورو J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. سانو، اس. ایکای، ک. کاتایاما، ک. تاکاساکو، ک. ناکامورا، تی. اوبیاشی، ع. آزور، ی. Enomoto، H. OF4949، مهارکننده های جدید آمینوپپتیداز B. II. تبیین ساختار. جی آنتی بیوت. 1986، 39، 1685-1696. [CrossRef] [PubMed]

19. سیاسولو، ال. کازاپولو، آ. کوتیگنانو، آ. بیفولکو، جی. دبیتوس، سی. هوپر، جی. گومز-پالوما، ال. Riccio، R. Renieramide، یک تری پپتید حلقوی از اسفنج وانواتو Reniera n. sp. جی. نات. تولید 2002، 65، 407-410. [CrossRef] [PubMed]

20. سولانو، ف. بریگانتی، اس. پیکاردو، ام. عوامل هیپوپیگمانت کننده غانم، GH: بررسی به روز شده در جنبه های بیولوژیکی، شیمیایی و بالینی. پیگم. سلول ملانوما Res. 2006، 19، 550-571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; نوبر، تی. کوری، CR; Aanen، DK; پولسن، ام. بررسی پتانسیل اکتینوباکتری ها به عنوان همزیست های دفاعی در موریانه های در حال رشد قارچ. میکروب. Ecol. 2012، 63، 975-985. [CrossRef] [PubMed]

22. هال، TA BioEdit: یک ویرایشگر و برنامه تجزیه و تحلیل تراز توالی های بیولوژیکی کاربر پسند برای ویندوز 95/98/NT. علائم اسیدهای نوکلئیک سر. 1999، 41، 95-98.

23. پروس، ای. پپلیز، جی. گلوکنر، FO SINA: همراستایی توالی چندگانه با توان عملیاتی بالا ژنهای RNA ریبوزومی. بیوانفورماتیک 2012، 28، 1823-1829. [CrossRef] [PubMed].

24. سایتو، ن. نی، م. روش پیوند همسایه: روشی نوین برای بازسازی درختان فیلوژنتیک. مول. Biol. تکامل. 1987، 4، 406-425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. درختان تکاملی از توالی های DNA: رویکرد حداکثر احتمال. جی. مول. تکامل. 1981، 17، 368-376. [CrossRef] [PubMed]

26. کومار، س. استچر، جی. Tamura، K. MEGA7: تجزیه و تحلیل ژنتیک تکاملی مولکولی نسخه 7.0 برای مجموعه داده های بزرگتر. مول. Biol. تکامل. 2016، 33، 1870-1874. [CrossRef] [PubMed]

27. تامورا، ک. Nei, M. برآورد تعداد جانشینی های نوکلئوتیدی در ناحیه کنترل DNA میتوکندری در انسان و شامپانزه. مول. Biol. تکامل. 1993، 10، 512-526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. محدودیت های اطمینان در فیلوژنی: رویکردی با استفاده از راه انداز. تکامل 1985، 39، 783-791. [CrossRef] [PubMed]

در دسترس بودن نمونه:

نمونه هایی از ترکیبات از نویسندگان در دسترس نیست.

For more information:1950477648nn@gmail.com