قسمت 2: Echinacoside از طریق تنظیم مسیر ROS/ATF3/CHOP در برابر آپوپتوز عصبی ناشی از MPP پلاس محافظت می کند.

اکیناکوزیدمحافظت در برابر آپوپتوز عصبی ناشی از MPP پلاس از طریق تنظیم مسیر ROS/ATF3/CHOP

Qing Zhao1 • Xiaoyan Yang2 • Dingfang Cai3,4 • Ling Ye5,6 • Yuqing Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com

لطفا برای قسمت 1 اینجا را کلیک کنید

لطفا برای قسمت 3 اینجا را کلیک کنید

سیستانچ اکیناکوزیدخاصیت آنتی اکسیدانی دارد

رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس

1 mmol/L MPP؟، 4{12}} LG/mL ECH، یا ترکیبی از MPP؟ و ECH. سپس سلول ها در یک بافر مسدود کننده (3 درصد BSA در PBS) در دمای اتاق (RT) به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند. سپس آنتی‌بادی‌های ضد ATF3، ضد CHOP یا کاسپاز 3 ضد شکاف تا 1:100 در بافر مسدودکننده (1 درصد BSA در PBS با 0.3 درصد Triton X-100) رقیق شدند و یک شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. پس از سه بار شستشو با PBS، سلول‌ها با الکسا 488-IgG ضد خرگوش بز (Life Technologies، Carlsbad، CA) در RT انکوبه شدند.

1 ساعت هسته ها با Hoechst 33342 رنگ آمیزی شدند. تصاویر با میکروسکوپ کانفوکال (Leica SP8، Wetzlar، آلمان) گرفته شد.

سنجش dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) با واسطه دئوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز

ما هر دهمین بخش تاج (در مجموع 14-15) را از طریق SNc از برگما -2.92 نانومتر تا -3.64 میلی متر رنگ آمیزی کردیم.

چهار بخش معمولی از طریق SNc در همان سطح در هر گروه برای شمارش TH و TUNEL استفاده شد [10]. سنجش‌های TUNEL برای تجزیه و تحلیل آپوپتوز در بخش‌های بافت با کیت تشخیص مرگ سلولی درجا (روش، روتکروز، سوئیس)، به دنبال دستورالعمل‌های سازنده انجام شد. پس از برچسب‌گذاری DNA، بخش‌هایی برای رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس با آنتی‌بادی ضد TH استفاده شد و تصاویر با میکروسکوپ کانفوکال (Leica SP8، Wetzlar، آلمان) گرفته شد. پس از تعیین SNc در بزرگنمایی کم ({3}} اهداف) طبق اطلس مغز موش [20]، سلولهای TH- مثبت و سلولهای دو مثبت TH/TUNEL با بزرگنمایی بالاتر شمارش شدند ({7} } اهداف) توسط دو ناظر نابینا نسبت به درمان. نسبت سلول های TH/TUNEL دو مثبت به سلول های TH مثبت محاسبه شد.

سیستانچاکیناکوزید داردضد التهابخواص

تحلیل آماری

همه داده ها به صورت میانگین ± SD ارائه شده اند. ANOVA یک طرفه و سپس تجزیه و تحلیل تعقیبی با HSD Tukey و آزمون مقایسه چندگانه Student-Newman-Keuls برای اهداف آماری انجام شد. مقدار P \ 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج

ECH محصولات ROS را کاهش می دهد و تضعیف می کند

MPP{0}}آپوپتوز القا شده

نشان داده شده است که ECH از نورون ها در برابر آپوپتوز در مدل های حیوانی محافظت می کند و همچنین سطح سایتوکاین های پیش التهابی را در سلول های نوروبلاستوما کاهش می دهد [12]. با این حال، مشخص نیست که آیا ECH به طور مستقیم آپوپتوز عصبی ناشی از MPP را تعدیل می کند؟ داده‌های ما نشان داد که ECH بر تکثیر یا مرگ سلول‌های SH-SY5Y تأثیری ندارد (شکل 1B)، و مورفولوژی آنها بدون تغییر باقی ماند (شکل 1C). جالب توجه است، به دنبال قرار گرفتن در معرض سلول‌های SH-SY5Y با MPP؟، بقا به صورت وابسته به دوز پس از درمان ECH (10-40 Lg/mL) افزایش یافت (شکل 1B، C).

مطالعات قبلی نشان داده است که MPP؟ به طور خاص زنجیره انتقال الکترون در میتوکندری را مهار می کند و همچنین با تولید ROS مرتبط است [6، 21]. با استفاده از DCFH-DA به عنوان یک پروب فلورسنت برای ارزیابی تغییرات در سطوح ROS، دریافتیم که ECH به طور قابل توجهی تولید ROS ناشی از MPP؟ را سرکوب می کند (شکل 2A). میکروسکوپ کانفوکال نشان داد که محصولات کاهش یافته ROS با سطوح ECH مرتبط هستند (شکل 2C). همچنین نشان داده شد که ECH از غشای سلولی در برابر ROS محافظت می‌کند و سطوح MDA، محصول نهایی پراکسیداسیون لیپیدی را کاهش می‌دهد (شکل 2B). گرفته شده با هم،

ECH بقای سلولی را با کاهش محصولات ROS ناشی از MPP? در نورون ها افزایش می دهد.

ECH سرکوب ROS استرس مرتبط/MPP1-بیان ژن القا شده و افزایش GDNF

بیان در سلول‌های تحت درمان با MPP{0}

نشان داده شده است که محصولات ROS پاسخ پروتئین بازشده را تحریک کرده و بیان ژن‌های مرتبط با استرس از جمله ATF3، ATF4 و CHOP را القا می‌کنند [22]. ATF3 و CHOP نقش مهمی در آپوپتوز عصبی ناشی از استرس دارند [9، 23]. بیان غیر طبیعی a-synuclein نیز یکی از نشانگرهای مهم در آسیب شناسی PD است [2]. با استفاده از qRT-PCR، بیان ATF3، CHOP، SNCA، و فاکتور نوروتروفیک مشتق شده از خط سلول گلیال (GDNF) را در MPP تجزیه و تحلیل کردیم؟ مدل سلول و متوجه شد که MPP؟ به طور قابل توجهی بیان ATF3، CHOP و SNCA را در مقایسه با گروه کنترل PBS افزایش داد. ECH بر بیان این ژن‌ها در سلول‌های SH-SY5Y که با MPP درمان نشده بودند تأثیری نداشت. با این حال، ECH بیان ناشی از MPP? خود را لغو کرد (شکل 3). علاوه بر این، MPP؟ به طور قابل توجهی بیان GDNF را در سلول های SH-SY5Y سرکوب کرد، اما ECH تا حدی این پدیده را معکوس کرد (شکل 3B).

ECH از فعال شدن MPP{0}}کاسپاز القایی-3 در سلول های SH-SY5Y جلوگیری می کند

سطوح بالای ATF3 و CHOP به طور مستقیم آپوپتوز عصبی را ترویج می کند [9، 23]. داده های ما نشان داد که ECH بیان ATF3 و CHOP را به روشی وابسته به دوز مهار می کند (شکل 4A). ECH همچنین کاسپاز ناشی از MPP را مسدود کرد-3

فعالیت (شکل 4A, B). تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس شکل شکافته شده کاسپاز{1}} بیشتر نشان داد که ECH به طور قابل توجهی بیان پروتئین کاسپاز{2}} بریده شده را در سلول های تیمار شده با MPP؟ کاهش داد (شکل 4C).

ECH باعث معکوس شدن MPP{0}}تجمع ATF3 و CHOP القا شده در سلول‌های SH-SY5Y می‌شود

به دنبال قرار گرفتن در معرض سموم محیطی، پروتئین های ATF3 و CHOP در سیتوپلاسم و هسته قرار می گیرند [24، 25] و این منجر به آپوپتوز می شود. نتایج ما نشان داد که MPP؟ درمان بیان ATF3 و CHOP را در هسته افزایش داد و ECH به طور موثر این فرآیند را کاهش داد (شکل 5A، B). تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان داد که MPP؟ به طور قابل توجهی سطوح هر دو پروتئین در سیتوپلاسم و هسته افزایش یافته است. جالب است که ECH MPP را لغو کرد؟ اثرات و سرکوب تجمع ATF3 و CHOP در هسته (شکل 5C-E).

ATF3 نقش مهمی در MPP{1}}آپوپتوز القایی در سلول های SH-SY5Y ایفا می کند

نشان داده شده است که ATF3 باعث القای آپوپتوز در سلول های SH-SY5Y می شود [23]، و نتایج مطالعه حاضر نشان می دهد که ECH به طور قابل توجهی mRNA و بیان پروتئین ATF3 ناشی از MPP را سرکوب می کند؟ در این سلول ها با این حال، نقش ATF3 در آپوپتوز و حفاظت ECH از بقای سلول نامشخص باقی مانده است. بنابراین ما از RNA سنجاق سر کوچک (shRNA) مخصوص ATF3 برای بررسی این موضوع استفاده کردیم و هیچ تفاوتی در قابلیت زنده ماندن بین گروه ATF{7}}و گروه کنترل در شرایط عادی پیدا نکردیم (شکل 6A). با این حال، سرکوب ATF3 یا درمان ECH به طور قابل توجهی تغییرات مورفولوژیکی ناشی از MPP را نجات داد؟ (شکل 6B). پس از قرار گرفتن در معرض MPP، سلول‌های ATF{11}}در مقایسه با گروه کنترل زنده ماندند؟ (شکل 6C). سطح پروتئین CHOP و کاسپاز فعال-3 در سلول‌های ATF{14}}کوک‌داون کمتر از

در سلول های کنترل با shRNA غیر اختصاصی (شکل 6C، D). این داده ها نشان داد که ATF3 نقش مهمی در آپوپتوز ناشی از MPP? سلول های نوروبلاستوما ایفا می کند. بنابراین، این نتایج از این فرضیه حمایت می‌کند که ECH از سلول‌های SH-SY5Y در برابر اثرات ناشی از MPP? از طریق کاهش مسیر ROS/ATF3/CHOP محافظت می‌کند. جالب توجه است، داده‌های ما نشان داد که ECH همچنین از افزایش سطح p53 و PUMA (p{10}}تعدیل‌کننده آپوپتوز تنظیم‌شده بالا) ناشی از MPP در سلول‌های SH-SY5Y جلوگیری می‌کند (شکل 7).

سیستانچاکیناکوزیداثر تقویتی داردمصونیت

ECH از نورون های DA در برابر آپوپتوز محافظت می کند

القا شده توسط MPP1 in vitro یا MPTP در Vivo

برای تأیید عملکرد ECH در PD، نورون‌های اولیه DA با MPP درمان شدند؟ یا MPP؟ و ECH. آزمایشات آزمایشگاهی نشان داد که MPP؟ به طور قابل توجهی زنده ماندن نورون های DA را کاهش داد و این توسط ECH جلوگیری شد

(شکل 8). ما آپوپتوز را در نورون‌های DA در SNc بعد از درمان‌های مختلف در موش‌های مبتلا به PD و گروه کنترل ناشی از MPTP ارزیابی کردیم. نورون های TH مثبت بیشتری در این ناحیه در گروه کنترل نسبت به گروه MPTP یافت شد (شکل 9A). سنجش TUNEL نشان داد که NS و ECH آپوپتوز را در نورون‌های DA در SNc القا نکردند، اما MPTP این کار را کرد و ECH از نورون‌ها در برابر آن محافظت کرد (شکل 9B، S2). جالب توجه است که وسترن بلات لیزات SNc از مدل موشی PD نشان داد که سطح پروتئین ATF3 و CHOP نیز توسط ECH کاهش یافته است (شکل 10).

سیستانچاکیناکوزیددارای یکاثر ضد آپوپتوز