نورووگونین استرس اکسیداتیو و آپوپتوز ناشی از هیپوکسی را در سلول های PC12 کاهش می دهد

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

خلاصه

مقدمه: نورووگونین یک فلاون طبیعی با سه گروه هیدروکسیل فنولیک در ساختار اسکلتی است و دارای عالی است.آنتی اکسیدانفعالیت. با این حال، اثر محافظت عصبی نوروگونین نامشخص است. در اینجا، ما ظرفیت محافظتی نوروگونین را در برابر آسیب اکسیداتیو ناشی از هیپوکسی در سلول‌های PC12 بررسی کردیم. روش‌ها: بقای سلولی و آپوپتوز به ترتیب با استفاده از روش MTT و رنگ‌آمیزی Annexin V-FITC/PI مورد بررسی قرار گرفت. محتوای گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) با استفاده از روش DCFH-DA اندازه‌گیری شد. لاکتات دهیدروژناز (LDH)، مالون دی آلدئید (MDA) وآنتی اکسیدانسطح آنزیم با استفاده از کیت های تجاری تعیین شد. بیان ژن‌ها و پروتئین‌های مرتبط به ترتیب با روش Real-time کمی PCR و وسترن بلات اندازه‌گیری شد. یافته‌ها: ما دریافتیم که نورووگونین آسیب ناشی از هیپوکسی را در سلول‌های PC12 با افزایش زنده‌مانی سلولی، کاهش انتشار LDH و بهبود تغییرات در مورفولوژی سلولی کاهش می‌دهد. نورووگونین نیز به عنوان یکآنتی اکسیدانبا حذف ROS، کاهش تولید MDA، حفظ فعالیت های سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPx)، و کاهش سطح بیان HIF-1 و VEGF. علاوه بر این، ووگونین از طریق مهار سطوح بیان کاسپاز-3، سیتوکروم c و Bax از آپوپتوز سلولی جلوگیری کرد و در عین حال سطح بیان Bcl-2 و نسبت Bcl-2/Bax را افزایش داد. نتیجه‌گیری: نورووگونین آسیب ناشی از هیپوکسی را در سلول‌های PC12 با خاموش کردن ROS کاهش می‌دهد و فعالیت‌های آن را حفظ می‌کند.آنتی اکسیدانآنزیم ها و مهار مسیر آپوپتوز میتوکندریایی.

کلمات کلیدی: نوروگونین،فعالیت آنتی اکسیدانیهیپوکسی، استرس اکسیداتیو، آپوپتوز

زمینه

موجودات هوازی برای تولید انرژی به اکسیژن (O2) نیاز دارند. هیپوکسی به عنوان عرضه ناکافی O2 برای حفظ عملکرد سلولی در بافت تعریف می شود و اغلب در برخی موقعیت های فیزیولوژیکی مانند ارتفاع زیاد [1] و در بسیاری از موقعیت های پاتولوژیک مانند سکته [2] رخ می دهد. مغز به دلیل مصرف بالای اکسیژن، غنی از اسیدهای چرب غیراشباع و کم، به آسیب های ناشی از هیپوکسی حساس است.آنتی اکسیدانظرفیت [3]. شواهد فزاینده ای نشان می دهد که هیپوکسی می تواند اثرات نامطلوبی بر مغز ایجاد کند [4-6].

Linlin Jing، Rongmin Gao، Jie Zhang، Dongmei Zhang، Jin Shao، Zhengping Jia و Huiping Ma

بخش داروسازی، بیمارستان 940 نیروی پشتیبانی لجستیک مشترک PLA، لانژو 730050، گانسو، چین

استرس اکسیداتیو و آپوپتوز به عنوان دو عامل کمک کننده در آسیب ناشی از هیپوکسی در نظر گرفته می شوند [7، 8]. گزارش شده است که قرار گرفتن در معرض هیپوکسی باعث افزایش تولید گونه‌های اکسیژن فعال درون سلولی (ROS) می‌شود که استرس اکسیداتیو را تسهیل می‌کند. ROS بیش از حد، مانند آنیون سوپراکسید (O2-˙)، پراکسید هیدروژن (H2O2)، و رادیکال هیدروکسیل (HO•)، منجر به تغییرات ساختاری و عملکردی سلولی با حمله به لیپیدها، غشاها، پروتئین ها و DNA می شود و متعاقبا باعث آسیب سلولی می شود. 9].

برای آنتی اکسیدان روی Cistanches کلیک کنید

به طور همزمان، ROS بیش از حد تولید شده همچنین باز شدن منافذ انتقال نفوذپذیری میتوکندری (mPTP) [10] و انتقال پروتئین های پرو آپوپتوز به غشای خارجی میتوکندری را تسهیل می کند، که باعث دپلاریزاسیون غشای میتوکندری و آزاد شدن سیتوکروم c می شود [11]. این تغییرات در نهایت باعث آپوپتوز وابسته به میتوکندری می شود [12]. بنابراین، اعتقاد بر این است کهآنتی اکسیدان هابا توانایی مهار یا حذف ROS بیش از حد ممکن است اثر محافظتی خود را از طریق کاهش استرس اکسیداتیو و آپوپتوز ناشی از هیپوکسی اعمال کند. مطالعات زیادی این را ثابت کرده استآنتی اکسیدانمکمل‌هایی مانند ویتامین C [13]، ایزوفلاون [8] و رادیکال‌های نیتروکسید [14] می‌توانند آسیب‌های ناشی از هیپوکسی را در شرایط in vitro و in vivo محدود کنند. فلاونوئیدها دسته بزرگ و متنوعی از متابولیت های ثانویه گیاهی هستند که در همه جا حاضر هستند. آنها همیشه به عنوان یک طبیعی عالی در نظر گرفته می شوندآنتی اکسیدانبا توانایی حذف رادیکال های آزاد و مهار پراکسیداسیون لیپیدی.

در حال حاضر توجه بیشتری به این دسته از ترکیبات به دلیل اثرات مفید آنها بر سلامت انسان شده است. نشان داده شده است که فلاونوئیدها دارای طیف وسیعی از اقدامات دارویی هستند، مانند فعالیت ضد التهابی، ضد درد، و محافظت عصبی و غیره، که همه آنها ممکن است به فعالیت های آنتی اکسیدانی آنها نسبت داده شوند [15]. بسیاری از مطالعات نشان داده اند که فلاونوئیدها اثرات محافظتی بسیار خوبی بر شکست ناشی از هیپوکسی نشان می دهند. به عنوان مثال، روتین یک اثر محافظت کننده عصبی قوی در برابر مرگ سلول های گانگلیونی شبکیه ناشی از هیپوکسی دارد [16]. یک مطالعه اخیر همچنین نشان می دهد که روتین می تواند آسیب هیپوکسی ناشی از کلرید کبالت را با مهار استرس اکسیداتیو و آپوپتوز در سلول های H9c2 کاهش دهد [17]. علاوه بر این، لیو و همکاران پیشنهاد می کنند که نوبیلتین (3',4',5,6, 7,8-هگزامتوکسی فلاون) آسیب I/R میوکارد را از طریق فعال کردن مسیر Akt/GSK-3 در سلول H9c2 کاهش می‌دهد. [18]. علاوه بر این، آکاستین می‌تواند از کاردیومیوسیت‌های موش صحرایی و کاردیومیوبلاست‌های H9C2 در برابر آسیب‌های ناشی از هیپوکسی/اکسیژناسیون مجدد از طریق فعال‌سازی مسیر سیگنالینگ Nrf2 با واسطه AMPK محافظت کند [19].

نورووگونین (5،7،8-تری هیدروکسی فلاون، شکل 1) یک فلاون فعال دارویی است که از ریشه Scutellaria baicalensis Georgi (در چینی "هوانگ کین")، یک گیاه سنتی چینی که برای درمان آنفولانزا و سرطان استفاده می شود، جدا شده است. [20، 21]. با این حال، مطالعات محدودی در مورد فعالیت های بیولوژیکی نوروگونین به دلیل سطوح پایین آن در گیاهان طبیعی گزارش شده است. به منظور پرداختن به این مشکل، چندین روش سنتز نوروگونین گزارش شده است [22، 23].

مطالعه قبلی ما همچنین یک روش ساده برای به دست آوردن نوروگونین از کریزین در چهار مرحله ایجاد کرد [24]. این تحقیقات بر ارزیابی بیشتر فعالیت‌های بیولوژیکی نوروگونین تأثیر مثبت گذاشته است. مطالعات نشان داده اند که نورووگونین دارای فعالیت های آنتی اکسیدانی [25]، ضد سرطانی [26، 27]، ضد ویروسی [28] و فعالیت های ضد میکروبی [29] است و همچنین از تولید ROS تحریک شده با سیانید [30] جلوگیری می کند. با این حال، اینکه نوروگونین دارای ظرفیت های محافظتی در برابر آسیب ناشی از هیپوکسی است ناشناخته باقی مانده است. هدف از مطالعه حاضر بررسی اثرات محافظتی نوروگونین در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از هیپوکسی و آپوپتوز در سلول های PC12 بود.

مواد و روش ها

مواد و شناساگرها

نوروگونین (خلوص بیش از یا برابر با 98 درصد) طبق روش گزارش شده قبلی ما سنتز شد [24]. روتین (خلوص بیش از یا برابر با 96 درصد) از شرکت بیوتکنولوژی Ci Yuan، Ltd. (Xian، Shannxi، چین) خریداری شد. نوروگونین و روتین در دی متیل سولفوکسید استریل (DMSO) حل شدند، در دمای 20- درجه نگهداری شدند و بلافاصله قبل از استفاده در محیط کشت سلولی رقیق شدند. محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM)، سرم جنین گاوی (FBS)، استرپتومایسین و پنی سیلین از شرکت Solarbio، Ltd. (پکن، چین) خریداری شد.

کیت های مالون دی آلدئید (MDA)، لاکتات دهیدروژناز (LDH)، سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) از موسسه مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ (جیانگ سو، چین) به دست آمد. 2'،7'-دی کلرید-هیدروفلورسئین دی استات (DCFH-DA) و (3-(4,5-دی متیل تیازول-2-ایل)-2،5- دی فنیل تترازولیوم برمید) تترازولیوم (MTT) از شرکت سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. آنتی بادی های اولیه برای عامل القا کننده هیپوکسی-1 (HIF{14}})، فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF)، لنفوم سلول B-2 (Bcl{16}})، Bcl{17 }} پروتئین X مرتبط (Bax)، کاسپاز{18}}، سیتوکروم C و -اکتین همگی از Abcam (کمبریج، انگلستان) خریداری شدند. آنتی بادی های ثانویه از شرکت ZsBio (پکن، چین) به دست آمد.

یک کیت تجزیه و تحلیل آپوپتوز از موسسه بیوتکنولوژی Beyotime (جیانگسو، چین) به دست آمد. تمام مواد شیمیایی و حلال ها دارای درجه تحلیلی بودند و از یک تامین کننده تجاری در چین به دست آمدند. کشت سلولی سلول‌های PC12 از بانک سلولی آکادمی علوم چین (TCR 9، شانگهای، چین) خریداری شد و در DMEM با 10 درصد (v/v) FBS، 100 واحد در میلی‌لیتر پنی‌سیلین، و 100 واحد بر میلی‌لیتر استرپتومایسین نگهداری شد. در دمای 37 درجه در انکوباتور مرطوب حاوی 5 درصد CO2. برای ارزیابی سمیت سلولی نورووگونین، سلول‌های PC12 (پاساژ 4 تا 6) با غلظت‌های مختلف (10-8، 10-7، 10-6، 10-5، 10-4 mol/L) از نور ووگونین از قبل انکوبه شدند. 1 ساعت و سپس به مدت 24 ساعت کشت داده شود. قرار گرفتن در معرض هیپوکسی برای القای مدل آسیب هیپوکسی سلولی، سلول‌های PC12 تحت یک محیط هیپوکسی (1 درصد O2، 5 درصد CO2، و 94 درصد N2) در دمای 37 درجه به مدت 24 ساعت در یک محفظه مرطوب قرار گرفتند. سلول های کنترل نورموکسیک در دمای 37 درجه در انکوباتور 5 درصد CO2 به مدت 24 ساعت کشت داده شدند.

برای ارزیابی اثر محافظتی نورووگونین در برابر آسیب ناشی از هیپوکسی، سلول‌های PC12 با غلظت‌های مختلف از قبل انکوبه شدند (1{17}}-8، 1{21}}-7، 10-6، 10-5 mol/ L) نوروگونین به مدت 1 ساعت قبل از درمان هیپوکسی. زنده ماندن سلول زنده ماندن سلول ها با روش MTT اندازه گیری شد همانطور که قبلا توضیح داده شد [31]. به طور خلاصه، سلول های PC12 (1 × 105 سلول در میلی لیتر) در پلیت های کشت 96 چاهی کاشته شدند. سپس غلظت های مختلف نوروگونین به چاهک ها اضافه شد. حجم مساوی DMSO به چاه های کنترل اضافه شد. غلظت نهایی DMSO در محیط کشت سلولی 0.1 درصد است. پس از انکوباسیون در شرایط نرموکسیک یا هیپوکسی، 10 میکرولیتر MTT (5.0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر) به هر چاهک اضافه شد و سپس در دمای 37 درجه به مدت 4 ساعت انکوباسیون شد. سپس مایع رویی با MTT خارج شد و محصول فورمازان در 100 میکرولیتر DMSO حل شد. میزان جذب روی میکروپلیت خوان SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) در 570 نانومتر اندازه‌گیری شد. نتایج به عنوان درصد نسبی گروه کنترل بیان شد. سلول‌های PC12 رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (HE) که روی پوشش‌های شیشه‌ای کاشته شده بودند به مدت 24 ساعت انکوبه شدند قبل از اینکه با نوروگونین به همان روشی که در بالا توضیح داده شد درمان شوند.

محیط برداشته شد و ورقه های شیشه ای با PBS سرد شسته شدند و سپس با متانول به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند و سپس با PBS سرد سه بار به مدت 5 دقیقه شسته شدند. در نهایت، سلول ها طبق پروتکل رنگ آمیزی HE [32] رنگ آمیزی شدند. تجزیه و تحلیل سلول با استفاده از میکروسکوپ OLYMPUS IX73 (100×) به منظور بررسی تغییرات مورفولوژیکی سلول انجام شد. تصاویر دیجیتال با استفاده از دوربین دیجیتال DXM 1200 C (Nikon) مرتبط با میکروسکوپ به دست آمد. محتوای ROS سطح ROS داخل سلولی در سلول‌های PC12 با استفاده از روش DCFH-DA تعیین شد [33]. به طور خلاصه، سلول‌های PC12 (1 × 105 سلول در میلی‌لیتر) در 6-صفحه‌های چاه کاشته شدند. پس از درمان هیپوکسی، سلول های PC12 با PBS شسته و سپس در محیط کشت حاوی 10 میکرومولار DCFH-DA به مدت 30 دقیقه در تاریکی در دمای 37 درجه انکوبه شدند. سلول ها با میکروسکوپ فلورسانس معکوس Olympus (توکیو، ژاپن) مشاهده شدند و توسط فلوسیتومتر Bec ton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA) با طول موج تحریک 488 نانومتر و طول موج انتشار 525. سطح ROS به عنوان درصد نسبی کنترل بیان شد. نشت LDH، محتوای MDA و فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانی سلول های PC12 (105 × 1 سلول در میلی لیتر) در یک ظرف 90 میلی متری کاشته شدند. پس از درمان هیپوکسی همانطور که در بالا توضیح داده شد، 50 میکرولیتر رویی کشت از هر ظرف جمع‌آوری شد و فعالیت LDH در محیط با استفاده از کیت‌های سنجش تجاری (موسسه بیوتکنولوژی Jiancheng، نانجینگ، چین) شناسایی شد و به صورت U/ml بیان شد. سلول های PC12 پس از دو بار شستشو با PBS سرد برداشت و همگن شدند. غلظت پروتئین کل توسط کیت سنجش پروتئین BCA اندازه گیری شد. محتوای MDA و فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانی با استفاده از کیت های سنجش تجاری (موسسه بیوتکنولوژی Jiancheng، نانجینگ، چین) تعیین شد.

محتوای MDA به صورت nmol/mg پروتئین ارائه شد. فعالیت های SOD، CAT و GPx به عنوان پروتئین U/mg ارائه شد. آپوپتوز سلولی (رنگ‌آمیزی Annexin-V/PI) پس از درمان هیپوکسی، سلول‌های PC12 برداشت شدند، دو بار با PBS سرد شسته شدند و سپس با بافر اتصال تعلیق شدند. سلول ها با محلول Annexin V-FITC و PI مطابق پروتکل سازنده (Beyotime، شانگهای، چین) تیمار شدند. جمع آوری داده ها با استفاده از فلوسیتومتر Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA) انجام شد. تجزیه و تحلیل کمی PCR Real-time RNA کل سلول های PC12 با استفاده از معرف تریزول (Takara، Dalian، چین) استخراج شد و با استفاده از کیت معرف PrimeScript TM RT (AK4301،

تاکارا، دالیان، چین). cDNA کد کننده ژن HIF-1، VEGF، Bcl-2، Bax، کاسپاز-3، سیتوکروم C و گلیسرآلدئید{3}فسفات دهیدروژناز (GAPDH) با روش کمی واقعی تکثیر شد. زمان PCR با استفاده از یک سیستم تشخیص بلادرنگ 7300 (Applied Biosystems، CA، USA). پرایمرهای مورد استفاده در جدول 1 نشان داده شده است. شرایط چرخه PCR 95 درجه برای 30 ثانیه و به دنبال آن 40 سیکل 95 درجه برای 5 ثانیه و 60 درجه برای 31 ثانیه بود. سطوح mRNA با استفاده از روش 2-ΔΔCt محاسبه و به GAPDH، که ژن مرجع است، نرمال شد. سلول‌های وسترن بلات PC12 برداشت و در عوامل RIPA همگن شدند. غلظت کل پروتئین ها با استفاده از کیت سنجش پروتئین BCA اندازه گیری شد. 30 میکروگرم از نمونه ها بر روی 12 درصد الکتروفورز SDS-PAGE تجزیه و سپس به غشاهای پلی وینیلیدین فلوراید (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA) منتقل شدند.

غشاها با شیر خشک بدون چربی 5 درصد در بافر TBST به مدت 1 ساعت در دمای اتاق مسدود شدند و با آنتی بادی های اولیه: anti-HIF{4}} (1:3{39}}0، ab179483، Abcam، انکوبه شدند. UK), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, UK), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, UK), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, UK)، آنتی کاسپاز{21}} (1:300, ab44976, Abcam, UK), آنتی سیتوکروم C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) و آنتی{28}}اکتین (1:2000, ab8227) , Abcam, UK) در 4 درجه در طول شب. سپس غشاها شسته و با آنتی بادی های ثانویه (1:2000، ZsBio، پکن، چین؛) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. باندهای واکنش‌پذیر با استفاده از معرف‌های لومینسانس شیمیایی افزایش یافته (ECL) مشاهده شدند. شدت نسبی باندها به کنترل داخلی -اکتین نرمال شد و با استفاده از Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA) آنالیز شد.

تحلیل آماری

نتایج به صورت میانگین ± انحراف معیار به دست آمده از حداقل سه آزمایش مستقل بیان شد. تفاوت بین گروه ها با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و سپس آزمون تعقیبی Student-Newman- Keuls مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. P-value 0.05 < 0="" از="" نظر="" آماری="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

نتایج

سلول های محافظ نورووگونین PC12 در برابر آسیب ناشی از هیپوکسی

ابتدا، برای جلوگیری از فعالیت پرولیفراتیو نورووگونین، سمیت سلولی آن بر روی سلول‌های PC12 طبیعی با استفاده از روش MTT تعیین شد. همانطور که در شکل 2a مشاهده می شود، تکثیر سلولی پس از درمان با نوروگونین در غلظت های 1 × 1 0- 8 -1 × 10- 5 mol/L به طور قابل توجهی تغییر نکرد (P > 0.05 ). با این حال، زنده ماندن سلولی به طور قابل توجهی کاهش یافت زمانی که غلظت نوروگونین به 1 × 10-4 mol / L افزایش یافت (P <0.05). نتایج="" نشان="" داد="" که="" نوروگونین="" سمیت="" یا="" فعالیت="" تکثیری="" بر="" روی="" سلول‌های="" pc12="" در="" غلظت‌های="" 1="" ×="" 10-="" 8="" -1="" ×="" 10-5="" mol/l="" نشان="">

سپس اثر محافظتی نوروگونین را در برابر آسیب سلول‌های PC12 ناشی از هیپوکسی بررسی کردیم. همانطور که در شکل 2b نشان داده شده است، در مقایسه با گروه کنترل، زنده ماندن سلولی در گروه هیپوکسی به 58.71 درصد کاهش یافت (P < 0.01).="" در="" مقایسه="" با="" درمان="" هیپوکسی،="" قبل="" از="" درمان="" با="" 1="" ×="" 10-="" 8،="" 1="" ×="" 10-="" 7،="" و="" 1×10-="" 6="" mol/l="" نورووگونین="" pc12="" محافظت="" شده="" وابسته="" به="" دوز="" سلول‌ها="" در="" برابر="" آسیب="" ناشی="" از="" هیپوکسی،="" زنده‌مانی="" سلولی="" را="" به="" ترتیب="" از="" 71/58="" تا="" 79/62="" درصد="" (05/0="">P)، 68/66 درصد (01/0>P) و 88/69 درصد (01/0>P) بازیابی می‌کنند. پیش تیمار با روتین 1×10-6 mol/L نیز یک اثر محافظتی از خود نشان داد و به طور قابل توجهی زنده ماندن سلول را به 63.78 درصد در مقایسه با درمان هیپوکسی افزایش داد. زنده ماندن پیش تیمار شده با نوروگونین 1×10-5 mol/L به 63.43 درصد کاهش یافت که هنوز به طور قابل توجهی بالاتر از گروه هیپوکسی است (05/0 > P). این نتایج نشان داد که نورووگونین در غلظت‌های 1 × 10- 8 -1 × 10-5 مول در لیتر محافظت سلولی قابل توجهی نشان داد و موثرترین غلظت 1 × 10-6 مول در لیتر است. سپس این دوز به عنوان دوز بهینه در آزمایشات زیر مورد استفاده قرار گرفت.

ظرفیت حفاظتی نوروگونین نیز با تغییرات مورفولوژیکی تایید شد. همانطور که در شکل 2c نشان داده شده است، سلول های PC12 بدون درمان هیپوکسی با اشکال منظم (دوکی شکل) و اندازه های یکنواخت به خوبی رشد کردند. پس از قرار گرفتن در معرض هیپوکسی، سلول های PC12 انقباض، شکل گرد، پوسته پوسته شدن و کاهش تراکم سلولی را نشان دادند. سلول هایی که قبل از قرار گرفتن در معرض هیپوکسی با نوروگونین یا روتین پیش تیمار شده بودند، بهتر رشد کردند، تعداد سلول های لایه برداری کاهش یافت و شکل سلول به طور طبیعی بهبود یافت. علاوه بر این، توانایی محافظتی نوروگونین توسط نشت LDH تأیید شد که با از دست دادن یکپارچگی غشای سلولی همراه است. همانطور که در شکل 2d نشان داده شده است، فعالیت LDH در محیط کشت به طور قابل توجهی به دنبال مواجهه با هیپوکسی افزایش یافت (01/0 <>

پیش درمانی با نورووگونین یا روتین به طور چشمگیری نشت LDH را کاهش داد، که نشان می دهد نوروگونین و روتین یکپارچگی غشای سلولی را بازیابی کردند. نورووگونین استرس اکسیدانی ناشی از هیپوکسی را در سلول های PC12 مهار می کند ROS و MDA دو شاخص مهم استرس اکسیدان سلولی ناشی از هیپوکسی هستند. همانطور که در شکل 3a و b نشان داده شده است، افزایش قابل توجهی محتوای ROS و MDA در سلول های PC12 به دنبال مواجهه با هیپوکسی مشاهده شد. نوروگونین یا پیش تیمار روتین به طور قابل توجهی تولید ROS و MDA را مهار کرد.

آنزیم های آنتی اکسیدانی مانند SOD، CAT و GPx به عنوان سیستم دفاعی اصلی در برابر استرس اکسیداتیو در سلول ها در نظر گرفته می شوند. همانطور که در شکل 3c-e نشان داده شده است، قرار گرفتن در معرض هیپوکسی به طور قابل توجهی فعالیت های SOD، CAT و GPx را در سلول های PC12 مهار می کند. درمان با نوروگونین یا روتین این تغییرات را معکوس کرد و فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی را بازسازی کرد. همه این نتایج نشان داد که نوروگونین از سلول‌های PC12 در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از هیپوکسی محافظت می‌کند.