قسمت 2: کمبود DHHC21 اختلال عملکرد کلیه را در هنگام آسیب سپتیک کاهش می دهد

مخاطبtina.xiang@wecistanche.com

بحث

در کار حاضر، ما DHHC21 را به عنوان یک تنظیم کننده جدید پرفیوژن و عملکرد کلیه در هنگام آسیب سپتیک گزارش می کنیم. یافته های جدید ما نشان می دهد: (1) Zdhhc21devde? موش‌ها عملکرد کلیوی بهتر و آسیب کلیوی کمتری را پس از آسیب سپتیک در مقایسه با موش‌های WT نشان می‌دهند؛ (2) کمبود عملکردی DHHC21 باعث حفظ پرفیوژن بافت کلیوی، اشباع اکسیژن و RBF در آسیب سپتیک می‌شود؛ (3) DHHC21-پالمیتویلاسیون alAR کاتالیز شده است. برای فعال شدن مسیر سیگنالینگ alAR و انقباض شریان های کلیوی ناشی از alAR لازم است. این مطالعه بینش مکانیکی جدیدی را در مورد تنظیم پرفیوژن و عملکرد کلیه در طول آسیب سپتیک ارائه می دهد. ما پیشنهاد می‌کنیم که کمبود عملکردی DHHC21 اثرات محافظتی بر روی آن می‌گذاردعملکرد کلیهدر آسیب سپتیک و مهار DHHC21 ممکن است به عنوان یک استراتژی درمانی برای مبارزه بااختلال عملکرد کلیهدر هنگام آسیب سپتیک

برای اطلاع از مزایای عصاره سیستانچ توبولوزا اینجا را کلیک کنید

هیپوپرفیوژن/هیپوکسی بافت کلیه یکی از علل اصلی اختلال عملکرد کلیه در هنگام آسیب سپتیک است3-5. ما هیپوپرفیوژن کلیوی را در موش‌ها پس از CLP شناسایی کردیم که با شدت سیگنال MSOT ضعیف هموگلوبین کل، کاهش اشباع اکسیژن در بافت کلیوی و کاهش RBF پس از آسیب سپتیک مشهود بود. مطابق با یافته‌های ما، کاهش RBF در بیماران سپسیس با آسیب کلیوی و همچنین در مدل‌های حیوانات بزرگ آسیب سپتیک مشاهده شده است. شایان ذکر است که چندین مطالعه گزارش می‌دهند که اختلال عملکرد کلیوی می‌تواند در حیوانات سپسیس بدون تغییر ایجاد شود. یا حتی RBF334 را افزایش داد. این یافته های متناقض ممکن است به مدل های حیوانی و روش های مختلف مورد استفاده برای اندازه گیری جریان خون نسبت داده شود. به عنوان مثال، در حالی که آسیب سپتیک چند میکروبی ناشی از CLP معمولاً مورد استفاده قرار می گیرد، برخی از مطالعات از تزریق داخل وریدی اشریشیا کلی 35 استفاده می کنند.

اخیراً پالمیتویلاسیون پروتئین به عنوان یک تنظیم کننده جدید عملکرد پروتئین گزارش شده است که در پاتوژنز و پیشرفت بسیاری از بیماری ها نقش دارد. اولین بار به عنوان نوع جدیدی از اصلاحات پس از ترجمه توسط اشمیت و همکاران 3637 شناسایی شد. کشف خانواده DHHC از آن زمان به گسترش سریع این زمینه کمک کرده است38،39. نقش پالمیتویلاسیون و PAT در شرایط فیزیولوژیکی و پاتولوژیک متعددی از جمله متابولیسم لیپید گزارش شده است.سرطان, بیماری های قلبی عروقیو اختلالات عصبی23،{1}}،4. اگرچه قبلاً دخالت پالمیتویلاسیون در بیماری کلیه پلی کیستیک و سرطان کلیه گزارش شده بود، مطالعات بسیار محدودی برای بررسی نقش عملکردی PAT ها دربیماری های کلیویبه ویژه در اختلال عملکرد کلیه در هنگام آسیب سپتیک. با بهترین دانش خود، ما اولین کسی هستیم که نقش DHHC2l را در اختلال عملکرد کلیه در آسیب سپتیک بررسی می کنیم. یافته های ما نشان می دهد که مهار DHHC21 تا حد زیادی عملکرد کلیه را نجات می دهد و ساختار کلیه را در آسیب سپتیک حفظ می کند.

مطالعه ما با استفاده از Zdhhc21dp/d4؟ موش ها نشان می دهند که اثرات مفید کمبود عملکردی DHHC21 بر عملکرد کلیه به توانایی آن در بهبود پرفیوژن بافت کلیوی در طول آسیب سپتیک نسبت داده می شود. در شرایط پایه، موش‌های Zdhhc21ewaeP هیچ نشانه‌ای از عدم تعادل نمک/آب یا آسیب ساختاری/عملکردی کلیوی نشان نمی‌دهند. با این حال، از دست دادن عملکرد DHHC21 کاهش RBF ناشی از آسیب سپتیک، پرفیوژن کلیوی و اشباع اکسیژن کلیوی را سرکوب می کند. افزایش مقاومت عروق کلیوی ناشی از انقباض بیش از حد عروق کلیوی دلیل اصلی اختلال در پرفیوژن بافت کلیه در آسیب سپتیک است. نتایج ما نشان‌دهنده دخالت alAR در میانجی‌گری هیپوپرفیوژن بافت کلیوی ناشی از آسیب سپتیک است، همانطور که با افزایش پالمیتویلاسیون alAR و فعال شدن یک مسیر سیگنالینگ alAR در آسیب سپتیک مشهود است. با این حال، کمبود عملکردی DHHC21، alARpalmitoylation را مهار می‌کند و منجر به کاهش توانایی alAR برای فعال کردن افکتور پایین‌دست خود و واسطه‌سازی انقباض عروقی ناشی از فنیل افرین در شریان‌های کلیوی می‌شود.

مکانیسم مولکولی زیربنای تنظیم عملکرد alAR توسط DHHC21 هنوز به طور کامل مشخص نشده است. نقص در عملکرد alAR ناشی از از دست دادن عملکرد DHHC21 ممکن است به تغییر ساختاری alAR نسبت داده شود. بسیاری از GPCR ها برای مناسب بودن خود به پالمیتویلاسیون وابسته هستند ترکیب درون سلولی، پالمیتات متصل در دم C ترمینال GPCR ها وارد غشای پلاسمایی می شود تا چهارمین حلقه درون سلولی را ایجاد کند، که برای تعامل GPCR ها با پروتئین های شریک آنها و انتشار سیگنال های GPCR ضروری است17،4. مطالعه قبلی نشان داده است که پالمیتویلاسیون Albar در ناحیه C ترمینال آن نیز رخ می دهد. بنابراین، فقدان پالمیتویلاسیون lAR با واسطه DHHC ممکن است ترکیب داخل سلولی alAR را تغییر دهد، بنابراین انتشار سیگنال های lAR را مسدود می کند. این می تواند پشتیبانی شود. با نتایج ما نشان می‌دهد که فعال‌سازی ERK، یک رویداد سیگنال‌دهی پایین‌دستی فعال‌سازی alAR، در موش‌های Zdhhc21devider که در معرض سپتامبر قرار گرفتند، مهار می‌شود. آسیب ic با این حال، توپولوژی تنظیم‌شده DHHC{11}}ترمینال کربوکسیل alAR باید با استفاده از کریستالوگرافی اشعه ایکس تأیید شود.

یکی دیگر از جنبه های جدید مطالعه ما استفاده از MSOT برای ارزیابی پرفیوژن و عملکرد کلیه در طول آسیب سپتیک است. MSOT به عنوان یک روش بدون برچسب برای اندازه گیری پرفیوژن اندام های مختلف و یک تکنیک تصویربرداری قابل اعتماد برای تعیین عملکرد کلیه گزارش شده است2832،45. در مقایسه با فلومتر داپلر که اجازه تجسم ریز عروق را نمی دهد، MSOT تصاویری با وضوح فضایی بالا در 150 میکرومتر تولید می کند و در عین حال ارزیابی کمی از وضعیت پرفیوژن در ریز عروق کلیه ارائه می دهد. IRDye800CW محلول در آب یک ردیاب ایمن برای اندازه گیری کلیرانس کلیوی است و در دوز بالای 20 میلی گرم بر کیلوگرم باعث ایجاد سمیت نمی شود. حرکت دو فازی IRDye800CW که مشاهده کردیم با مطالعات منتشر شده قبلی مطابقت دارد. ضبط‌های MSOT ما نشان‌دهنده تاخیر Tmax بیشتر در سپسیس کلیه‌ها است که نشان‌دهنده اختلال در کلیرانس کلیوی است. یک مطالعه نفروپاتی نشان می‌دهد که اختلال عملکرد کلیه شناسایی شده توسط MSOTis به طور قابل‌توجهی با آسیب بافت‌شناسی گلومرولی ارتباط دارد. داده های ما، مطابق با انتشارات قبلی، نشان می دهد که MSOT یک روش کم تهاجمی و قابل اعتماد برای نظارت بر پرفیوژن و عملکرد کلیه است.

در حال حاضر، هیچ مهارکننده{0}} خاص DHHC موجود نیست. متداول‌ترین مهارکننده PAT 2-BP است که تأثیر گسترده‌ای بر چندین DHHC دارد و همچنین با متابولیسم اسیدهای چرب تداخل دارد. همچنین شایان ذکر است که alAR تنها بستر DHHC21 نیست. چندین سوبسترا دیگر DHHC21 اخیراً شناسایی شده است، از جمله مولکول چسبندگی سلول های اندوتلیال پلاکتی (PFCA M-1)، گیرنده استروژن caveolin-1، اندوتلیال نیتریک اکساید سنتاز (eNOS)، Fyn، سوپراکسید دیسموتاز (SOD{{{{ 8}})، و PLCB122،41،4s،49، در حالی که فراتر از محدوده مطالعه حاضر است، ما نمی توانیم این احتمال را که این بسترها ممکن است بر عملکرد کلیه در طول آسیب سپتیک نیز تأثیر بگذارند را رد کنیم.

در نتیجه، مطالعه حاضر برای اولین بار نشان می‌دهد که DHHC21 نقش مهمی در تنظیم پرفیوژن کلیوی در طول آسیب سپتیک از طریق مکانیسم‌های مربوط به پالمیتویلاسیون alAR و انقباض عروقی با واسطه alAR ایفا می‌کند. علاوه بر این، مهار DHHC21 اثرات محافظتی بر عملکرد کلیه در هنگام آسیب سپتیک اعمال می کند.

مواد و روش ها

معرف ها. همه معرف ها در جدول تکمیلی S1 فهرست شده اند.

حیوانات. موش‌های Zdhhc21depher و موش‌های کنترل نوع وحشی آن‌ها (B6C3Fe) از آزمایشگاه جکسون خریداری شدند. ژنوتیپ Zdhhc21dephe؟ موش ها با توالی یابی تایید شدند (Genewiz, Inc., NJ, USA). پرایمرهای مورد استفاده برای توالی یابی عبارت بودند از: AGCTGACTGAAGGGGCACC (به جلو) و AAAACCTGTAACGCATTTCCA (معکوس)23. حیوانات تحت یک چرخه نور/تاریکی 12/12- ساعت با دسترسی آزاد به غذا و آب نگهداری شدند. برای این مطالعه از موش‌های (16-20 هفته) هر دو جنس استفاده شد. تمام آزمایشات حیوانی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات نهادی دانشگاه فلوریدا جنوبی تایید شده است و با راهنمای NIH برای مراقبت و استفاده از آزمایشگاه مطابقت دارد.

بستن و سوراخ کردن ساکال، موش ها با ایزوفلوران بیهوش شدند (3 درصد القاء و 1 درصد نگهداری). یک برش خط وسط در ناحیه تراشیده شده شکم ایجاد شد، و سکوم بیرونی شد، در 5 میلی متر زیر دریچه ایلئوسکال محکم بسته شد و دو بار با یک سوزن {3}}دیستال تا نقطه بستن سوراخ شد. یک میلی متر مدفوع از هر سوراخ سوراخ اکسترود شد. سپس سکوم تغییر مکان داد و شکم در دو لایه بسته شد. محلول رینگر 37 درجه سانتی گراد به صورت موضعی برای جلوگیری از خشک شدن سکوم استفاده شد. سپس به موش‌ها سرم سالین 37 درجه 0.9 درصد به صورت زیر جلدی برای احیای مایع داده شد. قبل از عمل 5-1. 5 mg/kg دوز رهش پایدار بوپرنورفین برای بی‌دردی داده شد. موش‌های شم تحت همان عمل جراحی قرار گرفتند، اما بدون بستن و سوراخ کردن سکوم50،51.

توموگرافی اپتوآکوستیک چندطیفی. ارزیابی دفع کلیوی IRDye800CW. موش ها از طریق ایزوفلوران بیهوش شدند و در اطراف ناحیه تنه اپیلاسیون شدند. موش ها با استفاده از سیستم تصویربرداری MSOT پزشکی Altera (مونیخ، آلمان) در طول موج های چندگانه: 700،730،760،775،785، 800،850 نانومتر با سرعت 10 فریم بر ثانیه تصویربرداری شدند. موش ها در حالت خوابیده در یک نگهدارنده قرار گرفتند و در امتداد مرحله خطی افقی حرکت کردند تا کلیه ها را در بالای مبدل مقعر با موقعیت ثابت قرار دهند. پس از ثبت خط پایه، 60 نانومول از RDve800CW حل شده در 100 لیتر سالین 0.9 درصد به صورت داخل وریدی در یک دوره 10 ثانیه تزریق شد. تصاویر با استفاده از فرمول back-projection بازسازی شدند و با تجزیه و تحلیل چند طیفی پردازش شدند. مناطق مورد علاقه (ROIs) در اطراف قشر کلیه و ناحیه بصل النخاع / لگن ترسیم شد و تغییرات زمانی سیگنال MSOT در ROI به تصویر کشیده شد.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

هیستوپاتولوژی کلیه. کلیه ها ثابت شدند، در امتداد صفحه ساژیتال بریده شدند و برای جاسازی پارافین پردازش شدند. بخش ها (5 میکرومتر) پارافین زدایی شدند، هیدراته شدند و با اسید پریودیک به مدت 8 دقیقه در دمای اتاق (RT) اکسید شدند و سپس با محلول شیف به مدت 25 دقیقه انکوباسیون شدند. سپس برش ها با هماتوکسیلین ضد رنگ آمیزی شدند. تصاویر با استفاده از Keyence BZ-X710 (Itasca، IL، ایالات متحده آمریکا) گرفته شد. آسیب ساختاری کلیه بر اساس ویژگی های زیر ارزیابی شد: ناهنجاری گلومرولی، از دست دادن مرز برس لوله پروگزیمال، واکوئل شدن، اتساع اپیتلیوم لوله، جدا شدن/نکروز سلولی لوله، و ارتشاح نوتروفیل. هر ویژگی بر اساس شدت در مقیاس 0-5 درجه بندی شد.

اندازه گیری کراتینین و نیتروژن اوره خون. خون موش از طریق سوراخ قلبی 24 ساعت پس از آسیب سپتیک جمع آوری شد. پلاسما با سانتریفیوژ کردن خون در 2500 گرم به مدت 15 دقیقه در RT تولید شد. اندازه گیری کراتینین: پلاسما با استفاده از ستون اسپین 10-kDa پروتئین زدایی شد. سپس سطح کراتینین در فیلتر با استفاده از کیت سنجش کراتینین اندازه گیری شد. سطح نیتروژن اوره خون (BUN) با استفاده از کیت تشخیص رنگ سنجی نیتروژن اوره طبق دستورالعمل سازنده تعیین شد.

اندازه گیری RBF و MAP. موش ها با استفاده از ایزوفلوران بیهوش شدند. مبدل فشار خون به داخل شریان کاروتید کانوله شد. یک برش خط وسط در ناحیه شکم و به دنبال آن یک برش عرضی سمت چپ برای نمایان شدن شریان کلیوی ایجاد شد. RBF با استفاده از یک جریان سنج زمان انتقال اولتراسوند (TS{1}}؛ Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, USA) اندازه گیری شد. پس از قرار دادن پروب جریان در اطراف شریان کلیوی در معرض، موش ها اجازه دادند تا حداقل 30 دقیقه تثبیت شوند. RBF و MAP به طور همزمان با استفاده از PowerLab (AD Instruments، Colorado Springs، CO، USA) ثبت شدند. داده ها با استفاده از نرم افزار LabChart Pro نسخه 7، 55، تجزیه و تحلیل شد

جذب به کمک رزین. شریان‌های کلیوی جمع‌آوری و در بافر لیز (1{22}}0 میلی‌مولار HEPES.25 میلی‌مولار NaCl، 1 میلی‌مولار EDTA، 10 میکرومولار پالموستاتین B، مهارکننده‌های پروتئاز، pH 7.4）22، 56. لیزهای بافت با بافر مسدودکننده (100 میلی‌مولار HEPES.1 میلی‌مولار EDTA، 2.5 درصد SDS، 6 ul/ml MMTS، pH 7.4) در دمای 50 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه با گرداب مداوم انکوبه شدند و پس از رسوب با استون سرد، پروتئین‌ها انکوبه شدند. گلوله با سانتریفیوژ در 5000 گرم به مدت 30 دقیقه و پنج بار شستشو با 70 درصد استون سرد، گلوله های پروتئینی در بافر اتصال (100 میلی مولار HEPES، 1.0 درصد SDS، 1 میلی مولار EDTA، pH 7.4) مجدداً معلق شدند. هر نمونه پروتئین به دو قسمت مساوی تقسیم شد که هر کدام به ترتیب دانه های ایزوپروپیل سفاروز 6B، هیدروکسولامین (0.2 M، pH 7.4) و NaCl (0.2 M) به هر قسمت اضافه شد. پس از 4 ساعت انکوباسیون در RT. با چرخش ثابت، پروتئین های پالمیتویله با 50 میلی مولار DTT در بافر 1 × نمونه شسته شدند و برای SDS-PAGE جمع آوری شدند.

وسترن بلاتینگ اندازه گیری lAR پالمیتویله. نمونه‌های جمع‌آوری‌شده از RAC روی ژل تریس گلایسین 4-20 درصد بارگذاری و پس از الکتروفورز روی غشای نیتروسلولزی منتقل شدند. پس از مسدود شدن به مدت 1 ساعت در RT، alAR با آنتی بادی اولیه ضد lAR خرگوش (1:500) در طول شب در دمای 4 درجه کاوش شد. پس از سه بار شستشو با TBST، غشاء با آنتی بادی ثانویه ضد خرگوش IRDye800CW (1:20،{11}}) به مدت 45 دقیقه در RT انکوبه شد.

اندازه گیری فسفوریلاسیون ERK. شریان های کلیوی در 1×RIPA حاوی مهارکننده های پروتئاز و فسفاتاز لیز شدند. غشاء با آنتی بادی‌های ضد ERK خرگوش (1:1{13}}) و آنتی‌بادی ضد فسفریله موش (1:1000) بررسی شد. برای انکوباسیون ثانویه از آنتی بادی های ضد موش الاغی IRDye800CW و ضد خرگوش الاغی IRDye680RD استفاده شد (1:20000). غشاها با استفاده از Li-COR Odyssey CLx تصویربرداری و آنالیز شدند.

ارزیابی عروقی از طریق میوگراف سیمی. شریان های کلیوی موش. شریان های کلیوی ({0}}} میکرومتر قطر) از موش های WTand Zdhhc21dp/de جدا شد و در محلول نمک فیزیولوژیکی اکسیژن دار یخ (95 درصد O، / 5 درصد CO.) غوطه ور شد (PSS,13{). {47}} mM NaCl، 4.7 میلی‌مولار KCl، 1.18 میلی‌مولار KH، PO، 1.17 میلی‌مولار MgSO.7H، O، 14.9 میلی‌مولار NaHCO، 5.5 میلی‌مولار گلوکز، 0.026 میلی‌مولار EDTA، و 1.6 میلی‌مولار CaCl، بخش‌های pH 7.4 ~V). به طول 2 میلی متر) روی محفظه میوگراف سیمی (Living Systems Instrumentation, VT, USA) بین دو سیم تنگستن (قطر 30 میکرومتر) سوار شدند. تنش ایزومتریک با استفاده از تهویه‌کننده سیگنال Living Systems (MYO-SC{26}}) همراه با نرم‌افزار LabScribe v4 iWorks ثبت شد. پس از برقراری تعادل به مدت 30 دقیقه در 37 درجه Cin PSS، روند نرمال سازی برای تعیین محیط داخلی بهینه L، {30}}.9×L (Lo{32}}محیط داخلی که مربوط به فشار transmural 100 mmHg است) انجام شد. . سپس، زنده ماندن رگ با mMKPSS 60 (74.7 mM NaCl، 60 mM KCl، 1.18 mM KH، PO.1.17 mM MgSO.7H، O، 14.9 mM NaHCO، 5.5 mM گلوکز، mM 0.026 mM EDMTA Ca, 1) آزمایش شد. 7.4). شریان هایی که به KPSS پاسخ نمی دادند دور انداخته شدند. شریان ها با افزایش غلظت فنیل افرین (10 نانومولار-30 میکرومولار) درمان شدند. سپس یکپارچگی اندوتلیال با استفاده از استیل کولین (10 میکرومولار) ارزیابی شد. منحنی های غلظت-پاسخ ساخته شدند.

شریان های کوچک از کلیه های انسان. شریان های کوچک (~1{4}}00 میکرومتر قطر) از کلیه های سالم انسانی که برای جراحی پیوند رد شده بودند، جدا شد. بخش‌های رگ (طول 2 میلی‌متر) بر روی میله‌های I (قطر 250 میکرومتر) محفظه میوگراف سیمی نصب شدند. روش‌های تعادل و نرمال‌سازی مشابهی روی شریان‌های انسانی انجام شد. سپس، شریان ها با کنترل وسیله نقلیه (0.02 درصد DMSO در PSS) به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. سپس عروق برای زنده ماندن با 60 میلی مولار KPSS مورد آزمایش قرار گرفتند و با افزایش غلظت فنیل افرین (10 نانومولار{9}} میکرومولار) تیمار شدند. پس از شستشو، عروق با 2-BP(100 میکرومولار) به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. زنده ماندن کشتی دوباره با 60 میلی مولار KPSS با 100 میکرومولار 2-BP آزمایش شد. شریان های کوچک بدون پاسخ یا کاهش پاسخ به KPSS دور انداخته شدند. سپس شریان ها با همان غلظت فنیل افرین و سپس استیل کولین (10 میکرومولار) به چالش کشیده شدند. منحنی‌های غلظت-پاسخ شریان‌های تحت درمان با کنترل وسیله نقلیه یا 2-درمان شده با BP ساخته و مقایسه شدند.

ایمونوفلورسانس. شریان‌های کلیوی انسان به مدت 48 ساعت در فرمالین 10 درصد تثبیت شدند، پارافین جاسازی شدند و برش داده شدند. اسلایدها سپس پارافین زدایی شدند، هیدراته شدند و با PBS حاوی 05/0 درصد تریتون X{5}} نفوذ پذیر شدند. پس از مسدود کردن، اسلایدها با آنتی بادی ضد DHHC21 خرگوش و آنتی بادی ضد lAR بز (1:100) در طول شب در دمای 4 درجه سانتیگراد برچسب گذاری شدند. فلور 568 (1:500). پس از نصب با محیط نصب ProLong Diamond با DAPI، اسلایدها با میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری معکوس طیفی لایکا SP8 تصویربرداری شدند.

تحلیل آماری. اطلاعات تفصیلی (مثلاً نام آزمون، آزمون تعقیبی، n مقدار، سطح آلفا، p-value) برای هر آزمون آماری در جدول تکمیلی S2 فهرست شده است. همه داده ها با فرض توزیع نرمال مطابقت دارند. آزمون نرمال بودن با استفاده از آزمون Shapiro-Wilk با سطح آلفا در 0.05 انجام شد. مقایسه بین دو گروه با استفاده از آزمون t Student (دو دنباله) و سه گروه یا بیشتر از طریق آنالیز واریانس یک طرفه با تحلیل تعقیبی Tukey مقایسه شد. مقایسه منحنی های میوگراف سیمی با استفاده از آنالیز واریانس دو طرفه انجام شد<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">