بخش 1: رویکردی جدید برای افزایش پتانسیل بازسازی سلول های پیش ساز اندوتلیال در بیماران مبتلا به بیماری کلیوی در مرحله پایانی

برای اطلاعات بیشتر. مخاطبtina.xiang@wecistanche.com

خلاصهسلول های پیش ساز اندوتلیال مشتق از مغز استخوان (EPCs) در گردش، ترمیم عروقی را در چندین اندام از جمله کلیه تسهیل می کند، اما در مرحله نهایی به تدریج کاهش می یابد.بیماری کلیویبیماران (ESKD)، که با پیامدهای قلبی عروقی و مرگ و میر مرتبط مرتبط است. بنابراین ما تعیین کردیم که آیا افزایش اثرات ترمیمی بافت سلول‌های استرومایی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان (BM-MSCs) با اثرات عروقی ریلکسین انسانی نوترکیب (RLX) می‌تواند تکثیر و عملکرد EPC را تقویت کند. CD34 به علاوه EPC از خون بیماران سالم و ESKD جدا شد، تا زمانی که EPC های دیررس تشکیل شود، کشت داده شدند، سپس با محیط های شرایطی مشتق از BM-MSC (CM؛ 25 درصد o)، RLX (1 یا 10ng/mL) یا هر دو تحریک شدند. درمان های ترکیبی در حالی که RLX به تنهایی تکثیر EPC، تشکیل لوله مویرگی و بهبود زخم را در شرایط آزمایشگاهی تحریک می‌کند، این اقدامات با اثرات ترکیبی CM و RLX مشتق از BM-MSC در EPCهای مشتق شده از بیماران سالم و ESKD، سریع‌تر و به طور قابل‌توجهی افزایش یافت. این یافته‌ها پیامدهای بالینی مهمی دارند، زیرا یک درمان ترکیبی جدید را شناسایی کرده‌اند که می‌تواند تعداد و عملکرد EPC را در بیماران ESKD بازیابی و افزایش دهد.

کلید واژه ها: سلول های پیش ساز اندوتلیال; مرحله نهایی بیماری کلیه؛ سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان؛ ریلکسین؛ التیام زخم؛ رگزایی؛ بازسازی

برای اطلاعات بیشتر در مورد سیستانچ برای فروش اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

بیماری مزمن کلیوی(CKD) یک مشکل بهداشتی جهانی است که به عنوان کاهش نرخ فیلتراسیون گلومرولی (GFR) کمتر یا مساوی 60 میلی لیتر در دقیقه / 1.73 متر مربع تعریف می شود که اغلب منجر به مرحله نهایی (مرحله V) بیماری کلیوی (ESKD؛ تعریف شده به عنوان) می شود. GFR کمتر یا مساوی 15 میلی لیتر در دقیقه/1.73 متر مربع)[2]. ویژگی‌های پاتولوژیک CKD شامل آتروفی لوله‌ای همراه با کاهش مویرگ‌ها و پودوسیت‌های کلیوی، تخریب سلول‌های اندوتلیال کلیه و توسعهفیبروز کلیه[3،4]. اندوتلیوم کلیه در طی این فرآیندها به خطر می افتد و منجر به اختلال در رگزایی و عملکرد کلیه می شود [5]. ذیلآسیب کلیهسلول های پیش ساز اندوتلیال مشتق از مغز استخوان (EPCs) در محل های آسیب به کار گرفته می شوند تا ترمیم بافت را تسهیل کنند [6]. EPCها نقش اساسی در بلوغ و تکثیر سلول های اندوتلیال کلیه، یکپارچگی عروق و ترمیم اندوتلیوم آسیب دیده دارند. با این حال، تعداد EPC در گردش در بیماران ESKD [7-9] به تدریج کاهش می‌یابد که با پیامدهای نامطلوب قلبی عروقی [9،10] و مرگ‌ومیر طولانی‌مدت مرتبط است.

سلول های استرومایی مزانشیمی (MSCs) گزارش شده است که با تحریک برنامه ریزی EPC، رگزایی را ترویج می کنند. با این حال، در حالی که سلول های بنیادی مزانشیمی در کارآزمایی های بالینی مختلف [13] ارزیابی شده اند، توانایی آنها در تسهیل بازسازی اندوتلیال کلیه بررسی نشده است. مطالعات اخیر در آزمایشگاه ما پتانسیل درمانی افزایش یافته ترکیب سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان انسان (BM) را با یک عامل ضد فیبروتیک، یعنی رلاکسین نوترکیب انسانی (ژن{3}}) (سرلاکسین؛ RLX[14) در بهبود شناسایی کرده است. آسیب کلیه،التهابو فیبروز در مدل های پیش بالینی بیماری در حالی که RLX به تنهایی می تواند تکثیر EPC مشتق از خون انسان و تولید اکسید نیتریک (NO) را در شرایط آزمایشگاهی و واسکولوژنز در موش ها را در داخل بدن تحریک کند [18]، ناشناخته باقی می ماند که آیا اثرات ترکیبی آن با BM-MSCs می تواند EPC- را تسریع و/یا افزایش دهد. رگزایی و بهبود زخم حاصل شده است. بنابراین، این مطالعه، پتانسیل درمانی ترکیب RLX و محیط‌های شرطی مشتق از BM-MSC (CM) را بر روی تکثیر EPC، رگ‌زایی و ترمیم زخم سالم در مقابل ESKD ارزیابی کرد.

2. مواد و روشها

2.1. جداسازی EPC و کشت از خون محیطی

پس از دریافت فرم رضایت بیمار امضا شده، حدود {{0}} میلی لیتر خون از افراد سالم مرد از سرویس خون صلیب سرخ استرالیا جمع آوری شد. در مقابل، حداکثر 5 میلی لیتر خون بیماران مرد ESKD به دلیل وضعیت سلامتی آنها از مرکز پزشکی موناش جمع آوری شد. تمام نمونه های خون در 24 ساعت پس از زمان جمع آوری پردازش شدند. تمام نمونه های خون با 1× محلول نمک متعادل هنک (HBSS؛ Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) به حجم کل 2{18}} میلی لیتر رقیق شدند. سپس، خون به دقت روی 15 میلی‌لیتر Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare، اوپسالا، سوئد) در یک لوله فالکون 5{20}} میلی‌لیتری (BD Biosciences، San Jose، CA، USA) قرار گرفت و در 400× سانتریفیوژ شد. گرم به مدت 40 دقیقه در دمای اتاق تا با استفاده از روش جداسازی گرادیان چگالی همانطور که قبلاً توضیح داده شد، پوشش بافی از سایر اجزا جدا شود [19،20]. پس از جداسازی گرادیان، لایه بالایی حاوی پلاسما و پلاکت ها با قرار دادن دقیق یک پیپت سرولوژیکی برداشته شد و پوشش بافی حاوی سلول های تک هسته ای خون محیطی (PBMCs) که شامل سلول های پیش ساز اندوتلیال (EPCs) است، دست نخورده باقی ماند. گلوله در 2 میلی لیتر از محیط رشد سلول های اندوتلیال (EGM){13}} کیت گلوله میکروواسکولار (MV) (محصول #CC-3162، Lonza, Hayward, CA, USA) مجدداً معلق شد. مکمل با 5 درصد سرم جنین گاوی (FBS)، 0.04 درصد هیدروکورتیزون، 0.4 درصد فاکتور رشد فیبروبلاست انسانی (hFGF) و 0.1 درصد از فاکتور رشد اندوتلیال عروقی (VEGF)، R{22}}فاکتور رشد شبه انسولین (IGF) )-1، اسید اسکوربیک، فاکتور رشد اپیدرمی انسانی (hEGF)، و جنتامایسین سولفات/آمفوتریسین (GA-1000)، برای کشت EPCهای جدا شده. سلول ها با استفاده از شمارشگر سلولی خودکار CountessM (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) قبل از کاشت بر روی بشقاب ها/ فلاسک های کشت با پوشش فیبرونکتین، شمارش شدند.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 سلول/کلنی) با استفاده از روش واحد تشکیل کلنی (CFU).

2.2. تهیه محیط های شرطی شده (CM) از کشت BM-MSC

از آنجایی که افزودن BM-MSC به کشت های EPC، نقاط پایانی مرتبط با EPC را به خطر می اندازد، تصمیم گرفته شد که بهتر است اثرات CM مشتق شده از BM-MSC بر عملکرد EPC، همانطور که قبلا برای تجزیه و تحلیل استفاده می شد، تجزیه و تحلیل شود. سایر نقاط پایانی [19]. به طور خلاصه، سلول های بنیادی مزانشیمی BM-MSC در محیط آلفا حداقلی ضروری (-MEM؛ Sigma-Aldrich، Castle Hill، NSW، استرالیا)، با 16 درصد سرم جنین گاوی (FBS) و 1 درصد 200 میلی مولار رشد کردند. ال-گلوتامین و 1 درصد پنی سیلین/استرپتومایسین. هنگامی که سلول‌ها به 80 درصد تلاقی رسیدند، سلول‌های بنیادی مزانشیمی BM-MSC بیشتر زیر کشت شدند و در یک 12-صفحه چاهی با چگالی ~0.5×10 درجه در هر چاهک قرار گرفتند و به مدت 24-48 ساعت در کشت نگهداری شدند. برای اطمینان از اتصال سلولی برای تهیه محیط های شرطی شده (CM) از سلول های بنیادی مزانشیمی سلول های بنیادی مزانشیمی، به طور خلاصه، سلول ها سه بار با 1 میلی لیتر HBSS 1× از قبل گرم شده شسته شدند. پس از مراحل شستشو، 500 میکرولیتر سرم و محیط پایه سلول های اندوتلیال بدون فاکتور رشد (EBM). محصول #CC{28}}. Lonza، Hayward، CA، USA) به سلول‌ها اضافه شد و در کشت در 5 درصد CO، 37 درجه برای 24 ساعت دیگر نگهداری شد. در پایان این دوره انکوباسیون، CM جمع آوری شد و در 400×g به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد تا هرگونه باقی مانده سلولی حذف شود. CM در مقادیر 500 میکرولیتری تا زمان استفاده بعدی در درجه {35}} ذخیره شد.

2.3. سنجش های عملکردی

2.3.1. درمان EPCهای دیررس کشت شده

هنگامی که EPCهای اواخر برداشت شدند، سنجش عملکردی انجام شد. همه آزمایش‌ها در قسمت‌های 3-6 انجام شد. سنجش‌های عملکردی برای بررسی اثر (i) 25 درصد رسانه شرطی مشتق شده از BM-MSC (25 درصد CM) [20]؛ (ii) 1 [RLX-1] یا 10 [RLX-10 انجام شد. ]ng/mL [18] RLX (نماینده سطوح در گردش H2 ریلکسین موجود در زنان باردار [21]). یا (i) اثرات ترکیبی 25 درصد CM و 1 یا 10 نانوگرم در میلی لیتر RLX؛ (iv) 20 درصد FBS به عنوان یک کنترل مثبت بر روی پتانسیل تکثیر و تشکیل لوله (رگ زایی) EPCهای دیررس مشتق شده از بیماران کنترل استفاده شد. . گروه های درمانی با سلول های تیمار نشده مقایسه شدند.

2.3.2. سنجش زنده ماندن و تکثیر

قابلیت زنده ماندن و پتانسیل تکثیر EPCهای متأخر با استفاده از {{0}}(4,{2}}dimethythiazol-2-yl)-2،5- تعیین شد. سنجش دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) طبق دستورالعمل سازنده (سیگما آلدریچ، ملبورن، VIC، استرالیا). به طور خلاصه، 103×5 سلول در هر چاهک در صفحات چاهک (BD Falcon، North Ryde، NSW، استرالیا) کاشته شدند، سپس سلول‌ها با CM، RLX مشتق از BM-MSC (10 نانوگرم در) تیمار شدند. میلی لیتر)، یا ترکیبی از CM و RLXat 1 یا 10ng/ml به مدت 24 ساعت. در پایان دوره جوجه کشی، 10 میکرولیتر از معرف نشاندار MTT (0.5 میلی گرم در میلی لیتر، سیگما آلدریچ، ملبورن، VIC، استرالیا) اضافه شد و در دمای 37 درجه Cand 5 درصد CO2 برای 4 ساعت دیگر انکوبه شد. سلول ها با افزودن 100 میکرولیتر محلول حل شدن (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia) حل شدند و پتانسیل تکثیر EPCهای اواخر با اندازه گیری جذب هر نمونه در 590 نانومتر با استفاده از میکرو پلیت تعیین شد. خواننده (Bio-strategy، Balwyn North، VIC، استرالیا) و با نرم افزار SoftMax Pro برای سیستم عامل ویندوز (نسخه 7.3، Molecular Devices LLC، CA، USA) تجزیه و تحلیل شد. هر یک از گروه های درمانی در شش تکرار انجام و مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

2.3.3. سنجش تشکیل لوله

اثرات درمان‌های مختلف برای ارتقای پتانسیل رگ‌زایی EPCهای اواخر، با استفاده از روش تشکیل لوله با استفاده از روش μ-رگ‌زایی (Abidi، Fitchburg، WI، USA) تعیین شد. به طور خلاصه، 10 میکرولیتر ماتریژل کاهش‌یافته با فاکتور رشد (GFR) (محصول #356231، Corning، Tewksbury، MA، USA) به چاه داخلی μ-اسلاید کیت سنجش رگ‌زایی اضافه شد (Abidi، Fitchburg، WI، USA ). کشت‌های هم‌آهنگ EPCهای متأخر بر روی سلول‌های پوشش داده شده کاشته شدند و با CM مشتق از BM-MSC، RLX (10 نانوگرم در میلی‌لیتر)، یا ترکیبی از CM و RLX در 10 نانوگرم در میلی‌لیتر تیمار شدند. حجم کل 50 میکرولیتر سوسپانسیون سلولی حاوی 104×1 سلول به هر چاهک اعمال شد. تصاویر بلافاصله گرفته شد و به عنوان 0-نقطه زمانی ساعت برچسب گذاری شد. توانایی سلول ها تحت درمان های مختلف به

لوله های شکل مشاهده شد و تصاویر در 2-24 ساعت پس از کاشت سلولی با استفاده از میکروسکوپ نوری گرفته شد. تعداد لوله ها، طول لوله و تعداد نقاط انشعاب با استفاده از نرم افزار ImageJ تعیین شد.

2.3.4. سنجش ترمیم زخم

اثرات درمان های مختلف بر پتانسیل بازسازی EPCهای اواخر با استفاده از روش التیام زخم تعیین شد. برای انجام آزمایش، 10×1 سلول در محیط رشد 50 میکرولیتری تعلیق شد و در 2 سیلیکون خوب در ظرف 35 میلی‌متری برای سنجش ترمیم زخم کاشته شد (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). زخم‌های مصنوعی درون ظروف با برداشتن آرام چاه‌های سیلیکونی با استفاده از موچین استریل (فاصله فاصله=500±100μm) ایجاد شد. ظروف با 2 میلی‌لیتر 50 درصد EGM-2 با افزودن انواع مختلف پر شدند. درمان‌هایی از جمله CM مشتق از BM-MSC، RLX (10 نانوگرم در میلی‌لیتر)، یا ترکیبی از CM و RLX با 1 یا 10 نانوگرم در میلی‌لیتر. تعداد سلول‌هایی که برای بستن زخم مهاجرت کردند با استفاده از میکروسکوپ نوری ارزیابی شد. سلول های مهاجرت شده در 0-24 ساعت پس از درمان گرفته شدند. درصد ناحیه بسته شدن شکاف با استفاده از نرم افزار Image] تعیین شد.

2.3.5. تجزیه و تحلیل تصویر

تمام تجزیه و تحلیل تصویر برای سنجش عملکردی با استفاده از ImageJ برای MacOS (نسخه 1.8، موسسه ملی بهداشت، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. برای پتانسیل تشکیل لوله EPCهای اواخر، تصاویر با استفاده از پلاگین سنجش رگ زایی آنالیز شدند و چهار پارامتر مختلف شامل طول کل، تعداد مش ها، تعداد اتصالات و تعداد شاخه ها ثبت شد. برای سنجش ترمیم زخم، ناحیه بسته شدن زخم با علامت‌گذاری دستی ناحیه بدون سلول در هر یک از نقاط زمانی آنالیز شد. تمام اندازه گیری ها حداقل 3 بار برای کنترل تغییرات انجام شد.

2.3.6. ایمونوفلورسانس

محل یابی پروتئین گیرنده پپتیدی خانواده Relaxin 1 (RXFP1؛ گیرنده RLX همزاد) در EPCهای اواخر کشت با استفاده از رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس تعیین شد. ابتدا، سلول‌های ~1 × 1{{20}} درجه رشد کرده روی یک پوشش شیشه‌ای 13 میلی‌متری (پوشش‌دهی شده با پلی دی لیزین) در یک صفحه چاهی در 4 درصد PFA ثابت شدند. 15 دقیقه در دمای اتاق. سلول های ثابت برای اتصال پروتئین غیر اختصاصی با استفاده از آلبومین سرم 1 درصد گاوی (BSA) به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق مسدود شدند. در پایان دوره جوجه کشی، سلول ها در PBS به مدت 5 دقیقه (3 بار) شسته شدند و با آنتی بادی پلی کلونال RXFP1 خرگوش انکوبه شدند (aa 609-624؛ A 9227; 1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Germany در 0.01 درصد BSA یک شبه در 4 درجه. سلول ها با PBS شسته و با آنتی بادی ثانویه الکسا فلور 594 بز ضد خرگوش (1:500؛ Invitrogen، Scoresby، ویکتوریا، استرالیا) در 0.01 درصد BSA به مدت 2 ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. ضدرنگ‌آمیزی هسته‌ای با افزودن 40 میکرولیتر DAPI در محیط نصب Vectashield (Vector Laboratories، Burlingame، CA، USA) انجام شد و لغزش شد. پروتئین Immunoreactive RXFP1 با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس با بزرگنمایی 40× (Olympus BX51) مشاهده شد و تصاویر با استفاده از نرم افزار ImageJ ادغام شدند.

2.4. تحلیل های آماری

تمام داده‌ها به‌عنوان میانگین ± SEM نشان داده شده‌اند و تمام تحلیل‌های آماری با استفاده از GraphPad Prism'M (نسخه 9؛ GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) انجام شد. روش ANOVA برای مقایسه اثر تیمارهای مختلف بر تکثیر (آزمون MTT) و پتانسیل رگ زایی (آزمایش تشکیل لوله) EPCهای اواخر استفاده شد، و به دنبال آن یک تست تعقیبی Tukey برای امکان مقایسه های متعدد بین گروه های درمانی امکان پذیر است. یک اندازه گیری مکرر- دو طرفه-ANOVA برای مقایسه اثر درمان های مختلف بر بسته شدن زخم توسط EPC های دیررس در طول زمان مورد استفاده قرار گرفت و به دنبال آن آزمون تعقیبی Tukey برای مقایسه هر یک از گروه های درمانی انجام شد. مقدار p کمتر از 05/0 0 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.