Pinocembrin Ameliorates نارسایی قلبی پس از سکته از طریق فعال سازی Nrf2/HO-1 مسیر سیگنالینگ قسمت 1

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای کسب اطلاعات بیشتر

چکيده

پس زمینه:استرس اکسیداتیو عامل مهمی است که در پیشرفت نارسایی قلبی نقش دارد. مطالعه حاضر برای بررسی اینکه آیا پینوسمبرین قادر به بهبود نارسایی قلبی پس از سکته قلبی (PIHF) و مکانیسم های زمینه ای است یا نه، انجام شد.

لطفا برای دانستن اطلاعات بیشتر اینجا را کلیک کنید

روش:موش های صحرایی برای القای سکته قلبی، رباط شریانی نزولی قدامی چپ انجام شدند و متعاقباً به مدت ۶ هفته برای تولید نارسایی مزمن قلبی مطرح شدند. سپس pinocembrin هر روز در بین به مدت 2 هفته مدیریت شد. اثرات آن با استفاده از اکوکاردیوگرافی، بلات غربی، رنگ آمیزی ماسون، معاینات بیوشیمیایی، ایمونوهیستوشیمی و فلورسانس مورد ارزیابی قرار گرفت. در آزمایشگاهی، ما همچنین کشت H9c2 کاردیومیوسیت ها و میوفیبروبلاست های قلبی برای شهادت بیشتر مکانیسم ها.

نتیجه:ما متوجه شدیم که زوال های ناشی از PIHF عملکردهای قلبی به طور قابل توجهی با مدیریت پینوسمبرین بهبود یافته است. علاوه بر این، درمان پینوسمبرین همچنین رسوب کلاژن و گیرنده فاکتور رشد اندوتلیال عروقی تقویت شده 2 در منطقه مرزی منقرض شده همراه با آپوپتوز کاهش یافته، که مربوط به آملیوراسیون استرس اکسیداتیو بود که با کاهش گونه های واکنش پذیر اکسیژن (ROS) در بافت قلب و مالون دی آلدهید (MDA) در سرم، و افزایش سوپراکسید دیسموتاز (SOD) نشان داده شده بود. این امر با تنظیم مجدد مسیر فاکتور هسته ای erythroid 2 مرتبط با 2 (Nrf2)/heme oxygenase-1(HO-1) همراه بود. در آزمایش های آزمایشگاهی متوجه شدیم که مهارکننده خاص Nrf2 به طور قابل توجهی اثرات ناشی از پینوسمبرین شامل آنتی اکسیدان، ضد آپوپتوز، ضد فیبروز، و نئوواسکولاریزاسیون را معکوس کرد که بیشتر نشان دهنده آملیوراسیون PIHF توسط پینوسمبرین به شیوه ای وابسته به مسیر Nrf2/HO-1 بود.

سیستانچه می تواند ایمنی را بهبود بخشد

نتیجه:Pinocembrin ameliorated توابع قلبی و بازسازی ناشی از PIHF توسط روکش ROS و Nrf2/HO-1 فعال سازی مسیر که بیشتر تشدید رسوب الیاف کلاژن و آپوپتوز, و تسهیل آنژیوژنز.

کليدواژه:پینوسمبرین، نارسایی قلبی، استرس اکسیداتیو، Nrf2/HO-1

مقدمه

نارسایی قلبی (HF)، مشخص شده توسط طیف وسیعی از سندرم های بالینی ترمینال ناشی از اختلالات ساختاری و / یا عملکردی قلب، به عنوان یک بار سلامت جهانی باقی می ماند، با سکته قلبی (MI) به عنوان علت پیشرو (ضیائیان و فونارو 2016؛ Galli and Lombardi 2016; Rengo et al.2013). با وجود پیشرفت های بزرگی که در درمان ها و در کیفیت مراقبت در HF به دست آمده است، شیوع تخمینی ۳۷٫۷ میلیون نفر در هر سال در سراسر جهان، همراه با مرگ و میر ۵۰٪ در ۵ سال پس از تشخیص HF (Go et al.۲۰۱۴) وجود دارد. معضل فعلی ممکن است تا حدودی به آن HF پس از سکته (PIHF) نسبت داده شود متشکل از طیف گسترده ای از مکانیسم های پاتوفیزیولوژیک است که روش های درمانی حاضر قادر به ارجاع کامل به آن نیستند.

مطالعات انباشته کننده نشان داده اند که استرس اکسیداتیو (OS) عمدتاً در پیشرفت پاتولوژیک PIHF نقش دارد (Dubois-Deruy et al.2020; Ma et al. 2019; Bubb et al.2017; Habtemariam 2019). سیستم عامل، عمدتا توسط تجمع بیش از حد رادیکال های آزاد / گونه های اکسیژن واکنشی (ROS) حاوی هیدروکسیل رادیکال، سوپر اکسید، اکسید نیتریک، و غیره ارائه شده است(Dubois-Deruy و همکاران 2020؛ Habtemariam 2019), اثبات شده است که قادر به برانگیختن اصلاح اکسیداتیو و یا آسیب چربی, پروتئین, و DNA, با اختلالات اندامک, التهاب, آپوپتوز در میوسیت ها و ابرویوز فیبروز واسطه (Dubois-Deruy et al.2020; Bubb et al.2017; هرمیدا و همکاران ۲۰۱۸). به دلیل اثرات زیان بار متعدد ROS، آنتی اکسیدان ها در درمان های PIHF مورد توجه قرار گرفته اند که مکانیسم های آن شامل روکش مستقیم ROS و/یا تحریک دفاع آنتی اکسیدانی حاوی گلوتاتیون، سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز و غیره (Habtemar-iam 2019) است. با این حال، پشیمان بود که استفاده از برخی از آنتی اکسیدان ها، نه ویتامین E(لی و همکاران 2005)، و نه resveratrol(ساخته شده و همکاران 2015؛ اولسن و همکارانش در سال ۲۰۱۴ موفق به پاسخگویی به رضایت در درمان بیماری های قلبی عروقی نشدند که بر اثر شکست در بهبود عملکردهای قلبی شاهد آن بود. بنابراین آنتی اکسیدان های کارآمدتری در درمان PIHF مورد نیاز است.

Pinocembrin (پینو)(ساختار شیمیایی در شکل نشان داده شده است.1A)یک ترکیب فلاونوئید طبیعی است, که می تواند از عسل استخراج, بره شهر, و چند گیاه دیگر (لان و همکاران 2015; Rasul et al.2013) علاوه بر سنتز مصنوعی(Costa and Leitao 2011)، اعمال اثرات ضد التهابی، ضد باکتری، ضد و ضد سرطان (Rasul et al.2013؛ Ye et al.2019), along with the emphasized antioxidant effect (Kim et al.2020; Sangweni et al.2020). همانطور که قبلا نشان داد، ساختار فنلی پینو مسئول حذف مستقیم ROS و همچنین هر دو ساختار فنلی و غیر فنلی است که تشدید دفاع آنتی اکسیدانی(Habtemariam 2019)حساب برای اثر آنتی اکسیدانی پینو، که توسط آن پینو مورد مطالعه قرار گرفته است و در طیف گسترده ای از بیماری ها، مانند بیماری های نورودژنراتیو، آتروسکلروز، سمیت کاردیومیوسیت ناشی از دوکسوروزین مورد مطالعه و اعمال قرار گرفته است (سنگوینی و همکاران 2020؛ Sang et al.2012; Liu et al.2014). با این حال، با توجه به اینکه آنتی اکسیدان های متعددی برای سکته قلبی و HF برای تبدیل به استفاده بالینی بی اعتبار یا کافی نیست، آیا اثر آنتی اکسیدانی پینو می تواند در درمان PIHF برآورده شود، همچنان ضعیف درک شده است. به این ترتیب این تحقیق برای بررسی اینکه آیا اداره پینو می تواند اثرات سلامی بر PIHE اعمال کند، وعده رمان بودن، یا اگر نه غالب اما حداقل درمان کمکی انجام شد.

روش ها و مواد

مدل حیوانی و پروتکل آزمایش

56 موش نر اسپراگ داولی، خریداری شده از مرکز آزمایش حیوانات دانشگاه چین سه Gorges،

در اداره حیوانات بیمارستان ووهان شماره ۳ مطرح شدند. تمام آزمایش ها به طور رسمی مجاز و انجام شده در آزمایشگاه هوبئی کی قلب، مطابق با راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی منتشر شده توسط موسسه ملی بهداشت آمریکا (نشریه NIH شماره ۸۲-۲۳، تجدید نظر شده در سال ۱۹۹۶) بود.

موش ها در ابتدا رباط عروق کرونر نزولی قدامی چپ (LAD) یا جراحی شام دریافت کردند. به طور خلاصه، موش های صحرايی با پنتوباربيتال 3 درصد (2 ميلی ميلی تال بر کيلوگرم) بی حس شدند. Sigma-Aldridge, St.Louis, USA, intraperitoneal), followed by tracheal intubation and respiratory support (tidal vol-ume: 5-10 mL, rate: 70 times/minute). پس از آن قرار گرفتن در معرض قلب انجام شد و LAD توسط 7-0 سوتور نایلون مونوفیلامنت لیگاتور شد. وقوع رنگ پریده بودن آپککوردیس یا ارتفاع بخش ST بر روی سرب I الکتروکاردیوگرام نشان دهنده القای MI بود. عملیات شام به جز رباط LAD تحت روش های یکسان قرار گرفت. پنی سیلین (۲۰۰٬۰ IU)، یک بار در روز به مدت یک هفته پس از عمل به صورت عضلانی تزریق می شد.

پس از آن موش ها به دقت به مدت ۶ هفته برای تولید PIHF بزرگ شدند. سپس موش ها به طور تصادفی به 4 گروه تقسیم شدند:(i) sham+saline (sham group);(i)sham+Pino group;(ii)LAD ligation+saline(HF group);(iv)LAD ligation+Pino(HF+Pino group). Pinocembrin(5 میلی گرم در کیلوگرم, خلوص>98٪; سیگما-الدریج)یا همان حجم سالین هر روز به مدت ۲ هفته از طریق ورین دم به صورت وریدی تزریق می شد. دزا به یک مطالعه قبلی اشاره داشت (Lan et al.2017). این پروتکل در Fig.1B نشان داده شد.

موش های صحرايی کنترل مثبت کنترل شامل 3 گروه شامل شام+سالين(گروه شام)؛ LAD ligation+saline (HF group); LAD ligation+enalapril (HF+ACEI group). موش های صحرايی تحت عمليات مربوطه قرار دادند با اين تفاوت که موش های گروه HF+ACEI به صورت دندانی با 20 ميلی گرم بر کيلوگرم انالاپريل تغذیه شدند.

اندازه گیری های اکوکاردیوگرافی

عملکرد قلب توسط اکوکاردیوگرافی ترانس قفسه سینه با استفاده از یک سیستم تصویربرداری سونوگرافی (Vevo 2100، شرکت ویژوال سونیکز، تورنتو، کانادا)، همانطور که قبلا در گروه ما گزارش شده بود (Fo et al.2020) ارزیابی شد. بعد داخلی بطن چپ در مرحله انتهایی دیاستولیک (LVIDd)و مرحله انتهای سیستول (LVIDs)، انتهای بطن چپ و حجم دیاستولیک انتهایی (LVESV و LVEDV) توسط اکوکاردیوگرام های دو بعدی M-mode برای حداقل 3 چرخه متوالی برای هر موش صحرایی ثبت شد. پس از آن کسر خارج شدن بطن چپ (LVEF) و کوتاه شدن کسری (FS) که تابع سیستولیک را منعکس می کرد، محاسبه شد.

آماده سازی نمونه

پس از انجام آزمایش های پینو و اکوکاردیوگرافی، موش های صحرایی دوباره بی دندان شدند. بیش از 2 میلیL خون وریدی از ورین دم به اتیلن دی آمینتترااستیک اسید (EDTA)حاوی لوله های جمع آوری خون خلاء با سانتریفیوژ متوالی با سرعت 3000 r/min به مدت 15 دقیقه و در دمای 4 درجه سانتی گراد گرفته شد و به دنبال آن جداسازی سوپرناتانت سرم و حفظ در 80-"C. سپس قلب ها به سرعت برداشت شدند. بخشی از منطقه مرزی منقرض شده هر قلب در نیتروژن مایع برای تجزیه و تحلیل بلات غربی قطع و منجمد شد، با بافت قلب دیگر ثابت در پارافورمالدهید 4٪ برای بیش از 24 ساعت.

رنگ آمیزی ماسون

ما رنگ آمیزی ماسون را برای تشخیص رسوب کلاژن در منطقه مرزی منقرض شده انجام دادیم. بطن های ثابت پارافورمالدهید توسط پارافین تعبیه شدند و سپس به بخش های ۵ میکرومتر برش داده شدند. بخش ها متعاقباً با سه رنگ ماسون رنگ آمیزی شدند که در آن کلاژن به رنگ آبی، میوکارد به رنگ صورتی و هسته به رنگ سیاه رنگ شده بود. نسبت رسوب کلاژن توسط نرم افزار Image J(NIH, Bethesda, MD) در بزرگنمایی × شد.

تحلیل ایمونوهیستوشیمیایی

تجزیه و تحلیل ایمونوهیستوشیمیایی به منظور بررسی تراکم گیرنده فاکتور رشد آندوتلیال عروقی 2 (VEGFR2) انجام شد که تنظیم بالا آنژیوژنز را ترویج کرد که در کاهش بازسازی سلامی و مهم بود (Rengo et al. 2013). بخش های بطنی مانند بخش هایی که در رنگ آمیزی ماسون انجام می شد و به دنبال آن دپارافینیزه و دوباره آب می شدند، ساخته می شدند. سپس بخش ها بازیابی ضد ژن با میانجیگری گرما دریافت کردند و با 3 درصد H، O، برای جلوگیری از پراکسیداز اندوژن، با انکوباسیون 1 آنتی بادی ug/mL VEGFR2 (Abcam, ab9530)برای 12h در 4 درجه سانتی گراد انجام شد. پس از آن، بخش ها توسط آنتی بادی ثانویه با برچسب اسب تربچه پراکسیداز (HRP)(1:200، Service، G1213) به مدت 50 دقیقه در درجه سانتی گراد انکوبه شدند. علاوه بر این، 3,3'-diaminobenzidine مورد استفاده قرار گرفت برای توسعه رنگ آمیزی مثبت است که در tawny نشان داده شد. در نهایت میانگین چگالی نوری VEGFR2 توسط نرم افزار Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA) مورد تجزیه و تحلیل و محاسبه قرار گرفت.

پایانه - deoxynucleotidyl transferase میانجی نیک پایان برچسب (TUNEL) assay

آپوپتوز متعاقباً توسط اندازه TUNEL شناسایی شد. پیش از این توده های پارافین تولید شده که بافت بطنی را جاسازی می کردند، به برش های دیگری برای اندازه سازی TUNEL بریده می شدند و به دنبال آن رنگ آمیزی TUNEL با توجه به دستورالعمل های تولیدکننده کیت آسان سازی تجاری (روش، سوئیس؛11684817910) صورت می گرفت. به طور خلاصه، بخش های بطنی در معرض واکنشگر TUNEL قرار گرفتند، جایی که TdT و dUTP با نسبت ۱:۹، به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق، پس از جوجه کشی پروتئیناز K و پاره شدن غشای سلول مخلوط شدند. در نهایت، تصاویر فلورسنت در طول موج 530 nm مشاهده شد که با طول موج انتشار 450 nm (×400 بزرگنمایی) آغاز شد. میزان آپوپتوتیک بافت های بطنی در هر گروه توسط نرم افزار Image مورد تجزیه و تحلیل و محاسبه قرار گرفت.

بلات غربی

ما بلات غربی را پیاده سازی می کنیم تا مکانیسم های زمینه ای را که پینو توسط آن PIHF را بهبود بخشد، آشکار کنیم. روش های استخراج و آماده سازی نمونه پروتئین شبیه به روش هایی بود که قبلاً در مطالعه ما گزارش شده بود (Chen et al.2020a). غشاها با آنتی بادی در برابر فاکتور هسته ای erythroid 2 مرتبط با فاکتور 2 (Nrf2)، هم اکسيژناز-1(HO-1;1:2000، Abcam, ab189491),p53(1:1000,cell signaling technology,2524S), BCL-2 (1:1000, cell signaling technology,2870P),bax (1:1000, Abcam, ab32503), cleaved caspase-3(1:1000, cell signaling technology, 9664 T), collagen I(1:1000, Affinity, AF7001), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH, Service, GB12002), با تجسم بعدی توسط آنتی بادی های ثانویه با برچسب HRP (سرویس، G1213 و G1214)و ریجنت های تشخیص شیمی لومینسانس. تصاویر بلات در نهایت توسط نرم افزار Image J مورد تجزیه و تحلیل و کمی قرار گرفتند.

کشت و دفع کاردیومیوسیت های H9c2 در آزمایشگاهی قلب موش صحرایی مشتق از H9c2 کاردیومیوسیت ها که از مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (CRL-1446) خریداری شده بودند، برای بررسی بیشتر اثرات اعمال شده توسط پینو در آزمایشگاهی کشت داده شدند. کاردیومیوسیت های H9c2 در محیط اصلاح شده عقاب e Dulbecco (DMEM)/ F12 کشت شدند که حاوی 10 درصد سرم گاو جنین (سیجیگینگ، هانگژو، چین) تحت دمای 37 درجه سانتی گراد و جو 95 درصد هوا و 5 درصد CO بود. سلول ها پس از رشد به 90 درصد به صفحات 6 چاه بذرپاشی شدند، علاوه بر این، یک محیط سرم حاوی ایزوپرنالین 25 uM (ISO) پس از آن جایگزین محیط طبیعی در 3 چاه برای جوجه کشی سلول ها به مدت 48 ساعت به تقلید از حالت HF از HF نیز با فعال شدن بیش از حد تن سمپاتتیک و تحریک گیرنده β آدرنرجی تولید ROS (Velusamy و همکاران 2020) مشخص شد. سپس سلول ها به 6 گروه تقسیم شدند:(i)گروه کنترل؛(ii) محیط کنترل اضافه شده با 25 میکرومتر پینو به مدت 4 ساعت (گروه کنترل+پینو)؛ (i) کنترل متوسط مشترک انکوبه شده توسط 25 میکرومتر پینو و 5 میکرومتر ML385 برای 4 ساعت (مهار کننده Nrf2; MCE, New Jersey, USA)(control+Pino+ML385 group);(iv)ISO group; v.ISO با انکوباسیون 4-h توسط 25 میکرومتر پینو (ISO+Pino group)؛ vi.ISO+25 μM Pino+5 μM ML385 group. غلظت و زمان جوجه کشی داروها به مطالعات قبلی یا دستورالعمل ها اشاره داشت(Jin et al.2015; Oliveira et al.2017).

کشت میوفیبروبلاست های قلبی موش صحرایی نوزادان و بررسی تکثیر

میوفیبروبلاست های قلبی موش صحرایی نوزادان برای بررسی اثرات پینو بر ترشح کلاژن کشت داده شدند. CMFs با استفاده از موش های صحرایی نوزادان 3 روز، با اشاره به روش های نشان داده شده قبلی از هم جدا شدند (Cui و همکاران 2021). قلب جدا شده و چرخ کرده توسط 0.125٪ trypsin هضم شد و به دنبال آن کوکتل حاوی 0.25٪ trypsin و 0.08٪ کلاژناز چند بار، با centrifugation و پیوند به ظرف پتری پس از آن انجام شده برای جمع آوری سلول ها از supernatant. سپس رسانه ها با یک محیط سرم مشابه آن که برای کشت کاردیومیوسیت های H9c2 پس از چسبش 90 دقیقه ای مورد استفاده قرار گرفت، جایگزین شدند. CMFs دفع یکسان به عنوان کسانی که در H9c2 کاردیومیوسیت دریافت کرد. ما همچنین یک کیت شمارش سلول -8 (CCK-8) assay (Dojindo، ژاپن) برای تشخیص تکثیر CMFs در هنگام رسیدن به تراکم 1.5×10 درجه در هر چاه، با بهره برداری از یک خواننده میکروپلیت در طول موج 450 nm، که در آن مقدار بالاتر نشان دهنده فعالیت تکثیر افزوده پیاده سازی شده است.

تشخیص ROS

توانایی پینو در روکش ROS توسط پروب فلورسنت دی هدرواتیدیوم (DHE) اندازه گیری شد. Beyotime, Shanghai, China). DHL که در DMSO حل شد، برای بخش های یخ زده به ۵ میکرومتر رقیق شد یا به محیط سرم اضافه شد تا مطابق با دستورالعمل ها به همان غلظت رقیق شود. قلب های ثابت پارافورمالدهید منجمد شدند و به دنبال آن تا بخش های 4 میکرومتری تکه تکه شدند. بخش ها یا کاردیومیوسیت های H9c2 با محلول DHE به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی گراد با هم انکوبه شدند که پس از آن توسط میکروسکوپ فلورسنت وارونه (IX70؛ IX70) تصویر شد. المپوس، توکیو، ژاپن). به طور خلاصه، هسته ای که با DNA و RNA پر شده بود، به دلیل قرابت بین هسته اسید و DHE به رنگ قرمز متمایز رنگ شد. علاوه بر این، شدت فلورسانس قوی تر نشان دهنده تجمع بیشتر ROS بود.

معاینات بیوشیمیایی

معاینات بیوشیمیایی برای بررسی تغییرات BNP سرم، SOD و مالون دی آلدهید (MDA) در سوپرناتانت سرم و سلولی انجام شد که به ترتیب نشان دهنده فنوتیپ HF و دفاع اکسیدانی بود. غلظت با استفاده از کیت های سنجش بیوشیمیایی مربوطه با توجه به دستورالعمل تولید کننده (Jiancheng، نانجینگ، چین) اندازه گیری شد.

این مقاله از چن و همکاران مول Med (2021) 27:100 استخراج شده است https://doi.org/10.1186/s10020-021-00363-7