بخش 1: ترسیم تعامل اپی ژنومیک و رونویسی در طول تشکیل حافظه و یادآوری در گروه هیپوکامپ انگرام

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

لطفا برای قسمت 2 اینجا را کلیک کنید

Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1 موسسه یادگیری پیکوور وحافظه، موسسه فناوری ماساچوست، کمبریج، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا.

2 گروه علوم مغز و شناختی، موسسه فناوری ماساچوست، کمبریج، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا.

3 آزمایشگاه علوم کامپیوتر و هوش مصنوعی، موسسه فناوری ماساچوست، کمبریج، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا.

4بخش پزشکی نوزادان، بیمارستان کودکان بوستون، دانشکده پزشکی هاروارد، بوستون، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا.

5 موسسه بزرگ هاروارد و MIT، کمبریج، ماساچوست، ایالات متحده آمریکا.

کلیک کنید تافروشگاه ویتامین Cistanche و Cistanche برای حافظه

خلاصه

اپی ژنوم و معماری ژنومیک سه بعدی (3D) به عنوان عوامل کلیدی در تنظیم دینامیکی برنامه های رونویسی مختلف مورد نیاز برای عملکردهای عصبی در حال ظهور هستند. در اینجا ما از یک سیستم برچسب گذاری وابسته به فعالیت در موش برای تعیین وضعیت اپی ژنتیکی، معماری ژنوم سه بعدی و چشم انداز رونویسی سلول های انگرام در طول عمر استفاده می کنیم.حافظهتشکیل و یادآوری یافته های ما این را نشان می دهدحافظهرمزگذاری منجر به یک رویداد آغازگر اپی ژنتیکی می شود که با افزایش دسترسی به تقویت کننده ها بدون تغییرات رونویسی مربوطه مشخص می شود.حافظهتثبیت متعاقباً منجر به سازماندهی مجدد فضایی بخش‌های بزرگ کروماتین و تعاملات پروموتر-افزایشگر می‌شود. در نهایت، با فعال‌سازی مجدد، نورون‌های انگرام از زیرمجموعه‌ای از برهم‌کنش‌های دامنه بلند denovolong استفاده می‌کنند، که در آن تقویت‌کننده‌های اولیه با پروموترهای مربوطه در تماس بودند تا ژن‌های دخیل در ترجمه پروتئین محلی در محفظه‌های سیناپسی را تنظیم کنند. در مجموع، کار ما رونویسی جامع را توضیح می‌دهد و کاربران می‌توانند متن این اسناد را مشاهده، چاپ، کپی و دانلود کنند و محتوای موجود در چنین اسنادی را برای تحقیقات آکادمیک، همیشه مشروط به شرایط کامل استفاده: http://www.nature، مشاهده کنند. com/authors/editorial{4}}policies/license.html#terms

*مطابقت با: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

مشارکت نویسنده:

AM و L.-HT پروژه را مفهومی و طراحی کردند. AM و AZ آزمایش‌های رفتاری، ISH، رنگ‌آمیزی ایمنی و تجزیه و تحلیل MARIS را انجام دادند. CA تزریق ویروس و رنگ آمیزی ایمنی را انجام داد. AM و HSM آزمایش‌های ATAC-seq را انجام دادند. AM و AZ آزمایش‌های RNA-seq هسته‌ای را انجام دادند. AM، HSM و VD آزمایش‌های pc-Hi-C و Hi-C را انجام دادند. AM، HSM، VD، RMR، و JDV تجزیه و تحلیل ATAC-seq را انجام دادند. AM، RMR، HSM، VD، و FG تجزیه و تحلیل RNA-seq هسته ای را انجام دادند. AM، VD، HSM، و RMR آنالیز pc-Hi-C و Hi-C را انجام دادند. همه نویسندگان به تفسیر داده ها کمک کردند. AM، HSM، VD، RMR، JZY، MK، و LHT نسخه خطی را با ورودی همه نویسندگان نوشتند. LHT ابزارها را فراهم کرد و بر پروژه نظارت داشت.

منافع رقابتی:

نویسندگان هیچ منافع رقیب را اعلام نمی کنند.

چشم انداز اپی ژنومیک در سراسر طول عمرحافظهتشکیل و یادآوری در گروه انگرام هیپوکامپ

شکل‌گیری و حفظ حافظه‌های بلندمدت به بیان ژن هماهنگ و سنتز پروتئین‌های سیناپسی بستگی دارد. این فرآیندهای مولکولی در یک جمعیت خاص از نورون‌ها که به عنوان سلول‌های انگرام 2-4 نامیده می‌شوند، عمل می‌کنند. رویکردهای اخیر با استفاده از بیان وابسته به فعالیت از گزارشگران، چارچوبی را برای کاوش مجموعه انگرام 5-8 ارائه می کند، اما مکانیسم های مولکولی حاکمحافظهذخیره و بازیابی به خوبی شناخته نشده است. به طور خاص، تغییرات اپی ژنتیکی و معماری سه بعدی ژنومی به عنوان یک عامل کلیدی در تنظیم دینامیکی بیان ژن 9-17 ظاهر می شود و اهمیت آنها در عملکرد، توسعه و بیماری های عصبی افزایش می یابد.

در اینجا، ما از مدل 5،6 موش از نوترکیبی هدفمند در جمعیت‌های فعال (TRAP) استفاده کردیم، که در آن نورون‌های فعال بیان‌کننده پروتئین مرتبط با اسکلت سلولی تنظیم‌شده فعالیت، ژن (Arc)، به‌طور دائمی به شیوه‌ای القایی برچسب‌گذاری می‌شوند. نورون های فعال در طولحافظهرمزگذاری، تثبیت، و یادآوری مرتب شده و در معرض توالی RNA هسته ای (nRNA-seq)، سنجش کروماتین قابل دسترسی به ترانسپوزاز با استفاده از توالی یابی (ATAC-seq)، و گرفتن ترکیب کروموزوم (Hi-C) قرار گرفتند. داده های ما این را نشان می دهدحافظهرمزگذاری منجر به افزایش ژنوم در دسترسی کروماتین، بدون تغییرات مورد انتظار در بیان ژن می شود. علاوه بر این، ما نشان می‌دهیم که مرحله پایانی تثبیت حافظه با مکان‌یابی مجدد بخش‌های کروماتین بزرگ (زیر محفظه‌ها) از محیط‌های غیرفعال به محیط‌های مجاز، و سازمان‌دهی مجدد چشم‌انداز تعامل پروموتر-افزایش‌دهنده همراه بود. در نهایت، فعال شدن مجدد نورون ها در طولحافظهیادآوری با فعل و انفعالات denovopromoter و تقویت کننده همراه است، با استفاده از یک زیر مجموعه بزرگ از تقویت کننده هایی که در طولحافظهرمزگذاری این برهمکنش‌های پروموتر-افزایش‌دهنده با تغییر قوی در بیان ژن‌های دخیل در سنتز پروتئین محلی و مورفوژنز سیناپسی همراه است.

نتایج

شناسایی زمانی و مکانی سلول های انگرام فعال و فعال شده مجدد

ردیابی فعالیت عصبی در طول زمان یکی از چالش‌های اصلی در مطالعه سلول‌های انگرام بوده است، زیرا نشانگرهای فعالیت عصبی که به عنوان ژن‌های اولیه فوری (IEGs) شناخته می‌شوند، مدت کوتاهی پس از القا به حالت اولیه باز می‌گردند. برای غلبه بر این محدودیت، از مدل TRAP5،6 استفاده کردیم، که به دو ترانس ژن نیاز دارد، یکی که CreERT2 را از یک پروموتر Arc وابسته به فعالیت بیان می کند و دیگری که امکان بیان گزارشگر پروتئین فلورسنت زرد (eYFP) را در یک Cre- روش وابسته تجویز تاموکسیفن (TAM) به موش های TRAP منجر به برچسب دائمی eYFP در نورون های قوس فعال می شود. بدون TAM، CreERT2 در سیتوپلاسم حفظ می شود و eYFP بیان نمی شود (داده های توسعه یافته شکل 1a). موش‌های TRAP تحت الگوی کلاسیک شرطی‌سازی ترس زمینه‌ای پاولوی (CFC) قرار گرفتند (شکل 1a)، روشی که معمولاً برای مطالعه خاطرات بد استفاده می‌شود. تقریباً 1.5 تا 2 ساعت پس از قرار گرفتن در معرض FS، مغزها برای شناسایی i) همولوگ 3 روباه پروتئین متصل به RNA (Rbfox3) که با نام‌های NeuN plus و eYFP به‌علاوه نورون‌های برچسب‌گذاری شده شناخته می‌شوند که در طول مواجهه اولیه فعال شدند (فعال شده) جمع‌آوری شد. -Early)، که می تواند از ii) NeuN به علاوه /eYFP- نورون های حالت پایه غیرفعال شده (Basal) متمایز شود (شکل 1a). پس از پنج روز، در غیاب بازیابی، iii) NeuN به علاوه /eYFP به علاوه نورون‌هایی را که در روز تمرین برچسب‌گذاری شده بودند، جمع‌آوری کردیم که نشان‌دهنده طولانی‌مدت است.حافظهتثبیت (فعال - دیر). در یک

گروه‌های مختلف، موش‌ها دوباره در معرض محرک شرطی قرار گرفتند و بیان پروتئین درون‌زای ARC 1.5-2 ساعت پس از قرار گرفتن مجدد مورد سنجش قرار گرفت. این امکان شناسایی IV) نورون‌های NeuN دو مثبت به همراه /eYFP پلاس / درون زا Arc به علاوه انگرام را فراهم کرد که در طول تمرین فعال شده و در طی مجدد فعال شدند.حافظهفراخوان (Reactivated). قابل توجه است، اگرچه ممکن است نوترکیبی DNA به طور کامل 1.5-2 ساعت پس از FS رخ ندهد، ما هم‌محلی (متوسط ​​84 درصد) را بین پروتئین Arc درون‌زا و گزارشگر Arc:eYFP (داده‌های توسعه‌یافته شکل 1b) مشاهده کردیم. مطابق با گزارش های قبلی 20.

برای تاییدحافظهرمزگذاری و یادآوری در طول CFC، رفتار انجماد در طول تمرین و قرار گرفتن مجدد در معرض نشانه های ترس آور ثبت شد (داده های توسعه یافته شکل 1c). مطابق با انتشارات قبلی 6،20، داده‌های ما افزایش قابل توجهی در تعداد نورون‌های eYFP به علاوه (فعال‌شده زودرس و دیررس) در هیپوکامپ در مقایسه با موش‌هایی که نسبت به CFC در قفس خانگی خود بی‌تفاوت مانده بودند نشان داد (F (2, 70)=240.3، ص<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

تشکیل حافظه با افزایش دسترسی کروماتین، عمدتاً بر روی تقویت کننده ها مرتبط است

برای درک بهتر نیروهای مولکولی حاکم بر برنامه‌های رونویسی مختلف، تغییرات ژنومی در دسترسی کروماتین را در مراحل مختلف اندازه‌گیری کردیم.حافظه. بافت های هیپوکامپ ادغام شدند و هسته های جدا شده (داده های توسعه یافته شکل 2a، جدول تکمیلی 1) تحت آماده سازی کتابخانه ATAC-seq قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل مناطق با دسترسی متفاوت (DARs) (Diffbind، حالت DESeq2) بین همه جمعیت ها (شکل 2a) نشان داد که بیشتر تغییرات در حالت کروماتین در مرحله اولیه شکل گیری حافظه رخ می دهد، جایی که 7،{6}} ناحیه در سراسر ژنوم افزایش می یابد. دسترسی (پایه در مقابل اولیه، جدول تکمیلی 2). در مقابل، ما تغییرات نسبتاً حداقلی را در حالت کروماتین در هنگام انتقال از فعال شده زودرس به دیر فعال (582 DARs) و بین نورون های فعال شده دیر و فعال شده مجدد (725 DAR) مشاهده کردیم، با 48 درصد همپوشانی بین آنها (داده های توسعه یافته شکل 2b). ). به طور قابل‌توجهی، ما درصد زیادی (52 درصد) از DAR‌های پایدار به‌دست‌آمده را شناسایی کردیم که در اوایل فعال‌شده در دسترس‌تر بودند و در نورون‌های فعال‌شده دیر فعال و فعال‌شده مجدد در دسترس بودند (شکل 2b,c؛ جدول تکمیلی 2). جالب توجه است، در حالی که هر دو تغییرات اولیه (پایه در مقابل اولیه) و DARهای پایدار به دست آمده برای مناطق بین ژنی غنی شده بودند، تغییرات کروماتین دیرهنگام (اوایل در مقابل دیر و دیر در مقابل فعال مجدد) بیشتر برای مکان های پروموتور غنی شدند (شکل 2d).

بینش عملکردی با ارزیابی اینکه چگونه DAR ها با تغییرات هیستون مختلف مشخص می شوند، به دست آمد. ما ابتدا از ChromHMM برای ایجاد یک مدل حالت کروماتین از دو مطالعه مستقل استفاده کردیم که از بافت هیپوکامپ حجیم قبل و بعد از شوک پا 21،22 استفاده کردند. در مرحله بعد، ما یک تجزیه و تحلیل غنی‌سازی برابری (مشاهده بر توزیع مورد انتظار) از DARها برای این حالت‌های مختلف انجام دادیم و نشان دادیم که تغییرات اولیه کروماتین و DARهای پایدار برای علائم تقویت‌کننده غنی شده‌اند (شکل 2e؛ داده‌های توسعه‌یافته شکل 2c، جدول تکمیلی 3). .

این نتایج با انتشارات قبلی مطابقت دارد و نشان می‌دهد که تحریک کشت عصبی اولیه باعث افزایش فعالیت طولانی‌مدت تقویت‌کننده می‌شود12،23. در مرحله بعد، همپوشانی جایگاه‌های پایدار فردی را با H3K4me1 و H3K27ac21 تجزیه و تحلیل کردیم. این دو علامت هیستون جمعیت‌های مختلفی از تقویت‌کننده‌ها را مشخص می‌کنند که می‌توانند «پرایم‌شده» (فقط H3K4me1)، «فعال» (H3K4me1 و H3K27ac)، یا «نهفته» (بدون علامت) باشند. پیک‌های پایدار توزیعی را در بین تقویت‌کننده‌های اولیه و فعال نشان دادند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2d)، که در آن 47 درصد از این مکان‌ها «نهفته» پیش‌بینی می‌شدند (هیچ همپوشانی بین DARs و علامت‌های هیستون21 یک ساعت پس از FS به دست آمد). برای تایید مدل خود، ما رسوب ایمنی کروماتین (ChIP) را برای نشانگرهای هیستونی H3K4me1 و H3K27ac انجام دادیم و به دنبال آن qPCR انجام دادیم. چهار سایت منتخب از تحلیل مدل‌سازی تقویت‌کننده فرضی ما انتخاب شدند (داده‌های توسعه‌یافته شکل 2d؛ تقویت‌کننده 1 - پیش‌بینی‌شده اولیه، تقویت‌کننده 2- پیش‌بینی‌شده فعال، تقویت‌کننده 3 و 4 - پیش‌بینی‌شده پنهان). در توافق با مدل خود، ما دو مکان "نهفته" را در حالت پایه (تقویت کننده های 3 و 4) شناسایی کردیم که در طول مدت به حالت "فعال" تبدیل شدند.حافظهتشکیل (شکل 2f). علاوه بر این، تقویت‌کننده فرضی 1 در حالت پایه "پرایم" شده و فعال شد، جایی که افزایش پایدار قابل توجهی در نشانگرهای H3K27ac در طول فاز پایانی و یادآوری وجود داشت (شکل 2f). با هم، این داده‌ها نشان می‌دهند که مجموعه تقویت‌کننده‌های تازه در دسترس در نورون‌های انگرام تقویت‌شده، جایی که مناطق نهفته یا اولیه نشان‌های H3K4me1 و H3K27ac را به دست آورده‌اند و در نتیجه به تقویت‌کننده‌های فعال تبدیل شده‌اند، گسترش یافته است.

برای درک نقش عملکردی نواحی تقویت کننده و تقویت کننده در دسترس، ما تجزیه و تحلیل غنی سازی موتیف را انجام دادیم (جدول تکمیلی 4). داده‌های ما نشان می‌دهد که اکثر (70 درصد) نقوش روی پروموترهای در دسترس به همان اندازه غنی شده‌اند و در تمام مراحل شناسایی شده‌اند.حافظه(داده های توسعه یافته شکل 2e). در مقابل، اکثر سایت‌های تقویت‌کننده الگوهای مشخصی از نقوش اتصال فاکتور رونویسی (TF) را در مراحل مختلف حافظه نشان دادند. جالب توجه است، نقوش بیان شده در همه جا از Jun Proto-Oncogene، Ap{3}} زیرواحد فاکتور رونویسی (یعنی Jun-Ap1)، و فاکتور تنظیمی X (Rfx) خانواده TFها، به طور قابل توجهی تنها پس از مرحله اولیه غنی‌سازی شدند. رمزگذاری (داده های توسعه یافته شکل 2e). قبلاً گزارش شده بود که کمپلکس Jun-Ap1 نقش اصلی را در انتخاب تقویت کننده ایفا می کند و ممکن است به عنوان یک TF پیشگام برای تعریف مکان های تقویت کننده در طول رشد مغز و فعالیت عصبی عمل کند. این یافته‌ها با داده‌های ما که درصد بالایی از مکان‌های نهفته/پریمد را در حالت پایه نشان می‌دهند، مطابقت دارند (شکل 2f، داده‌های گسترده شکل 2c,d). از این رو، به نظر می رسد که فعالیت عصبی ممکن است باعث اتصال Jun-Ap1 به تقویت کننده های نهفته شود، که سپس اصلاح کننده های کروماتین را به کار می گیرد که تقویت کننده های نهفته را فعال می کند. به طور مشابه، غنی‌سازی نقوش فاکتور رونویسی یین یانگ 1 (Yy1) فقط در تقویت‌کننده‌های حالت‌های اولیه و اواخر، نشان می‌دهد که سازمان ارتقاء دهنده-افزایشگر یک فرآیند فعال است.حافظهشکل‌گیری، همانطور که اخیراً گزارش شده است که Yy1 شکل‌گیری این تعاملات دوربرد را تسهیل می‌کند. در مجموع، این داده ها نشان می دهد که فاز اولیهحافظهشکل‌گیری چشم‌انداز دسترسی کروماتین را در نورون‌های فعال تغییر می‌دهد، با تغییرات پایدار طولانی‌مدت که عمدتاً در مناطق تقویت‌کننده رخ می‌دهد.

تغییرات دینامیکی در معماری هسته ای فضایی و دسترسی کروماتین در طول اولیهحافظهتشکیل با افزایش فرکانس تعاملات پروموتر-افزایش دهنده مطابقت داردحافظهبه خاطر آوردن

معماری سه بعدی هسته ای به عنوان یک عامل کلیدی در تنظیم دینامیکی بیان ژن، در بسیاری از عملکردهای عصبی 26-28 در حال ظهور است. از این رو، ما علاقه مند به ترسیم تغییرات دقیقی بودیم که در سازماندهی کروماتین فضایی در طی آن رخ می دهدحافظهتشکیل و تثبیت ما داده‌های Hi-C را از حالت پایه و eYFP به‌علاوه نورون‌های برچسب‌گذاری شده تولید کردیم (تبلیغات اولیه و دیررس، جدول تکمیلی 5). کروماتین به دو بخش زیرهسته ای از نظر فضایی متمایز، 'A' و 'B'، که به ترتیب مربوط به کروماتین فعال و غیرفعال رونویسی هستند، جدا می شود 15، 16،26. شواهد اولیه نشان می دهد که فعالیت عصبی و سیگنال دهی بیرونی ممکن است باعث سازماندهی مجدد معماری کروماتین سه بعدی شود. تجزیه و تحلیل وضعیت محفظه ما 15، 16،26 (شکل 3a-c) مکان‌یابی مجدد بخش‌های کروماتین بزرگ از غیرفعال (B) به محیط مجاز (A) (و بالعکس) را در طول فاز اولیه و اواخر نشان داد.حافظهتشکیل (212 بخش از A به B، 127 از B به A، اندازه متوسط ​​~436Kbp تغییر یافته است). جالب توجه است، 52 درصد از مناطق در فاز اولیه که از B به A تغییر مکان دادند، آن حالت را در مرحله آخر حفظ کردند (یعنی در حالت A، ​​شکل 3b,c؛ جدول تکمیلی 6 باقی ماندند). علاوه بر این، تقریباً تمام این نواحی با DARهای به‌دست‌آمده از تجزیه و تحلیل ATAC-seq ما همپوشانی داشتند و انتقال بخش فرعی از محیط غیرفعال به محیط مجاز را تأیید می‌کنند (شکل 3d). این داده‌ها نشان می‌دهد که برخی از جایگاه‌ها در مراحل مختلف حافظه تحت تغییر محفظه فرعی قرار می‌گیرند و بنابراین ممکن است به تغییرات طولانی‌مدت در خواص و عملکرد عصبی پس از فعال‌سازی اولیه کمک کنند.

در حالی که داده‌های Hi-C ما سازمان‌دهی مجدد در مقیاس بزرگ را پیشنهاد می‌کردند، هنوز مشخص نیست که آیا این جهت‌گیری مجدد، تعامل رپرتوارهای جدید ترویج‌کننده-افزایش‌دهنده و تنظیم دقیق برنامه‌های رونویسی مختلف را ممکن می‌سازد یا خیر (شکل 3e). با استفاده از تکنیک ضبط پروموتر Hi-C (pc-HiC)، ما تغییرات دقیقی را که در تعاملات پروموتر-افزایش دهنده در طول فرآیند رخ می دهد مورد مطالعه قرار دادیم.حافظهتشکیل و یادآوری برای این مطالعه، ما از «طعمه‌های» طراحی‌شده سفارشی با هدف قرار دادن ~5000 مروج29 استفاده کردیم. در توافق با انتشارات قبلی 29، ما 19000 (در هر گروه) تعامل مهم محرک-افزایش دهنده (67.5 درصد) و مروج- مروج (46.2 درصد) را شناسایی کردیم (داده های توسعه یافته شکل 3a,b).

از آنجایی که پروموترها در مغز پستانداران می‌توانند تحت کنترل چندین عنصر تنظیمی 14، 30، 31 باشند، ما همپوشانی بین همه تقویت‌کننده‌های متقابل و پروموترهای مربوطه را تجزیه و تحلیل کردیم. ما متوجه شده ایم که در طول هرحافظهدر مرحله، همان پروموترها بیشتر با زیرمجموعه‌ای از تقویت‌کننده‌ها تعامل دارند (یعنی منحصربه‌فرد، Basal – 3243، Early - 7602، Late - 7028، Reactivated – 7244؛ شکل 4a,b؛ Extended Data شکل. 3ج؛ جدول تکمیلی 7). این نتیجه با انتشارات قبلی مطابقت دارد که نشان می‌دهد تقویت‌کننده‌های متعدد پیرامون چندین ژن (c-Fos و Arc) برای فعال‌سازی آن‌ها حیاتی هستند و فرکانس تعامل آن‌ها با پروموترهای مربوطه در پاسخ به عوامل دپلاریزاسیون مختلف در نورون‌های کشت‌شده تغییر می‌کند. ما همچنین زیرمجموعه کوچک‌تری از تعاملات را شناسایی کردیم که در آن پروموترها با تقویت‌کننده‌های یکسانی در نقاط مختلف تعامل داشتند.حافظهمراحل (یعنی مشترک، ~ 31 درصد از تمام تعاملات؛ جدول تکمیلی 7). علاوه بر این، نورون‌های فعال‌شده مجدد امتیازات تعاملی قوی‌تری را ارائه کردند (همانطور که توسط شیکاگو، شکل 4b محاسبه شده است؛ داده‌های توسعه‌یافته شکل 3d). از این رو، اگرچه تعداد تعاملات منحصربه‌فرد در حالت‌های اولیه، دیررس و فعال‌شده مشابه بود، اما نمرات تعامل قوی‌تر نشان می‌دهد که تعاملات خاص پروموتر-افزایش‌دهنده بیشتر در طول حافظه رخ می‌دهد.

به خاطر آوردن. این مفهوم بیشتر توسط آزمایش‌های 3C تأیید شد، با آغازگرهایی که برای اندازه‌گیری فرکانس برهمکنش بین تقویت‌کننده انتخابی (E) و پروموترهای ژنی (P) که فاکتور شروع ترجمه یوکاریوتی 3 زیرواحد D (Eif3d) یا گیرنده گلوتامات، یونوتروپیک، کاینات را کد می‌کنند، تأیید شد. 3 (Grik3) (شکل 4c). داده‌های ما نشان داد که نورون‌های فعال‌شده مجدداً نسبت به سایر جمعیت‌ها افزایش قابل‌توجهی در فرکانس تعامل بین پروموتر Eif3d و تقویت‌کننده انتخابی داشتند (شکل 4c). در مجموع، این داده ها نشان می دهد که فعل و انفعالات پروموتر-افزایش دهنده بیشتر در طول رخ می دهدحافظهبه خاطر آوردن.

در مرحله بعد، ما پرسیدیم که آیا تعاملات دوربرد پویا شناسایی شده از طریق pc-HiC با مناطق کروماتین که از طریق ATAC-seq تعیین می‌شوند، در دسترس‌تر می‌شوند، مطابقت دارد یا خیر. این امر تأیید می کند که افزایش دسترسی یک پیامد عملکردی در ایجاد تعاملات مروج-افزایش دهنده جدید دارد. برای دستیابی به این هدف، همپوشانی بین تقویت‌کننده‌های تعاملی در هر جمعیت سلولی را با DARها (مشاهده‌شده) یا مجموعه‌ای تصادفی از مکان‌های ژنومی قابل دسترس (مورد انتظار) مقایسه کردیم. تجزیه و تحلیل ما همپوشانی قابل توجهی را بین DARهای به دست آمده در نورونهای فعال اولیه و DARهای پایدار به دست آمده با تقویت کننده های تعاملی، در همه جمعیت های سلولی نشان داد (همه Ps < 0.0001،="" داده="" های="" توسعه="" یافته="" شکل="" 3e).="" در="" مقابل،="" تغییرات="" در="" دسترسی="" کروماتین="" که="" در="" اواخر="" فاز="" رخ="" داده="">حافظهتثبیت و فعال سازی مجدد به طور قابل توجهی با تقویت کننده های تعاملی همپوشانی نداشتند (داده های توسعه یافته شکل 3e). با هم، این نتایج نشان می‌دهد که دستیابی به دسترسی در طول رمزگذاری حافظه یک رویداد آغازگر است و این مکان‌های اولیه در تعاملات عملکردی پروموتر-افزایش‌دهنده در مراحل بعدی فعالیت می‌کنند.حافظهتشکیل. این چشم انداز پویا با تجسم نواحی ژنومی اطراف ژن فاکتور شروع ترجمه یوکاریوتی 5 زیر واحد A (Eif5a) نشان داده شده است (شکل 4d). این تشریح مولکولی زمانی طول عمر انگرام نشان می‌دهد که چگونه آغازگر هماهنگی وضعیت اپی ژنتیکی یک سلول در طولحافظهرمزگذاری و تثبیت تعاملات طولانی مدت در طول فعال سازی مجدد را تسهیل می کند.