قسمت 1|عصاره گیاه سیستانچ تولید ATP میتوکندری را در قلب موش صحرایی و سلول های H9c2 افزایش می دهد.

تماس: emily.li@wecistanche.com

هوی یان لیونگ و کام مینگ کو

گروه بیوشیمی، دانشگاه علم و فناوری هنگ کنگ، خلیج آب شفاف، هنگ کنگ SAR، چین

کلمات کلیدی: ATPCistanche deserticola، سلول های H9c2، قلب، میتوکندری

خلاصه

برای بررسی اساس فارماکولوژیک "یانگ- نیروبخشعمل گیاه سیستانش [گیاه کامل خشک شده ازCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae)]، در طب چینی، اثرات عصاره متانولی گیاه هربا سیستانچ بر ظرفیت تولید ATP میتوکندریایی با استفاده از یک مدل قلب موش صحرایی در شرایط in vivo و یک روش سلولی H9c2 درجا مورد بررسی قرار گرفت. درمان با عصاره گیاه هربا سیستانچ ظرفیت تولید ATP میتوکندری میوکارد را به روشی وابسته به دوز در موش‌ها افزایش داد، همانطور که با اندازه‌گیری آزمایشگاهی ارزیابی شد. تحریک ظرفیت تولید ATP با افزایش موازی در حمل و نقل الکترون میتوکندری همراه با پیرووات اما نه سوکسینات همراه بود. درمان Herba Cistanche همچنین فعالیت‌های مجتمع میتوکندری I و Complex III میوکارد را افزایش داد و میزان تحریک در فعالیت پیچیده I بیشتر بود. درمان Herba Cistanche باعث افزایش وابسته به دوز و زمان در ظرفیت تولید ATP میتوکندری در سلول‌های H9c2 شد. نتایج نشان می دهد که درمان هربا سیستانچ می تواندافزایش تولید ATP میتوکندریاییدر قلب موش های آزمایشگاهی و سلول های H9c2 در محل، احتمالا از طریقافزایش فسفوریلاسیون اکسیداتیو.

سیستانچ می تواند عملکرد قلب را بهبود بخشد، فشار خون را کاهش دهد و چربی خون را کاهش دهد

مقدمه

"تقویت یانگ" که مظهر افزایش تعمیم عملکرد بدن در طب چینی است، شامل استفاده از انرژی در هدایت فرآیندهای مختلف بیوشیمیایی است.

در این راستا، ATP که ارز جهانی انرژی در سوخت رسانی عملکرد سلولی است، عمدتاً از طریق فسفوریلاسیون اکسیداتیو در میتوکندری تولید می شود. ما فرض کرده ایم که گیاهان "یانگ نیروبخش".دارای توانایی افزایش ظرفیت تولید ATP میتوکندریایی است(کو و همکاران، 2004). این با یافته اخیر ما تأیید می‌شود که گیاهان تقویت‌کننده چینی "یانگ تقویت‌کننده" اما نه "یین مغذی" می‌توانند ظرفیت تولید ATP میوکارد را در قلب موش‌ها افزایش دهند (کو و همکاران، 2006). Herba Cistanche، گیاه انگلی خشک شده (به استثنای گل) Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae)، به عنوان یک گیاه طبقه بندی می شود.'گیاه تقویت کننده یانگ تقویت کننده در طب سنتی چینی (چن، 1998)، و به عنوان محبوب ترین ماده در تعدادی از فرمولاسیون های ثبت اختراع چینی که برای تقویت یانگ استفاده می شود، ظاهر می شود. در چین و ژاپن، هربا سیستانچ به طور گسترده برای درمان تعدادی از علائم کمبود یانگ استفاده می شود. مطالعات فارماکولوژیک نشان داد که هربا سیستانچ می تواندرادیکال های آزاد را از بین می برد(Xiong و همکاران، 1996)،آرام بخش تولید کند(لو، 1998)،ضد پیری(لی و همکاران، 1990)،اثرات ضد درد و ضد التهابی(لین و همکاران، 2002)، وافزایش عملکرد سیستم ایمنی(وو و همکاران، 2005). ماده اصلی فعال هربا سیستانچ استگلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی(Ouyang et al., 2003)، که مشخص شده استآنتی باکتریال، ضد استرس و آنتی اکسیدانخواص (Xiong و همکاران، 1998)، و همچنین اثرات ضد آپوپتوز بر روی سلول های عصبی کشت شده (Tian & Pu, 2005). در مطالعه حاضر، به منظور بررسی اساس فارماکولوژیک اثر تقویت کننده یانگ هربا سیستانچ، اثرات تیمار هربا سیستانچ بر ظرفیت تولید ATP در میتوکندری های جدا شده از قلب موش صحرایی در شرایط in vivo و کاردیومیوسیت های H9c2 کشت شده در محل مورد بررسی قرار گرفت. برای کشف مکانیسم بیوشیمیایی زیربنای عملکرد افزایش تولید ATP، اثرات درمان هربا سیستانچ بر انتقال الکترون میتوکندری و فعالیت های پیچیده I-IV نیز در قلب موش مورد بررسی قرار گرفت.

ترکیبات موثر سیستانچ می تواند رادیکال های آزاد اکسیژن فعال مختلف را از بین ببرد

مواد و روش ها

مواد شیمیایی، کشت سلولی و مواد گیاهی

ATP، ADP، و 3-[4،5-دی متیل تیوزول-2-yl]-2،5-دی فنیل- تترازولیوم بروماید (MTT) از شرکت شیمیایی سیگما خریداری شدند. (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا). محلول لوسیفراز (ATPlite) از PerkinElmer (بوستون، MA، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM) و سرم جنین گاوی (FBS) از GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, USA) خریداری شد. خط سلولی H9c2 از ATTC (Rockville، MD، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. هربا سیستانچ توسط یک فروشنده گیاهی محلی (لی هونگ کی) عرضه شد. این گیاه توسط تامین کننده تایید شد و یک نمونه کوپن (HKUSTY00301) در بخش بیوشیمی دانشگاه علم و فناوری هنگ کنگ (HKUST) سپرده شد.

عصاره گیری گیاهی

Herba Cistanche (1{8}}0 گرم) به قطعات کوچک بریده شد و سپس با حرارت دادن تحت رفلاکس در 300 میلی لیتر متانول در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت استخراج شد. این روش دو بار تکرار شد. عصاره مخلوط با تبخیر حلال تحت فشار کاهش یافته خشک شد و عصاره متانولی گیاه هربا سیستانچ با عملکرد 39 درصد (وزنی/وزنی) به دست آمد. تجزیه و تحلیل شیمیایی نشان داد که عصاره متانولی گیاه هربا سیستانچ به ترتیب حاوی ساپونین کل، فلاونوئید کل، لیگنان کل و پلی ساکارید در غلظت های 1.62 درصد (وزنی)، 0.08 درصد، 0.15 درصد و 75.6 درصد است.

مراقبت از حیوانات

موش های صحرایی نر بالغ نژاد Sprague-Dawley (8 تا 10 هفته؛ 250 تا 300 گرم) تحت یک چرخه تاریکی/روشنایی 12- ساعت در اتاقی با هوا/رطوبت کنترل شده در دمای حدود 22 درجه سانتیگراد نگهداری شدند و به طور آزاد به غذا و آب اجازه دادند. در مراکز مراقبت از حیوانات در HKUST. پروتکل‌های آزمایشی توسط کمیته تمرین تحقیقاتی در HKUST تأیید شد.

درمان دارویی

حیوانات به طور تصادفی به گروه هایی تقسیم شدند که در هر گروه پنج تا شش حیوان قرار داشتند. در گروه‌های درمان، موش‌ها با عصاره متانولی گیاه هربا سیستانش (محلول/ معلق در آب) در دوزهای روزانه افزایش یافته ({0}}.031-0.5 گرم بر کیلوگرم) به مدت 3 روز به صورت داخل معده تجویز شدند. حیوانات کنترل فقط آب دریافت کردند. بیست و چهار ساعت پس از آخرین دوز، قلب از حیوانات بیهوش شده با فنوباربیتال گرفته شد و تحت آنالیز بیوشیمیایی قرار گرفت.

تهیه فراکسیون های میتوکندری و اندازه گیری ظرفیت تولید ATP (ATP-GC) ex vivo

نمونه‌های بافت بطن چپ قلب برداشته شدند و با بافر ایزوتونیک سرد یخی (0.32 مولار ساکارز، 1 میلی‌مولار EDTA، 50 میلی‌مولار Tris/HCl، pH 7.4) شستشو شدند. فراکسیون های میتوکندری قلب با سانتریفیوژ افتراقی در بافر ایزوتونیک در دمای 4 درجه سانتیگراد تهیه شدند. یک هموژنه قلبی 10 درصد (w/v) با همگن کردن بافت بطنی خرد شده با هموژنایزر شیشه تفلون در 4000 دور در دقیقه برای 20 تا 30 ضربه کامل تهیه شد. هموژنه در 600 × گرم به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد تا هسته ها و بقایای سلولی حذف شوند. سپس مایع رویی در 8000 × گرم به مدت 30 دقیقه سانتریفیوژ شد تا میتوکندری ته نشین شود (Evan, 1992). گلوله ها مجدداً در 1 میلی لیتر از بافر ایزوتونیک معلق شدند و فراکسیون های میتوکندری را بازسازی کردند. ATP-GC میتوکندری حیوانات درمان نشده با روش Leung و همکاران اندازه گیری شد. (2005)

پلی ساکاریدهای سیستانچ می توانند انحطاط فیزیولوژیکی اندام ها و انحطاط مورفولوژی سلولی را به تاخیر بیندازند.

اندازه گیری انتقال الکترون میتوکندریایی

اندازه‌گیری انتقال الکترون در میتوکندری‌های جدا شده، که بر اساس کاهش MTT است، همانطور که توسط کوهن و همکارانش توضیح داده شده است. (1997). میتوکندری با غلظت پروتئین 1 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر با بافر انکوباسیون (25{16}} میلی‌مولار ساکارز، 5{18}} میلی‌مولار HEPES، 10 میلی‌مولار KH2PO4، 2 میلی‌مولار MgCl2، 1 میلی‌مولار EGTA، pH 7.4) تهیه شد. . مقدار کمی (40 میکرولیتر) از میتوکندری ها با 100 میکرولیتر پیرووات 15 میلی مولار یا سوکسینات 0.5 میلی مولار و 0.42 میلی گرم در میلی لیتر MTT مخلوط شد. مخلوط واکنش در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه با تکان دادن ملایم انکوبه شد. پس از انکوباسیون، مخلوط واکنش با افزودن 100 میکرولیتر بافر لیز (10 درصد، w/v، سدیم دودسیل سولفات و 45 درصد دی متیل فرمامید، تنظیم شده با pH 4.7 با اسید استیک یخبندان) خاتمه یافت. پس از ایستادن به مدت 5 دقیقه، قرائت جذب مخلوط واکنش با دستگاه صفحه خوان میکروتیتر (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) گرفته شد و به عنوان اختلاف بین 570 نانومتر و 630 نانومتر گزارش شد. داده ها به عنوان درصدی از مقدار میانگین گروه کنترل (به عنوان مثال، هربا سیستانچ- درمان نشده) بیان شد.

کشت سلولی

سلول های H9c2، یک رده سلولی دائمی مشتق شده از میوبلاست های قلبی (Hescheler و همکاران، 1991)، به عنوان تک لایه در DMEM تکمیل شده با 10 درصد (v/v) FBS کشت داده شدند. محیط حاوی گلوکز (4.5 گرم در لیتر) و گلوتامین (4.5 میلی مولار)، مکمل NaHCO3 (17 میلی‌مولار)، پنی سیلین (100 واحد بین‌المللی در میلی‌لیتر)، و استرپتومایسین (100 میکروگرم در میلی‌لیتر) بود. تمام سلول ها در اتمسفر 5 درصد (v/v) CO2 در هوا در دمای 37 درجه سانتیگراد رشد کردند. هر 2 یا 3 روز یک بار محیط با محیط تازه جایگزین می شد. مجموعه ای از سلول ها در یک فلاسک کشت 75 سانتی متر مربع رشد داده شد و قبل از تلاقی با نسبت زیر کشت 1:10 تقسیم شد. برای سنجش ATP-GC، سلول‌های H9c2 با تراکم 2.5 × 104 سلول/چاه در یک صفحه چاهک کاشته شدند. پس از اتصال سلولی، عصاره هربا سیستانچ (محلول در سالین بافر فسفات؛ PBS) در محیط استفاده شد و سلول ها برای دوره های افزایشی (2 تا 16 ساعت) زمان انکوبه شدند. سلول های کنترل (درمان نشده) فقط PBS داده شد.

اندازه گیری ATP-GC در محل

پس از دوره‌های نشان‌داده‌شده انکوباسیون با عصاره HerbaCistanche در غلظت‌های فزاینده (5{{10}}-300 میکروگرم در میلی‌لیتر)، سنجش ATP-GC انجام شد. محیط آسپیره شد و سلول ها با دیژیتونین (50 میکروگرم در میلی لیتر) در بافر انکوباسیون (120 میلی مولار KCl، 5 mMKH2PO4، 2 میلی مولار EGTA، 10 میلی مولار HEPES، 0.1 میلی مولار MgCl2، 0.5 درصد BSA، pH 7.4 دقیقه در دقیقه) تیمار شدند. ◦C پس از آسپیراسیون تدیژیتونین، گلوتامات (5 میلی‌مولار)، مالات (5 میلی‌مولار)، و ADP (60 میکرومولار) برای تولید ATP میتوکندریایی به سلول‌ها اضافه شدند که در بازه‌های زمانی افزایش یافته از 0 تا 15 دقیقه کنترل می‌شد. واکنش با افزودن 60 میکرولیتر اسید پرکلریک (30 درصد، وزنی بر حجم) خاتمه یافت و سپس مخلوط های واکنش در 600 × g به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شدند. مقدار کمی (120 میکرولیتر) از مایع رویی با 90 میکرولیتر KHCO3 1.4 مولار برای خنثی سازی مخلوط شد. مخلوط ها دوباره در گرمای 600 × گرم در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند و مواد رویی برای محتوای ATP که قبلاً توضیح داده شد اندازه گیری شدند. ATP-GC سلول‌های تیمار نشده با محاسبه مساحت زیر منحنی نمودار (AUC1) تخمین زده شد که ATP تولید شده (nmol/mg پروتئین) در مقابل زمان (0-15 دقیقه) و در واحدهای دلخواه بیان شد. برای سلول های تیمار شده با HerbaCistanche، مقادیر AUC1 افزایش زمان انکوباسیون (3، 5، 7، 10، و 15 دقیقه) به مقدار میانگین کنترل مربوطه از نمونه های تیمار نشده نرمال شد و به عنوان درصد کنترل بیان شد. سپس، سطح زیر منحنی (AUC2) نمودار نمودار درصد کنترل مقادیر در مقابل زمان انکوباسیون (3-15 دقیقه) محاسبه و در واحدهای دلخواه بیان شد. داده های گروه های تیمار شده با هربا سیستانچ به صورت درصدی از کنترل از معادله بیان شد:

[AUC2 (HerbaCistanche - درمان شده)/AUC2 (درمان نشده)] × 100 درصد

اندازه‌گیری فعالیت‌های ترکیبی I-IV و سیترات

فعالیت های زنجیره انتقال الکترون میتوکندری (ETC) مجتمع I-III با روش های اسپکتروفتومتری با استفاده از بسترهای پیچیده (NADH برای کمپلکسI، سوکسینات برای کمپلکس II، و دسیلوبیکینول برای کمپلکس III) اندازه گیری شد (گراد و لمیر، 2004؛ Hsu و همکاران). ، 2005؛ مارک و همکاران، 2001). فعالیت کمپلکس IV با استفاده از کیت سنجش سیتوکروم سی اکسیداز از سیگما اندازه گیری شد. فعالیت سیترات سنتاز میتوکندری با روش Srere (1969) اندازه گیری شد.

سنجش پروتئین

غلظت پروتئین فراکسیون‌های میتوکندری و سلولی‌ها با استفاده از کیت پروتئین BioRad با استفاده از آلبومین سرم گاوی به‌عنوان استاندارد (038.0.600-0.600 mg/mL{0}}) تعیین شد.

تحلیل آماری

تمام داده ها به صورت میانگین ± خطای استاندارد موضوع (SEM) بیان شد. آنها با استفاده از تحلیل واریانس یک طرفه (ANOVA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. مقایسات چندگانه پست هاک با LSD انجام شد. مقادیر P<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

نتایج

اثرات درمان هربا سیستانچ بر ATP-GC میوکاردیال میتوکندری در موش صحرایی

همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، درمان با عصاره هربا سیستانچ در دوزهای تا 0.5 گرم بر کیلوگرم، ATP-GC میتوکندری میوکارد را به روشی وابسته به دوز در موش‌ها افزایش داد، با درجه تحریک 89 درصد در یک دوز. از 0.5 گرم بر کیلوگرم.

اثرات درمان هربا سیستانچ بر انتقال الکترون میتوکندری در قلب موش صحرایی

میزان انتقال الکترون در میتوکندریای جدا شده با نظارت بر کاهش MTT اندازه گیری شد. سوبسترای مورد استفاده برای سنجش یا پیروات یا سوکسینات بود.

شکل 1. تأثیر تیمار هربا سیستانچ بر ظرفیت تولید ATP میتوکندریایی در قلب موش صحرایی در شرایط محیطی

هر نوار نشان دهنده تم ± SEM با n {{0}} است. حیوانات به مدت 3 روز تحت درمان خوراکی HerbaCistanche در دوزهای مشخص شده روزانه قرار گرفتند. ظرفیت تولید ATP همانطور که در "مواد و روش ها" توضیح داده شد اندازه گیری شد. داده ها در درصد کنترل با توجه به مقادیر (AUC2) گروه کنترل درمان نشده مربوطه بیان شد. ∗به طور قابل توجهی با گروه کنترل درمان نشده مربوطه متفاوت است. تفاوت معنی داری با گروه تیمار شده با گیاه گیاه سیستانچ در 0.5 گرم بر کیلوگرم.

شکل 2. اثرات درمان هربا سیستانچ بر انتقال الکترون میتوکندری در قلب موش صحرایی

هر نوار نشان دهنده میانگین ± SEM با n {{0}} است. (الف) انتقال الکترون میتوکندری با پشتیبانی از پیروات (ب) با کاهش MTT اندازه‌گیری شد، همانطور که در "مواد و روش‌ها" توضیح داده شد. داده‌ها در درصد مقادیر کنترل‌شده درمان‌نشده بیان شد. 10}}؛ ساکسینات پشتیبانی شده: مرد، 0.015 ± 0.255، n=5]. ∗به طور قابل توجهی با گروه شاهد درمان نشده مربوطه متفاوت است. تفاوت معنی داری با گروه 0.5 گرم بر کیلوگرم.

همانطور که در شکل 2a نشان داده شده است، درمان هربا سیستانچ به طور وابسته به دوز، میزان انتقال الکترون میتوکندری را که توسط پیرووات پشتیبانی می شود در قلب موش صحرایی افزایش داد، با تحریک بهینه قابل مشاهده در دوزهای 0.5 گرم بر کیلوگرم. با این حال، هیچ تغییر قابل توجهی در میزان انتقال میتوکندریالکترون پشتیبانی شده توسط سوکسینات در قلب موش تیمار شده با Herba Cistanche مشاهده نشد (شکل 2b).

برای قسمت 2،لطفا اینجا کلیک کنید.