بخش Ⅰ ارزش کمکی سیستانچ های گیاهی هنگام استفاده در ترکیب با استاتین در مدل های موش

الین وات، چون فای نگ، چی من کون، چنگ ژانگ، سی گائو، برایان تاملینسون و کلارا بیک سان لائو

1 موسسه پزشکی چینی، دانشگاه چینی هنگ کنگ، شاتین، مناطق جدید، هنگ کنگ.

2 آزمایشگاه کلیدی دولتی فیتوشیمی و منابع گیاهی در غرب چین، دانشگاه چینی هنگ کنگ، شاتین، مناطق جدید، هنگ کنگ.

3 بخش فارماکولوژی بالینی، گروه پزشکی و درمانی، دانشگاه چینی هنگ کنگ، شاتین، مناطق جدید، هنگ کنگ. الین وات و چون فای نگ به طور مساوی در این کار مشارکت داشتند. مکاتبات و درخواست مواد باید به CBSL ارسال شود (ایمیل: claralau@cuhk.edu.hk)

برای اطلاعات بیشتر: emily.li@wecistanche.com

برای دریافت اطلاعات بیشتر در مورد Cistanche اینجا را کلیک کنید

خلاصه

به خوبی شناخته شده است که استاتین ها مشکلات سمیت عضلانی دارند.هرباسیستانچ(HC) یک گیاه چینی است که به طور سنتی برای درد در ناحیه کمر و زانو استفاده می شود. مطالعه قبلی ما در شرایط آزمایشگاهی نشان داد که می تواند در برابر سمیت عضلانی ناشی از استاتین محافظت کند. با این حال، این است که در داخل بدن اثر محافظتی هرگز بررسی نشده است. هدف از این مطالعه تعیین اینکه آیا عصاره آبی ازهرباسیستانچ(HCE) می‌تواند از سمیت عضلانی ناشی از سیمواستاتین در موش‌ها جلوگیری کند و اینکه آیا Herba Cistanche E نیز می‌تواند اثرات مفیدی در کاهش کلسترول خونی ناشی از رژیم غذایی پرچرب و افزایش کلسترول کبد داشته باشد، در نتیجه دوز سیمواستاتین را در صورت استفاده در درمان ترکیبی کاهش می‌دهد. از نتایج ما، Herba Cistanche E به طور قابل توجهی کاهش وزن عضلانی ناشی از سیمواستاتین را بازسازی کرد و کراتین کیناز پلاسما را در موش‌ها کاهش داد.هرباسیستانچE همچنین کاهش سطح گلوتاتیون عضلانی ناشی از سیمواستاتین، پتانسیل غشای میتوکندری عضلانی و کاهش التهاب عضلانی ناشی از سیمواستاتین را بهبود بخشید. علاوه بر این، HCE می‌تواند وزن کبد، سطح کل چربی کبد و سطح چربی پلاسما را در موش‌های تغذیه‌شده با چربی بالا کاهش دهد. در نتیجه، مطالعه ما شواهد in vivo ارائه کرد کههربا سیستانچE دارای اثرات محافظتی بالقوه بر روی سمیت ناشی از سیمواستاتین در عضلات، و همچنین اثرات مفیدی بر کبد چرب غیر الکلی ناشی از رژیم غذایی و افزایش چربی خون در صورت استفاده به تنهایی یا همراه با سیمواستاتین در دوز کاهش یافته دارد.

مهارکننده‌های ردوکتاز HMG-CoA که به نام استاتین‌ها نیز شناخته می‌شوند، به خوبی برای بیماران هیپرکلسترولمیک با خطر متوسط ​​و بالا بیماری قلبی عروقی مفید هستند. استاتین‌ها، یکی از پرفروش‌ترین گروه‌های دارویی نسخه‌ای در جهان، از طریق مهار کاهش HMG-CoA به اسید موالونیک در مراحل اولیه مسیر موالونات برای کاهش سنتز کلسترول درون‌زا عمل می‌کنند. یکی از مهم ترین و شناخته شده ترین عوارض جانبی بالینی، ناهنجاری های عضلانی اسکلتی است که می تواند از میالژی خوش خیم تا میوپاتی شدید متغیر باشد. درمان با استاتین علائم عضلانی را گزارش کرد که 30 درصد از این بیماران علامت دار منجر به قطع درمان شدند. کارگروه ایمنی استاتین انجمن ملی لیپید توصیه هایی را برای مدیریت علائم مرتبط با عضله در بیماران تحت درمان با استاتین ارائه کرده است. به طور کلی، توصیه می شود در بیمارانی که علائم شدیدی مانند افزایش کراتین کیناز (CK) بیش از 5×ULN دارند، تا زمانی که سطح CK دوباره نرمال شود، مصرف استاتین خودداری شود. با توجه به بروز این عوارض جانبی، و اینکه هیچ درمان موثری برای سمیت عضلانی ناشی از استاتین وجود ندارد، بنابراین نیاز به جستجوی درمان‌های جدید برای مدیریت مشکلات عضلانی ناشی از استاتین وجود دارد.

در حالی که مجموعه‌ای از مکانیسم‌ها پیشنهاد شده‌اند و می‌توانند مسئول اثرات نامطلوب استاتین باشند، اعتقاد بر این است که مکانیسم‌های میتوکندریایی در اثرات نامطلوب سمیت عضلانی استاتین 1 دخیل هستند. موالونات نه تنها یک پیش ساز کلسترول است، بلکه پیش ساز ترکیبات مهمی مانند سلنوپروتئین ها، دولیکول و یوبی کینون است. استاتین می تواند سلنوپروتئینی مانند گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) را کاهش داده و تراکم آنتی اکسیدانی را به خطر بیندازد و در ایجاد عوارض جانبی آن نقش داشته باشد. اثرات 4. استاتین ها همچنین می توانند منجر به کاهش یوبی کینون شوند که باعث کاهش مصرف اکسیژن و سنتز ATP می شود. علاوه بر این، افزایش مطالعات in vitro و in vivo نشان داد که استاتین همچنین می‌تواند مستقیماً بر روی میتوکندری‌های بافتی تأثیر بگذارد و باعث افزایش گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) و استرس اکسیداتیو میتوکندری شود که منجر به مرگ سلولی و در نتیجه منجر به آسیب‌های کبدی و عضلانی می‌شود.

هرباسیستانچ، کل گیاه خشک شده ازسیستانچدسرتیکولاYC Ma (خانواده Orobanchaceae)، گیاهان انگلی هستند که عمدتاً در نواحی بیابانی شمال و شمال شرق چین رشد می کنند. بر اساس تئوری طب چینی، هربا سیستانچ طعم شیرین، گرم و شور دارد. این یک گیاه مقوی چینی تقویت کننده یانگ است که عمدتاً برای درمان کمبود کلیه با علائمی مانند ناتوانی جنسی، ناباروری، انزال زودرس استفاده می شود. همچنین یک گیاه چینی است که به طور سنتی برای بیماران برای درد در ناحیه کمر و زانو تجویز می شود و معمولاً در فرمول های چینی برای درمان مشکلات عضلانی استفاده می شود. فعالیت های خستگی یک عصاره غنی از پلی ساکارید و غنی از فنیل اتانوئید از گیاه سیستانچ در موش های صحرایی پس از ورزش با کاهش آسیب عضلانی و بهبود ذخیره سازی ATP15. علاوه بر این، کار اخیر نشان داده است که عصاره متانولی گیاه هربا سیستانچ می تواند نسل ATP میتوکندریایی را افزایش دهد.هرباسیستانچهمچنین ثابت شده است که یک آنتی اکسیدان قوی و پاک کننده رادیکال های آزاد در اندام های مختلف است که استرس اکسیداتیو و فعالیت های ROS را در مطالعات داخل بدن کاهش می دهد.هرباسیستانچعصاره آبی به طور قابل توجهی از سمیت ناشی از سیمواستاتین در سلول‌های ماهیچه‌ای اسکلتی L6 جلوگیری کرد، و همچنین کاهش تولید ATP در سلول‌های L6 ناشی از سیمواستاتین را به‌طور وابسته به دوز بازیابی کرد که نشان‌دهنده پتانسیلهرباسیستانچعصاره آبی در محافظت در برابر سمیت عضلانی ناشی از استاتین 19. با این وجود، شواهد in vivo وجود ندارد.

از این رو فرض کردیم کههرباسیستانچعصاره آبی (HCE) می تواند اثرات مفیدی بر سمیت عضلانی ناشی از سیمواستاتین داشته باشد. بنابراین، این مطالعه با هدف تعیین اینکه آیا استفاده از HCE می‌تواند سمیت عضلانی ناشی از سیمواستاتین را با استفاده از یک مدل حیوانی in vivo کاهش دهد یا خیر، و علاوه بر این، آیا HCE می‌تواند اثرات مفیدی بر کاهش هیپرکلسترولمی ناشی از رژیم غذایی پرچرب و افزایش کلسترول کبد داشته باشد یا خیر. ، در نتیجه دوز سیمواستاتین مصرفی را کاهش می دهد.

مواد و روش ها

احراز هویت و استخراج مواد گیاهی.

مواد خام گیاهی ازهرباسیستانچ(Cistanche deserticola، منبع آن از مغولستان داخلی) از Zi Xin، یک تامین کننده مشهور در گوانگژو، چین خریداری شد. Herba Cistanches از نظر شیمیایی با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک و کروماتوگرافی مایع فوق العاده مطابق با فارماکوپه چینی 201013 همانطور که قبلاً توضیح داده شد تأیید شد.ورباسکوزیدواکیناکوزید(خریداری شده از موسسه ملی کنترل محصولات دارویی و بیولوژیکی، چین) به عنوان نشانگر شیمیایی. پس از احراز هویت شیمیایی، نمونه کوپن هرباریوم ازهرباسیستانچبا شماره نمونه کوپن 2014-3434 در موزه انستیتو طب چینی دانشگاه چینی هنگ کنگ سپرده شد.

هرباسیستانچعصاره آبی همانطور که قبلا توضیح داده شد تهیه شد. به طور خلاصه، 1 کیلوگرم گیاه خام به مدت 1 ساعت خیسانده شد و سپس دو بار با حرارت دادن به مدت 1 ساعت تحت رفلاکس در 100 درجه با استفاده از 10 برابر آب مقطر استخراج شد. سپس عصاره های آبی (HCE) ترکیب و فیلتر شدند و فیلتر تحت فشار کاهش یافته در دمای 60 درجه تغلیظ شد. عصاره غلیظ لیوفیلیزه شد تا خشک شود. درصد عملکرد 50.1 درصد وزنی بر وزن بود. تمام پودر استخراج شده در خلاء بسته بندی شد و تا زمان استفاده نگهداری شد.

حیوانات آزمایشی.

سیمواستاتین از SR Pharmasolutions Ltd. خریداری شد. موش‌های نر Sprague Dawley (180-200 گرم) و موش‌های نر C57Bl/6J ({4}} هفته‌ای) توسط مرکز خدمات حیوانات آزمایشگاهی، دانشگاه چینی هنگ‌کنگ عرضه شدند. آزمایشات حیوانی توسط کمیته اخلاقیات آزمایش حیوانات دانشگاه چینی هنگ کنگ (مرجع شماره 12/074/MIS) تایید شد. تمام روش‌های آزمایشی با دستورالعمل‌های تایید شده توسط کمیته اخلاق آزمایش حیوانات دانشگاه چینی هنگ کنگ انجام شد. همه موش‌ها (3 حیوان در هر قفس) و موش‌ها (5 حیوان در هر قفس) در قفس‌های استاندارد معمولی در دمای ثابت 21 درجه با چرخه نور-تاریکی 12- ساعت قرار گرفتند. هر قفس استاندارد حاوی آسپن به عنوان مواد بستر بود. همه حیوانات به طور آزاد اجازه دسترسی به رژیم غذایی و آب را داشتند.

بررسی سمیت عضلانی ناشی از استاتین در موش صحرایی

همه موش ها به طور تصادفی به 5 گروه (n=5-10) تقسیم شدند. همه حیوانات رژیم غذایی معمولی داشتند. همچنین روزانه آب مقطر یا سیمواستاتین و با یا بدون درمان HCE به صورت داخل معده به آنها داده شد. برای حیواناتی که باید هم سیمواستاتین و هم HCE داده شود، HCE 3 ساعت پس از تجویز سیمواستاتین داده شد تا از هرگونه تداخل شیمیایی مستقیم گیاه با دارو جلوگیری شود. عصاره گیاهی یا سیمواستاتین در 0.5 درصد متیل سلولز در آب مقطر با غلظت مشخص حل شد. یک حجم از پیش محاسبه شده به صورت داخل معده با توجه به وزن فرد به هر حیوان داده شد تا حجم محاسبه شده حاوی مقدار دوز پیشنهادی مورد نیاز باشد. مشخصات این گروه ها به شرح زیر است:

گروه الف) رژیم غذایی معمولی به همراه آب مقطر (گروه کنترل عادی)

گروه ب) رژیم غذایی معمولی به همراه سیمواستاتین (640 میلی گرم بر کیلوگرم)

گروه ج) رژیم غذایی معمولی به همراه سیمواستاتین (640 میلی گرم بر کیلوگرم) به همراه دوز کم HCE (1.1 گرم بر کیلوگرم حیوان)

گروه د) رژیم غذایی معمولی به همراه سیمواستاتین (640 میلی گرم بر کیلوگرم) به همراه دوز بالا HCE (2.2 گرم بر کیلوگرم حیوان)

گروه e) رژیم غذایی معمولی به همراه دوز بالا HCE (2.2 گرم بر کیلوگرم حیوان)

میزان غذای دریافتی روزانه ثبت شد و وزن بدن دو بار در هفته اندازه گیری شد. درمان به مدت 4 هفته انجام شد. پس از آن، حیوانات با استفاده از مخلوط کتامین (mg/kg 100) و زایلازین (mg/kg 10) به صورت داخل صفاقی بیهوش شدند. خون با سوراخ قلب خارج شد و اجازه لخته شدن داده شد. پلاسما سپس با سانتریفیوژ (3،{4}} دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه) جدا شد. عضلات مختلف (چهارسر ران، گاستروکنمیوس، سولئوس، تیبیالیس قدامی، و بازکننده انگشتر) برداشته شدند و تا زمان تجزیه و تحلیل در 80- درجه ذخیره شدند.

اندازه گیری کراتین کیناز پلاسما فعالیت کراتین کیناز پلاسما (CK) با استفاده از کیت Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430، Stanbio Laboratory، USA) طبق دستورالعمل سازنده تعیین شد.

اندازه گیری گلوتاتیون پراکسیداز عضلانی گلوتاتیون پراکسیداز عضلانی (GPx) با استفاده از کیت تجاری موجود (703102، Cayman Chemical، USA) طبق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد. به طور خلاصه، بافت‌های عضلانی با PBS در pH 7.4 برای حذف گلبول‌های قرمز شسته شد و در 10-5 میلی‌لیتر بافر لیز سرد همگن شدند و پس از آن هموژنه در 10،{6}} گرم به مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتریفیوژ شد. سپس مایع رویی برداشته شد و با استفاده از کیت تجاری از نظر فعالیت GPx مورد سنجش قرار گرفت.

آماده سازی فراکسیون های میتوکندری و سیتوزولی عضلانی. بخش‌های میتوکندری و سیتوزولی از نمونه‌های عضلانی با استفاده از کیت جداسازی میتوکندری (MITOISO، Sigma-Aldrich Corporation، USA) طبق دستورالعمل سازنده تهیه شد. به طور خلاصه، نمونه‌های عضلانی تازه با کره استخراج، به قطعات کوچک بریده شدند و در بافر استخراج همگن شدند. سپس هموژن های بافتی سانتریفیوژ شدند. مایع رویی جمع آوری شد و برای تجزیه و تحلیل کسر سیتوزولی ذخیره شد. سپس گلوله های میتوکندری شسته و دوباره سانتریفیوژ شدند و برای تجزیه و تحلیل کسر میتوکندری استفاده شدند.

اندازه گیری گونه های اکسیژن فعال میتوکندری عضلانی (ROS). ROS با پروتکل اصلاح شده از ادبیات قبلی اندازه گیری شد20. به طور خلاصه، ROS از بخش میتوکندری (50 میکروگرم پروتئین در میلی لیتر) با استفاده از محلول DCFDA (C6827، Invitrogen، ایالات متحده آمریکا) اندازه گیری شد. مخلوط در دمای 37 درجه به مدت 10 دقیقه در تاریکی انکوبه شد و پس از آن با محلول سوبسترا (10 میلی مولار پیروات، 15 میلی مولار مالات) برای فعال سازی عکس انکوبه شد. شدت فلورسانس هر 5 دقیقه به مدت 60 دقیقه توسط BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader در تحریک 485 نانومتر و گسیل 520 نانومتر اندازه‌گیری شد. شدت فلورسانس برای اندازه گیری تولید ROS محاسبه شد.

پتانسیل غشای میتوکندری عضلانی پتانسیل غشای میتوکندریایی کسر میتوکندری از نمونه‌های عضلانی بر اساس پروتکل سازنده (MITOISO، Sigma-Aldrich Corporation، ایالات متحده آمریکا) تعیین شد. این روش یک سنجش نقطه ثابت است که جذب JC-1 را با تشکیل J-aggregates اندازه‌گیری می‌کند. به طور خلاصه، سوسپانسیون میتوکندری حاوی 20 میکروگرم پروتئین رقیق شد و با رنگ JC{5}} به مدت 7 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد. این 7-دقیقه زمانی است که توسط سازنده با استفاده از ترکیبات مختلف (همانطور که در پروتکل سازنده بیان شده است) بهینه‌سازی و تأیید شده است، زیرا فلورسانس مشاهده شده محلول پس از 5 تا 10 دقیقه به یک سطح می‌رسد و به دنبال آن کاهش شدیدی در فلورسانس JC{10}} به دلیل برابری غلظت JC{11}} در داخل و خارج از ماتریکس میتوکندری. شدت فلورسانس توسط BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader در تحریک 490 نانومتر و انتشار 590 نانومتر اندازه‌گیری شد. شدت فلورسانس برای اندازه‌گیری گرادیان‌های بالقوه محاسبه شد.

ارزیابی بافت شناسی و التهاب عضلات ایمونوهیستوشیمی سلول های التهابی درون ماهیچه ها با رنگ آمیزی CD68 و CD163 همانطور که قبلا توضیح داده شد 21-23 ارزیابی شد. مقاطع پارافن 5 میکرومتری برش داده شد، به لام های شیشه ای Superfrost™ Plus (Menzel-Gläser، آلمان) چسبانده شد. آنتی بادی های CD68، ED1 و CD163 ضد موش اولیه موش، ED2، (Bio-Rad، ایالات متحده آمریکا) در رقت 1:100 بر روی بخش ها اعمال شد. رنگ‌آمیزی خاص توسط EnVision™ Systems (داکو، دانمارک)، با استفاده از آنتی‌بادی ثانویه، IgG ضد موش کونژوگه با پلیمر EnVision-HRP در رقت 1:200 شناسایی و با استفاده از محلول DAB (داکو، دانمارک) شناسایی شد. با ضد رنگ آمیزی با هماتوکسیلین. سپس برش ها در دی بوتیل فتالات در هیستون (DPX) سوار شدند. وجود نوتروفیل ها در عضلات با استفاده از روش ایمونوهیستوشیمی کمی با استفاده از نرم افزار ImageJ شناسایی شد.

تجزیه و تحلیل بیان ژن عضلانی سنجش PCR که ژن‌های مرتبط با استرس اکسیداتیو را نمایان می‌کند با استفاده از آرایه‌های PCR استرس اکسیداتیو و دفاع آنتی‌اکسیدانی موش صحرایی (PARN{1}}Z، SABiosciences، Frederick، USA) انجام شد. آرایه PCR طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. به طور خلاصه، RNA کل با اتصال انتخابی به یک غشای مبتنی بر ژل سیلیکا به دنبال لیز و همگن سازی نمونه‌های عضلانی در بافر گوانیدین تیوسیانات دناتوره‌کننده (کیت RNeasy، Qiagen) جدا شد. RNA با استفاده از کیت رشته اول RT2 (SABiosciences, Frederick, USA) به cDNA معکوس رونویسی شد. سپس این cDNA به مخلوط اصلی RT2 SYBR Green qPCR (SABiosciences، Frederick، ایالات متحده آمریکا) اضافه شد. سپس، هر نمونه بر روی آرایه‌های PCR استرس اکسیداتیو و دفاع آنتی‌اکسیدانی موش (SABiosciences، Frederick، USA) تقسیم شد. تمامی مراحل طبق پروتکل سازنده انجام شد.

مطالعه هیپرلیپیدمی و استئاتوز کبدی ناشی از رژیم غذایی پرچرب در موش

همه موش ها به طور تصادفی به 5 گروه (n=8-10) تقسیم شدند و موارد زیر را دریافت کردند: گروه الف) رژیم غذایی معمولی (جدول 1). گروه های b تا e) رژیم غذایی پرچرب (حاوی 21 درصد چربی و 0.15 درصد کلسترول) (جدول 2). برای القای چاقی حیوانات به مدت 8 هفته رژیم غذایی داده شد. پس از 8 هفته، 3 ساعت پس از تجویز سیمواستاتین، به تمام گروه های تغذیه شده با چربی بالا، آب مقطر یا سیمواستاتین روزانه و یا HCE به صورت داخل معده داده شد. عصاره گیاهی یا سیمواستاتین در 0.5 درصد متیل سلولز (شرکت Sigma-Aldrich، ایالات متحده آمریکا) در آب مقطر با غلظت مشخص حل شد. یک حجم از پیش محاسبه شده به صورت داخل معده با توجه به وزن فرد به هر حیوان داده شد تا حجم محاسبه شده حاوی مقدار دوز پیشنهادی مورد نیاز باشد. مشخصات این گروه ها به شرح زیر است:

گروه الف) رژیم غذایی معمولی و آب مقطر

گروه ب) رژیم غذایی پرچرب به اضافه آب مقطر

گروه ج) رژیم غذایی پرچرب به همراه سیمواستاتین (50mg/kg)

گروه د) رژیم غذایی پرچرب به اضافه HCE (4.4 گرم بر کیلوگرم)

گروه e) رژیم غذایی پرچرب به همراه سیمواستاتین (25 میلی گرم بر کیلوگرم) به همراه HCE (4.4 گرم بر کیلوگرم)

میزان غذای دریافتی روزانه ثبت شد و وزن بدن دو بار در هفته اندازه گیری شد. در پایان مطالعه 16-هفته‌ای، همه موش‌ها پس از 16-ساعت ناشتایی شبانه قربانی شدند. حیوانات با مخلوطی از کتامین (mg/kg 100) و زایلازین (mg/kg 10) به صورت داخل صفاقی بیهوش شدند. خون با سوراخ قلب خارج شد و اجازه لخته شدن داده شد. پلاسما با سانتریفیوژ (3،{5}} دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه) جدا شد. کبد جدا شد و در دمای 80- درجه تا تجزیه و تحلیل ذخیره شد.

اندازه گیری پلاسما و چربی کبد

تری گلیسیرید پلاسما، کلسترول (11488872216 و 11489232216، Roche Diagnostics، سوئیس)، کلسترول لیپوپروتئین با چگالی بالا و چگالی کم (L-Type HDL-C و L-Type LDL-C و L-Type LDL-C) توسط شرکت های Wako Industrials اندازه گیری شد. روش های آنزیمی با استفاده از کیت تجاری موجود طبق دستورالعمل سازنده. فعالیت کراتین کیناز پلاسما (CK) با استفاده از کیت Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430، Stanbio Laboratory، USA) تعیین شد. چربی کل کبد پس از استخراج به روش Bligh و Dyer24 به روش وزن سنجی تعیین شد. لیپیدهای کبدی به صورت آنزیمی (همانطور که در بالا توضیح داده شد) پس از حل شدن در ایزوپروپانول (سیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا) 25 اندازه گیری شدند.

ارزیابی هیستوپاتولوژی و التهاب کبد رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (رنگ آمیزی H&E). بخش‌های کنه (5 میکرومتر) از بافت تعبیه‌شده در پارافین با میکروتوم بریده شد و روی لام‌های میکروسکوپ SuperFrost Plus® (Thermo Scientific، ایالات متحده آمریکا) قرار گرفت. برش ها بر اساس روش هریس و همکاران تحت رنگ آمیزی H&E قرار گرفتند. 26 و با دی بوتیل فتالات در هیستون (DPX) (سیگما آلدریچ، ایالات متحده آمریکا) 25 نصب شده است.

رنگ آمیزی و کمی سازی Mac-3. مقاطع ضخیم (5 میکرومتر) از بافت جاسازی شده با پارافین با استفاده از میکروتوم بریده شد و روی لام های میکروسکوپ SuperFrost Plus® (Thermo Scientific، ایالات متحده آمریکا) قرار گرفت. بازیابی آنتی ژن و به دنبال آن مسدود کردن با بلوک پراکسیداز (Dako Cytomation، دانمارک) انجام شد. آنتی بادی Mac{4}} ضد موش خالص اولیه (BD Pharmingen، USA) در رقت 1:50 بر روی بخش ها اعمال شد. رنگ‌آمیزی خاص با استفاده از سیستم‌های EnVision™ (داکو، دانمارک) شناسایی شد. اسلایدها با آنتی بادی ثانویه، EnVision-HRP کونژوگه با پلیمر ضد خرگوش IgG در رقت 1:200 انکوبه شدند. مک{12}} با استفاده از محلول DAB (داکو، دانمارک) شناسایی و با هماتوکسیلین رنگ آمیزی شد. سپس بخش ها در DPX سوار شدند. وجود ماکروفاژها در کبد با روش ایمونوهیستوشیمی کمی با استفاده از نرم افزار ImageJ شناسایی شد.

تحلیل آماری. تفاوت بین گروه‌های درمان و کنترل با آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) و پس از آن آزمون مقایسه چندگانه Bonferroni پس‌هواک مورد آزمایش قرار گرفت. همه تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از GraphPad Prism نسخه 6 انجام شد.{2}} (GraphPad، ایالات متحده). احتمال p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

نتایج

اثرهرباسیستانچE بر سمیت عضلانی ناشی از سیمواستاتین در موش صحرایی وزن عضلانی و اندازه گیری کراتین کیناز پلاسما. پنج نوع مختلف ماهیچه (چهارسر ران، گاستروکنمیوس، کف پا، ماهیچه های تیبیالیس قدامی و بازکننده انگشتان بلند) از تمام موش های تحت درمان جدا شد. اثرات درمان های مختلف بر وزن عضله در شکل 1a نشان داده شده است. سیمواستاتین (640mg/kg) باعث کاهش وزن قابل توجهی در عضلات چهارسر ران، گاستروکنمیوس و تیبیالیس قدامی در موش‌های صحرایی شد، در حالی که این کاهش‌ها به طور قابل‌توجهی توسط HCE بر روی عضلات چهارسر ران و گاستروکنمیوس به صورت وابسته به دوز بازسازی شد. با اينكههرباسیستانچE روندی را برای بازگرداندن وزن عضله قدامی تیبیالیس در موش‌های تحت درمان با سیمواستاتین اعمال کرد، هیچ یک از این گروه‌های درمانی به اهمیت آماری نرسیده بودند. هیچ اثر قابل توجهی از درمان HCE به تنهایی بر وزن عضلانی در مقایسه با موش های کنترل مشاهده نشد (شکل 1a).

شکل 1b اثرات تیمارهای مختلف را بر سطوح کراتین کیناز پلاسما (CK) در موش نشان داد. سیمواستاتین باعث افزایش قابل توجهی در فعالیت کراتین کیناز در موش صحرایی شد که به طور قابل توجهی توسط درمان های مشترک HCE در هر دو دوز کاهش یافت. همچنین اثر معنی داری درمان HCE به تنهایی بر سطوح CK در مقایسه با گروه کنترل وجود نداشت. از آنجایی که به نظر می رسد گاستروکنمیوس به درمان سیمواستاتین حساس است و بزرگترین عضله جدا شده از نظر جرم است، بنابراین، این عضله را برای تجزیه و تحلیل بیشتر از جمله اندازه گیری گلوتاتیون پراکسیداز عضلانی (GPx)، اندازه گیری MMP و ROS میتوکندری، و بافت شناسی عضلانی و ارزیابی التهاب انتخاب کردیم. .

اندازه گیری گلوتاتیون پراکسیداز عضلانی (GPx). سطح گلوتاتیون پراکسیداز عضلانی اندازه گیری شد و در شکل 2a نشان داده شد. تجویز سیمواستاتین باعث کاهش اندازه گیری گلوتاتیون پراکسیداز عضلانی (GPx) در موش صحرایی شد. با این حال، HCE روندی را برای بهبود کاهش GPx عضلانی ناشی از سیمواستاتین در هر دو دوز 1.1 گرم بر کیلوگرم و 2.2 گرم بر کیلوگرم اعمال کرد. همچنین هیچ اثر قابل توجهی از درمان HCE به تنهایی بر سطح GPx عضله در مقایسه با موش های کنترل عادی وجود نداشت.

پتانسیل غشای میتوکندری (MMP) و اندازه گیری ROS. درمان با سیمواستاتین (640mg/kg) باعث کاهش قابل توجهی در MMP عضلانی شد (شکل 2b). این کاهش وابسته به دوز در موش‌هایی که درمان مشترک HCE و سیمواستاتین را دریافت کردند، بهبود یافت (شکل 2b). از سوی دیگر، جالب توجه است که گروه درمان با سیمواستاتین به تنهایی سطوح ROS میتوکندری عضلانی را در مقایسه با گروه کنترل طبیعی به طور قابل توجهی کاهش داده بود (شکل 2c). با این حال، درمان HCE که به موش‌های تحت درمان با سیمواستاتین داده شد، یک روند وابسته به دوز را برای بازگرداندن سطح ROS میتوکندری عضلانی به سطح طبیعی اعمال کرد. همچنین هیچ اثر معنی‌داری از درمان HCE به تنهایی در موش‌ها در مقایسه با گروه کنترل طبیعی برای اندازه‌گیری MMP میتوکندری و ROS وجود نداشت.

ارزیابی بافت شناسی و التهاب عضلات عضلات گاستروکنمیوس از موش‌هایی که درمان‌های متفاوتی دریافت کرده‌اند، بیشتر از نظر بافت‌شناسی آنالیز شدند و بخش‌های رنگ‌آمیزی نماینده در شکل 3a نشان داده شده‌اند. حیوانات گروه کنترل بخش های بافتی عضلات طبیعی را نشان دادند. در مقابل، بخش‌های H&E از حیوانات تحت درمان با سیمواستاتین، نفوذ نشانگرهای التهابی (فلش‌های زرد) را نشان داد که با توجه به ترکیب سیمواستاتین و HCE به طور قابل‌توجهی در آن بخش‌های عضلانی موش‌ها کاهش یافت. آنالیزهای ایمونوهیستوشیمی نیز برای حضور ماکروفاژهای CD68 و CD163 به ترتیب در شکل‌های 4a و 5a، با تعیین کمیت ماکروفاژهای مربوطه در شکل‌های 4b و 5b انجام شد. تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی مقاطع عضلانی وجود ماکروفاژ (CD68) را در موش‌های تحت درمان با سیمواستاتین (رنگ قهوه‌ای) نشان داد که در موش‌ها با توجه به درمان همزمان HCE در هر دو دوز به طور قابل‌توجهی کاهش یافت (شکل 4b). همچنین هیچ التهاب قابل توجهی در حیوانات تحت درمان با HCE به تنهایی مشاهده نشد. به طور مشابه، تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی برش‌های عضلانی وجود ماکروفاژهای CD مثبت را در موش‌های تحت درمان با سیمواستاتین (رنگ قهوه‌ای) نشان داد که در موش‌ها با توجه به درمان همزمان HCE با 2.2 گرم بر کیلوگرم کاهش یافت (شکل 5b). ). همچنین هیچ التهاب قابل توجهی در حیوانات تحت درمان با HCE به تنهایی مشاهده نشد.

تجزیه و تحلیل بیان ژن عضلانی برای تعیین اثرات سیمواستاتین و HCE بر روی ژن‌های مرتبط با استرس اکسیداتیو درون عضله، سنجش PCR که ژن‌های مرتبط با استرس اکسیداتیو را نمایان می‌کند با استفاده از آرایه‌های PCR استرس اکسیداتیو و دفاع آنتی‌اکسیدانی موش صحرایی انجام شد. ژن هایی که به طور قابل توجهی تحت تاثیر تیمار با سیمواستاتین قرار گرفتند، در شکل 6 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند. این شامل گلوتاتیون پراکسیدازها (GPx) GPx1 و GPx7 و سایر پراکسیدازها از جمله Serpinb1b و کلاب (شکل 6a) می باشد. HCE در هر دو دوز (1.1 یا 2.2 گرم بر کیلوگرم) این افزایش های ناشی از سیمواستاتین در GPxs و سایر پراکسیدازها را به سطوح طبیعی کاهش داد. از سوی دیگر، درمان HCE به تنهایی به طور قابل توجهی سطوح بیان GPx1 را افزایش داد. با توجه به بیان ژن های تنظیم کننده متابولیسم ROS، سیمواستاتین به طور قابل توجهی بیان سایر ژن های متابولیسم سوپراکسید از جمله Cyba، Ncf1، Ncf2، Scd1 و Ucp2 را القا کرد. به طور مشابه، HCE در هر دو دوز به طور قابل توجهی این افزایش ها را کاهش داد (شکل 6b). علاوه بر این، سیمواستاتین بیان ژن‌های پاسخ‌دهنده به استرس اکسیداتیو شامل Apoe، Ccl5 و Txn1 را القا کرد، در حالی که این عبارات در حیوانات تحت درمان با HCE در هر دو دوز به طور قابل‌توجهی کاهش یافت (شکل 6c). از سوی دیگر، سیمواستاتین باعث کاهش قابل توجهی در بیان ژن Txnip شد. هیچ اثر قابل توجهی از HCE بر کاهش ناشی از سیمواستاتین در بیان ژن Txnip وجود نداشت (شکل 6c). سیمواستاتین همچنین افزایش قابل توجهی در بیان ژن های تنظیم کننده ناقلان اکسیژن از جمله Slc38a1 و Vim اعمال کرد. درمان همزمان HCE بیان این ژن ها را در هر دو دوز کاهش داد (شکل 6d).

اثرات استفاده ترکیبی از سیمواستاتین و HCE بر مصرف غذا و وزن بدن در موش. شکل 7a مصرف غذای روزانه موش ها را برای تمام گروه های درمان نشان داد. یک رژیم غذایی پرچرب باعث افزایش قابل توجهی در مصرف غذای روزانه حیوانات در مقایسه با حیواناتی شد که با غذای خوراکی تغذیه شده بودند (p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

اندازه گیری وزن بدن در هفته پس از 16 هفته تغذیه با چربی بالا، حیوانات تغذیه شده با HF به طور قابل توجهی وزن بیشتری نسبت به حیوانات تغذیه شده با غذا اضافه کردند (شکل 7b). با این حال، هیچ اثر معنی‌داری بین موش‌های تغذیه شده با HF و تمام گروه‌های درمانی دریافت‌کننده HF وجود نداشت. همچنین تفاوت معنی داری بین موش های تغذیه شده با HF دریافت کننده درمان مشترک سیمواستاتین و موش های HCE در مقابل موش های تغذیه شده با HF دریافت کننده HCE یا درمان سیمواستاتین به تنهایی وجود نداشت (شکل 7b).

اثرات استفاده ترکیبی از سیمواستاتین و HCE بر چربی خون و استئاتوز کبدی در موش. اندازه گیری فعالیت لیپید و کراتین کیناز پلاسما سطوح لیپید پلاسما همه موش ها در شکل 8 نشان داده شده است. در مقایسه با موش های تغذیه شده با غذای معمولی، موش های تغذیه شده با HF به طور قابل توجهی سطوح کلسترول تام پلاسما (TC) را افزایش دادند که در تمام گروه های درمان به طور قابل توجهی کاهش یافت (شکل 8a). . موش های تغذیه شده با HF تحت درمان با سیمواستاتین و HCE در مقایسه با حیوانات HF که به تنهایی سیمواستاتین یا حیوانات HF به تنهایی HCE دریافت کردند، TC پلاسما به طور قابل توجهی پایین تر بود (p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

TG پلاسما در مقایسه با موش های تغذیه شده با HF که به تنهایی درمان با سیمواستاتین دریافت کردند (ص<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">اندازه گیری لیپید روده

اثرات گروه های درمانی مختلف بر هپاتومگالی (کبد بزرگ شده) ناشی از HF با کاهش قابل توجهی در محتوای کل چربی کبد، که به صورت میلی گرم چربی در هر کبد بیان می شود، همراه بود (شکل 9a). محتوای کل چربی کبد در موش‌های تغذیه‌شده با HF در مقایسه با موش‌های معمولی که با غذای خوراکی تغذیه می‌شوند، به طور قابل‌توجهی بالاتر بود (3.0- برابر بیشتر، p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

همانطور که در شکل 9b و c نشان داده شده است، اندازه گیری کلسترول تام کبد (TC) و تری گلیسیرید کبد (TG) نشان داد که موش های تغذیه شده با HF سطوح بالاتری از هر دو لیپید را در مقایسه با موش های تغذیه شده با غذای معمولی داشتند (یعنی 3.{4} }برابر افزایش در TC، ص<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

ارزیابی التهاب کبد رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی برای رنگ‌آمیزی برای حضور ماکروفاژها (Mac{0}}) انجام شد (شکل 10a). تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمی مقاطع کبدی وجود Mac{2}} را در موش‌های پرچرب و معمولی (رنگ قهوه‌ای) نشان داد. این التهاب در حیوانات تحت درمان با سیمواستاتین بیشتر افزایش یافت، اگرچه چنین افزایشی از نظر آماری معنی دار نبود. جالب توجه است، درمان HCE، با یا بدون درمان مشترک سیمواستاتین، به طور قابل توجهی التهاب را در موش‌های تغذیه شده با چربی بالا کاهش داد. هنگام مقایسه در بین تمام گروه‌های درمانی، درمان HCE، با یا بدون درمان همزمان سیمواستاتین نیز التهاب کمتری نسبت به گروه درمان با سیمواستاتین داشت (p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

ادامه مطلب...