بخش اول: اثرات عصاره آبی سیستانچه توبولوسا بر میکروبیوتای روده موش های دارای اختلالات روده ای

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای کسب اطلاعات بیشتر

اختلالات میکروبیوتای روده با بسیاری از بیماری ها همراه است. *e aqueous extract fromسیستانچه توبلوسا (سی تی)، یک فرمول گیاهی سنتی چینی، گزارش شده است که نقش درمحافظت از روده انسان. با این حال، در مورد اثرات آن بر میکروبیوتا روده چیز کمی شناخته شده است. مطالعه حاضر با هدف تعيين اين که آيا عصاره آبی CT می تواند ميکروبوم روده را در موش های دارای اختلالات روده ای مدوله کند يا نه، انجام شد. ما متوجه شديم که آسيب ديده هاریفت شناسی رودهحاصل از درمان با cefixime می تواند با استفاده از عصاره آبی سی تی نجات. *مقایسه تنوع میکروبی بین موش های تحت درمان با عصاره سی تی و موش های کنترل نیز نشان داد که اختلال در جامعه میکروبیوم گروه های مدل می تواند با درمان با غلظت های بالا و متوسط عصاره آبی ترمیم شود. درمان با سیفیکسیم منجر به کاهش قابل توجهی در باکتری های اسید لاکتیک شد؛ با این حال، مکمل عصاره آبی سی تی رشد این باکتری های اسید لاکتیک را بازیابی کرد. علاوه بر این، عصاره آبی سی تی توانست تغییرات چشمگیر مسیرهای متابولیک میکروبیوم روده ناشی از افیکسیم را تعدیل کند. *ese findings provided an insight into the beneficial effects of the CT aqueous extract on gut microbiota, and they also provided a important reference for the development of related drugs in the future.

Cistanche برای روده آرامش بخش، لطفا کلیک کنیداینجابرای دانستن بیشتر

مقدمه

نشان داده اند که C.پلی ساکریدهای بیابانیکولاالقا melanogenesis درملانوسیت ها, کاهش استرس اکسیداتیو[15], کاهش اختلال عملکرد شناختی با تنظیم فرایندهای آنتی اکسیدانی و ضد التهابی در موش های صحرایی [16], محافظت از سلول هایPC12 در برابر آسیب ناشی از OGD / RP [17], افزایش جذب اکیناکوساید در ویوو, و تحت تاثیر قرار میکروبیوتا روده [18]. پروبیوتیک ها میکروارگانیسم های غیرپاتوژنیک زنده ای هستند که مزایای بهداشتی دارند و تعادل میکروبی کنفرانس در دستگاه گوارش هنگامی که به مقدار کافی تجویز می شوند [19]. *ey می تواند پاسخ های ایمنی سلولی غیر اختصاصی مشخص شده توسط فعال شدن ماکروفاژها، سلول های قاتل طبیعی (NK) و لنفوسیت های T سیتوتوکسیک خاص آنتیژن و آزاد شدن سیتوکین های مختلف به شیوه ای خاص کرنش و وابسته به دوز [20] را افزایش دهد. سویه های پروبیوتیک بهبود خواص اپیتالیوم روده از طریق مدولاسیون TJ, و سویه های پروبیوتیک خاص نشان داده شده است برای تنظیم بیان موسین, در نتیجه تاثیر بر خواص لایه مخاط و به طور غیر مستقیم تنظیم سیستم ایمنی روده [21]. سویه های باکتری های اسید لاکتیک (LAB) و بیفیدوباکتریوم پروبیوتیک های عمده ای هستند که در بسیاری از زمینه ها [۲۲–۲۶] مورد استفاده قرار گرفته اند. *مزایای سلامت eir متعدد هستند، با ظرفیت آنتی اکسیدانی خود را به عنوان یک عامل مهم در عملکرد های مربوط به سلامت خود را[27]. پروبیوتیک ها می توانند برای جلوگیری از اکسید شدن آن ها از اکسید شدن از کار بیفتند [28, 29]; آنها همچنین می توانند بیان آنزیم های آنتی اکسیدان را افزایش [30, 31]، تولید انواع متالیت ها با فعالیت آنتی اکسیدانی [32، 33]، مسیرهای سیگنالینگ آنتی اکسیدان میانجی [34–36]، و تنظیم آنزیم های تولید کننده گونه های اکسیژن واکنشی (ROS) و پاسخ میکروارگانیسم های روده ای به استرس اکسیداتیو[37]. یک مطالعه اخیر نشان داد که پلی ساکریدهای سی دی می تواند رشد برخی اسیدباکتری های لاکتیک را تحریک کند که می تواند به نفع سلامت انسان [38] باشد. با این حال، محتوای پلی ساکریدها در سی دی با آن در CT [7, 39] متفاوت است و این تفاوت ممکن است منجر به تاثیرات دیففرنت در میکروارگانیسم های روده ای شود. علاوه بر این، اگرچه پلی ساکریدهای سی دی می توانند استرس اکسیداتیو را کاهش دهند که مسیر NRF2/HO-1 [15] را فعال می کند، اما اثرات پلی ساکریدهای سی تی ممکن است با اثر کلی ترکیب های امولتیپ در سی تی متفاوت باشد. *ما، لازم است اثرات عصاره های آبی CT را بر میکروارگانیسم های روده ای به طور دقیق تعریف کنیم. علاوه بر این، طرفداران می توانند استرس اکسیداتیو [40] و سرکوب پاسخ های التهابی با میانجیگری لیپولیزاکسا با فعال کردن مسیر TheKeap1/Nrf2/HO-1 [41]. *قبل از آن، تعیین اثر عصاره آبی CT ارزش زیادی دارد. اثر برخی از اجزای تشکیل دهنده عصاره آبی بر استرس اکسیداتیو و فلور روده نشان می دهد که مقاومت به استرس اکسیداتیو ممکن است با تغییرات فلور روده همبستگی داشته باشد. به منظور پر کردن شکاف در دانش در موضوعات ذکر شده در بالا، ما به بررسی اثرات عصاره CTaqueous بر میکروبیوتا روده موش با اختلالات روده ایفلورا. *نتایج ese اطلاعات ارزشمندی در مورد مکانیسم های ممکن است که از طریق آن تغییر فلور روده و مصادره مقاومت روده به استرس اکسیداتیو ارائه.

2. مواد و روش ها

تجویز روزانه در 12:00 ساعت، و مواد دیگر روزانه در 15:00 ساعت تجویز شد. در طی آزمایش ها، گروه های C، D، E و F در حالت مدل اختلالات روده نگهداری می شدند. مدفوع هر هفت روز یک بار بر روی یک میز قابل اجرا استریل جمع آوری می شد و در −20°C.2.4 ذخیره می شد. مشاهده هيستوپاتولوژيکي روده بزرگ موشها . در پایان آزمایش، موش ها بر اثر درکردن دهانه رحم کشته شدند و محتویات روده بزرگ آن ها بر روی یک میز اپرابل استریل جمع آوری شد و در −۸۰ درجه سانتی گراد ذخیره شد؛ در همان زمان، نمونه های بافت کولونی در فرمالین خنثی 10 درصد ثابت شدند.en، نمونه ها با استفاده از غلظت گرادیان اتانول، هیالینیزه شده با استفاده از گزیلن، تعبیه شده در پارافین، بخش بندی شده و رنگ آمیزی شده با هماتوکسیلین هئوسین کم آب شدند. تغییرات مورفولوژیک در مخاط کولونی مشاهده و با استفاده از میکروسکوپ نوری مقایسه شد. طول پرز و عمق دخمه در روده بزرگ اندازه گیری شد و نسبت طول پرز به عمق دخمه (مقدار V/C) محاسبه شد (5/2).51. استخراج DNA و ساخت کتابخانه. DNA از مدفوع با استفاده از کیت DNA خاک E.Z.N.A ®(امگا بیو تک، Norcross، GA، ایالات متحده آمریکا) با توجه به پروتکل تولید کننده استخراج شد. کیفیت DNA با استفاده از فلوئورومتر (QuantiFluor™–ST، شرکت پرومگا، ایالات متحده آمریکا) تعیین شد. آغازگرهای جفت شده در منطقه V3-V4 rDNA 16s برای تقویت منطقه و تولید 466 قطعه DNA bp طراحی شده بودند. *e forward primer was 341F (-5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3-), and the reverse primerwas 806R (-5-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3-). حجم هرPCR 25 میکرول بود که حاوی 2.5 میکرول از 10 × PCR بوفر، 2 میکرول از dNTPs، 1 میکرول از هر پریم، و 20–30 ng از DNA الگو بود. *en، آداپتورهای نمایه شده برای تولید کتابخانه های توالی به انتهای آملیکون ها متصل شدند. کتابخانه ها با استفاده از فلورومتر کوانتی™ فلوئور اعتبار سنجی شدند و به 10 nmol.2.6 کمی شدند. 16s rRNA توالی ژن و بررسی جامعه میکروبی. برای به دست آوردن 2 تا 250 جفت شده × E Illumina platform (Illumina MiSeq) مورد استفاده قرار گرفت. واحدهای تاکسونمی عملیاتی (OTUs) با استفاده از نرم افزار Uparse از طریق خوشه بندی استاندارد با شباهت 97 درصد به دست آمد. *e naïve Bayesianassignment algorithm of the RDP classififier was used to align the OTUs with the Greengene database Release 13.5 and perform species annotation. *e تنوع آلفای میکروبیوتای روده با استفاده از شاخص های شانون و سیمپسون محاسبه شد و دیففرانس های بین گروه ها با استفاده از تجزیه و تحلیل تبعیض آمیز خطی اندازه اففکت (LEfSe) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. *e تنوع بتا با استفاده از تجزیه و تحلیل مختصات اصلی (PCoA) از عدم شباهت های برادی–کورتیس مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. PICRUSt2 برای تخمین ظرفیت متابولیک میکروبی میکروبیوم روده [42].2.7 استفاده شد. تجزیه و تحلیل داده های آماری. برای آناليز واريانس يک طرفه از نرم افزار SPSS 20 استفاده شد و داده های تجربی به صورت x ± S؛ X مقدار متوسط را نشان می دهد، و S نشان دهنده انحراف استاندارد است.

سیستانچه برای بهبود ایمنی

3. نتایج

3.1. 8 اثر عصاره آبی CT بر ریختن روده بزرگ.e ترکیبات نماینده (اکیناکوساید و استونید)و غلظت آنها از عصاره CT توسط HPLC (شکل S1) اعتبار سنجی شد. برای تعیین اثر عصاره آبی بر روده، ما به بررسی طول پرز روده بزرگ و عمق تعطیلی پس از درمان با عصاره آبی. *پرزهای کولون در گروه های نرمال و با دوز بالا (A، B و D) طولانی تر و انگشت مانند بودند، در حالی که پرزهای کولون در مدل و گروه های کم دوز (C و F) کوتاه بودند و نوک پرزهای کولون شکسته شد (شکل 1). بر این اساس عصاره آبی سی تی با دوز بالا طول پرزهای کولون و کاهش عمق تعطیلی موش های دارای اختلالات روده ای را در مقایسه با موش های گروه مدل به طور معنی داری افزایش داد (05/0P< 0.01).="" in="" contrast,="" recess="" depth="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" high-dose="" group="" and="" the="" normal="" group="" (p="">0.05) (جدول S1). *نتایج نشان داد که دوز بالای عصاره آبی سی تی می تواند ریولوژی داخل روده بزرگ موش های دارای اختلالات روده ای را بهبود بخشد.3.2. 8e اثر عصاره آبی CT بر تنوع میکروبیوتای گت. ما توالی ژن rRNA 16s را انجام دادیم تا علت بالقوه تغییرات مورفولوژیک داخل روده بزرگ را بررسی کنیم و تغییرات میکروبیوتای روده را به دنبال درمان با عصاره آبی CT بررسی کنیم. به طور متوسط ۱۰۰٬۵۵۳ تگ مؤثر، از ۷۷٬۷۳۴ تا ۱۲۵٬۱۴۴، از داده های خام (جدول S2) به دست آمد. *استگ ها به 4932 OTUs (جدول S3) خوشه بندی شدند. سپس تنوع میکروبیوتای روده را بر اساس تایسوس مورد تجزیه و تحلیل قرار دادیم. *e شاخص های شانون و سیمپسون تفاوتی بین گروه A (نرمال با عصاره آبی CT) و گروه B (نرمال بدون عصاره آبی CT) (شکل 2(a)) نشان دادند. *نشان داد که در موش های بدون درمان cefixime، عصاره آبی CT ممکن است هیچ اثرات مفید یا مضر اضافی بر تنوع آلفا از میکروبیوتا روده داشته است. اما تنوع α در گروه مدل (C) روند کاهشی را نسبت به آن در گروه های عادی نشان داد. *e موش های تحت درمان با عصاره های آبی CT با دوز متوسط و بالا نشانه هایی از بازیابی تنوع آلفا را نشان دادند، در حالی که چنین پدیده ای در موش های تحت درمان با عصاره آبی سی تی با دوز پایین (شکل 2(a)) مشاهده نشد. در همین حال، PCoA نشان داد که گروه های طبیعی (A و B) و گروه های اختلال روده با دوز بالا (D) و عصاره CTaqueous دوز میانی (E) تمایل به فاصله بین نمونه کوتاه تر از گروه مدل و در گروه مکمل عصاره CTaqueous با دوز پایین (F) (شکل 2(ب)). *نتایج نشان داد که عصاره آبی سی تی می تواند به بهبود تنوع میکروبیوتای روده در موش های دارای اختلالات روده ای کمک کند.

3.3. تغییرات در ترکیب روده میکروبیوتا درمان با عصاره سی تی آبی. پروفایل های ترکیب میکروبیوتا در گروه های مختلف مقایسه شدند. در سطح phylum، فراوانی نسبی پروتئوباکتری ها در گروه مدل بیشتر از آن در گروه های دیگر بود.

شکل 1: *e اثر عصاره آبی Cistanche tubulosa (CT) بر ریولوژی روده بزرگ: A, یک گروه طبیعی با دوز میانی aqueousCistanche tubulosa (CT) عصاره اضافه شده; ب، گروه عادی؛ ج، گروه مدل؛ D، گروه مدل با دوز بالا سی تی عصاره آبی اضافه شده؛ E، یک گروه مدل با دوز میانی سی تی عصاره آبی اضافه شده؛ F، یک گروه مدل با عصاره آبی سی تی با دوز پایین اضافه شده است. (a) GroupA. ب) گروه B.(c) گروه C.(d) گروه D(e) گروه E.(f) گروه F.

(شکل 3(a)). *e افزایش در پروتئوباکتری پیشنهاد کرد که میکروبیوم موش های مدل توسط cefixime تغییر کرده است و عصاره آبی CT ممکن است میکروبیوتا روده بهره مند به عنوان افزایش شیوع پروتئوباکتری ها نشانگر هاب فلور روده بی نظم [43–45]. علاوه بر این، در سطح جنس، فراوانی نسبی لاکتوباسیلوس در گروه مدل در مقایسه با آن در گروه های طبیعی و با دوز بالا کاهش یافت؛ با این حال، آن را در مقایسه با آن در گروه متوسط و کم دوز (شکل 3(ب)) افزایش یافته است. *این نتایج نشان داد که عصاره CTaqueous با دوز بالا ممکن است رشد برخی از باکتری ها را از جنس لاکتوباسیلوس ترویج. ميکروبيوتای تفکيکی بين گروه های مورد مطالعه با توجه به تحليل LEfSe بيشتر تعيين شد. تجزيه و تحليل نشان داد که بعد از درمان با سيفيکسيم، فراوانی نسبی توریسیباکتر، آلفاپروتئوباکتری، اسیدوباکتری، بتاپروتئوباکتریال ها و کلروفلفکسی به طور قابل توجهی افزایش یافت، در حالی که فراوانی نسبی لاکتوباسیلوس، Eubacterium_nodatum_group، پسودونوکاردیال ها، و Christensenellaceae_R-7_group در مقایسه با کسانی که در گروه عادی بودند به طور معنی داری کاهش یافت (شکل 4(a)). به طور چشمگیری، هنگامی که گروه مدل با عصاره آبی سی تی با دوز بالا تکمیل شد، فراوانی نسبی موریباکولاسه، لاکتوباسیلوس، کینوستوریاسه، یوباکتریوم هیچ گروه دتوم، و پدوباکترویر به طور قابل توجهی در مقایسه با گروه مدل افزایش یافت. در ضمن فراوانی نسبی رودوباکتر، رومینوکوکاسه UCG_013، رزبوریا، Ruminiclostridium_9 و کاندیداتوس استوکفیفیچوس نسبت به افراد گروه مدل به طور معنی داری کاهش یافت (شکل 4(ب))

شکل 2: تجزیه و تحلیل تنوع میکروبیوتا روده مدفوع موش. (a) α تنوع جوامع باکتری اندازه گیری شده توسط شاخص شانون (A)و شاخص سیمپسون (B)؛ ب) تجزیه و تحلیل مختصات اصلی (PCoA) رسم تجسم داده ها بر اساس شباهت های برای کورتیس. A, گروه نرمال با دوز میانی آبی عصاره Cistanche tubulosa (CT) اضافه شده; ب، گروه عادی؛ ج، گروه مدل؛ D، گروه مدل با دوز بالا سی تی عصاره آبی اضافه شده؛ E، گروه مدل با دوز میانی سی تی عصاره آبی اضافه شده؛ F، گروه مدل با عصاره آبی CT با دوز پایین اضافه شده است.