پنتراکسین{0}}با واسطه فعال‌سازی مکمل در مدل خوکی آسیب‌های ایسکمی کلیوی/پرفیوژن مجدد

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

کیارا دیولا و همکاران

چکیده

پنتراکسین‌ها خانواده‌ای از مولکول‌های تشخیص الگوی تکاملی هستند که نقش‌های محوری در ایمنی ذاتی و التهاب دارند، مانند اپسونیزاسیون پاتوژن‌ها در طول عفونت‌های باکتریایی و ویروسی. به طور خاص، پنتراکسین 3 طولانی (PTX3) نشان داده شده است که چندین جنبه از التهاب عروقی و بافتی را در طول پیوند عضو جامد تنظیم می کند.

مطالعه ما نقش PTX3 را به‌عنوان تعدیل‌کننده احتمالی فعال‌سازی کمپلمان در مدل خوکی آسیب ایسکمی/پرفیوژن مجدد کلیه (I/R) بررسی کرد. ما نشان دادیم که رسوبات اولیه PTX3 ناشی از آسیب I/R در سطوح مویرگ اطراف لوله و گلومرولی ایجاد می‌شود. میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال رسوبات PTX3 را نشان داد که با CD31 به علاوه سلول های اندوتلیال هم موضعی می شوند. علاوه بر این، PTX3 با ماکروفاژهای نفوذی (CD163)، سلول‌های دندریتیک (SWC3a)، و میوفیبروبلاست‌ها (FSP1) مرتبط بود. به طور خاص، ما فعال سازی قابل توجهی با واسطه PTX{10}} مسیرهای کلاسیک (با واسطه C1q) و لکتین (با واسطه MBL) کمپلمان را نشان دادیم. جالب توجه است که رسوبات PTX3 همزمان با فعال شدن کمپلمان انتهایی (C5b-9) روی سلول‌های اندوتلیال، نشان می‌دهد که فعال‌سازی مکمل PTX عمدتاً در سطح عروق کلیوی رخ داده است. در نتیجه، این داده ها نشان می دهد که PTX3 ممکن است یک هدف درمانی بالقوه برای جلوگیری از آسیب I/R ناشی از مکمل باشد.

مکاتبه با:جوزپه کاستلانو

کلید واژه ها:آسیب ایسکمی/ریپرفیوژن، سیستم کمپلمان، پنتراکسین 3،کلیه، مسیر کلاسیک

Cistanche tubulosa از بیماری کلیوی جلوگیری می کند، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

مقدمه

آسیب ایسکمی خونرسانی مجدد (I/R) نشان دهنده اصلی ترین علت حاد استکلیهصدمهپس از پیوند و با فعال شدن قابل توجهی از سیستم مکمل مشخص می شود [1، 2]. در این سناریو، سلول‌های اندوتلیال (EC) نقش مهمی در ترمیم ناسازگار پس از I/R ایفا می‌کنند که منجر به فیبروز اولیه توسط انتقال اندوتلیال به مزانشیمی (EndMT) می‌شود [3]. در طول فاز خونرسانی مجدد، کمپلمان فرآیندهای ایمنی و التهابی را تنظیم می کند و به بیماری های مختلف ایمنی و التهابی کمک می کند [2-5]. سایر اجزای ضروری بازوی هومورال سیستم ایمنی ذاتی توسط پنتراکسین ها نشان داده می شوند که تصور می شود نقش محوری در زیست شناسی عروقی دارند [6].

پنتراکسین‌ها خانواده‌ای از پروتئین‌های محلول چندمری هستند [6] که بر اساس ساختارشان به خانواده‌های کوتاه و بلند طبقه‌بندی می‌شوند [7]. این پروتئین‌های حفظ‌شده به‌طور تکاملی، عامل‌های فاز حاد هستند که به عنوان حسگر برای شروع التهاب عمل می‌کنند و به سرعت در پلاسما در طی عفونت افزایش می‌یابند [8]. پنتراکسین بلند 3 (PTX3) یک مولکول تشخیص الگوی محلول است که در محافظت ذاتی ایمنی حیاتی است و می تواند سیستم مکمل را فعال کند [9-11].

به طور خاص، PTX3 با اتصال به C1q، MBL، Ficolin{2}} باعث فعال‌سازی مسیر کلاسیک و لکتین می‌شود و می‌تواند بر مسیر جایگزین از طریق CFH تأثیر بگذارد [10-12].

برخلاف سایر پنتراکسین‌های تولید شده توسط کبد در جریان خون (یعنی CRP)، PTX3 می‌تواند توسط سلول‌های ساکن در محل التهاب آزاد شود، به عنوان مثال از فاگوسیت‌های تک هسته‌ای، سلول‌های دندریتیک، فیبروبلاست‌ها و EC [9] که به شیوه‌ای پاراکرین عمل می‌کنند. [13]. PTX3 همچنین به شکل آماده در نوتروفیل‌ها ذخیره می‌شود، در گرانول‌های خاص موضعی می‌شود و در پاسخ به شناسایی بخش‌های میکروبی ترشح می‌شود [14]. در EC، بیان PTX3 به آسانی توسط TNF- و IL{9}} القا می‌شود و انتقالی از یک فنوتیپ خاموش و ضد التهابی به حالت پیش‌انعقادی و پیش‌التهابی ایجاد می‌کند و در نتیجه عملکرد میکروواسکولار را به شدت تنظیم می‌کند [7، 8]. ]. به همین دلیل، سطوح PTX3 به صورت توصیف شده استمزمنکلیهمرضافزایش سطح پروتئین PTX3 با کاهش GFR و عوارض قلبی عروقی مرتبط است، با این حال، هنوز اطلاعات کمی در مورد نقش PTX3 در تنظیمات اولیه به عنوان حاد ناشی از I/R شناخته شده است.کلیهآسیب [15، 16].

نقش PTX3 در بیماری‌های التهابی کلیوی دو ظرفیتی است، از یک طرف پروتئین می‌تواند مسیرهای کلاسیک و لکتین را فعال کند که باعث التهاب و آسیب اولیه می‌شود [10-12]. از طرف دیگر، دامنه N ترمینال فعال سازی کمپلمان تعدیل شده PTX3 باعث کاهش جذب لکوسیت و مهار فیبروز بینابینی در آسیب حاد کلیوی می شود که باعث ترمیم بافت می شود [17-20].

مکمل نقش اساسی در پاتوفیزیولوژی حاد ناشی از آسیب I/R ایفا می کندکلیهصدمه[21، 22]. در مدل خوکی آسیب I/R کلیوی، ما نقش محوری فعال شدن سیستم کمپلمان را در القای EndMT و فیبروز اولیه، با دخالت مسیرهای کلاسیک و لکتین نشان دادیم [23]. علاوه بر این، ما نشان دادیم که مهار درمانی این مسیرهای کمپلمان توسط C{3}}INH نوترکیب (rhC1INH) باعث کاهش قابل توجهی در رسوب کمپلمان، با کاهش جذب سلول‌های التهابی نفوذی و آسیب توبولو بینابینی شد [23]. این نتایج توسط دلپچ PO و همکاران [24] نیز تایید شد. یک مدولاسیون قابل توجه در رسوب گلومرولی و لوله ای C1q، MASP و C4d پس از 30 دقیقه پس از خونرسانی مجدد مورد ارزیابی قرار گرفت که نشان دهنده نقش مرکزی C{11}}INH برای مقابله با مسیرهای کلاسیک و لکتین است.

در این مطالعه، ما دخالت احتمالی PTX3 را در میانجی‌گری فعال‌سازی زودهنگام کمپلمان در آسیب I/R کلیوی، که منابع سلولی مختلف PTX3 را مشخص می‌کند، بررسی کردیم.

نتایج

PTX3 توسط سلول‌های اندوتلیال و سلول‌های نفوذی ایمنی در مدل خوکی آسیب I/R بیان می‌شود.

ابتدا، ما حضور PTX3 را در یک مدل خوکی از آسیب کلیوی ناشی از I/R گرم بررسی کردیم. ما رسوبات PTX3 بسیار محدودی را در بافت طبیعی مشاهده کردیم (شکل 1A). آسیب I/R باعث رسوب منتشر PTX3 در 15 دقیقه پس از خونرسانی مجدد (شکل 1B، 1C) در ناحیه لوله بینابینی (شکل 1E)، در مویرگهای اطراف لوله (شکل 1D؛ فلش)، و در سطوح گلومرولی (شکل 1D) شد. رسوبات PTX3 هنوز 1 ساعت پس از خونرسانی مجدد در سطح مویرگهای اطراف لوله قابل تشخیص بود (شکل 1G). در کار قبلی [23] ما نشان دادیم که ویژگی‌های اصلی آسیب I/R آپوپتوز سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای و به‌کارگیری سلول‌های التهابی نفوذی مانند مونوسیت‌ها، سلول‌های دندریتیک و لنفوسیت‌ها است. با این وجود، با ارزیابی بافت شناسی معمول (شکل 1 تکمیلی)، ما نشان دادیم که 30 دقیقه ایسکمی گرم و به دنبال آن 15 دقیقه آسیب بینابینی اولیه لوله ناشی از خونرسانی مجدد، که با احتقان مویرگی بزرگتر و واکوئل شدن سیتوپلاسمی کانونی توبول کلیوی در مقایسه با اپیتلیوم مشخص می شود. وضعیت.

برای مشخص کردن بیشتر محلی سازی سلولی رسوبات PTX3 و ارزیابی اثر بالقوه آن در مدولاسیون پاسخ التهابی و آسیب، ما آنالیز میکروسکوپ کانفوکال و رنگ آمیزی دوگانه را انجام دادیم. بیان پروتئین PTX3 در بیشتر EC در سطوح مویرگی اطراف لوله (شکل 2A) و گلومرولی (شکل 2B)، 15 دقیقه پس از خونرسانی مجدد تشخیص داده شد.

مشخص است که آسیب I/R با افزایش فعال‌سازی پاسخ‌های ایمنی ذاتی و سازگار، از جمله قاچاق سلول‌های التهابی به اندام بیمار که آسیب را از طریق سلول‌های ایمنی و سیستم کمپلمان تشدید می‌کند، مشخص می‌شود [25]. در مدل خوکی ما، 15 دقیقه پس از برقراری مجدد جریان خون، یک نفوذ التهابی متراکم که عمدتاً از ماکروفاژها و سلول‌های دندریتیک در ناحیه توبول-بینابینی تشکیل شده بود، مشاهده کردیم. ما متوجه شدیم که هر دو این سلول های ارائه دهنده آنتی ژن با افزایش بیان PTX3 در مقایسه با T{5}} مشخص می شوند زیرا ما افزایش تعداد CD163 plus /PTX3 plus (شکل 2E, 2F, 2K) و SWC3a به علاوه /PTX3 plus را مشاهده کردیم. (شکل 2G، 2H، 2L) سلول ها در سطوح بینابینی توبول در T15.

بیان PTX3 می تواند به EndMT در آسیب I/R کمک کند

در مشاهدات قبلی، ما نشان دادیم که آسیب I/R مسئول EndMT است [26، 27]، که با کسب یک فنوتیپ مزانشیمی توسط EC با از دست دادن نشانگرهای اندوتلیال خاص و افزایش نشانگرهای مزانشیمی، مانند فیبروبلاست خاص مشخص می‌شود. پروتئین 1 (FSP{4}})، کادهرین عصبی (N-cadherin) و اکتین عضلات صاف آلفا (alpha-SMA). بنابراین، ما بررسی کردیم که آیا بیان PTX3 توسط EC می تواند بر این فرآیند تأثیر بگذارد یا خیر. همانطور که انتظار می رفت، هنگامی که بیان آلفا-SMA را به عنوان نشانگرهای میوفیبروبلاست فعال بررسی کردیم، هیچ محلی سازی مشترک بین آلفا-SMA و PTX3 پیدا نکردیم (شکل 2C، 2D). در مقابل، ما افزایشی در FSP1 توبولو بینابینی به اضافه /PTX3 به اضافه میوفیبروبلاست ها در طول دوره مشاهده مشاهده کردیم (شکل 2K-2M).

رسوبات PTX3 با فعال شدن سیستم مکمل همراه است

در نهایت، ما بررسی کردیم که آیا رسوبات PTX3 با فعال سازی مکمل مرتبط است یا خیر. در واقع، مانند سایر اجزای خانواده پنتراکسین، PTX3 می‌تواند فعال‌سازی مسیر کمپلمان کلاسیک را تنظیم کند [7]. برای تعریف رابطه بین PTX3 و فعال‌سازی کمپلمان، ما ایمونوفلورسانس دو برچسب را برای ارزیابی بیان PTX3 و پایانه انجام دادیم. کمپلمان، C5b-9، با استفاده از یک آنتی بادی که علیه یک نئو اپی توپ C9- قرار گرفته است. ما محلی سازی قابل توجهی از رسوبات PTX3 و C5b{12}} را مشاهده کردیم (شکل 3A, 3B). همانطور که قبلاً نشان دادیم، کمپلکس انتهایی کمپلمان در سطح پری لوله و همچنین در داخل مویرگ های اطراف لوله همراه با لایه سلول های اندوتلیال قرار داشت [23، 28]. از آنجایی که PTX3 می تواند سیستم کمپلمان را از طریق مسیرهای کلاسیک و لکتین فعال کند، ما رسوب C1q و MBL را در پارانشیم کلیه ارزیابی کردیم. جالب توجه است که رسوبات C1q (شکل 3E، 3F) و MBL (شکل 3C، 3D) عمدتاً در سطح بینابینی و مویرگی (شکل 3C تا 3F)، همانطور که قبلاً توضیح داده شد [23] و با رسوبات PTX3 کلوکالیزه شدند، یافت شدند.

مهارکننده C با اتصال PTX3 به سلول‌های اندوتلیال تداخل می‌کند

در کار قبلی خود [23] نشان دادیم که تجویز بازدارنده C منجر به کاهش قابل توجهی در رسوب کمپلمان، با کاهش جذب سلول های التهابی نفوذی و آسیب توبولو بینابینی شد. بنابراین، سطح بیان PTX3 را در حیوانات تحت درمان با rhC1-INH بررسی کردیم. ما دریافتیم که تزریق مهارکننده C رسوبات PTX3 را در مویرگ های اطراف لوله و سطح بینابینی پس از 15 دقیقه پس از خونرسانی مجدد کاهش داد (شکل 4A).

علاوه بر این، برای حمایت از این فرضیه که کاهش رسوبات PTX3 در حیوانات تحت درمان با rhC1-INH با مهار آسیب اندوتلیال همراه بود، ما آزمایش‌های آزمایشگاهی انجام دادیم و اتصال rhC1-INH و PTX3 را بر روی آنها ارزیابی کردیم. EC کشت شده در شرایط عادی یا در حضور استرس سلولی (شکل 4B). تجزیه و تحلیل FACS نشان داد که EC در شرایط عادی به هر دو rhC1-INH و PTX3 متصل نمی شود. مطابق با مطالعه قبلی خود [26]، ما افزایش اتصال سلولی rhC1-INH روی EC تحریک‌شده با H2O را در مقایسه با شرایط پایه مشاهده کردیم. علاوه بر این، در غیاب rhC{11}}INH، PTX3 می‌تواند EC فعال شده را متصل کند. جالب توجه است، زمانی که H2O{14}}EC فعال شده با PTX3 و rhC{16}}INH انکوبه شد، مشاهده کردیم که C1INH قادر به محافظت از EC با مسدود کردن اتصال PTX3 بود.

بحث

در این مطالعه، ما رسوب PTX3 را در مرحله اولیه آسیب I/R کلیوی و سهم احتمالی آن در توسعه EndMT نشان دادیم. جالب توجه است، ما دریافتیم که فعال‌سازی کمپلمان با واسطه PTX عمدتاً در سطح عروقی رخ می‌دهد، که با C1q و MBL، مولکول‌های تشخیص مسیرهای کلاسیک و لکتین آبشار کمپلمان، هم‌محل می‌شوند.

آسیب I/R باعث ایجاد یک پاسخ التهابی مشخص می شود که با فعال شدن کمپلمان، رادیکال های آزاد اکسیژن و تولید سیتوکین های پیش التهابی مشخص می شود، که منجر به فعال شدن اندوتلیوم عروقی و لکوسیت های محیطی می شود [29، 30]. در طول آسیب I/R، فعال سازی کمپلمان منجر به رسوب اجزای مکمل بر روی غشای سطحی EC آسیب دیده و ناکارآمد، با تولید همزمان آنافیلاتوکسین ها و تقویت فرآیند التهابی می شود [31]. در طول التهاب، PTX3 به سرعت افزایش می‌یابد و می‌تواند نقش مرکزی در تعدیل پاسخ اندوتلیال داشته باشد. در واقع، PTX3 به عنوان یک نشانگر زیستی بالقوه اختلال عملکرد اندوتلیال عروقی در چندین بیماری از جمله مزمن نشان داده شده است.کلیهبیماری، پره اکلامپسی و چندین بیماری عروقی [7، 16، 17، 32]. ما همچنین نشان دادیم که PTX3 در سایر عوارض عروقی مانند شکست فیستول شریانی وریدی در بیماران همودیالیزی نقش دارد [33]. این مشاهدات نشان می دهد که PTX3 می تواند پلی بین پاسخ التهابی و اختلال عملکرد اندوتلیال باشد [34]. مطابق با این مطالعات، ما رسوبات PTX3 را در سطح اندوتلیال پس از 15 دقیقه پس از خونرسانی مجدد مشاهده کردیم (شکل 2A، 2B). نتایج ما همچنین نشان داد که در مرحله اولیه آسیب I/R، PTX3 با نشانگر میوفیبروبلاست، FSP{13}} (شکل 2I, 2J) کلوکالیزه می‌شود، اما نه با alpha-SMA، نشانگری که توسط میوفیبروبلاست فعال بیان می‌شود (شکل 2C، 2 بعدی). روی هم رفته، این داده ها می توانند نشان دهند که اختلال عملکرد اندوتلیال و فرآیند EndMT [35]، مشاهده شده در حیوانات I/R [26]، ابتدا در EC بیان کننده PTX3 رخ داده است.

ارتباط بین PTX3 و سلول های التهابی به طور گسترده ای شناخته شده است. در این مقاله، ما به طور خاص بر روی اثرات ذاتی PTX3 در نفوذ بینابینی لکوسیت هایی که منبع اصلی PTX3 هستند، تمرکز کردیم [36]. به طور خاص، ماکروفاژها و سلول های دندریتیک را بعد از 15 دقیقه پس از خونرسانی مجدد یافتیم که سطوح بالاتری از PTX3 را بیان می کنند (شکل 2E تا 2H). این داده‌ها با شواهد فزاینده‌ای مطابقت دارند که نقش مرتبط ایمنی ذاتی را در میانجی‌گری آسیب اولیه در آسیب I/R نشان می‌دهند [23]. فعال شدن زودهنگام کمپلمان در بافت کلیه پس از آسیب I/R منجر به تولید چندین واسطه التهابی می شود که جذب سلول های ایمنی را افزایش می دهد [21، 23، 37، 38]. مطالعات اخیر PTX3 را به عنوان یکی از اجزای اصلی شبکه شناسایی کرده اند که پاسخ التهابی ناشی از آسیب I/R را تنظیم می کند [39]. در مدل‌های تجربی مختلف آسیب I/R، PTX3 می‌تواند نقش‌های متضاد دوگانه را روی بافت‌های خاص اعمال کند [40، 41]. تولید اولیه PTX3 با آسیب کلیوی همراه است زیرا باعث بیان زودهنگام مولکول‌های چسبندگی اندوتلیال و کموکاین‌ها می‌شود که پاسخ التهابی ناسازگار موضعی را تسریع می‌کنند.

برعکس، تولید محلی طولانی مدت PTX3 از التهاب و اختلال عملکرد بیش از حد اندام جلوگیری می کند [41].

PTX3 یک مدولاتور آبشاری مکمل است [9، 42]. این با خواص پلیوتروپیک PTX3 مطابقت دارد که نشان دهنده نقش دوگانه PTX3 به عنوان تعدیل کننده یا تقویت کننده پاسخ ایمنی ذاتی است [39]. در ابتدا، PTX3 با اتصال C1q و MBL، کمپلمان را فعال می کند [43]. با این حال، افزایش زودهنگام التهاب باید به ناحیه مورد نظر محدود شود. بنابراین، PTX3، با به‌کارگیری فاکتور H یا مهار رگ‌زایی، می‌تواند پاسخ التهابی و فعال‌سازی مکمل را کاهش دهد و پارانشیم کلیوی را از آسیب التهابی حفظ کند [43]. اگرچه فعال‌سازی کمپلمان در I/R در جوندگان عمدتاً در سطح لوله‌ای [44] موضعی است، در طول فاز خونرسانی مجدد، اندوتلیوم هدف اصلی عوامل مختلف التهابی، از جمله واسطه‌های کمپلمان است [2]. ما قبلاً نشان دادیم که در مدل خوکی آسیب I/R و همچنین در بیماران DGF، فعال شدن سیستم کمپلمان در فاز اولیه، روی مویرگ های اطراف لوله، داخل بینابینی و روی اندوتلیوم گلومرولی رخ می دهد [23]. داده‌های ما یک هم‌محلی واضح رسوبات C5b-9 روی PTX3 به علاوه EC را پس از 15 دقیقه پس از جریان‌رسانی مجدد نشان داد (شکل 3A، 3B). بنابراین، به نظر می‌رسد که اندوتلیوم کلیه محل شایع فعال‌سازی کمپلمان با واسطه PTX در مرحله اولیه آسیب I/R در هر دو محیط بالینی و بالینی باشد.

تعامل پنتراکسین ها با C1q و نقش آن در فعال سازی مسیر کمپلمان کلاسیک به خوبی توضیح داده شده است [45-47]. در زمینه پاسخ های ایمنی ذاتی، PTX3 می تواند اجزای مختلف کمپلمان را متصل کرده و فعال سازی کمپلمان را تعدیل کند [43، 48]. PTX3 با اتصال C1q کمپلمان را فعال می کند [49]. نتایج ما در مدل حیوانی به وضوح نشان داد که PTX3 ممکن است با تعامل با C1q در فعال سازی مسیر کلاسیک واسطه شود (شکل 3E، 3F). علاوه بر این، PTX3 همچنین مسیر لکتین مکمل را تعدیل می کند، همانطور که در شکل 3C، 3D نشان داده شده است. MBL از طریق دامنه کلاژن مانند خود به PTX3 متصل می شود [45] و کمپلکس های MBL/PTX3 C1q را جذب می کنند و رسوب C3 و C4 را بر روی سطوح سلول هدف ایجاد می کنند.

در مجموع، این نتایج نشان دهنده نقش مرکزی PTX3 در میانجیگری استکلیهآسیب در آسیب I/R، که می تواند پیامدهای مهمی برای درمان های مکمل در آسیب I/R کلیوی داشته باشد.

در مطالعه قبلی خود [26]، ما دخالت مکمل را در میانجی‌سازی فعال‌سازی EC با استفاده از یک شکل نوترکیب C1-INH، یک مهارکننده قوی پروتئازهای مسیرهای کمپلمان کلاسیک و لکتین بررسی کردیم (C1r, C1s, و MASP2). در همان مدل حیوانی، ما نشان دادیم (شکل 4A) که مهار درمانی هر دو مسیر توسط rhC1INH رسوبات PTX3 را در مویرگ های اطراف لوله و سطح بینابینی پس از 15 دقیقه پس از خونرسانی مجدد کاهش می دهد. این داده‌ها که با نتایج آزمایشگاهی روی EC تأیید شد (شکل 4B)، ما را به این فرضیه سوق داد که rhC1INH ممکن است از EC آسیب‌دیده با مسدود کردن اتصال PTX3 محافظت کند. در ادبیات، شواهدی در مورد اتصال C{12}}INH به مولکول‌های چسبنده اندوتلیال، بیان شده بر روی اندوتلیوم فعال شده، به نام سلکتین‌ها، به ویژه P و E-selectin وجود دارد [50، 51]. این اتصال به EC می تواند با تعامل اندوتلیال-لکوسیت در طول التهاب تداخل داشته باشد و مکانیسم ضد التهابی مهم دیگری را نشان می دهد [50، 51]. بنابراین، ما فرض کردیم که rh-C1INH می‌تواند EC فعال شده را متصل کند و تنظیم موضعی فعال‌سازی مکمل و فرآیند التهابی را واسطه می‌کند. در مطالعات قبلی خود، دخالت مکمل را در آسیب I/R و سایر بیماری‌های کلیوی با واسطه ایمنی نشان داده‌ایم [38، 52-54]. مکانیسم‌های فعال‌سازی مکمل در این مدل حیوانی می‌تواند پیامدهای مهمی برای تفسیر داده‌های مورد انتظار در محیط انسانی داشته باشد. برای توسعه موفقیت آمیز مداخلات درمانی با هدف فعال سازی مکمل [36، 54]، ایجاد اعتبار داده های خوک نسبت به آنچه در شرایط بالینی رخ می دهد ضروری است. از آنجایی که این تحقیق محدود به مطالعات مشاهده‌ای است، آزمایش‌های بیشتری برای تعیین مکانیسم‌های به هم پیوسته بین PTX3 و Complement مورد نیاز است که ممکن است استراتژی‌های درمانی جدید را برجسته کند. از نتایج بالا، داده‌های ما از این فرضیه پشتیبانی می‌کنند که PTX3 ممکن است جنبه‌های متعدد آسیب I/R با واسطه مکمل را تنظیم کند و در نتیجه یک هدف درمانی بالقوه را نشان دهد.

مواد و روش ها

مدل خوک آسیب I/R کلیه

مدل حیوانی آسیب I/R کلیه همانطور که قبلاً توضیح داده شد [23] ایجاد شد. پس از تایید کمیته اخلاقی وزارت بهداشت، 4-خوک سفید ماده یک ماهه (n=8، n=4 برای گروه، 20 کیلوگرم) تحت آزمایش قرار گرفتند. روش جراحی باز تجربی تحت بیهوشی عمومی حیوانات به مدت 24 ساعت قبل از القای بیهوشی ناشتا بودند. الکتروکاردیوگرام، ضربان قلب، اشباع هموگلوبین اکسیژن، ترکیب گاز تنفسی، تعداد تنفس، حجم جزر و مد، فشار راه هوایی، فشار خون شریانی سیستولیک و فشار ورید مرکزی به طور مداوم کنترل و ثبت شد (Ohmeda Modulus CD؛ DatexOhmeda، هلسینکی، فنلاند) . شریان و ورید کلیوی چپ جدا شد و یک حلقه عروقی در اطراف شریان کلیوی با یک گیره زاویه راست قرار گرفت. بیوپسی کلیه قبل از ایسکمی (T0) انجام شد. سپس با کشیدن حلقه عروق، فاز ایسکمیک (30 دقیقه) القا شد. بیوپسی های متعدد پس از آن در 15، 30، و 60 دقیقه پس از خونرسانی مجدد انجام شد. حیوانات 24 ساعت پس از عمل جراحی قربانی شدند. بخشی از هر نمونه بیوپسی بلافاصله در محیط برش بهینه (Tissuetek، Pittsburgh، PA) منجمد شد و در نیتروژن مایع ذخیره شد. بخش دیگر به مدت 12 ساعت در فرمالین بافر (4 درصد) تثبیت شد و با استفاده از روش های استاندارد در پارافین جاسازی شد.

مطالعه میکروسکوپی

نمونه‌های کلیوی تعبیه‌شده با پارافین از بیوپسی‌های کلیه برای رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی معمولی (H&E، پریودیک اسید-شیف) استفاده شد. تصاویر توسط دستگاه Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies، Vista، CA، USA) به دست آمد. ضایعات توبولی-بینابینی و گلومرولی با استفاده از تجزیه و تحلیل کیفی توسط دو ناظر (CD, MR) که از منشاء بی اطلاع بودند مورد ارزیابی قرار گرفت.

آنتی بادی ها

آنتی بادی های اولیه مورد استفاده در این مطالعه آنتی ژن های زیر را شناسایی کردند: PTX3 (MNB4: مستقیم علیه دامنه N ترمینال PTX3، Exira Life Sciences In.، Larsen، Switzerland). CD163 (مونوسیت ها/ماکروفاژها، بیولوژیک ایالات متحده، سوامپسکات، MA)؛ SWC3a (سلول های دندریتیک، [55] 74-22-15A، BD Biosciences); FSP1 (پروتئین اختصاصی فیبروبلاست 1، Abcam، کمبریج، انگلستان)؛ اکتین عضلات صاف آلفا (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, USA). C1q (R9/2، AbDSerotec؛ Kidlington، انگلستان)؛ MBL (3E7: مستقیم در برابر دامنه تشخیص کربوهیدرات MBL، بیوتکنولوژی Hycult، Uden، هلند) و نئوآنتی ژن C9 (aE11، بیوتکنولوژی Hycult). واکنش متقاطع با پیش انکوباسیون آنتی بادی های خاص، قبل از استفاده از آنها، با پپتیدهای انسانی مورد استفاده برای افزایش آنها تأیید شد. قبل از جوجه کشی رنگ آمیزی خاص بر روی بافت خوکی لغو شد.

میکروسکوپ اسکن لیزری ایمونوفلورسانس بافتی و کانفوکال

خصوصیات و محلی سازی سیگنال PTX3 بر روی بافت منجمد موجود در محیط OCT (Tissue-Tek) مورد بررسی قرار گرفت. لام ها با سرم 5 درصد خرگوش به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. سپس لام ها به مدت 1 ساعت در دمای اتاق با آنتی بادی های اختصاصی انکوبه شدند. پس از سه بار شستشو در PBS، لام ها با آنتی بادی های ثانویه مناسب (آلکسا فلور 488 و 555، پروب مولکولی، یوجین، OR) انکوبه شدند. تمام مقاطع با TO-PRO{9}} (پروب مولکولی) ضد رنگ آمیزی شدند. کنترل های منفی با آنتی بادی های نامربوط تهیه شد. مقاطع با استفاده از میکروسکوپ اسکن لیزری کانفوکال لایکا TCS SP2 (لایکا، وتسلار، آلمان) تجزیه و تحلیل شدند. تعداد سلول‌های نفوذی در حداقل 10 میدان/بخش با توان بالا (x630) توسط دو ناظر مستقل که نسبت به مبدا اسلایدها کور شده بودند اندازه‌گیری شد. شمارش نهایی میانگین دو معیار بود. در هیچ موردی، تنوع بین ناظر بیشتر از 20 درصد نبود.

کشت سلولی و تجزیه و تحلیل فلوسیتومتری

سلول های اندوتلیال ورید ناف انسانی (HUVEC، EC) از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (استانداردهای ATCC-LGC، Sesto San Giovanni، ایتالیا) خریداری شدند. EC در محیط های توصیه شده آنها، EndoGro (Merck Millipore، دارمشتات، آلمان) رشد کرد. EC با تراکم 1{{10}}،000سلول در سانتی‌متر مربع کاشته شد و با تیمار H2O2 (3 درصد، 1 ساعت) تحریک شد. سپس EC پایه و تحریک شده دو بار با PBS شسته و با PBS-EDTA 2mM و تریپسین 0.001× حذف شدند. سپس سلول‌ها مجدداً در PBS معلق شدند و به ترتیب با PTX3 (PTX3 نوترکیب انسانی، سیگما آلدریچ، مرک، آلمان) (1 میکروگرم در میلی‌لیتر) یا/و با rhC{16}}INH (Ruconest®, Pharming) (2.5 میکروگرم) انکوبه شدند. /ml) به مدت 60 دقیقه. پس از سه بار شستشو با PBS 1X، سلول ها در بافر فلوسیتومتری (FACS) (سالین بافر فسفات، pH 7.2، 0.2 درصد آلبومین سرم گاوی و 0.02 درصد سدیم آزید) معلق شدند و با معرف مسدودکننده FCR (Miltenyiotec) انکوبه شدند. 10 دقیقه در دمای اتاق. پس از مسدود شدن، EC ها با C{30}}INH ضد انسان خرگوش (ارائه شده توسط پروفسور M. Daha، دانشگاه لیدن، رقت 1//100) یا/و با anti-PTX3 موش (MNB4، Exira Life) انکوبه شدند. Sciences In.، رقت 1/20) در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه و با بافر FACS شسته شد. سپس سلول ها با IgG PE ضد خرگوش بز (پروب مولکولی، رقت 1/100) یا با ضد موش IgG FITC (پروب مولکولی، رقت 1/100) در دمای اتاق به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند و سه بار شسته شدند. سلول ها با FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) و نرم افزار Kaluza آنالیز شدند. ناحیه مثبت با استفاده از mAb همسان با ایزوتیپ تعیین شد و در مجموع، 104 رویداد برای هر نمونه به دست آمد. سه آزمایش مستقل انجام شد.

تحلیل آماری

داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) ارائه شده و در صورت لزوم با استفاده از آنالیز واریانس یا آزمون تی زوجی مقایسه می شوند. زمانی که مقادیر p کمتر از 0 بود، تفاوت ها از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.05. داده ها با استفاده از بسته نرم افزاری Statview (نسخه 5.0) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نمودارها با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism 5 نمایش داده شدند.

اختصارات

I/R: ایسکمی/پرفیوژن مجدد. EC: سلول های اندوتلیال. PTX3: پنتراکسین 3; FSP{2}}: پروتئین اختصاصی فیبروبلاست 1. N-cadherin: کادهرین عصبی; آلفا-SMA: اکتین عضلات صاف آلفا.

مشارکت های نویسنده

CD مطالعه را هماهنگ کرد، در علامت‌گذاری ایمنی و میکروسکوپ کانفوکال بخش‌های کلیوی شرکت کرد و نسخه خطی را تهیه کرد. AS و RF در طراحی این مطالعه شرکت کردند، به تجزیه و تحلیل داده‌ها کمک کردند، آزمایش‌های آزمایشگاهی را انجام دادند و نسخه خطی را به طور انتقادی اصلاح کردند. MR و GSN آنالیز تصویر هیستوپاتولوژیک را انجام دادند. LL، FS، AMC مدل حیوانی آسیب ایسکمی-پرفیوژن مجدد را انجام دادند و به اصلاح نسخه کمک کردند. GL، PD، و MB تمام اقدامات جراحی را بر روی مدل خوک انجام دادند و به اصلاح نسخه خطی کمک کردند. MRD، P.vdP.، C.vK.، و FS نسخه خطی را اصلاح کردند.

PP، ER، GG، GS، و LG به طور انتقادی این نسخه را اصلاح کردند. GC ابزارهای تحلیلی جدیدی را ارائه کرد، تحقیق را طراحی و نظارت کرد. CD، AS و RF به طور مساوی به این مطالعه کمک کردند. همه نویسندگان به مقاله کمک کردند و نسخه ارسال شده را تایید کردند.

قدردانی

از کلودیا کورچی از بخش کلیه، دیالیز و پیوند، بخش اورژانس و پیوند اعضا،

دانشگاه باری برای کمک های فنی عالی.

تضاد علاقه

نویسندگان اعلام می کنند که هیچ تضاد منافعی ندارند.

منابع مالی

این مطالعه توسط دانشگاه باری "آلدو مورو"، وزارت بهداشت ایتالیا (GR 2016- 02362239) "رویکرد مبتنی بر رونویسی برای شناسایی عوامل پیش‌بینی‌کننده و اهداف درمانی برای عملکرد تاخیری پیوند درکلیهگیرندگان پیوند، Bando di Ricerca Finalizzata 2016، CD در این پروژه بورسیه دریافت کرد) و Fondo Sociale Europeo، Azione I.2 "Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori"- AIM-1810057-فعالیت 2 اعطا شده به AS

منابع

1. Bonventre JV، یانگ L. پاتوفیزیولوژی سلولی ایسکمیک حادکلیهصدمه. جی کلین سرمایه گذاری. 2011; 121:4210-21.

2. Jang HR، Rabb H. پاسخ ایمنی ذاتی در حاد ایسکمیککلیهصدمه. کلین ایمونول. 2009; 130:41-50.

3. Ricklin D، Hajishengallis G، Yang K، Lambris JD. مکمل: یک سیستم کلیدی برای نظارت بر سیستم ایمنی و هموستاز. نات ایمونول. 2010; 11:785-97.

4. Thurman JM, Holers VM. نقش محوری مسیر مکمل جایگزین در بیماری های انسانی جی ایمونول. 2006; 176:1305-10. PMID: 16424154

5. Franzin R، Stasi A، Fiorentino M، Stallone G، Cantaluppi V، Gesualdo L، Castellano G. سیستم التهابی و مکمل: پیوندی بین حادکلیهآسیب و آسیب مزمن پیوند. جلو ایمونول.

2020; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L، Jaillon S، Garlanda C، Bottazzi B، Mantovani A. پنتراکسین ها در ایمنی ذاتی: درس هایی از PTX3. سلول Tissue Res. 2011; 343:237–49.PMID:20683616

7. Cieślik P، Hrycek A. پنتراکسین طولانی 3 (PTX3) با توجه به ساختار، مکانیسم عمل و پیامدهای بالینی آن. خودایمنی. 2012; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kunes P، Holubcova Z، Kolackova M، Krejsek J. Pentraxin 3 (PTX 3): یک تعدیل کننده درون زا از پاسخ التهابی. واسطه ها التهاب 2012; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C، Bottazzi B، Bastone A، Mantovani A. پنتراکسین ها در تقاطع بین ایمنی ذاتی، التهاب، رسوب ماتریکس، و باروری زنانه. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66.115756PMID:15771574

10. Bottazzi B، Garlanda C، Cotena A، Moalli F، Jaillon S، Deban L، Mantovani A. پنتراکسین طولانی PTX3 به عنوان یک گیرنده تشخیص الگوی هومورال اولیه: تعامل با ایمنی ذاتی سلولی. Immunol Rev. 2009; 227:9-18.PMID:19120471

11. Ma YJ، Doni A، Hummelshøj T، Honoré C، Bastone A، Mantovani A، Thielens NM، Garred P. هم افزایی بین فیکولین-2 و پنتراکسین 3 تشخیص ایمنی ذاتی و رسوب مکمل را تقویت می کند. جی بیول شیمی. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS، Lucarelli G، Spadaccino F، Castellano G، Gigante M، Divella C، Rocchetti MT، Rascio F، Mancini V، Stallone G، Carrieri G، Gesualdo L، Battaglia M، Ranieri E. PTX3 ایمونوفلوگوزیس را در تومور تعدیل می کند. ریزمحیط و یک عامل پیش آگهی برای بیماران مبتلا به کارسینوم سلول کلیوی شفاف است. پیری (آلبانی نیویورک). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771

13. Souza DG، Amaral FA، Fagundes CT، Coelho FM، Arantes RM، Sousa LP، Matzuk MM، Garlanda C، Mantovani A، Dias AA، Teixeira MM. پنتراکسین طولانی PTX3 برای التهاب بافت پس از آن بسیار مهم است

ایسکمی روده و خونرسانی مجدد در موش جی پاتول هستم. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S، Peri G، Delneste Y، Frémaux I، Doni A، Moalli F، Garlanda C، Romani L، Gascan H، Bellocchio S، Bozza S، Cassatella MA، Jeannin P، Mantovani A. گیرنده تشخیص الگوی هومورال PTX3 در گرانول های نوتروفیل ذخیره می شود و در تله های خارج سلولی قرار می گیرد. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID:17389238

15. تانگ ام، کاررو جی جی، قریشی آر، اندرستم بی، هایمبورگر او، بارانی پی، اکسلسون جی، آلوستراند آ، استنوینکل پی، لیندهولم بی، سلیمان ME. پنتراکسین 3 پلاسما در بیماران مزمنکلیهبیماری: ارتباط با عملکرد کلیه، پروتئین-انرژی، هدر رفتن، بیماری قلبی عروقی و مرگ و میر. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A، Rydén M، Carrero JJ، Qureshi AR، Nordfors L، Näslund E، Hammarqvist F، Arefin S، Kublickiene K، Stenvinkel P. سطوح بالا در گردش خون و بیان بافتی pentraxin 3 در اورمی: بازتابی از دیس های اندوتلیال. PLoS One. 2013; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M، Camozzi M، Salvatori G، Rusnati M. نقش گیرنده تشخیص الگوی محلول PTX3 در بیولوژی عروقی. جی سل مول مد. 2007; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B، Inforzato A، Messa M، Barbagallo M، Magrini E، Garlanda C، Mantovani A. پنتراکسین های PTX3 و SAP در ایمنی ذاتی، تنظیم التهاب و بازسازی بافت. جی هپاتول. 2016; 64:1416-27.

19. Xiao Y، Yang N، Zhang Q، Wang Y، Yang S، Liu Z. Pentraxin 3 از طریق سرکوب مسیر IL-6/Stat3، فیبروز بینابینی ناشی از آسیب حاد کلیه را مهار می کند. التهاب. 2014; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A، Reading PC، Barbati E، Bottazzi B، Garlanda C، Mantovani A. جنبه "شیرین" یک پنتراکسین طولانی: چگونه گلیکوزیلاسیون بر عملکرد PTX3 در ایمنی ذاتی و التهاب تاثیر می گذارد. جلو ایمونول. 2013; 3:407. PMID: 23316195