قسمت دوم: مولکول آسیب کلیه-1 یک گیرنده بالقوه برای SARS-CoV-2 است

برای کسب اطلاعات بیشتر. تماسtina.xiang@wecistanche.com

تظاهرات بالینی ویروس کرونا

1. دوره جوجه کشی طولانی است، و علائم اصلی تب، خستگی، گلو درد، و سرفه است. تب می تواند تب بالا، تب متوسط، یا تب پایین باشد؛

۲- نوزادان و سالمندان معمولی نیستند و اغلب با خس و نفس همراه هستند. در موارد شدید، ممکن است آسیب چند سیستم رخ دهد؛

3. سرفه خشک در مرحله اولیه است که عمدتا paroxysmal و شدید, شبیه به سرفه whooping, که خواب و فعالیت های تاثیر می گذارد; در مرحله بعد، سرفه اسپوت است، اسپوم مفرغ است، گهگاه حاوی مقدار کمی خون است و برخی با خس همراه هستند؛

۴- برخی از بیماران علائم خفیفی دارند و ممکن است تب نداره. اکثر بیماران پیش آگهی خوبی دارند، و تعداد کمی از بیماران به شدت بیمار هستند یا حتی می میرند؛

5. سندرم حاد درماندگی تنفسی، شوک سپتیک، اسیدوز متابولیک نسوز، و اختلال در عملکرد انعقاد.

چگونگی جلوگیری از ویروس جدید کرونا، بهبود ایمنی خود را موثرترین وسیله برای مردم برای مبارزه با این ویروس است. سیستانچه که از دوران باستان به عنوان گنجینه تغذیه کننده مورد استفاده قرار می گرفته است، به عنوان " شناخته شده است "کویرجینسنگ" و پادشاه تقویت مصونیت است. سیستانچه - پادشاه تقویت مصونیت

تحقیقات پزشکی مدرن ثابت کرده است که علاوه بر عملکرد تغذیه و تقویت بدن، سیستانچهاس اثرات درمانی قابل توجهی در جلوگیری از تومورها، ضد پیری، ضد آریتمی، مهار آپوپتوز، و بهبود ایمنی دارد. نفع.

Theگلوکوسایدهای کل سیستانچهاجزای فعال جینسنگ برای تنظیم عملکرد ایمنی بدن هستند، که می تواند عملکرد ایمنی بدن را نه تنها برای افراد عادی بلکه برای افراد با عملکرد ایمنی پایین بهبود بخشد.

مشاهده بالینی تایید کرده است که سیستانچه اثر درمانی خاصی بر تومورهای بدخیم دارد، و اثر آشکار افزایش لکوسیت ها را دارد. مصرف جینسنگ در طول پرتودرمانی و شیمی درمانی می تواند عوارض سمی و جانبی پرتودرمانی و شیمی درمانی را کاهش دهد، ترمیم بافت آسیب دیده را تسریع کند، و از لکوپنیا جلوگیری کند؛

بحث

برای مبارزه باپاندمی COVID-19، درک عمیقی از اینکه چگونهSARS-CoV-2حمله سلول های انسانی تضمین شده است. مطالعات نشان داده اند عفونت مستقیم SARS-CoV-2 درکلیهعلاوه بر ریه (Braun et al., 2020; Farkash et al.,2020). با این حال ACE2 تنها گیرنده شناخته شده ای باقی می ماند که ممکن است میانجی گری این تهاجم را انجام دهد. علاوه بر این، تروپیسم کلیوی SARS-CoV-2 و مرتبط باآسیب کلیهبه نظر می رسد غیر قابل توضیح توسط سطح نسبتا کاهش یافته ACE2 پس از تهاجم ویروسی(کوبا و همکاران،2005). در اینجا، مطالعه ما نشان می دهد که KIM1، یک نشانگر زیستی به شدت تنظیم شده برای آسیب کلیه (یانگ و همکاران، 2015)، میانجی گری SARS-CoV-2 تهاجم کلیه به عنوان گیرنده است.

ما همچنین متوجه شدیم که SARS-CoV-2-RBD متصل به KIM1 با میل بالاتر از SARS-CoV-RBD و MERS-COV-RBD، که احتمالا ً واگیر قوی تر SARS-CoV-2 (Rabaan et al,2020)؛ بنابراین عفونت کلیوی و نقش KIM1 در این بیماری های تنفسی شدید ارزش بازدید مجدد را دارند. قابل توجه، نتایج ما نشان می دهد سایت های اتصال متمایز از KIM1 و ACE2 در RBD ویروسی، بنابراین ارزش بررسی اینکه آیا و چگونه KIM1 و ACE2 میانجی گری SARS-CoV-2 تهاجم در این اندام ها است. علاوه بر این، از آنجا که KIM1 از طریق مسیرهای وابسته به کلاترین (ژائو و همکاران،2016) اندوسیتوس شده است، همچنین جالب خواهد بود برای کشف بیشتر فرایند وابسته به KIM1 پس از دلبستگی ویروسی به غشای سلول.

ACE2 به خوبی مورد مطالعه ترین گیرنده برای SARS-CoV-2 است، با این حال آن را یک هدف درمانی ایده آل برای COVID-19 نیست، از آنجا که آن را به طور گسترده ای در اندام های متعدد بیان شده است و نقش های بسیار مهم در تنظیم فشار خون و جلوگیری از آسیب قلب / کلیه (Imai و همکاران،2005؛ Li et al.,2020d). در مقابل، KIM1 ارتباط قوی تری با عملکرد کلیه دارد و تنها پس از آن به شدت بیان می شودآسیب کلیوی(Kondratowicz et al,2011; یوان و همکاران، ۲۰۱۵؛ Costafreda and Kaplan,2018), which makes it a more specific and maybe also safer therapeutic target for COVID-19 patients with kidney diseases.

به طور خلاصه، داده های ما نشان می دهد نقش بسیار مهمی از KIM1 در تروپیسم کلیوی SARS-CoV-2 به عنوان یک گیرنده بالقوه برای SARS-CoV-2. در اینجا، ما یک مدل از یک 'چرخه مفرغ' با میانجیگری KIM1 و ACE2 (شکل 5G) پیشنهاد می کنیم، که ممکن است تروپیسم کلیوی سارس-CoV-2 را در بیماران COVID-19 توضیح دهد. طی مرحله اولیه تهاجم SARS-CoV-2، سطح فیزیولوژیک بالاتر (شکل مکمل S1) و میل اتصالی (جدول مکمل S1) ACE2 را هدف اولیه می کند که خاص کلیه نیست. با این حال ، پس از شروع AKl ناشی از ویروس ، در نتیجه به شدت upregulated KIM1 به سرعت ترویج عفونت ویروسی ثانویه با میانجیگری KIM1 و ACE2 ، که بیشتر کلیه خاص است ، و در نتیجه تشدید آسیب کلیه در چرخه مفرغ (شکل 5G). رویکردهایی که می توانند تعامل بین SARS-CoV-2 و KIM1 را بشکنند، از جمله آنتی بادی های ضد KIM1، مهارکننده های مولکول کوچک، و پپتیدهای آنتاگونیست مشتق از KIM1، ممکن است بر درمان COVID-19 نور بیندازند.

مواد و روش ها

مواد

SARS-CoV-2-RBD (T80302) از Genscript به دست آمد. پپتید آنتاگونیست 1 (AP1، SCSLFTCQNGIV، خلوص >95 درصد) و پپتید آنتاگونیست 2 (AP2، SCSLFTCQNGGGWF، خلوص >95 درصد) از نظر شیمیایی توسط Genscript سنتز شدند. آنتی بادی ضد موش-ال جی جی (p/n 18-8816-33) و ضد خرگوش-ال جی جی ضد بدن (p/n 18-8817-33) از راکلند به دست آمد. IgG با SureBeads" مهره های مغناطیسی پروتئین G (J2112LB-02) از بیو راد خریداری شد. DAPI (D9542) اهل سیگما بود. الکسی آرد ۵۹۴ با برچسب فالوئیدین (C2205S) اهل بیوتیم بود. آنتی بادی های ضد KIM1 (NBP1-76701، Novus Biologicals)، Flag (F1804، Sigma)، HA (H6908، Sigma)، و ACE2 (2115-1-AP، Proteintech) مورد استفاده قرار گرفت.

کسب و تجزیه و تحلیل پروفایل بیان KIM1 و ACE2

برای به دست آوردن رونویسی جامع و پروفایل پروتئینی KIM1 و ACE2 برای بافت های انسانی، داده های رونویسی و پروفایل های پروتئینی مبتنی بر ایمونوهیستوشیمی را از اطلس پروتئین انسانی (HPA، https://www.proteinatlas.org) که بیان و بومی سازی پروتئین های انسانی را در سراسر بافت ها و اندام ها نشان می داد، بر اساس توالی عمیق RNA (RNA-seq) از ۳۷ بافت طبیعی و ایمونوهیستوشیمی بر روی میکروآراهای بافتی حاوی ۴۴ نوع بافت (Uhlen و همکاران، 2015). HPA RNA-seq tissue of the protein-coding gene was recorded as mean protein-coding transcripts per million (pTPM), corresponding to the mean values of samples from each tissue. سطح بيان پروتئين مبتنی بر هيستولوژی به صورت دستی به چهار سطح (شناسايی نشده، کم، متوسط، و بالا) مورد تجزيه و تحليل قرار گرفت. در شکل مکمل S1، 10 سطح رونویسی تیسولار بالا و سطح بیان پروتئین مبتنی بر هستولوژی KIM1 و ACE2 به ترتیب ذکر شده است، و پروفایل بیان همگون KIM1 و ACE2 خلاصه شده است.

شبیه سازی های لنگر انداختن مولکولی و دینامیک

داکینگ ها از طریق Z-Dock (http://zdock) umassmed.edu/. ساختارهای بلوری SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF)، SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ)، MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N)، ACE2(PDB ID 1R42)، و دامنه KIM1 Ig V (PDB ID 5DZO) برای جستجوی مدل های اتصال بالقوه مورد استفاده قرار گرفت. بهترین مجموعه های پروتئینی برای شبیه سازی های دینامیک مولکولی زیر انتخاب شدند که توسط سرور دزموند انجام شد و با استفاده از Pymol2.3 و Maestro11.8.012 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.نمودار شبیه سازی دینامیک 50 ns برای مطالعه پارامترهای دینامیکی مجتمع های پروتئینی به کار گرفته شد. انرژی آزاد اتصال MM-GBSA توسط هاوک دوک (Misini lgnjatovic et al.,2016) محاسبه شد.

انحراف متوسط مربع ریشه (RMSD) و نوسان مربع میانگین ریشه (RMSF)

RMSD برای تخمین میانگین تغییر جابجایی انتخاب اتم ها برای یک قاب خاص به شرح مورد استفاده قرار گرفت (Li et al.,2011). RMSF برای بررسی تغییرات جابجایی در زنجیره پروتئین (Li et al.,2011) انجام شد.

مدل های موش AKI و qPCR

آسیب I/R بر روی موش های C57BL/6 همانطور که قبلا توصیف کرده بودیم انجام شد (چن و همکاران،2015، 2017). برای AKI ناشی از سیسلاتین، سیسپلاتین وزن بدن 30 میلی گرم بر کیلوگرم به صورت داخل وریدی به موش های نر 8 هفته ای تزریق شد و موش ها 3 روز بعد قربانی شدند. نمونه های خون و کليه برای تجزيه و تحليل بيشتر جمع آوری شد که برای هر گروه حيوانی تجربی 4 نفر بود. RNA توتال توسط RNAiso Plus (TaKaRa) از کلیه ها جدا شد و با استفاده از سیستم سنتز رشته اول M-MLV (Invitrogen) به cDNA معکوس رونویسی شد. فراوانی رونوشت ژن های اختصاصی با استفاده از qPCR مورد ارزيابی قرار گرفت. پرایمرها مورد استفاده در مطالعه ارائه می شوند (جدول مکمل S4).

ساختارهای

پلاسمیدهای بیان پستانداران برای KIM1 انسان، KIM1 Ig V (KIM1 باقی مانده aa 20-127)، KIM1 △lg V(truncated KIM1 با بقایای خارج aa 20-127)، KIM1-CFP، KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S residues aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV-2-RBD-YFP, and TIM4-YFPwere constructed. محصولات تقویت PCR قطعات cDNA مربوطه به یک بردار مبتنی بر پروموتر pRK حاوی یا HA یا برچسب FLAG کلون شدند. پلاسمیدهای مرتبط با SARS-CoV-2 هدایای مهربانی از دکتر P.H.Wang شاندونگ بودند.

کشت سلولی و انتقال

سلول های لوله ای کلیه انسانی HK-2 (که از مرکز چین برای جمع آوری نوع کشت به دست آمده است) در محیط DMEM/F12 (Hyclone) حاوی گلوکز 17.5 میلی مولار و 10 درصد سرم گاو جنین کشت داده شد. برای بررسی تاثیر SARS-CoV-2 بر سلول ها، سلول های HK-2 با پلاسمیدهای SARS-CoV-2-S و SARS-CoV-2-RBD منتقل و سپس برای تشخیص بیشتر جمع آوری شدند.

Co-IP

نشان داد که سلول های HK-2/HEK293T (1×10) در بافر 1 میلی لیتری پیش لیز (25 میلی متر تریس-HCl،pH7.4،150mM NaCl،1٪ NP-40، 1mM EDTA، 5٪ گلیس رول)، که برای pulldown و IP assays و به عنوان یک بافر شستشو برای مهره ها فرموله شده است. برای IP، لایزات سلولی با آنتی بادی نشان داده شده یا gG مربوطه با مهره های مغناطیسی SureBeadsTM Protein G یک شبه در 4C ایمن سازی شد. پس از شستن با بافر پیش لیز حاوی 500 میلی متر NaCl، مهره ها در یک بافر بارگیری جوشیده شدند و تحت ایمونوبلاتینگ قرار گرفت (Wan et al.,2017).

FRET assay

برهمکنش داخل سلولی بین KIM1 و SARS-CoV-2-RBD با استفاده از روش استاندارد مبتنی بر FRET(کارپووا و مک نالی،2006)با استفاده از KIM1-CFP و SARS-CoV-2-RBD-YFP شناسایی شد. به طور خلاصه، پلاسمیدهای بیان پستانداران بیان کننده KIM1-CFP یا KIM1 Alg V-CFP با سلول های SARS-CoV-2-RBD-YFP به سلول های 293T cotransfected شدند. برای تشخیص مبتنی بر طیف سنجی فلورسانس، سلول ها پس از ترانسفاسیون جمع آوری و 24h lysed شدند و lysate توسط یک طیف سنج فلورسانس F-2700 (هیتاچی) از طریق اسکن طول موج (500-600nm) و اسکن زمان (435/527 نانومتر، تحریک/ انتشار) شناسایی شد. برای تشخیص مبتنی بر کنفوکال، سلول ها با میکروسکوپ کانفوکال Leica TCS SP8 تحت لنز هدف با قدرت بالا (40×) تصویر شدند(کانال CFP:435/485 nm، تحریک/ انتشار؛ کانال YFP:485/527nm, تحریک / انتشار; FRET channel:435/527 nm, excitation/emission) (Li et al,2020b). Cotransfection از CFP و YFP به عنوان یک کنترل منفی به عنوان شرح داده شده گنجانده شد(کارپوا و مک نالی، 2006). تعامل بین KIM1 و TIM4 لیگاند آن توسط اندازه FRET به عنوان یک کنترل مثبت تشخیص داده شد (رونگ و همکاران، 2011).

CRISPR-Cas9-mediated knockout of KIM1

پروتکل های مبتنی بر CRISPR-Cas9 برای مهندسی ژنوم به شرح مورد استفاده قرار گرفت (ژانگ و همکاران،2017). راهنمای RNA توالی هدف برای KIM1 ارائه شده (جدول مکمل S4).

برچسب گذاری FITC و میکروسکوپ confocal

برچسب FITC همان طور که قبلاً توصیف کرده بودیم انجام شد(Li et al, 2020b; Zhang et al.,2020). به طور خلاصه، SARS-CoV-2-RBD با FITC (نسبت مولر 1:5)یک شبه انکوبه شد، و سپس 5 میلی متر NHCl اضافه شد تا واکنش متوقف شود و FITC اصلاح نشده را کوئنچ کند. راه حل دو بار دیالیز شد و برای استفاده بیشتر lyophilized شد.

سلول های HEK293T (5×109)یا سلول های HK-2 (1×107) با FITC آزاد یا FITC-SARS-CoV-2-RBD (100μg/ml برای 2) انکوبه شدند. برای اندازه های درونی سازی مبتنی بر پپتید، AP1 یا AP2(50μM) با FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 میکروگرم بر متر) به هم اضافه شد. پس از رفع با فرمالدهید 4 درصد (w/v) غشای سلولی با Phalloidin با برچسب Alex Flour 594 (2μg/ml) رنگ آمیزی شد و هسته ها توسط DAPI(1μg/m) رنگ آمیزی شدند و سپس با میکروسکوپ کانفوکل لایکا TCS SP8 تصویر شدند. برای هر گروه، حداقل 100 سلول از پنج میدان تحت یک لنز عینی با قدرت بالا (64×) در ارزیابی گنجانده شدند. تصاویر نماینده ارائه شد. کمی سازی تصاویر توسط ImageJ1.8.0 انجام شد.

سلول زنده ماندن assays

سلول ها در 3000-4000 سلول در هر چاه در صفحات 96 چاه اندود شدند. در تلاقی 80 درصد، سلول های انکوبه شده با SARS-CoV-2-RBD (100 میکروگرم بر میلی لیتر) با AP1 یا AP2 (10،50،100 میکرومتر) درمان شدند. پس از آن,10μl MTT (5 میلی گرم در میلی لیتر به هر اضافه شد

به خوبی برای 4h، رسانه حذف شد، و DMSO اضافه شد. جذب اندازه گیری شده در 490nm به گروه کنترل مربوطه نرمال شد.

تجزیه و تحلیل آماری

داده ها به عنوان میانگین ±SD بیان شد. تفاوت معنی داری با آزمون دو دم دانشجو مورد ارزیابی قرار گرفت. یک مقدار P دو طرفه<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">