بخش Ⅰ شلاتور آهن، PBT434، قاچاق آهن بین سلولی را در سلول‌های اندوتلیال میکروواسکولار مغز تعدیل می‌کند.

خلاصه

آهن و سایر فلزات واسطه مانند مس و منگنز برای حمایت از عملکرد مغز ضروری هستند، اما تجمع بیش از حد آن سیتوتوکسیک است. این تجمع بیش از حد فلزات، به ویژه آهن، در بسیاری از اختلالات عصبی مشترک است. اینها عبارتند از بیماری آلزایمر، بیماری پارکینسون، آتاکسی فردریش، و سایر اختلالاتی که با تخریب عصبی و تجمع آهن مغز همراه است. مدیریت شار آهن توسط سد خونی مغزی اولین خط دفاعی را در برابر تجمع بیش از حد آهن در فیزیولوژی طبیعی و این شرایط پاتولوژیک فراهم می کند. در این مطالعه، ما تعیین کردیم که شلاتور آهن PBT434، که در حال حاضر برای درمان بیماری پارکینسون و آتروفی سیستم چندگانه در حال توسعه است، جذب آهن توسط سلول‌های اندوتلیال میکروواسکولار مغز انسان (hBMVEC) را با کیلاسیون آهن خارج سلولی تعدیل می‌کند.^{2 به علاوه}. درمان hBMVEC با PBT434 منجر به افزایش فراوانی رونوشت‌های گیرنده ترانسفرین (TfR) و سرولوپلاسمین (Cp) می‌شود. وسترن بلات و آنالیز ELISA افزایش متناظر در پروتئین ها را نیز نشان می دهد. در داخل سلول، PBT434 سطح قابل تشخیص آهن غیر فعال و خیریه را افزایش می دهد^{2 به علاوه}; داده ها نشان می دهد که این Fe^{2 به علاوه}از فریتین آزاد می شود. علاوه بر این، PBT434 به دلیل افزایش آهن آهنی سیتوزولی، بستری برای صادرکننده آهن، فروپورتین، جریان آهن را تقویت می کند. PBT434 به سرعت و به صورت دو جهته در سراسر سد خونی مغزی hBMVEC تعادل برقرار می کند. این نتایج نشان می‌دهد که کمپلکس آهن PBT بستری برای جذب hBMVEC نیست و بنابراین مدلی را پشتیبانی می‌کند که در آن PBT434 آهن بینابینی را کلات می‌کند و از جذب مجدد آهن توسط سلول‌های اندوتلیال سد خونی مغزی جلوگیری می‌کند. همچنین جذب آن توسط سایر سلول های واحد عصبی عروقی را مهار می کند. به طور کلی، این یک مکانیسم جدید و امیدوارکننده برای کیلاسیون آهن درمانی است.

برای دریافت اینجا کلیک کنیدمزایای سیستانچ چیست؟

معرفی

درمان کیلاسیون فلزی (MCT) برای مدت طولانی به عنوان درمانی برای مسمومیت با فلزات واسطه و برای اختلالات ژنتیکی در متابولیسم یک یون فلزی ضروری که منجر به تجمع بیش از حد فلز می شود، استفاده می شود [1-3]. دو نمونه از دومی تجمع بیش از حد مس در بیماری ویلسون [4] و آهن در هموکروماتوز ارثی [5] است. مس و آهن هر دو کاتالیزورهای استرس اکسیداتیو هستند و بنابراین در غلظت‌هایی که از توانایی سلول و ارگانیسم برای "چاپون کردن" این فلزات انتقالی فعال ردوکس فراتر می‌رود، سیتوتوکسیک هستند [6، 7]. تجمع آهن، به ویژه، به طور گسترده ایدیوپاتیک است. در واقع، افزایش آهن نشانه بارز پیری مغز است [8-10]. از نظر پاتولوژیک، این تجمع آهن در مغز یکی از ویژگی‌های جهش در ژن‌های غیرمرتبط با متابولیسم آهن [11-15] و همچنین انواع دیگر بیماری‌های تخریب‌کننده عصبی است که برخی از آنها فاقد پیوند ژنتیکی خاص مانند پیری [16]، بیماری آلزایمر هستند. 17]، آتاکسی فریدریش [18] و بیماری پارکینسون [19]. به عنوان یک گروه، چنین اختلالاتی را می توان به عنوان تخریب عصبی با تجمع آهن مغز (NBIA) در نظر گرفت، اگرچه این مخفف معمولاً به آنهایی که پیوند ژنتیکی برای آنها شناسایی شده است محدود شده است [11، 13، 14].

در مورد اضافه بار آهن، هدف "پاکسازی" بدن از آهن اضافی به دلیل نقص در جذب یا خروج آهن سلولی است. در اینجا هدف این است که با دارو رقابتی با شلاتورهای آهن فیزیولوژیک انجام دهیم. ترکیبی که فارماکوکینتیک خوبی دارد و میل ترکیبی بالایی با آهن آهن دارد، داروی مورد نظر است. از آنجایی که بدن بیش از حد مملو از فلز ضروری است، نگرانی کمی در مورد ایجاد کمبود در دوره درمان وجود دارد. درمان بیماری مغزی با درمان کیلاسیون آهن نیاز به استراتژی متفاوتی دارد. این مشکل از اضافه بار آهن سیستمیک نیست، بلکه از تجمع آهن در مناطق آسیب شناسی با عواقب مخرب پایین دست است. به عنوان مثال، تجمع آهن مرتبط با سن در بیماری پارکینسون (PD)، به طور بالقوه به آسیب سلولی مرتبط با استرس اکسیداتیو کمک می کند [20]. آهن حساس بیش از حد باعث افزایش تاخوردگی نادرست سینوکلئین در نورون های ماده سیاه می شود. استفاده از شلاتر با میل ترکیبی بالا ممکن است منجر به کاهش بار آهن مغز شود، اما مطمئناً باعث ایجاد کمبود آهن می شود که حداقل در افراد مسن با توجه به کمبود آهن سیستمیک رایج در آن گروه سنی منع مصرف دارد [21]. . یک شلاتور با میل ترکیبی بهینه، پتانسیل کاهش تجمع آهن و همچنین استرس اکسیداتیو همراه را به دلیل آهن حساس بیش از حد و فرآیندهای بیماری زمینه ای دارد.

سیستانچه توبولوزاواثرات سیستانچ

یکی از شلاتورهای تایید شده برای استفاده در درمان اضافه بار آهن ناشی از انتقال خون در بیماران تالاسمی، دفریپرون (DFP، نام تجاری Ferriprox) است [5، 22]. DFP همچنین در درمان آتاکسی فریدریش [23] و بیماری پارکینسون [24، 25] استفاده شده است. در یک متاآنالیز، نشان داده شده است که DFP کاهش قابل توجهی در محتوای آهن میوکارد و همچنین محافظت بیشتر از قلب در بیماران تالاسمی نسبت به دفروکسامین، عامل کلات کننده آهن کلاسیک دارد [5]. از سوی دیگر، DFP به سرعت توسط کبد متابولیزه می شود [26] و تحقیقات جدیدتر نشان داده است که Fe2 پلاس را در محل فعال هیستون لیزین دی متیلازهای وابسته به آهن، کلات می کند، فعالیتی که با سمیت سلولی قبلاً ناشناخته مرتبط است [27]. این یافته بر یک محدودیت کلیدی در استفاده از درمان کیلاسیون آهن تاکید می کند، یعنی رقابت با دارو برای آهن فیزیولوژیکی ضروری، چه در انبار آهن یا پروتئینی که دارای گونه های آهن مصنوعی است. با این وجود، برای مثال، DFP در درمان آزمایشی فاز 2 بیماری پارکینسون اثربخشی را نشان داده است، همانطور که با هر دو شاخص تحلیلی (کاهش بار آهن مغز توسط MRI وزن‌دار T{14}) و شاخص‌های رفتاری (عملکرد نورون شناختی و حرکتی) نشان داده شده است. 24، 25].

با این حال، تمایل DFP به Fe3 plus همچنان یک نگرانی است. گونه پایدار DFP-آهن، tris-complex، [Fe(DFP)3] 0 [28] است. در حالی که خنثی بودن این مجموعه برای به حرکت درآوردن آهن از سلول ایده آل است، ثابت پایداری آن، ~1037، DFP را به یک جاذب آهن واقعی تبدیل می کند. در این زمینه، مهار آنزیم آهن مانند لیزین دی متیلاز قابل پیش بینی است [27]. این نگرانی نشان‌دهنده نیاز به ایجاد شلاتورهای آهنی است که دارای نفوذپذیری غشایی DFP هستند اما میل ترکیبی ضعیف‌تری برای Fe2 plus و Fe3 plus دارند. این ویژگی اخیر، مهار داروی فلز مصنوعی و پتانسیل ترمودینامیکی عامل کیلیت را برای کاتالیز اتواکسیداسیون آهن آهن که منجر به تولید گونه‌های اکسیژن فعال می‌شود، محدود می‌کند. در اصل، شلاتورهای آهن فریک قوی خاصیت پرواکسیدانی Fe2 پلاس را کاتالیز می کنند [29]. در این مطالعه، ما گزارش می‌کنیم که چگونه چنین شلات‌کننده آهن با قرابت متوسط ​​آهن آهنی و آهنی، جریان آهن را در سلول‌های اندوتلیال ریز عروقی مغز که سد خونی مغزی (BBB) ​​را تشکیل می‌دهند، تعدیل می‌کند.

قرص سیستانچ

این دارو، PBT434 [5،7-دی کلرو-2-((متیل آمینو) متیل)-8-هیدروکسی-3-متیل کینازولین-4 (3H)-one، شکل 1A] ، یک کمپلکس بی آهن را با ثابت های پایداری لگاریتم ~11 و ~15 برای Fe تشکیل می دهد.^{2 به علاوه}و Fe^{3 به علاوه}، به ترتیب [30]. PBT434 از از بین رفتن نورون های ماده سیاه پارس فشرده (SNpc)، کاهش تجمع نیگرال سینوکلئین، کاهش محتوای آهن مربوط به مدل بیماری PD در مغز میانی، و نجات عملکرد حرکتی در دو مدل موش بیماری پارکینسون بدون هیچ گونه تخلیه آشکاری از ذخایر آهن جلوگیری کرد. [30]. PBT434 همچنین در مدل‌های موش آتروفی سیستم چندگانه (MSA) [30، 31]، یک اختلال حرکتی شبیه به پارکینسون است، اما با تا زدن نادرست سینوکلئین و تجمع متعاقب آن که باعث تشکیل ادخال‌های سیتوپلاسمی گلیال می‌شود، مشخص می‌شود. آسیب شناسی بیماری [32]. به طور قابل توجهی، PBT434 نشانگرهای استرس اکسیداتیو را در مدل‌های PD موش کاهش داد [30] که نشان می‌دهد 1) PBT434 ذخایر آهن را هدف قرار می‌دهد که در غیر این صورت به عنوان پرو اکسیدان عمل می‌کردند و 2) PBT434 این سمیت سلولی مبتنی بر اکسیداسیون را تقویت نکرد. PBT434 یک مطالعه فاز 1 را به طور رضایت بخشی تکمیل کرده است [33].

کار ارائه شده در اینجا برای بررسی تأثیر PBT434 بر قاچاق آهن در سلول‌های مانع مغز، سلول‌های اندوتلیال میکروواسکولار که همراه با گلیای زیرین سد خونی مغزی را تشکیل می‌دهند، طراحی شده است. این مطالعات از یک رده سلولی اندوتلیال جاودانه شده معتبر در هر دو فرمت کشت تک لایه و ترانس چاه استفاده کرده اند [34-37]. هدف اولیه از این مطالعات تعیین سینتیک جذب و خروج آهن از این سلول ها و مدولاسیون آنها توسط PBT434 بود. مدل transwell BBB همچنین برای نشان دادن شار بین سلولی دو طرفه PBT434 در سراسر سد سلولی اندوتلیال مورد استفاده قرار گرفت. این مدل در شرایط مولکولی نشان داد که PBT434 جذب آهن را با کیلاسیون مهار می کند و در عین حال جریان آهن را تحریک می کند. مطالعات تصویربرداری سلولی نشان می دهد که PBT434 به همان حوضچه آهن ناپایدار که توسط آهن کلاسیک کاوش شده است دسترسی دارد.^{2 به علاوه}عامل کیلیت، 2،2'-بی پیریدین یا بی پیریدیل، و یک پروب فلورسنت برای آهن آهن. نتایج یک مکانیسم عمل احتمالی را برای PBT434 نشان می‌دهد که شامل مهار جذب آهن سیستمیک در BBB، و متعاقب آن جداسازی آهن مغز در فضای بینابینی است.

نتایج

1. PBT434 هیچ اثر سیتوتوکسیک بر سلول های اندوتلیال میکروواسکولار مغز ندارد

برای تعیین محدوده غلظت کاری مناسب برای PBT434 در کشت سلولی آزمایشگاهی خود، از روش MTT برای نظارت بر عملکرد میتوکندری hBMVEC در پاسخ به PBT434 استفاده کردیم. بر اساس گزارش های قبلی [30]، با طیف وسیعی از غلظت PBT434 تا 100 میکرومولار به مدت 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. ما هیچ تغییر قابل توجهی در زنده ماندن hBMVEC با هر غلظت آزمایش شده مشاهده نکردیم (شکل 2).

2. PBT434 به سرعت از سد hBMVEC گرفته شده و قاچاق می شود

PBT434 یک داروی خوراکی زیستی است که می تواند به آسانی به BBB نفوذ کند، همانطور که در مطالعات انجام شده بر روی موش و انسان مشاهده شد [30، 38، 39]. ما تجمع PBT434 را در hBMVEC رشد یافته در تک لایه ها با استفاده از PBT434 نشاندار شده با 14C به عنوان یک ردیاب رادیویی کنترل کردیم. داده ها نشان داد که در مرحله اول، 14C-PBT434 به سرعت بین محیط جذب و سلول تعادل برقرار کرد. این جذب اولیه با تجمع آهسته اضافی در طول 3 ساعت دنبال شد که نرخ 9.8 ± 30.1 pmol/mg/h را نشان داد (شکل 3A). در پروتکل جذب، جذب خاموش می شود و سلول ها قبل از پردازش برای تجمع 14C-PBT434 در دمای 4 درجه سانتی گراد شسته می شوند (روش ها). در یک آزمایش جداگانه، ما جریان 14C-PBT434 از hBMVEC را پس از یک دوره بارگذاری 30 دقیقه بررسی کردیم. در پروتکل جریان، سلول ها در دمای 25 درجه سانتی گراد شستشو می شوند. داده‌های شکل 3B نشان می‌دهد که در شستشوی دمای 25 درجه سانتی‌گراد، تقریباً 92 درصد از 14C-PBT434 انباشته شده در سلول از بین رفت (550 pmol 14C-PBT434/mg پروتئین در 3A در 30 دقیقه تا 43 pmol 14C-PBT4 پروتئین در t=0 در 3B). از دست دادن آهسته بیشتر 14C-PBT434 باقی مانده بود (شکل 3B). داده ها دو جنبه از تجمع و جریان PBT434 توسط hBMVEC را نشان می دهد. شار در سراسر غشای پلاسما به سرعت در حال رسیدن به چیزی است که به نظر می رسد تعادل است، چه در طول جذب یا جریان. با این حال، در هر دو فرآیند، روند کندتر دیگری وجود دارد. این نشان می‌دهد که در داخل سلول، بخشی از سلول PBT434 در یک موقعیت/حالت است که در یک رابطه حالت پایدار جنبشی با بخش در تعادل با محیط خارج سلولی است. تجزیه و تحلیل جنبشی ذکر شده در شکل 3B تخمین زد که این مخزن PBT434 توسط پروتئین 4±27 pmol/mg در لیز سلولی نشان داده شده است، زمانی که سلول ها با معرف 20 میکرومولار تیمار شدند.

برای بررسی شار بین سلولی PBT434، ما از یک مدل BBB در شرایط آزمایشگاهی معتبر با استفاده از رشد در سمت آپیکال یک غشای transwell استفاده کردیم [35، 36، 40، 41]. ویژگی‌های بازدارنده این کشت‌های transwell با تعیین کمیت مقاومت الکتریکی ترانس اندوتلیال (TEER) و نفوذناپذیری آنها نسبت به دکستران نشاندار شده با FITC تأیید شد (شکل S1). ما جذب 14C-PBT434 را در غشای مجرا (یا اپیکال، خون) (شکل 4A) با جذب در غشای شکمی (یا سمت قاعده جانبی مغز) (شکل 4C) مقایسه کردیم. در همان آزمایش، جریان مربوطه (شار بین سلولی) با ظاهر 14C-PBT434 در محفظه جریان (شکل 4 پانل های B و D) اندازه گیری شد. نرخ این فرآیندها در جدول 1 ارائه شده است. داده های جرمی نشان داده شده در شکل 4 (پانل های B و D) نشان می دهد که شار خالص PBT434 در این سد خونی مغزی مدل در دو جهت یکسان بوده است. 976±185 pmol 14C-PBT434 در محفظه پایه انباشته شده بود (شکل 4B) و 1033±210 pmol در محفظه پایه (شکل 4D) اندازه گیری شد. این هم ارزی تقریباً در نرخ های بسیار مشابه جریان PBT434 در دو غشای مانع نیز منعکس شد (جدول 1). با این حال، جذب بیشتر PBT434 در غشای قاعده‌ای در این مدل سد وجود داشت، همانطور که با 50 درصد از دست دادن بیشتر ترکیب از محفظه پایه (شکل 4C) نشان داده شده است که با نرخ 40 درصد بیشتر جذب سلولی مطابقت دارد. (میز 1). پیش‌بینی می‌شود که جذب قوی‌تر منجر به تجمع بیشتر شود. تجزیه و تحلیل سلول ها در 3 ساعت نشان داد که آنها ~ 6 میکرومولار PBT434 را بدون توجه به جهت شار حفظ کردند. مقادیر 8.1±1.3 میکرومولار (اپیکال به پایه) و 4.7±1.2 میکرومولار (پایه به آپیکال) بود. همانطور که در بالا ذکر شد، این تجزیه و تحلیل پس از شستشوی سلول ها قبل از لیز و تعیین کمیت پروتئین کل سلول و 14C-PBT434 انجام می شود. علاوه بر این، محیط در محفظه آپیکال حاوی RPMI به اضافه 10 درصد FBS و 10 درصد NuSerum بود در حالی که محفظه پایه، مغز حاوی تنها RPMI (روش‌ها) بود. یک استنباط منطقی این بود که "جذب" بیشتر در غشای پایه منعکس کننده جذب سطح سلولی PBT434 است که در محفظه آپیکال به دلیل حضور اجزای پروتئین در سرم محدود شده بود. پس از شستشوی سلول ها برای تجمع PBT434، این ماده جذب شده (که به عنوان "جذب" ثبت شده بود) حذف شد. تکرار این آزمایش شار اما با سرم در محفظه پایه نشان داد که در واقع، سرم این جذب احتمالی PBT434 سطح سلولی را سرکوب می کند (شکل S2).

3. PBT434، بر خلاف بی پیریدیل، دسترسی داخل سلولی آهن حساس را محدود نمی کند.

از آنجایی که PBT434 نسبت به شلاتورهای کلاسیک آهن مانند دفریپرون یا بی پیریدیل میل ترکیبی متوسط ​​تری برای آهن دارد، ما بررسی کردیم که چگونه این تفاوت در اثر PBT434 روی استخر آهن حساس سلولی (LIP) hBMVEC منعکس شد. برای این کار از نفوذپذیر Fe استفاده کردیم^{2 به علاوه}- رنگ فلورسنت خاص FerroOrange، که با آهن سیتوپلاسمی خیریه واکنش می دهد. ما شاهد کاهش قابل توجهی از فلورسانس در سلول ها در هنگام درمان با بی پیریدیل بودیم که مطابق با کیلاسیون LIP توسط این شلاتور آهن آهنی با میل ترکیبی بالا بود و در نتیجه عملکرد نشانگر آهن فلورسنت را مسدود می کرد (شکل 5A). در مقابل، PBT434 برای آهن با FerroOrange رقابت نکرد^{2 به علاوه}، رفتاری منطبق با قرابت متوسط ​​تر آن [30]. نتایج نشان داد که PBT434، اما نه مشتق غیرفعال PBT، باعث افزایش 9 ± 34 درصدی در آهن قابل دسترسی به فرواورنج شد.^{2 به علاوه}نشان می دهد که این عامل کیلیت آهن را بدون سمیت همزمان در سلول بسیج می کند. داده های ارائه شده در زیر نشان می دهد که این آهن از فریتین به دست آمده است.

قبلا نشان داده شده بود که PBT434 بیان پروتئین فروپورتین تهی شده را در موش های تحت درمان با MPTP به سطحی مشابه سطح موش های بدون آسیب بازگرداند [30]. این نتیجه، همراه با افزایش رنگ‌آمیزی آهن آهن درون سلولی در پاسخ به PBT434، تأثیر بالقوه‌ای را بر سیستم پاسخ آهن سلولی و عملکرد پروتئین‌های مرتبط با آهن پایین‌دست نشان داد. برای ارزیابی این، ما ابتدا تجزیه و تحلیل کمی PCR (qPCR) را از تأثیر PBT434 بر فراوانی رونوشت‌ها برای چندین پروتئین حمل‌کننده آهن انجام دادیم (شکل 6). در حالی که رونوشت‌های پروتئین جریان آهن، فروپورتین (Fpn) و دو چاپرون آهن سیتوپلاسمی، PCBP1 و 2 بی‌تأثیر بودند، فراوانی mRNA‌ها برای گیرنده ترانسفرین (TfR) و فرواکسیداز، سرولوپلاسمین (Cp) تأثیری نداشت. تغییر دادن. رونوشت های TfR و Cp به ترتیب 2.8 و 3.{13}}برابر افزایش یافت. بیان گیرنده ترانسفرین (TfR) به سیستم عنصر پاسخگو به آهن (IRE)/پروتئین تنظیم کننده آهن (IRP) مرتبط است [42-44]. افزایش mRNA TfR نشان می‌دهد که PBT434 با تحویل وابسته به PCBP{18}}آهن برای جمع‌آوری خوشه Fe, S که IREBP تنظیم‌کننده را از پروتئین متصل‌کننده به RNA به آکونیتاز سیتوزولی تبدیل می‌کند، رقابت می‌کند [45]. بنابراین، PBT434 این مدولاسیون تنظیمی را به سمت اتصال به RNA و مهار مربوط به تخریب mRNA TfR تغییر می‌دهد. در کمبود آهن سلولی، بیان Cp تا حدی توسط HIF تنظیم می‌شود [46]. افزایش عملکرد HIF{25}} ناشی از کاهش هیدروکسیلاسیون آن توسط فعالیت پرولیل هیدروکسیلاز در یک واکنش وابسته به آهن است [47]. همانطور که در مورد IREBP، PBT434 به نظر می رسد که مجموعه آهنی را که به عنوان یک عامل کمکی در هیدروکسیل شدن و تجزیه HIF عمل می کند، کاهش می دهد. در این مدل، افزایش سطح حالت پایدار این فعال کننده رونویسی، رونویسی Cp را افزایش می دهد.

با استفاده از ترکیبی از آنالیز ELISA و وسترن بلات، بیان پروتئین‌های کنترل‌کننده آهن را در PBT434 یا PBT{2}}hBMVEC تیمار شده بررسی کردیم. نمونه هایی از تحلیل های WB در شکل 7A آورده شده است. داده ها نشان داد که فراوانی مونومر و دایمر TfR به طور قابل توجهی تا 24 ساعت افزایش یافته است، همانطور که Cp افزایش یافته است (شکل 7B و 7C). هر دو افزایش به موازات افزایش وابسته به PBT در رونوشت های مربوطه بود (شکل 6)، در مقابل، بیان پروتئین جریان آهن، Fpn، نسبت به تیمار PBT434 حساس نبود (شکل 7D).

ما از ELISA به عنوان یک روش اضافی برای تعیین کمیت تغییرات چین نشان داده شده توسط داده های وسترن بلات استفاده کردیم. بنابراین، hBMVEC با PBT434 به مدت 24 ساعت تیمار شد و لیزهای سلولی توسط ELISA برای TfR مورد سنجش قرار گرفتند (شکل 8A). افزایش برابری در TfR در پاسخ به تیمار PBT434 که توسط الایزا اندازه‌گیری شد، معادل آنالیز وسترن بلات بود (شکل 7B). ELISA همچنین برای ارزیابی فراوانی پروتئین Cp ترشح شده و مرتبط با GPI، با استفاده از سلول‌های HepG2 به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. در مورد Cp ترشح شده در محیط رشد، این رویکرد از این جهت محدود بود که فراوانی sCp در هر دو محیط شرطی شده HepG2 و hBMVEC در حد حساسیت پایین تر این سنجش یا کمتر از آن بود (شکل S3). با این حال، ارزیابی فراوانی GPI-Cp را امکان پذیر کرد. در این روش، سلول ها با فسفاتیدیلینوزیتول خاص فسفولیپاز C (PI-PLC)، که لنگر GPI را می شکند، تیمار شدند. رسانه ای که بدین ترتیب شرطی شده است متمرکز و توسط Cp-ELISA تجزیه و تحلیل شد. در حالی که این رویکرد نشان داد که PBT434 مقدار GPI-Cp را در سلول‌های HepG2 افزایش می‌دهد، دوباره نتوانست هر Cp منتشر شده توسط PI-PLC را شناسایی کند (شکل 8B). ELISA همچنین یک روش مستقیم برای تعیین کمیت فریتین ارائه کرد. برای انجام این کار، hBMVEC با 1 میکرومولار آهن سیترات به مدت 24 ساعت بارگذاری شد و به دنبال آن درمان در غیاب یا حضور PBT434 برای 1 ساعت اضافی انجام شد. لیزات سلولی به دست آمده تحت آنالیز ELISA برای فریتین قرار گرفتند (شکل 8C). برخلاف افزایش TfR، درمان با PBT434 پروتئین فریتین (Ft) را تا 18 درصد کاهش داد. در واقع، این از دست دادن پروتئین Ft تنها پس از درمان 1 ساعت با معرف آشکار شد. ماهیت زمانی این نتیجه را می توان با افزایش Fe2 به علاوه خیریه که در بالا به دنبال درمان 30 دقیقه ای با PBT434 ذکر شد، مرتبط دانست. همانطور که بعداً مورد بحث قرار گرفت، کاهش فریتین به دنبال درمان با سایر عوامل حاوی Fe2 به همراه کلات کننده در سلول نشان داده شده است [48].

4. ⁵⁵آهن^{2 به علاوه}جذب با کمپلکس شدن با PBT434 مهار می شود

با توجه به تعادل سریع PBT434 در hBMVEC در عرض 30 دقیقه، در مقایسه با جذب آهسته و دو فازی و تعادل Fe2 به علاوه در طول 24 ساعت [49]، ما فرض کردیم که PBT434 و Fe2 plus مکانیسم جذب یکسانی ندارند. برای آزمایش این، تک‌لایه‌ها با 55Fe2 پلاس نشاندار شده با رادیواکتیو در غیاب یا حضور PBT434 یا PBT{10}} انکوبه شدند و جذب 55Fe2 به علاوه طی 3 ساعت تحت نظارت قرار گرفت (شکل 9A). PBT434 به طور قابل توجهی سرعت جذب 55Fe2 به علاوه کاهش و همچنین تجمع کلی 55Fe2 پلاس در لیزات سلولی را کاهش داد (شکل 9C). این اثر با PBT{21}}متد دیده نشد. مقایسه نرخ جذب PBT434 با 55Fe نشان می‌دهد که PBT434 و Fe2 plus توسط مسیرهای انتقال جداگانه جذب می‌شوند. علاوه بر این، مهار جذب 55Fe در حضور PBT434 اما نه PBT{30}}میت نشان می‌دهد که یک کمپلکس آهن خارج سلولی PBT{31}} لیگاندی برای انتقال‌دهنده‌های آهن آهنی در hBMVEC، یعنی ZIP8 نیست، و ZIP14.

مکمل های سیستانچ

برای بررسی بیشتر نقش PBT434 در انباشت آهن، ما تأثیر قرار گرفتن قبل از آن را بر جذب 55Fe2 به علاوه آزمایش کردیم. سلول های پیش تیمار شده با PBT434 که پس از شستن در معرض 55Fe2 پلاس قرار گرفتند، افزایشی در نرخ جذب و تجمع 55Fe2 به علاوه پس از 3 ساعت نشان دادند (شکل 9، پانل های B و D). این تجمع افزایش یافته برای حداقل 24 ساعت حفظ شد. این داده ها نشان می دهد که قرار گرفتن قبل از قرار گرفتن سلول ها در معرض PBT434 به طور موقت جذب آهن را تقویت می کند. به طور غیرمنتظره، PBT{14}}پیش درمان نیز افزایشی در جذب و انباشتگی نشان داد (شکل 9B)، اما این اثر به اندازه آنچه توسط PBT434 نشان داده شده است قابل توجه یا پایدار نبود.

ما نشان داده‌ایم که جذب آهن از 59Fe-ترانسفرین توسط کاهش فر و نفوذ فرو در غشای پلاسمایی have پشتیبانی می‌شود [50، 51]. یکی از نتایج تجربی در حمایت از این مدل جذب آهن TBI، از بین بردن این جذب با مهار فعالیت فریردوکتاز خارج سیتوپلاسمی بود. نتیجه دیگر مهار 60 درصدی جذب آهن TBI توسط فروزین، یک عامل کلات کننده آهن آهنی قوی بود [50]. این استراتژی اخیر برای نشان دادن اینکه PBT434، اما نه PBT، جذب آهن TBI را مهار می‌کند (شکل 10) مورد استفاده قرار گرفت.

5. PBT434 55Fe2 به علاوه جریان وابسته به Fpn را تحریک می کند

PBT434 تقریباً 20 درصد از توانایی دفریپرون برای تولید تحریک آشکار Fe2 به اضافه جریان خروجی از سلول های عصبی را دارد [30]. ما جریان 55Fe2 پلاس از hBMVEC را در غیاب یا حضور PBT434 در سلول‌های کنترل یا سلول‌های تیمار شده با مینی هپسیدین، PR73 ارزیابی کردیم. هپسیدین یک هورمون پپتیدی است که هم به صورت سیستمیک و هم در بینابینی مغز یافت می شود که به Fpn متصل می شود و ناقل را برای تخریب هدف قرار می دهد. اثرات هپسیدین بر عملکرد صادرات آهن Fpn به طور گسترده مورد مطالعه قرار گرفته است [52-54]. ما قبلاً نشان داده بودیم که جریان Fe2 به علاوه از hBMVEC وابسته به Fpn است [35، 49]. PR73 دارای EC50 ~4 نانومتر برای تخریب Fpn در سنجش گزارشگر GFP است [55]. hBMVEC در تک لایه ها با 55Fe2 پلاس به مدت 24 ساعت در غیاب یا حضور PR73 بارگذاری شد. سپس جریان 55Fe در یک دوره 5 ساعته در غیاب یا حضور مداوم PR73 در ترکیب با عدم حضور و حضور PBT434 اندازه گیری شد (شکل 11). در حالی که PR73 جریان 55 Fe را از هر دو کشت شاهد و تیمار شده با PBT کاهش داد، PBT434 تا حدی مهار را به دلیل مینی هپسیدین سرکوب کرد. در غیاب PBT434، جریان آهن از کشت‌های تیمار شده با PR تا 75 درصد کاهش یافت، در حالی که کاهش در کشت‌های تیمار شده با PBT تنها 50 درصد بود (شکل 11 و جدول 2). از این نتایج می توان دو نتیجه گرفت. اول، از بین بردن Fpn توسط PR73 جریان 55Fe را در حضور و همچنین عدم وجود PBT434 کاهش می دهد. دوم، تحت هر دو شرایط، PBT434 از تحریک قابل توجه هر چند کوچک جریان آهن پشتیبانی می کند.

منابع

1. Hatcher HC، Singh RN، Torti FM، Torti SV. شلاتورهای آهن مصنوعی و طبیعی: پتانسیل درمانی و استفاده بالینی Future Med Chem. 2009; 1 (9): 1643-70.

2 . Nuñez MT، Chana-Cuevas P. دیدگاه‌های جدید در درمان کیلاسیون آهن برای درمان بیماری‌های عصبی. داروسازی (بازل). 2018; 11 (4): 109.

3. Tosato M, Di Marco V. Metal Chelation Therapy و بیماری پارکینسون: مروری انتقادی بر ترمودینامیک تشکیل کمپلکس بین یون های فلزی مرتبط و داروهای امیدوارکننده یا تثبیت شده. زیست مولکول ها 2019; 9 (7).

4. Hedera P. به روز رسانی در مورد مدیریت بالینی بیماری ویلسون. Appl Clin Genet. 2017; 10:9-19.

5. Xia S، Zhang W، Huang L، Jiang H. اثربخشی و ایمنی مقایسه‌ای دفروکسامین، دفریپرون و دفراسیروکس در تالاسمی شدید: یک متاآنالیز از 16 کارآزمایی تصادفی‌سازی شده کنترل‌شده. PLoS One. 2013; 8 (12): e82662.

6. Buettner GR، Jurkiewicz BA. فلزات کاتالیزوری، آسکوربات و رادیکال‌های آزاد: ترکیباتی که باید اجتناب کرد. Radiat Res. 1996; 145 (5): 532-41. PMID: 8619018

7. سینگ A، Kukreti R، Saso L، Kukreti S. استرس اکسیداتیو: یک تعدیل کننده کلیدی در بیماری های عصبی. مولکول ها. 2019; 24 (8).

8. اشرف الف، کلارک ام، سو پی دبلیو. پیری مرد آهنی. اعصاب پیری جلویی 2018; 10:65.

9. Ghadery C، Pirpamer L، Hofer E، Langkammer C، Petrovic K، Loitfelder M، و همکاران. نقشه برداری R2* برای آهن مغز: ارتباط با شناخت در پیری طبیعی نوروبیول پیری. 2015; 36 (2): 925-32.

10. Zecca L، Youdim MBH، Riederer P، Connor JR، Crichton RR. آهن، پیری مغز و اختلالات نورودژنراتیو. Nat Rev Neurosci. 2004; 5 (11): 863-73.

11. Di Meo I، Tiranti V. طبقه بندی و پاتوژنز مولکولی سندرم های NBIA. Eur J Paediatr Neurol. 2018; 22 (2): 272-84.

12. Levi S، Finazzi D. تخریب عصبی با تجمع آهن در مغز: به روز رسانی مکانیسم های بیماری زا. فارماکول جلو. 2014; 5:99–.

13. Levi S، Tiranti V. تخریب عصبی با اختلالات تجمع آهن در مغز: مدل های ارزشمند با هدف درک پاتوژنز رسوب آهن. داروسازی (بازل). 2019; 12 (1).

14. Meyer E، Kurian MA، Hayflick SJ. تخریب عصبی با تجمع آهن در مغز: تنوع ژنتیکی و مکانیسم های پاتوفیزیولوژیکی. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015; 16:257-79.

15. تنکابنی SH، ملامحمدی محمد. تخریب عصبی با تجمع آهن در مغز: مروری. ایران جی کودک نورول. 2014; 8 (4): 1-8. PMID: 25657764

16. Cozzi A، Orellana DI، Santambrogio P، Rubio A، Cancellieri C، Giannelli S، و همکاران. مدل سازی سلول های بنیادی نوروفریتینوپاتی آهن را به عنوان عامل تعیین کننده پیری و فروپتوز در طول پیری عصبی نشان می دهد. گزارش سلول های بنیادی 2019; 13 (5): 832-46.

17. Liu JL، Fan YG، Yang ZS، Wang ZY، Guo C. آهن و بیماری آلزایمر: از پاتوژنز تا پیامدهای درمانی. نوروسک جلو. 2018; 12:632.

18. Llorens JV، Soriano S، Calap-Quintana P، Gonzalez-Cabo P، Molto MD. نقش آهن در آتاکسی فریدریش: بینش هایی از مطالعات در بافت های انسانی و مدل های سلولی و حیوانی. نوروسک جلو. 2019; 13:75.

19. Puschmann A. ژن های جدید عامل بیماری پارکینسون ارثی یا پارکینسونیسم. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17 (9): 66.

20. Crielaard BJ، Lammers T، Rivella S. هدف قرار دادن متابولیسم آهن در کشف و تحویل دارو. Nat Rev Drug Discov. 2017; 16 (6): 400-23.

21. Guralnik JM، Eisenstaedt RS، Ferrucci L، Klein HG، Woodman RC. شیوع کم خونی در افراد 65 سال و بالاتر در ایالات متحده: شواهدی برای میزان بالای کم خونی غیرقابل توضیح. خون 2004; 104 (8): 2263-8.

22. Pepe A، Meloni A، Capra M، Cianciulli P، Prossomariti L، Malaventura C، و همکاران. درمان دفراسیروکس، دفریپرون و دسفریوکسامین در بیماران تالاسمی ماژور: مقایسه آهن و عملکرد قلب توسط تصویربرداری رزونانس مغناطیسی کمی تعیین شد. هماتولوژیک. 2011; 96 (1): 41-7.

23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A, et al. دفریپرون در آتاکسی فریدریخ: یک کارآزمایی تصادفی کنترل شده یک ماهه 6-. آن نورول. 2014; 76 (4): 509-21.

24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C, et al. کیلاسیون آهن مغز توسط دفریپرون در کارآزمایی بالینی تصادفی دوسوکور کنترل شده با دارونما در فاز 2 در بیماری پارکینسون. Sci Rep. 2017; 7(1):1398.

25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. هدف قرار دادن آهن کلات به عنوان یک روش درمانی در بیماری پارکینسون سیگنال ردوکس آنتی اکسیدان 2014; 21 (2): 195-210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381

26. Singh S، Epemolu RO، Dobbin PS، Tilbrook GS، Ellis BL، Damani LA، و همکاران. پروفایل های متابولیک ادراری در انسان و موش های صحرایی 1،{2}}دی متیل و 1،2-دی اتیل جایگزین 3-هیدروکسی پیریدین-4-. متابولیسم و ​​دفع دارو. 1992; 20 (2): 256. PMID: 1352218

27. خداوردیان وی، تاپادار اس، مک دونالد IA، ژو یی، هو پی.ای، پل های آ، و همکاران. دفریپرون: مطالعه ارتباطی فعالیت بازدارندگی هیستون لیزین دمتیلاز پان انتخابی و ساختار فعالیت. Sci Rep. 2019; 9 (1): 4802.

28. Hider R. تحولات اخیر بر روی شلاتورهای آهن فعال خوراکی متمرکز شده است. گزارشات تالاسمی 2014; 4 (2).

29. دی جی کوسمان. متابولیسم آهن در هوازی: مدیریت هیدرولیز آهن آهن و اتوکسیداسیون آهن آهن Coord Chem Rev. 2013; 257 (1): 210-7.

30. Finkelstein DI، Billings JL، Adlard PA، Ayton S، Sedjahtera A، Masters CL، و همکاران. ترکیب جدید PBT434 از تخریب عصبی ناشی از آهن و سمیت آلفا سینوکلئین در مدل های متعدد بیماری پارکینسون جلوگیری می کند. Acta Neuropathol Commun. 2017; 5 (1): 53.

31. هراس-گاروین A، Refolo V، Schmidt C، Bradbury M، Stamler D، Stefanova N، ویراستاران. PBT434 نورون‌های دوپامینرژیک را حفظ می‌کند، الیگومریزاسیون آلفا سینوکلئین را کاهش می‌دهد و عملکرد حرکتی را در مدل آتروفی سیستم چندگانه موش تراریخته بهبود می‌بخشد. Annals of Neurology; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ USA.

32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: از مکانیسم های اساسی تا درمان های تجربی. اختلال مربوط به پارکینسونیسم 2020; 73:94-104.

33. داوسون وی ال، داوسون تی ام. درمان های نویدبخش اصلاح کننده بیماری برای بیماری پارکینسون. پزشکی ترجمه علوم. 2019; 11(520):eaba1659.

34. Eigenmann DE، Xue G، Kim KS، Moses AV، Hamburger M، Oufir M. مطالعه مقایسه ای چهار رده سلولی اندوتلیال مویرگی مغز انسان جاودانه، hCMEC/D3، hBMEC، TY10 و BB19 و بهینه سازی شرایط کشت، برای یک مدل سد خونی مغزی در شرایط آزمایشگاهی برای مطالعات نفوذپذیری دارو مایعات و موانع CNS. 2013; 10 (1): 33.

35. مک کارتی آرسی، کوسمن دی جی. سرولوپلاسمین سلول گلیال و هپسیدین به طور متفاوتی جریان آهن را از سلول های اندوتلیال ریز عروقی مغز تنظیم می کنند. PLoS One. 2014; 9 (2): e89003.

36. Steimle BL، Smith FM، Kosman DJ. حامل های املاح ZIP8 و ZIP14 تجمع منگنز را در سلول های اندوتلیال ریز عروق مغز تنظیم می کنند و سطح منگنز مغز را کنترل می کنند. جی بیول شیمی. 2019; 294 (50): 19197-208.

37. Stins MF، Badger J، Sik Kim K. تهاجم باکتریایی و ترانس سیتوز در سلول های اندوتلیال ریز عروق مغز انسان ترانسفکت شده. پاتگ میکروب. 2001; 30 (1): 19-28.

38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. A First in Human Study of PBT434, a Novel Small Molecule Inhibitor of -Synuclein Aggregation (S4.001). عصب شناسی. 2019; 92 (15 مکمل): S4.001.

39. Stamler D، Bradbury M، Wong C، Offman E. مطالعه فاز 1 PBT434، یک مهارکننده جدید مولکول کوچک تجمع سینوکلئین، در داوطلبان بزرگسال و مسن تر (4871). عصب شناسی. 2020; 94(15 ضمیمه):4871.

40. مک کارتی آر سی، کوسمن دی جی. فعال سازی بیان سرولوپلاسمین سلول گلیوبلاستوم C6 توسط اینترلوکین های مشتق از اندوتلیای مغز انسان همسایه در یک سیستم مدل سد خونی مغزی آزمایشگاهی. ارتباطات سلولی و سیگنالینگ: CCS. 2014; 12:65.

41. McCarthy RC، Park YH، Kosman DJ. sAPP با تثبیت فروپورتین صادرکننده آهن آهن، جریان آهن را از سلول های اندوتلیال ریز عروق مغز تعدیل می کند. گزارش های EMBO 2014; 15 (7): 809-15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889

42. Hentze MW، Muckenthaler MU، Galy B، Camaschella C. Two to Tango: تنظیم متابولیسم آهن پستانداران. سلول. 2010; 142 (1): 24-38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012

43. ژو زد، تان EK. مسیر سیگنالینگ پروتئین تنظیم کننده آهن (IRP) - عنصر پاسخگو به آهن (IRE) در بیماری های عصبی انسان. تخریب عصبی مولکولی. 2017; 12 (1): 75. https://doi.org/10. 1186/s{10}} PMID: 29061112

44. Crichton RR، Dexter DT، Ward RJ. متابولیسم آهن مغز و اختلالات آن در بیماری های عصبی J انتقال عصبی. 2011; 118 (3): 301-14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066

45. Patel SJ، Frey AG، Palenchar DJ، Achar S، Bullough KZ، Vashisht A، و همکاران. یک کمپلکس چاپرون PCBP1-BolA2 آهن را برای مجموعه خوشه‌ای سیتوزولی [2Fe-2S] تحویل می‌دهد. Nat Chem Biol. 2019; 15 (9): 872-81. https://doi.org/10.1038/s{12}} PMID: 31406370

46. ​​Mukhopadhyay CK، Mazumder B، Fox PL. نقش عامل القا کننده هیپوکسی{2}} در فعال سازی رونویسی سرولوپلاسمین در اثر کمبود آهن. جی بیول شیمی. 2000; 275 (28): 21048-54.

47. Strowitzki MJ، Cummins EP، Taylor CT. هیدروکسیلاسیون پروتئین توسط هیدروکسیلازهای عامل القاء کننده هیپوکسی (HIF): منحصر به فرد یا همه جا حاضر؟ سلول ها. 2019; 8 (5).

48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et al. بسیج آهن فریتین با واسطه فروپورتین قبل از تجزیه فریتین توسط پروتئازوم انجام می شود. امبو جی. 2006; 25 (22): 5396-404.

49. مک کارتی آر سی، دی جی کوسمن. فروپورتین و فعالیت فرواکسیداز اگزوسیتوپلاسمی برای خروج آهن سلول های اندوتلیال میکروواسکولار مغز مورد نیاز است. مجله شیمی بیولوژیکی. 2013; 288 (24): 17932-40.

50. McCarthy RC، Kosman DJ. تجزیه و تحلیل مکانیکی تجمع آهن توسط سلول های اندوتلیال BBB بیومتال ها 2012; 25 (4): 665-75.

51. دی جی کوسمان. تلوهای احیا و اکسیداسیون متالو در قاچاق آهن و مس یوکاریوتی. متالومیک. 2018; 10 (3): 370-7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341

52. Aschemeyer S، Qiao B، Stefanova D، Valore EV، Sek AC، Ruwe TA، و همکاران. تجزیه و تحلیل ساختار-عملکرد فروپورتین محل اتصال و مکانیسم جایگزین اثر هپسیدین را مشخص می کند. خون 2018; 131 (8): 899-910.

53. Ganz T، Nemeth E. هپسیدین و هموستاز آهن. Biochim Biophys Acta. 2012; 1823 (9): 1434-43.

54. Qiao B، Sugianto P، Fung E، Del-Castillo-Rueda A، Moran-Jimenez MJ، Ganz T، و همکاران. اندوسیتوز فروپورتین ناشی از هپسیدین به یوبیکوئیتیناسیون فروپورتین وابسته است. سلول متاب. 2012; 15 (6): 918-24.

55. Fung E، Chua K، Ganz T، Nemeth E، Ruchala P. مینی هپسیدین های مشتق شده با تیول فعالیت بیولوژیکی را حفظ می کنند. Bioorg Med Chem Lett. 2015; 25 (4): 763-6.

دانیل کی بیلی آی دی، ویتنی کلارک، دانیل جی. کاسمن

گروه بیوشیمی، دانشکده پزشکی و علوم زیست پزشکی جاکوبز، دانشگاه ایالتی نیویورک در بوفالو، بوفالو، نیویورک، ایالات متحده آمریکا