رژیم های غذایی گیاهی با کاهش خطر ابتلا به بیماری های مزمن مانند چاقی مرتبط است

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه:پیشنهاد شده است که عصاره متانولی اسفناج (SME) از تشکیل محصولات نهایی گلیکاسیون پیشرفته (AGEs) جلوگیری می کند، که در طول پیشرفت دیابت افزایش می یابد، بنابراین مهم است که بدانیم آیا SME ها اثرات مفیدی بر شبکیه دیابتی دارند یا خیر. در این مطالعه، سنجش‌های آزمایشگاهی نشان داد که SME از گلیکاسیون، تشکیل گروه کربونیل و کاهش کاهش گروه تیول در آلبومین سرم گاوی انکوبه‌شده با قندهای احیاکننده یا متیل گلیوکسال جلوگیری می‌کند. اثر SME در شبکیه موش‌های دیابتی ناشی از استرپتوزوتوسین (STZ2) نیز در گروه نرموگلیسمی، موش‌های STZ، STZ تحت درمان با SME و موش‌های STZ تحت درمان با آمینوگوانیدین (مرجع ضد AGEs) مورد مطالعه قرار گرفت (n{3}}). گروه) طی 12 هفته. شبکیه برش داده شد و برای Ne-کربوکسی متیل لیزین (CML)، گیرنده RAGE، NADPH-Nox4، نیتریک اکسید سنتاز القایی (iNOS)، نیتروتیروزین (NT)، NF-kB هسته ای، فاکتور رشد اندوتلیال عروقی رنگ آمیزی شد. VEGF)، پروتئین اسیدی فیبریلاری گلیال (GFAP)، پروتئین S100B و سنجش TUNEL. پراکسیداسیون لیپیدی در کل شبکیه توسط سطوح مالون دی آلدئید (MDA) تعیین شد. نتایج نشان داد که در شبکیه دیابتی، SME هم‌محلی‌سازی CML-RAGE، استرس اکسیداتیو (NOX4، iNOS، NT، MDA)، التهاب (NF-B، VEGF، S10B، GFAP) و آپوپتوز را کاهش می‌دهد.<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

کلید واژه ها:اسفناج؛ رتینوپاتی دیابتی؛ محصولات نهایی گلیکاسیون پیشرفته؛ استرس اکسیداتیو؛ التهاب؛ خشم; کربوکسی متیل ال لیزین

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

رژیم های غذایی گیاهی با کاهش خطر ابتلا به بیماری های مزمن مانند چاقی، دیابت نوع 2 و بیماری عروق کرونر قلب مرتبط است. اسفناج (Spinacia oleracea L.) یک سبزی برگی خوراکی است که به دلیل تامین مقدار قابل توجهی فیبر، ویتامین و مواد معدنی در سراسر جهان مصرف می شود [1،2]. چندین ماده شیمیایی گیاهی آن شناسایی شده است، از جمله کلروفیل ها، کاروتنوئیدها (لوتئین و زآگزانتین) [3]، و ترکیبات فنلی (فلاون ها، فلاونوئیدها، کومارین ها) [4-8] (به مکمل 1 مراجعه کنید). گزارش شده است که اسفناج هنگامی که به عنوان غذا، عصاره محلول در آب یا به صورت خشک شده در انجماد خورده شود و تیلاکوئیدهای آن دارای خواص ضد سرطانی، ضد چاقی و کاهش قند خون هستند [9]. اثر ضد التهابی اسفناج در مدل‌های اندوتوکسمی حیوانی، حیوانات چاق و انسان‌های سالم نشان داده شده است [9]. اثر آنتی اکسیدانی آن در سلول های سرطان پروستات انسانی، مدل های حیوانی مبتلا به چاقی، موش های تحت تابش اشعه ماوراء بنفش و آدنوکارسینوم پروستات تراریخته موش مورد مطالعه قرار گرفت [9،10]. اثرات ضد گلیکوزیشن و ضد التهابی عصاره متانولی اسفناج (SME) به ترتیب در مدل دیابت ناشی از گلوکز در گورخرماهی و نکروز میوکارد ناشی از ایزوپروترنول در موش صحرایی مورد مطالعه قرار گرفته است [11،12]. SME سطح هموگلوبین گلیکوزیله و فروکتوزامین از جمله سطوح پروتئین گلیکوزیله را با کاهش فعالیت آلدوز ردوکتاز در چشم عدسی کاهش داد [11]. یافته های بالا نشان می دهد که SMEs ممکن است یک اثر پیشگیرانه بر پیشرفت عوارض دیابت مانند رتینوپاتی دیابتی (DR) داشته باشد.

DR به تدریج منجر به از دست دادن حدت بینایی یا کوری می شود که با التهاب، استرس اکسیداتیو و تجمع محصولات نهایی گلیکوزیشن پیشرفته (AGEs) مرتبط بوده است [13،14]. AGE ها باعث ایجاد اتصال عرضی پروتئین، تغییر ساختار / عملکرد و گردش / پاکسازی آن می شود. AGE ها را می توان با یک واکنش غیر آنزیمی بین گلوکز با یک گروه آمینه آزاد از پروتئین ها تولید کرد و واسطه های برگشت پذیری مانند بازهای شیف و محصولات آمادوری (فروکتوزامین) را تشکیل داد [15]. مکانیسم های دیگر برای تشکیل AGE ها عبارتند از مسیر "تنش کربونیل"، که در آن اکسیداسیون قندها و لیپیدها باعث ایجاد ترکیبات میانی دی کربونیل مانند گلیوکسال و متیل گلیوکسال (MGO) می شود که منجر به تشکیل AGE ها به عنوان N:-کربوکسی متیل لیزین (CML) می شود. 16]. افزایش سطح CML در سرم و زجاجیه می تواند یک نشانگر بیوشیمیایی برای ظهور و پیشرفت DR باشد [17،18]. در شبکیه، فعال شدن گیرنده RAGE توسط AGEs (AGEs-RAGE) باعث بیان بیش از حد پروتئین اسیدی فیبریلاری گلیال (GFAP) و عوامل پیش التهابی می شود که توسط فاکتور nu-clear کاپا-زنجیره سبک-افزایش دهنده B فعال تنظیم می شود. سلول ها (NF-kB) [19]. NF-kB به طور مثبت بیان RAGE را با عمل به عنوان یک مکانیسم بازخورد مثبت تنظیم می کند [20].سیستانچ چیستاز سوی دیگر، غلظت‌های بالای S100B، یک پروتئین متصل‌کننده به کلسیم، ممکن است NF-kB را فعال کند و باعث التهاب عصبی و فعال‌سازی سلول‌های گلیال شود [21]. بیان بیش از حد S100B در آستروسیت ها باعث ایجاد اثرات نوروتوکسیک می شود که با آستروگلیوز شبکیه آشکار می شود [22].

سیستانچ می تواند ضد پیری باشد

استراتژی هایی به صورت تجربی برای جلوگیری از آسیب شبکیه ایجاد شده است. برخی از فیتوکمیکال‌های اسفناج جدا شده از گیاهان دیگر با مهار AGEs و استرس اکسیداتیو مرتبط هستند [8،{1}}]. لوتئین، آستاگزانتین و کامفرول از سلول‌های اپیتلیال رنگدانه شبکیه مشتق شده از انسان (ARPE{3}}) در برابر آسیب از طریق خواص ضد AGE، آنتی اکسیدانی و ضد آپوپتوز محافظت می‌کنند [26-28]. این نتایج نشان می‌دهد که فیتوکمیکال‌های اسفناج نقش مرتبطی در پیشگیری از دژنراسیون شبکیه مانند DR دارند. استراتژی دیگر استفاده از آمینوگوانیدین (AG) به عنوان یک مهار کننده قوی گلیکوزیشن و فعالیت iNOS، کاهش تجمع CML و تشکیل پیش سازهای دی کربنیلیک فعال در موش است [29]. با این حال، در یک کارآزمایی بالینی چند مرکزی و تصادفی با 690 بیمار دیابتی، اثر مفید آن به وضوح مشخص نشد [30].

تغییرات در دژنراسیون شبکیه تحت شرایط هیپرگلیسمی به ندرت مورد مطالعه قرار گرفته است. بنابراین، جالب است بدانید که آیا SME از لایه های شبکیه در برابر آسیب های مربوط به خواص ضد AGE، آنتی اکسیدانی و ضد التهابی آن در شبکیه شبکیه موش های دیابتی ناشی از استرپتوزوتوسین محافظت می کند یا خیر.

2. مواد و روشها

2.1. تهیه عصاره متانولی اسفناج (SME)

برگهای تازه اسفناج (S.oleracea L.) در فصل پاییز و زمستان در یک مزرعه کشاورزی در استان پوئبلا، مکزیک برداشت شد و توسط یک گیاه شناس در هرباریوم موسسه ملی پلی تکنیک (IPN، مکزیکو سیتی) شناسایی شد. مکزیک). نمونه کوپن شماره 4532 در هرباریوم دانشکده ملی علوم زیستی IPN سپرده شد.

برگها کم آب و ریز آسیاب شدند. برگ های خشک شده با متانول در دمای اتاق خیسانده شدند، از طریق فیلترهای سلولزی (Whatman، Maidstone، UK) فیلتر شدند و با استفاده از یک اواپراتور خلاء چرخشی (BUCHI Rotavapor R{{0}}، سوئیس) در دمای 45 درجه تا خشک شدند. یک صمغ سبز (95.0 گرم / کیلوگرم برگ خشک) تولید کنید.ضد پیری سیستانچSME تا زمان استفاده در تاریکی در دمای 4 درجه نگهداری شد. برای همه سنجش‌ها، عصاره در آب مقطر بازسازی شد[11].

2.2. سنجش In vitro فعالیت ضد گلیکاسیون SME

2.2.1. تشکیل محصولات نهایی گلیکاسیون پیشرفته مشتق شده از آلبومین سرم گاوی (BSA-AGEs)

سنجش BSA-AGEs همانطور که قبلاً توضیح داده شد [31] انجام شد. به طور خلاصه، 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر BSA (کسر V؛ سیگما آلدریچ، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده) یا در D-گلوکز 0 اضافه شد. 5 مولار، D-فروکتوز {{12 }}.5 M، یا متیل گلیوکسال 2.5 میلی مولار، و ساخته شده در محلول 0.1 M PBS (pH 7.4) و 0.02 درصد سدیم آزید. غلظت‌های SME (5، 10، 25، 50، 100 و 200 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به هر مخلوط اضافه شد و سپس در دمای 37 درجه به مدت 4 هفته انکوبه شد. سپس قندهای واکنش نداده با دیالیز در برابر آب مقطر به مدت دو روز در دمای 4 درجه حذف شدند. سطوح BSA-AGE با اسپکتروفتومتری فلورسانس (Ex370/Em 440 نانومتر؛ مدل LS 30، PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, UK) تعیین شد[32]. گلیکیزه شدن پروتئین BSA با قندهای کاهنده و MGO یک کنترل مثبت (BSA glycated) بود، در حالی که انکوباسیون BSA گلیکوزه شده با آمینوگوانیدین (1 میلی گرم در میلی لیتر) به عنوان کنترل منفی (BSA glycated-AG) استفاده شد. سنجش ها در سه تکرار انجام شد.

2.2.2. سنجش فروکتوزامین

سطح فروکتوزامین با روش نیترو آبی تترازولیوم (NBT) تعیین شد [33]، که بر اساس توانایی فروکتوزامین برای کاهش NBT، تشکیل فرمازان، یک محصول نهایی رنگی در شرایط قلیایی است. ده میکرولیتر از هر یک از کنترل‌ها یا غلظت‌های SME انکوبه‌شده با BSA گلیکوزیله (BSA-SME) به 9{7}} میکرولیتر NBT در 2.5 میلی‌مولار اضافه شد، که در بافر کربنات (0.1 M؛ pH 10.3) تهیه شد. همه آنها در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. جذب در طول موج 530 نانومتر اندازه گیری شد. غلظت فروکتوزامین (nmol/mg) بر اساس منحنی استاندارد فورمازان محاسبه شد.

2.2.3. تعیین تشکیل گروه های کربونیل و کاهش گروه های تیول در BSA-AGEs

به گفته لوین و همکاران، غلظت گروه کربونیل در نمونه های BSA-SME و شاهد اندازه گیری شد. [34]. محلولی از 2،{3}Dinitrophenylhydrazine (DNPH؛ 10 میلی‌مولار) در 400 میکرولیتر از 2.5 مولار هیدروکلراید به 100 میکرولیتر هر نمونه اضافه شد و به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد.سیستانچ سودسپس، 500 میکرولیتر تری کلرواستیک اسید (20 درصد وزنی بر حجم) اضافه شد و به مدت 5 دقیقه روی یخ نگه داشت. نمونه ها با سرعت 4 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند و گلوله پروتئینی سه بار با اتیل استات/اتانول (1:1 V/V) شسته شد. پس از آن، نمونه ها در 250μL گوانیدین هیدروکلراید تا 6 مولار معلق شدند. غلظت گروه های کربونیل (nmol/mg پروتئین) با استفاده از اسپکتروفتومتری در جذب 370 نانومتر (EON، BioTek Instruments, Inc.، Winooski، VT، USA) محاسبه شد. ضریب جذب DNPH (22000 M-1 cm-1).

بر اساس روش المن، تعیین میزان تخلیه گروه تیول در نمونه های BSA-SME و شاهد انجام شد. به طور خلاصه، 10 میکرولیتر از 5،5'-Disulfanediylbis (2-نیتروبنزوئیک اسید) (DNTB؛ 10 میلی‌مولار، تهیه شده در PBS) با 50 میکرولیتر نمونه گلیکوزه شده به مدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. سپس جذب در طول موج 410 نانومتر اندازه‌گیری شد. سطح گروه های تیول آزاد با استفاده از منحنی استاندارد L-سیستئین (0.{12}} میکرومولار) محاسبه شد و بر حسب nmol/mg پروتئین بیان شد [34].

2.3. اثر SME بر روی شبکیه موش های دیابتی 2.3.1. القای دیابت در موش ها

از موش‌های صحرایی نر نژاد ویستار با وزن 10±250 گرم (N=40) که به مدت 8 ساعت ناشتا بودند استفاده شد. دوز داخل صفاقی استرپتوزوتوسین (60 میلی گرم بر کیلوگرم) در بافر سیترات (10 میلی مولار، pH 4.5) (سیگما آلدریچ، شرکت، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) تجویز شد [35]. سه روز بعد، سطح گلوکز (گلوکومتر؛ ACCU-CHEK فعال؛ Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Germany) با جمع‌آوری یک قطره نمونه خون از دم اندازه‌گیری شد. حیوانات با سطوح گلیسمی بالاتر از 350 میلی گرم در دسی لیتر برای مطالعه انتخاب شدند. گلوکز خون به مدت 12 هفته به صورت هفتگی اندازه گیری شد.

2.3.2. طراحی تجربی

موش‌های دیابتی ناشی از استرپتوزوتوسین (STZ) به‌طور تصادفی به گروه‌های زیر تقسیم شدند (n =10): STZ تحت درمان داخل معده با 2 میلی‌لیتر آب آشامیدنی (STZ). STZ تحت درمان با SME با 4{12}} میلی گرم بر کیلوگرم (STZ-SME). موش های نرمال گلیسمی (NG)؛ و STZ تیمار شده با 50 میلی گرم بر کیلوگرم آمینوگوانیدین (AG؛ Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). STZ-AG به عنوان یک گروه مرجع ضد AGE استفاده شد. دوزهای تعیین شده هر 24 ساعت (9:00 صبح) به مدت 12 هفته تجویز شد. سطح گلیسمی در همه گروه ها به صورت هفتگی کنترل شد. رژیم دوز SME در mg/kg 400 بر اساس موارد زیر بود: 7 گرم SME از 100 گرم اسفناج تازه به دست می‌آید (داده‌ها نشان داده نشده است). این مقدار معادل مصرف روزانه یک فرد متوسط ​​70 کیلوگرمی در رژیم غذایی آمریکایی است [36] که معادل 100 میلی گرم عصاره به ازای هر کیلوگرم وزن بدن است.عصاره سیستانچ ضد تشعشعاز سوی دیگر، با توجه به تفاوت در متابولیسم تسریع شده در موش‌ها، توصیه می‌شود برای مطالعات مقایسه با انسان، مصرف هر عصاره طبیعی را تا 6.4 برابر افزایش دهید [37]. دوز 400 میلی‌گرم بر کیلوگرم که ما استفاده کردیم عمدتاً بر اساس نتایج به‌دست‌آمده در مدل نکروز میوکارد القا شده در موش‌های صحرایی Wistar بود که نشان داد اثر ضد التهابی SME در mg/kg 300 قابل‌توجه‌تر است [12].

2.3.3. ارزیابی های بافت شناسی و ایمونوهیستوشیمی

چشم‌های هسته‌دار در فرمالین خنثی تثبیت شدند و سپس در الکل‌های درجه‌بندی شده آب‌گیری و در پارافین جاسازی شدند. مقاطع بافت شناسی 2 میکرومتر بر روی اسلایدهای الکتروشارژ نصب شدند، موم زدایی شدند و تا محلول بازیابی آنتی ژن مجدد هیدراته شدند (K035؛ 10× سیترات بافر، pH6؛ Diagnostic BioSystems، Pleasanton، CA، USA). یک سیستم تشخیص ایمنی مبتنی بر پلیمر (سیستم تشخیص DAB PolyVuemouse/rabbit، Diagnostic BioSystems) استفاده شد. آنتی بادی های اولیه زیر مورد استفاده قرار گرفتند: پروتئین اسیدی فیبریلاری گلیال (ضد GFAP؛ MAB360؛ Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA). فاکتور رشد یافته اندوتلیال عروقی (ضد VEGF؛ sc-7269؛ سانتا کروز بیوتکنولوژی، شرکت، دالاس، تگزاس، ایالات متحده)، پروتئین B اتصال دهنده کلسیم S100 (ضد S100B؛ ab52642؛ Abcam PLC، کمبریج، انگلستان) و فاکتور هسته‌ای کاپا-زنجیره سبک-افزایش‌دهنده سلول‌های B فعال (anti-NF-kB p65;sc{20}}). همه رقت‌ها در 1:200 و یک شبه در دمای 4 درجه انکوبه شدند. یک آنتی بادی ثانویه (Mouse/Rabbit PolyVueTM) طبق دستورالعمل های تامین کننده اضافه شد.گیاه سیستانچبرش ها با سوبسترای DAB پلاس/کروموژن و هماتوکسیلین رنگ آمیزی شدند. مشاهدات بافت شناسی و گرفتن تصاویر در میکروسکوپ کارل زایس (Carl Zeiss Microscopy GmbH، Jena، آلمان) انجام شد.

برای رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس، لام‌ها یک شبه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد با آنتی‌بادی‌های اولیه زیر انکوبه شدند: کربوکسی متیل لیزین (ضد CML؛ ab124145؛ Abcam PLC، کمبریج، انگلستان)، گیرنده AGE (ضد RAGE؛ sc{4}})، NADPH اکسیداز 4 (ضد Nox4؛ ab133303)، 3-نیتروتیروزین (ضد NT؛ ab110282) و نیتریک اکسید سنتاز (القائی) (ضد iNOS؛ A00368-1؛ Boster Bio، Pleasanton، CA ، ایالات متحده آمریکا). سپس، آنتی‌بادی‌های ثانویه زیر مورد استفاده قرار گرفتند: برای ضد RAGE، بز ضد موش lgG(FITC)-conjugated (1:200؛ Santa Cruz, Biotechnology, Inc.). for anti-CML and anti-NT, mouse anti-rabbit IgG-PE (SC{23}}); و برای anti-iNOS و anti-Nox4، m-IgGkBP-PE (Sc{29}}). همه در دمای اتاق به مدت 60 دقیقه انکوبه شدند. پس از آن، مقاطع در محیطی حاوی 4'،{32}}دی آمیدین-2'-فنیلندول دی هیدروکلراید (DAPI) سوار شدند. آنتی بادی های ضد CML و ضد RAGE در همان اسلاید هیبرید شدند. ایستگاه تصویربرداری سلولی FLoidTM (فناوری های زندگی کارلزباد، سن دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) برای تصاویر فلورسانس استفاده شد.

2.3.4. ارزیابی آپوپتوز

آپوپتوز سلول‌های شبکیه بر اساس کتابچه راهنمای توصیف‌شده توسط روش برچسب‌گذاری با واسطه دئوکسی‌نوکلئوتیدیل ترانسفراز (TdT) با واسطه دئوکسی‌اوریدین تری فسفات (dUTP) با استفاده از کیت تشخیص مرگ سلولی درجا، TMR (تترامتیل رودامین) شناسایی شد. 3}}dUTP) قرمز، نسخه 12 (12156792910؛ Roche Diagnostics). به طور خلاصه، اسلایدهای موم زدایی مجدد هیدراته شدند و دو بار با PBS شسته شدند. سپس، آنها با مخلوط واکنش TUNEL در اتمسفر مرطوب به مدت 60 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. IOD برای TUNEL برای لایه های شبکیه محاسبه شد.

2.3.5. سنجش پراکسیداسیون لیپید

برای ارزیابی سطوح مالون دی‌آلدئید (MDA) در بافت شبکیه، تقریباً 3 میلی‌گرم از بافت تازه (n=3) هموژنه شد و همانطور که قبلاً گزارش شده بود پردازش شد [38]. سطوح MDA به دنبال دستورالعمل‌های تامین‌کننده کیت (کیت سنجش OXItek-TBARS، Enzo Life Sciences، Farmingdale، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) اندازه‌گیری شد.

2.4.تحلیل آماری

برای تجزیه و تحلیل آماری، همه میکروگراف های شبکیه با قدر 200× در ۱۰۰ میکرومتر فراتر از ناحیه عصب بینایی گرفته شد. تقریباً 40 تصویر در هر گروه از حیوانات (n=7) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. تجزیه و تحلیل تصویر با نرم افزار Image-Pro Premier Version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA) انجام شد. ما از نرم افزار GraphPad Prism (La Jolla، CA، USA؛ نسخه 8.0) استفاده کردیم. ارقام مقادیر نمودار شده در نمودارهای جعبه و سبیل (میانگین، چارک اول سوم، مقدار حداقل حداکثر) را برای لایه سلول گانگلیونی (GCL)، لایه هسته ای داخلی (INL) و لایه هسته ای خارجی (ONL) نشان می دهد. میانگین و انحراف معیار (میانگین ± انحراف معیار) در پیوست A نشان داده شده است (جدول A{13}}A3). در تمامی موارد، آزمون ANOVA یک طرفه و سپس تست توکی انجام شد. پ<0.05 was="" considered="" statistically="">