قسمت 1: اکیناکوزید با سرکوب Ca2 وابسته به ولتاژ به اضافه ورودی و پروتئین کیناز C در پایانه های عصبی مغزی مغز موش، آزادسازی گلوتامات را مهار می کند.

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

چنگ وی لو 1،2، تزو یو لین 1،2، شو کوئی هوانگ 1 و سو جین وانگ 3،*

خلاصه:

سیستم گلوتاماترژیک ممکن است در اثرات درمان های محافظت کننده عصبی نقش داشته باشد.اکیناکوزید، یک گلیکوزید فنیل اتانوئید استخراج شده از گیاه دارویی چینیهربا سیستانچ، دارای اثرات محافظت کننده عصبی است. این مطالعه به بررسی اثراتاکیناکوزیددر مورد آزادسازی گلوتامات برانگیخته شده توسط آمینوپیریدین در پایانه های عصبی قشر مغز موش صحرایی (سیناپتوزوم) اکیناکوزید آزادسازی گلوتامات ناشی از آمینوپیریدین را به روشی وابسته به غلظت مهار کرد، اما نه وابسته به Ca2 به علاوه، آزادسازی گلوتامات را مهار کرد. Echinacoside همچنین افزایش 4-آمینوپیریدین برانگیخته در غلظت Ca2 آزاد سیتوپلاسمی به علاوه کاهش داد اما پتانسیل غشای سیناپتوزومی را تغییر نداد. اثر مهاری اکیناکوزید بر انتشار گلوتامات برانگیخته شده با آمینوپیریدین توسط o-conotoxin MVIIC، مسدودکننده طیف گسترده کانال‌های Cav2.2 (نوع N) و Cav2.1 (نوع P/Q) جلوگیری شد. ، اما به مهارکننده های Ca2 داخل سلولی دانترولن و 7-کلرو-5-(2-کلروفنیل)-1،5-دی هیدرو-4 درون سلولی حساس نبود. ،1-بنزودیازپین-2(3H) -one (CGP37157). علاوه بر این، اکیناکوزید فسفوریلاسیون پروتئین کیناز C ناشی از آمینوپیریدین را کاهش داد و مهارکننده‌های پروتئین کیناز C اثر اکیناکوزید را بر آزادسازی گلوتامات لغو کردند. با توجه به این نتایج، ما پیشنهاد می‌کنیم که اثر مهاری اکیناکوزید بر رهاسازی گلوتامات برانگیخته با کاهش ورود Ca2 وابسته به ولتاژ و متعاقب آن سرکوب فعالیت پروتئین کیناز C همراه است.

کلید واژه ها:اکیناکوزید؛ انتشار گلوتامات؛ پایانه های عصبی مغزی؛ کانال های Ca2 پلاس وابسته به ولتاژ. پروتئین کیناز C

1. مقدمه

اکیناکوزیدیک گلیکوزید فنیل اتانوئید اصلی موجود درهرباسیستانچ، یک طب سنتی معروف چینی است که برای درمان فراموشی، ناتوانی جنسی و یبوست مزمن استفاده می شود [1].اکیناکوزیددارای فعالیت های زیستی مختلفی مانند آنتی اکسیداسیون، ضد التهاب، ضد سرطان، محافظت از کبد و تعدیل ایمنی است [2-4]. قابل ذکر است، اکیناکوزید دارای اثرات محافظت کننده عصبی است. به عنوان مثال، می تواند در برابر سمیت عصبی ناشی از استرس اکسیداتیو یا نوروتوکسین در نورون های قشر اولیه موش صحرایی، سلول های نوروبلاستوما SH-SY5Y انسان و سلول های فئوکروموسیتوم (PC12) محافظت کند [5-8]. علاوه بر این، اکیناکوزید آسیب مغزی را کاهش می دهد و عملکرد شناختی را در مدل های حیوانی بیماری پارکینسون، بیماری آلزایمر و انسداد شریان مغزی میانی بهبود می بخشد [9-12]. با این حال، مکانیسمی که از طریق آناکیناکوزیدالقای محافظت عصبی به طور کامل درک نشده است.

محافظت عصبی فرآیند پیچیده ای برای حفظ ساختار و عملکرد نورون ها بر روی توهین های سمی است. کاهش سمیت برانگیختگی گلوتامات یک مکانیسم بالقوه درگیر در محافظت عصبی مغز در نظر گرفته می شود. گلوتامات، یک انتقال دهنده عصبی اسید آمینه تحریک کننده، نقش مهمی در چندین عملکرد مغز دارد [13]. با این حال، فعال شدن بیش از حد گیرنده‌های گلوتامات تحت غلظت‌های بالای گلوتامات باعث اضافه بار کلسیم داخل سلولی، اختلال عملکرد میتوکندری، تولید رادیکال‌های آزاد و مرگ عصبی می‌شود [14،15]. این فرآیند پاتولوژیک در بسیاری از اختلالات مغزی از جمله ایسکمی مغزی، آسیب تروماتیک مغزی، صرع و بیماری های عصبی دخیل است [16،17]. از این رو، مهارکننده هایی که انتقال گلوتاماترژیک پاتوفیزیولوژیک را مسدود می کنند، داروهای بالقوه محافظت کننده عصبی در نظر گرفته می شوند. نمونه‌های قابل‌توجهی از این‌ها آنتاگونیست‌های گیرنده گلوتامات هستند [18،19]. با این حال، آزمایشات بالینی برای این داروها به دلیل اثربخشی کمتر و عوارض جانبی نامطلوب یا حتی سیتوتوکسیک شکست خورده است [20،21]. علاوه بر محاصره مستقیم گیرنده گلوتامات، مهار انتشار گلوتامات ممکن است یک استراتژی موثر برای محافظت عصبی باشد. چندین محافظ عصبی (مانند ممانتین و ریلوزول) می توانند آزادسازی گلوتامات را در بافت های مغز موش کاهش دهند [22-24].

با توجه به نقش گلوتامات در سمیت تحریکی و نمایه محافظ عصبی اکیناکوزید، مطالعه حاضر از پایانه های عصبی جدا شده (سیناپتوزوم) خالص شده از قشر مغز موش برای بررسی اثر اکیناکوزید بر آزادسازی گلوتامات و بررسی بیشتر مکانیسم های بالقوه استفاده کرد. آماده سازی پایانه عصبی جدا شده یک مدل به خوبی تثبیت شده برای مطالعه تنظیم پیش سیناپسی آزاد شدن انتقال دهنده های عصبی توسط داروها در غیاب هر گونه اثرات پس سیناپسی است [25]. با استفاده از این مدل، ما اثر اکیناکوزید را بر آزادسازی گلوتامات، پتانسیل غشا، هجوم Ca2 پیش سیناپسی و فعالیت پروتئین کیناز C ارزیابی کردیم. با توجه به بررسی ما از ادبیات، این اولین گزارشی است که مکانیسمی را مستند می کند که از طریق آن اکیناکوزید آزادسازی گلوتامات درون زا را در سطح پیش سیناپسی مهار می کند.

2. نتایج

2.1. اکیناکوزیدبا کاهش اگزوسیتوز وزیکولار، آزادسازی گلوتامات برانگیخته شده توسط آمینوپیریدین را از پایانه های عصبی مغزی مغز موش مهار می کند.

شکل 1 اثر وابسته به غلظت اکیناکوزید را بر انتشار گلوتامات برانگیخته شده توسط آمینوپیریدین از سیناپتوزوم های قشر مغز موش صحرایی خالص شده نشان می دهد. در سیناپتوزوم‌هایی که با 1 میلی‌مولار CaCl2 انکوبه شده‌اند، 1 میلی‌مولار {{7}آمینوپیریدین آزادسازی گلوتامات 7.4 ± {{1{{2{24}}}}}}.1 نانومول در میلی‌گرم در 5 دقیقه را برانگیخت که کاهش یافت. توسط 1، 5، 1{28}}، 30 و 50 میکرومولار اکیناکوزید به 0.2 ± 6.5، 0.3 ± 5.8، 0.2 ± 4.8،

4.1 ± 0.1، یا 2.3 ± 0.4 نانومول در میلی‌گرم/5 دقیقه، به ترتیب (F(5،24)=67.1، p=0. 000). مقدار IC50 برای مهار آزادسازی گلوتامات برانگیخته با آمینوپیریدین با واسطه اکیناکوزید، که از منحنی دوز-پاسخ به دست می‌آید، 24 میکرومولار بود. علاوه بر این، آزادسازی گلوتامات توسط 1 میلی‌مولار 4-آمینوپیریدین در محلول خارج سلولی Ca2 به اضافه‌ی آزاد حاوی 300 میکرومولار اتیلن گلیکول بیس (-آمینو اتیل اتر)-N,N,N/,N/-تترااستیک اسید (EGTA) برانگیخته شد. 2 بود.

و این جزء مستقل از Ca2 به علاوه آزادسازی گلوتامات ناشی از آمینوپیریدین تحت تأثیر 2{7}} uM اکیناکوزید قرار نگرفت (1.8 ± 0.2 نانومول در میلی‌گرم/5 دقیقه؛ p 0}}.58؛ شکل 1). در سیناپتوزوم‌های تیمار شده با 0.1 uM بافیلومایسین A1، یک مهارکننده ناقل وزیکولی [26]، انتشار گلوتامات برانگیخته با آمینوپیریدین به طور قابل‌توجهی کاهش یافت (2.2 ± 0.2 نانومول در میلی‌گرم/ 5 دقیقه؛ F (2،12)=249.518، p=0.000). در حضور بافیلومایسین A1، 2{65}} uM اکیناکوزید نتوانست به طور قابل توجهی آزادسازی گلوتامات را مهار کند (2.1 ± 0.2 nmol/mg/5 دقیقه؛ p=0.94؛ شکل 1). در مقابل، 10 میکرومولار DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA، یک مهارکننده بازجذب گلوتامات) [27]، آزادسازی گلوتامات ناشی از آمینوپیریدین را به 0.4 ± 11.8 نانومول در میلی‌گرم در 5 دقیقه افزایش داد. t(8)=-11.31, p=0.000). حتی در حضور DL-TBOA، اکیناکوزید 20 میکرومولار، آزادسازی گلوتامات ناشی از آمینوپیریدین را به طور قابل توجهی مهار کرد (7.7 ± 0.2 نانومول در میلی‌گرم/5 دقیقه؛ F(2،12)=87}}، ص.=0.000؛ شکل 1).

2.2 اکیناکوزید غلظت Ca2 سیتوزولی را کاهش می دهد اما پتانسیل غشای سیناپتوزومی را تغییر نمی دهد

دپلاریزاسیون سیناپتوزوم ناشی از 1 میلی مولار 4-آمینوپیریدین باعث افزایش غلظت Ca2 به علاوه (p=0.000؛ جدول 1) شد. استفاده از اکیناکوزید 20 میکرومولار تأثیر قابل توجهی بر غلظت کلسیم پایه به اضافه (t(8)=0}.06، p=0.95) نداشت، اما به طور قابل توجهی افزایش ناشی از آمینوپیریدین را کاهش داد. غلظت Ca2 به اضافه (t(10)=6.16, p=0.{20}}). علاوه بر این، 1 میلی‌مولار 4-آمینوپیریدین در فلورسانس 3'،3'،3'-dipropylthiadicarbocyanine [DiSC3(5)] فلورسانس افزایش یافت.{30}}. افزودن 20 میکرومولار اکیناکوزید پتانسیل استراحت غشاء را تغییر نداد (t(8)=0.976, p=0.36) یا به طور قابل توجهی افزایش 4-آمینوپیریدین در DiSC3 را تغییر نداد. (5) فلورسانس (t(8)=-0.014, p=0.99؛ جدول 1).

2.3 کاهش هجوم Ca2 به علاوه از طریق کانال های Cav2.2 (نوع N) و Cav2.1 (نوع P/Q) ممکن است با مهار 4-آمینوپیریدین برانگیخته گلوتامات توسط اکیناکوزید مرتبط باشد.

شکل 2 نشان می دهد که 2 uM o-conotoxin MVIIC، یک مسدود کننده کانال Ca2 به علاوه نوع N- و P/Q، آزادسازی گلوتامات ناشی از آمینوپیریدین را از 7.4 ± {{{0}} کاهش داد. 2 تا 2. 0 ± 0.1 نانومول در میلی‌گرم/5 دقیقه (t(9)=25.35، p=0.000). در حضور o-conotoxin MVIIC، اثر 20 میکرومولار اکیناکوزید بر آزادسازی گلوتامات ناشی از آمینوپیریدین غیر قابل توجه بود (1.{27}}± به علاوه 0.2 نانومول در میلی‌گرم در 5 دقیقه؛ t(8)=1.06,p=0.32). دانترولن (10 میکرومولار)، یک مهارکننده آزادسازی کلسیم داخل سلولی از اندوپلاسمی

شبکه [28]، کاهش 4-آزادسازی گلوتامات برانگیخته با آمینوپیریدین (5.6 ± 0.3 نانومول/میلی گرم/5 دقیقه؛ F(2،14) {{1{17}}}}. 95، ص=0.000). با این حال، در حضور دانترولن، 20 میکرومولار اکیناکوزید همچنان می‌تواند آزادسازی گلوتامات را به‌طور قابل‌توجهی مهار کند (3.3 ± 0.2 نانومول/میلی‌گرم/5 دقیقه؛ p {20}}.{21}}). نتایج مشابهی با استفاده از 100 میکرومولار 7-کلرو{24}}(2-کلروفنی)-1،5-دی هیدرو{28}}،1-بنزوتیازپین مشاهده شد. {30}}(3H)-one (CGP37157)، یک مسدود کننده نفوذپذیر غشایی از تبادل سدیم به علاوه /Ca2 به علاوه میتوکندری. در پنج فرآورده سیناپتوزومی مورد بررسی، 20 میکرومولار اکیناکوزید همراه با 100 میکرومولار CGP37157 باعث کاهش انتشار گلوتامات برانگیخته با آمینوپیریدین به میزان 2/5 ± 3/48 درصد شد (F(2،13) {{47}، 49}}.{50}})، مشابه مهار توسط اکیناکوزید به تنهایی (46.2 ± 2.3 درصد؛ p=0.89؛ شکل 2).

2.4 اکیناکوزیدبا ارسال سیگنال از طریق پروتئین کیناز C، آزادسازی گلوتامات برانگیخته شده توسط آمینوپیریدین را مهار می کند.

همانطور که در شکل 3 نشان داده شده است، 10 uM 2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl) maleimide (GF109203X)، یک بازدارنده عمومی پروتئین کیناز C [29]، انتشار گلوتامات برانگیخته شده با آمینوپیریدین را کاهش داد (F(2,13) ​​= 19.46, p=0.{17} }}). در سیناپتوزوم‌های تیمار شده با GF109203X، اکیناکوزید 20 میکرومولار آزادسازی گلوتامات ناشی از آمینوپیریدین را تنها 1.8 ± 5.5 درصد کاهش داد (89.0 ± 5.5 درصد)، که کمتر از آن تنها توسط اکیناکوزید (2 ± 42.3 درصد). درصد ؛ p=0.000). نتایج مشابهی با 5،6،7،13-تتراهیدرو{39}}متیل-5-oxo{41}}H-indolo[2،3-}a]pyrrolo[3 به دست آمد. ، 4-c]carbazole{47}}propanenitrile (Go6976)، یک ایزوفرم انتخابی برای ایزوفرم های Ca2 به علاوه پروتئین کیناز C وابسته به پروتئین (, I, II, y) [29]. در حضور 3 میکرومولار Go6976، 20 میکرومولار اکیناکوزید آزادسازی گلوتامات را 2.9 ± 11.9 درصد کاهش داد (P 65}}.000؛ شکل 3). در مقابل، 3 میکرومولار روتلرین، یک مهارکننده پروتئین کیناز C6 مستقل از Ca2 به علاوه [30]، به طور قابل توجهی آزادسازی گلوتامات برانگیخته شده با 4-آمینوپیریدین (1 میلی‌مولار) را تغییر نداد (p{76}}.45). با این وجود، در حضور روتلرین، 20 میکرومولار اکیناکوزید به طور موثر باعث مهار متوسط ​​5.6 ± 37.1 درصد از انتشار شد (F(2،13)=19.72، p=0.{88} }})، مشابه با اکیناکوزید به تنهایی (p=0.41؛ شکل 3). علاوه بر این، مهارکننده پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن 2-(2-آمینو-3-متوکسی فنیل){96}}H-1-بنزوپیران-4-وان) (PD98059 ) (50 میکرومولار) و مهارکننده پروتئین کیناز A N-[2-(p-bromocinnamylamino)ethyl]{104}}ایزوکینولین سولفونامید (H89) (100 میکرومولار) باعث کاهش انتشار گلوتامات ناشی از آمینوپیریدین شد. (p=0.{110}}). حتی در حضور PD98059 یا H89، 20 میکرومولار اکیناکوزید به طور موثر آزادسازی را کاهش داد (F(2,13) ​​= 52.3, p=0.{119}}؛ شکل 3).

شکل 4 نشان می دهد که 1 میلی مولار 4-آمینوپیریدین فسفوریلاسیون پروتئین کیناز C را در سیناپتوزوم ها افزایش داد (t(4)=-6.871، p=0.002). هنگامی که سیناپتوزوم ها با اکیناکوزید 20 میکرومولار به مدت 10 دقیقه قبل از افزودن {{10}آمینوپیریدین پیش تیمار شدند، 4-آمینوپیریدین فسفوریلاسیون پروتئین کیناز C را به طور قابل توجهی کاهش داد (F(2،6)=29.202 , p=0.001).

2.5 مهار انتشار گلوتامات با واسطه اکیناکوزید شامل گیرنده گاما آمینو بوتیریک اسید نوع A (GABAA) نمی شود

در شکل 5، اثر اکیناکوزید بر آزادسازی گلوتامات برانگیخته شده توسط آمینوپیریدین در غیاب یا حضور SR95531 (آنتاگونیست گیرنده گاباآ) مقایسه شد. علاوه بر این، 100 میکرومولار SR95531 به طور قابل توجهی تغییری در انتشار گلوتامات برانگیخته {{6}آمینوپیریدین (1 میلی‌مولار) نداد. در سیناپتوزوم‌های تحت درمان با SR، استفاده از اکیناکوزید 20 میکرومولار منجر به مهار 43 درصدی انتشار گلوتامات برانگیخته با آمینوپیریدین شد (F(2,12)=42.63, p {{12} {18}}.000)، که تفاوت قابل توجهی با مهار تولید شده توسط اکیناکوزید به تنهایی نداشت (40 درصد؛ p=0.000). نتیجه مشابهی با دیگر آنتاگونیست گیرنده گاباآ، بیکوکولین (50 میکرومولار) به دست آمد. آزادسازی اندازه‌گیری‌شده در حضور بیکوکولین و اکیناکوزید به‌طور قابل‌توجهی با آزادسازی به‌دست‌آمده در حضور بیکوکولین به تنهایی متفاوت بود (p=0.000).

3. بحث

در این مطالعه،اکیناکوزیدیک ترکیب فعال در هرباسیستانچ، آزادسازی گلوتامات برانگیخته شده توسط آمینوپیریدین در پایانه های عصبی قشر مغز موش صحرایی را مهار کرد. مکانیسم های احتمالی زمینه ای برایاکیناکوزیدمهار انتشار گلوتامات با واسطه در اینجا بیشتر مورد بررسی و بحث قرار می گیرد.

3.1 مکانیسم های نهفته در مهار انتشار گلوتامات با واسطه اکیناکوزید

آزادسازی گلوتامات برانگیخته شده توسط 4-آمینوپیریدین شامل دو جزء است: یک جزء وابسته فیزیولوژیکی Ca2 به علاوه وابسته، که از طریق اگزوسیتوز وزیکول های سیناپسی حاوی گلوتامات تولید می شود. و یک جزء مستقل از Ca2 به علاوه، که از دپلاریزاسیون طولانی‌مدت سرچشمه می‌گیرد که باعث جابجایی با واسطه پتانسیل غشایی در حالت ثابت ناقل گلوتامات به سمت خارج می‌شود، بنابراین بر جریان گلوتامات سیتوزولی تأثیر می‌گذارد [31]. در اینجا، مشاهده کردیم که اکیناکوزید به طور قابل توجهی از انتشار گلوتامات برانگیخته با آمینوپیریدین در حضور یک محیط بدون Ca2 به علاوه (انتشار مستقل Ca2 به علاوه) جلوگیری نمی کند. علاوه بر این، مهار مشاهده شده با واسطه اکیناکوزید از انتشار گلوتامات برانگیخته با آمینوپیریدین به طور موثر توسط بافیلومایسین A1 (که محتوای گلوتامات وزیکول های سیناپسی را کاهش می دهد) جلوگیری شد، اما نه توسط DL-TBOA (که به صورت غیرانتخابی اسید آمینه است) زیرگروه های حمل و نقل). این نتایج نشان می دهد که اکیناکوزید بر اگزوسیتوز وابسته به Ca2 به اضافه انتشار گلوتامات بدون تأثیر بر جریان سیتوزولی مستقل از Ca2 به علاوه گلوتامات از طریق معکوس شدن ناقل گلوتامات غشای پلاسمایی انتهایی عصبی تأثیر می گذارد. در پایانه های سیناپسی، مهار کانال Na به علاوه یا فعال شدن کانال K به علاوه تحریک پذیری غشاء را تثبیت می کند و در نتیجه ورود Ca2 برانگیخته و انتشار انتقال دهنده عصبی را کاهش می دهد [32،33]. بنابراین، مکانیسم بالقوه نهفته در مهار انتشار گلوتامات با واسطه اکیناکوزید شامل کاهش تحریک پذیری سیناپتوزومی است. با این حال، این احتمال بر اساس دو مشاهدات غیرقابل دفاع است: (1) 4-دپلاریزاسیون پتانسیل غشایی برانگیخته با آمینوپیریدین، اندازه‌گیری شده با رنگ حساس به پتانسیل غشاء DiSC3(5) با افزودن اکیناکوزید تحت تأثیر قرار نگرفت. و (2) اکیناکوزید بر 4-آمینوپیریدین برانگیخته شده Ca2 به اضافه گلوتامات مستقل تأثیری نداشت، جزء آزادسازی که فقط به پتانسیل غشاء بستگی دارد [31]. اگر این اثر ناشی از سرکوب تحریک پذیری سیناپتوزومی نباشد، ممکن است از طریق کاهش فعالیت کانال های Cav2.2 (نوع N) و Cav2.1 (نوع P/Q) Ca2 بعلاوه همراه با اگزوسیتوز گلوتامات در بدن آشکار شود. پایانه های عصبی [34-36]. با استفاده از فورا{47}}، نشان می‌دهیم که اکیناکوزید به طور قابل‌توجهی افزایش 4-آمینوپیریدین برانگیخته در غلظت Ca2 به علاوه را کاهش می‌دهد. علاوه بر این، داده‌های ما نشان می‌دهد که اثر مهاری اکیناکوزید بر انتشار گلوتامات برانگیخته با آمینوپیریدین از 42.4 درصد 2.3 درصد به 12.1 درصد 3.9 درصد پس از قرار گرفتن در معرض مسدودکننده‌های Cav2.2 (نوع N) و Cav2 کاهش یافته است. .1 (نوع P/Q) کانال های Ca2 plus. علاوه بر این، مشاهده کردیم که اکیناکوزید به طور قابل‌توجهی از انتشار گلوتامات برانگیخته با آمینوپیریدین در حضور مهارکننده‌های Ca2 داخل سلولی به‌علاوه مهارکننده‌های آزادسازی 4- ادامه می‌دهد. این نتایج نشان می‌دهد که سرکوب همزمان Cav2.2 (نوع N) و Cav2.1 (نوع P / Q) فعالیت کانال Ca2 به‌علاوه مکانیسم بالقوه نهفته در مهار انتشار گلوتامات با واسطه اکیناکوزید است. با این حال، فعال سازی ترکیبی Cav2.2 (نوع N) و Cav2.1 (نوع P/Q) Ca2 به علاوه فعالیت کانال نمی تواند عملکرد اکیناکوزید را به طور کامل مسدود کند. از این رو، انواع ناشناخته دیگر کانال های Ca2 به علاوه یا سایر مسیرهای پیش سیناپسی ممکن است در مهار دخیل باشند. به عنوان مثال، گیرنده های گاباآ در سطح پیش سیناپسی وجود دارند و نشان داده شده است که فعال شدن آنها هجوم Ca2 به علاوه و انتشار گلوتامات را مهار می کند [37]. در مطالعه حاضر، آنتاگونیست‌های گیرنده گاباآ SR95531 و بیکوکولین مانع از مهار آزادسازی گلوتامات با واسطه اکیناکوزید نشدند، که نشان می‌دهد گیرنده‌های گاباآ در کاهش فعالیت کانال Ca2 به علاوه وابسته به ولتاژ و در مهار متعاقب انتشار گلوتامات نقشی ندارند. ورود Ca2 پلاس از طریق کانال های Ca2 پلاس وابسته به ولتاژ، چندین پروتئین کیناز مرتبط با انتشار گلوتامات در پایانه های عصبی از جمله پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن، پروتئین کیناز C و پروتئین کیناز A را فعال می کند. در اینجا، نشان می دهیم که مهار کننده های پروتئین کیناز C به طور موثری با اکیناکوزید مخالفت می کنند. مهار انتشار گلوتامات با واسطه. با این وجود، مهارکننده پروتئین کیناز فعال شده با میتوژن PD98059 یا مهارکننده پروتئین کیناز A H89 بی اثر بود. علاوه بر این، فسفوریلاسیون پروتئین کیناز C ناشی از 4-آمینوپیریدین در سیناپتوزوم‌ها پس از پیش تیمار با اکیناکوزید در غلظتی موثر برای مهار آزادسازی گلوتامات کاهش یافت. بنابراین، مسیر سیگنالینگ مهار انتشار گلوتامات با واسطه اکیناکوزید ممکن است شامل پروتئین کیناز C باشد. پروتئین کیناز C یک سیستم سیگنال دهی مهم درون سلولی است که در سطح پیش سیناپسی وجود دارد و نقش مهمی در اگزوسیتوز انتقال دهنده عصبی دارد. به عنوان مثال، چندین پروتئین سیناپسی درگیر در قاچاق وزیکول سیناپسی یا استخدام و اگزوسیتوز، مانند سوبسترای C کیناز غنی از آلانین میریستویله شده، توسط پروتئین کیناز C فسفریله می شوند [38،39]. این فرآیند فسفوریلاسیون را می توان با ورود Ca2 به علاوه تحریک شده با دپلاریزاسیون افزایش داد که آزادسازی گلوتامات را تسهیل می کند [40]. از این رو، ما به طور منطقی می توانیم حدس بزنیم که اثر مهاری اکیناکوزید بر ورود Ca2 به علاوه مشاهده شده در اینجا ممکن است فعالیت پروتئین کیناز C و در نتیجه انتشار گلوتامات را کاهش دهد.

لطفا برای قسمت 2 اینجا را کلیک کنید