آسیب پودوسیت از طریق تعامل بین Tlr8 و لیگاند درون زا MiR-21 آن در کلیه انسدادی و جانبی آن

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com/ واتساپ: 008618081934791

اختلال نعوظ cistanche مربوط به کلیه

در حالی که بیماری مزمن کلیه در بزرگسالان شایع است، نفروپاتی انسدادی (ON) در بیماران جوان و مسن گزارش شده است. در ON، ضایعات توبولو بینابینی (TILs) به طور گسترده مورد بررسی قرار گرفته است، اما ضایعات گلومرولی (GLs) تا حد زیادی نادیده گرفته شده است. در اینجا، ما یک مکانیسم جدید زیربنای توسعه GL در ON در موش‌های جوان و پیر را نشان می‌دهیم. TILها زودتر از GLها به دلیل نفوذ سلولهای التهابی در توبولواینترستیتوم ایجاد می شوند، اما GLها به دنبال فعال شدن گیرنده Toll مانند 8 (Tlr8) حتی با وجود عدم وجود سلولهای التهابی که به گلومرول نفوذ می کنند، ایجاد می شوند. پروتئین‌های TLR8 و اینترلوکین 1 بتا (IL1b) با نشانگرهای کاهش‌دهنده عملکرد پودوسیت (PFMs) کلوکالیزه می‌شوند، که نشان‌دهنده فعال شدن سیگنال‌دهی TLR8 در پودوسیت‌های آسیب‌دیده است. علاوه بر این، سطح گلومرولی و سرمی miR{7}}، یک لیگاند درون‌زا برای Tlr8، در مدل موش ON بالاتر از کنترل شم بود. بیان گلومرولی Tlr8 با miR{10}} و سیتوکین های پایین دست Il1b و Il6 همبستگی مثبت دارد و با PFMs (Nphs1 و Synpo) همبستگی منفی دارد. ما همچنین کولوکالیزاسیون پروتئین‌های TLR8 و IL1b را با کاهش PFM در هر دو انسداد و انسداد نشان می‌دهیم.وثیقهکلیه هاموش های پیر و جوان علاوه بر این، نتایج مطالعه آزمایشگاهی بیانگر بیان بالاتر Tlr8 و سیتوکین های پایین دست آن در گلومرول های انسدادی بود.کلیه هاپس از درمان با miR{0}} نسبت به گروه شاهد. در نتیجه، بیان بیش از حد Tlr8 ممکن است به عنوان یک مکانیسم قابل قبول در زمینه توسعه GL در ON از طریق آسیب پودوسیت عمل کند.

کلمات کلیدی: بیماری مزمن کلیهنفروپاتی انسدادی، پودوسیت، TLR8، کلیه انسدادی و جانبی

مقدمه

بیماری مزمن کلیه (CKD)یک نگرانی عمده برای سلامت عمومی، در 8 تا 13 درصد از جمعیت عمومی شایع است (1). به دلیل پیری جامعه در افراد مسن شایع است. نفروپاتی انسدادی (ON) مورد توجه پزشکان است، زیرا در بیماران از گروه های سنی مختلف گزارش شده است. ON بر خلاف سایر CKD ها قابل درمان و برگشت پذیر است (2، 3). در کودکان، در یکی از 1500 جوان رخ می‌دهد و شیوع آن در کشورهای توسعه‌یافته به 1-5 درصد می‌رسد (4، 5). در بزرگسالان، شیوع ON از 5 در 1000 تا 5 در 10000 نفر متغیر است. علاوه بر این، شیوع ON مزمن یک طرفه تقریباً 0.5 درصد است، در حالی که ON حاد یک طرفه و مزمن دو طرفه تقریباً 0.1 درصد است (4-7).

ON می تواند منجر به آسیب حاد کلیه یا CKD شود که شامل کاهش تدریجی عملکرد کلیه و تغییرات در ساختار کلیوی است که بیش از 3 ماه طول می کشد (8، 9). انسداد یک طرفه حالب (UUO) یک استراتژی پرکاربرد برای مطالعه ON مزمن است. ON در کلیه UUO با هیپرتروفی، هیدرونفروز، به کارگیری سلول های التهابی در ناحیه بینابینی، مرگ سلول های لوله ای در اثر هیپوکسی، و رسوب کلاژن در توبولو اینترستیتیوم و به دنبال آن ایجاد فیبروز توبولو بینابینی (TF) مشخص می شود (10).

TF یکی از ویژگی های مهم بیماری کلیوی در مرحله پایانی و یک عامل تعیین کننده اصلی آسیب پیشرونده کلیه است (11). TF به طور گسترده در مدل‌های ON بررسی شده است، اما داده‌های مربوط به آسیب گلومرولی، به‌ویژه ناهنجاری‌های سد خونی ادراری (BUB) کمیاب است (8، 9، 12). علاوه بر این، مطالعات ضایعات توبولو بینابینی (TILs) را در کلیه جانبی در ON یک طرفه بررسی کرده‌اند، اما ضایعات گلومرولی (GLs) تا حد زیادی نادیده گرفته شده‌اند (12). چندین گزارش دخالت مویرگ های اطراف لوله را در پیشرفت TIL ها در ON تجربی نشان داده اند (13، 14). با این حال، گلومرول و مویرگ گلومرولی به ترتیب به بخش های لوله ای نفرون و مویرگ های اطراف لوله تخلیه می شوند. بنابراین، ما پیشنهاد می کنیم که گلومرولونفریت ممکن است بر توبولو اینترستیتیوم نیز تأثیر بگذارد. مطالعات قبلی ما سهم آسیب سلول‌های ذاتی گلومرولی، عمدتاً پودوسیت‌ها، به GL و توسعه متعاقب آن TIL را در یک مدل موش بیماری خودایمنی به دلیل بیان بیش از حد گیرنده‌های مختلف Toll مانند (TLRs) برجسته کرده‌اند (15-18).

اندوتلیوم مویرگی گلومرولی و پودوسیت ها دروازه بان های مهمی هستند که BUB ها را تشکیل می دهند. بین این دو اپیتلیوم، پودوسیت ها به دلیل مکان یابی منحصر به فرد خود در گلومرول ها، به طور مداوم در معرض سیگنال های خطر، از جمله لیگاندهای TLR مانند الگوهای مولکولی مرتبط با خطر (DAMPs) یا الگوهای مولکولی مرتبط با پاتوژن (PAMPs) قرار می گیرند (15). بنابراین، تصور می‌شود که تعامل بین TLRs در پودوسیت‌ها و لیگاندهای درون‌زای آن‌ها به آسیب سلولی در شرایط غیرعفونی کمک می‌کند. در مطالعه حاضر، ما بر توسعه GL در کلیه‌های انسدادی و جانبی موش‌های پیر و جوان تمرکز کردیم، زیرا ON اغلب در انسان‌های جوان و مسن‌تر یافت می‌شود. ما روشن کردیم که GL در ON به دلیل آسیب سلولی از طریق بیان بیش از حد Tlr8 در سلول‌های پادوسیت از کلیه‌های انسدادی و جانبی موش‌های جوان و پیر ایجاد شد.

مواد و روش ها

بیانیه اخلاقی و اسکان حیوانات تجربی همه آزمایش‌ها با استفاده از حیوانات آزمایشگاهی توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی دانشکده دامپزشکی دانشگاه هوکایدو تأیید شد (شماره تأییدیه 16- 0124). نویسندگان از راهنمای تایید شده مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه هوکایدو، دانشکده دامپزشکی (تأیید شده توسط انجمن ارزیابی و اعتباربخشی بین المللی مراقبت از حیوانات آزمایشگاهی) پیروی کردند. موش های شش هفته ای C57BL/6N از Japan SLC Inc. (Hamamatsu، ژاپن) خریداری شدند و در شرایط خاص عاری از پاتوژن در یک محیط نور تاریک 1:1 نگهداری شدند. به حیوانات آزمایشی به صورت آزاد غذا و آب آشامیدنی ارائه شد.

طراحی تجربی ما از موش های جوان (9 هفته) و پیر (12 ماه) استفاده کردیم. موش‌ها از هر گروه سنی (n=4) تحت عمل شم (گروه شاهد) یا UUO (2، 7، 11 و 21 روز) قرار گرفتند تا کلیه مدل ON را ایجاد کنند، همانطور که در مطالعه قبلی ما توضیح داده شد. (13).

آماده سازی نمونه موش ها با مخلوطی از عوامل بیهوش کننده همانطور که قبلاً توضیح داده شد (16) عمیقاً بیهوش شدند و با دررفتگی دهانه رحم کشته شدند. نمونه های خون از طریق شریان فمورال برای تجزیه و تحلیل نشانگر سرم جمع آوری شد. کلیه های UUO و جانبی جمع آوری و به برش های نازک برش داده شدند. برش های کلیه با 10 درصد فرمالین بافر خنثی (NBF)، 4 درصد پارافورمالدئید (PFA) و 2.5 درصد گلوتارآلدئید (GTA) به ترتیب برای مطالعات هیستوپاتولوژیک، ایمونوهیستوشیمی و میکروسکوپ الکترونی تثبیت شدند.

بلوک های پارافین ثابت با NBF ایمونوهیستوشیمی و ایمونوفلورسانس به ضخامت 2 میلی متر بریده شدند و با اسید پریودیک شیف-هماتوکسیلین (PAS-H) رنگ آمیزی شدند تا هیستوپاتولوژی کلیه بررسی شود. شناسایی نشانگرهای سلولی همانطور که قبلاً گزارش شده بود (16) برای سلول های B (B220)، سلول های T (CD3)، اندوتلیوم مویرگی (CD31)، IL1b، ماکروفاژها (Iba1)، پودوسیت ها (پودوسین و سیناپتوپودین)، و TLR8 انجام شد. شرایط رنگ آمیزی در جدول 1 ذکر شده است.

هیستوپلانمتری PAS-H و مقاطع کلیه رنگ‌آمیزی شده با استفاده از Nano Zoomer 2 به اسلایدهای مجازی تبدیل شدند.{2}} RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japan). با استفاده از نرم افزار NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) سلول های مثبت از 20 گلومرول یا 20 کانون به طور تصادفی از توبولو اینترستیتیوم با بزرگنمایی 400 برابر شمارش شدند. تصاویر 20 گلومرول از مقاطع رنگ آمیزی شده با PAS-H نیز با 400x از هر موش با استفاده از یک میکروسکوپ فلورسانس All-in-One BZ-X710 (Keyence، اوزاکا، ژاپن) گرفته شد. ناحیه و اندازه مزانژیال گلومرولی از تصاویر گرفته شده با استفاده از آنالایزر BZ-X (Keyence) اندازه گیری شد.

جداسازی گلومرول برای استخراج و کشت RNA گلومرول ها از کلیه های شم و UUO همانطور که قبلاً توضیح داده شد جدا شدند (16). به طور خلاصه، موش ها عمیقاً بیهوش شدند و با 40 میلی لیتر محلول نمک متعادل هنک (HBSS) حاوی Dynabeads (8 × 107؛ Life Technologies، Carlsbad، CA، USA) از طریق بطن چپ پرفیوژن شدند. کلیه برداشته شد

و به قطعات کوچک خرد کنید. سپس سلول ها با کلاژناز A (1 میلی گرم در میلی لیتر؛ روش، بازل، سوئیس) و دئوکسی ریبونوکلئاز I (100 واحد بر میلی لیتر؛ Life Technologies) در HBSS در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه هضم شدند. سوسپانسیون حاوی بافت هضم شده به آرامی از طریق یک صافی سلولی 100- میلی متری (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) با استفاده از یک حشره مسطح فشار داده شد. سوسپانسیون سلولی حاصل در 200 × گرم به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و گلوله سلولی مجدداً در 2 میلی لیتر HBSS معلق شد. گلومرول های حاوی Dynabeads با استفاده از یک متمرکز کننده ذرات مغناطیسی (Life Technologies) جمع آوری و برای جداسازی RNA مورد استفاده قرار گرفتند.

رونویسی معکوس و Real-Time PCRRNA کل با استفاده از کیت RNeasy (Qiagen، Hilden، آلمان) از گلومرول ها جدا شد. cDNA از RNA کل با رونویسی معکوس با استفاده از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japan) و پرایمرهای تصادفی dT (Promega) سنتز شد. cDNA در PCR بلادرنگ با ترکیب اصلی Brilliant III SYBR Green QPCR و Mx3000P (Agilent Technologies، La Jolla، CA، USA) استفاده شد. بیان ژن گلومرولی به بیان Actb نرمال شد. جفت پرایمرهای استفاده شده در جدول 2 نشان داده شده است.

رونویسی معکوس و PCR زمان واقعی مبتنی بر TaqManRNA کل، از جمله microRNA (miRNA) در گلومرول های جدا شده، با استفاده از کیت miRNeasy (Qiagen) جدا شد. آغازگرهای RT حلقه ساقه اختصاصی miRNA، رونوشت معکوس، بافر رونویسی معکوس، dNTPs و مهارکننده RNase برای رونویسی معکوس RNA کل طبق دستورالعمل سازنده (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) استفاده شد. PCR بلادرنگ با cDNA حاصل با استفاده از پرایمرهای TaqMan و پروب‌های خاص miR{3}} (Applied Biosystems)، TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) و Mx3000P (تکنولوژی‌های Agilent) انجام شد.

درمان در شرایط آزمایشگاهی گلومرول های جدا شده با میمیکگلومرول ها از شم عمل شده و UUO جدا شدندکلیه هاپس از 11 روز انسداد محیط کشت Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) (Fujifilm Wako، ژاپن) حاوی 300 گلومرول در هر چاهک 96-صفحه کشت چاهی (TPP، Trasadingen، سوئیس) و تحت درمان با PBS، کنترل منفی و miR{5}} (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer، Daejeon، کره جنوبی) در 1 pmol/μL به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه در 5 درصد CO2. بیان Tlr8 و سیتوکین های پایین دست آن همانطور که در بخش قبل توضیح داده شد اندازه گیری شد.

میکروسکوپ الکترونی روبشیبرای میکروسکوپ الکترونی روبشی معمولی (SEM)، کوچککلیه برش هابا 2.5 درصد GTA به مدت 4 ساعت و پس از تثبیت با 1 درصد تتروکسید اسمیم به مدت 1 ساعت، و سپس تیمار با 1 درصد اسید تانیک به مدت 1 ساعت تثبیت شدند. نمونه‌ها سپس با 1 درصد تتروکسید اسمیم به مدت 1 ساعت تثبیت شدند و به ترتیب با 0.5 درصد و تانیک اسید 1 درصد به‌مدت 10 دقیقه و 1 ساعت تیمار شدند.کلیهبرش هابا درجات صعودی الکل آبگیری شدند، به 3-متیل بوتیل استات منتقل شدند و در نهایت با خشک کن نقطه بحرانی HCP خشک شدند (هیتاچی، توکیو، ژاپن). نمونه ها تحت کندوپاش یونی قرار گرفتند و سپس در زیر میکروسکوپ الکترونی روبشی S{2}} با ولتاژ تسریع شده 12 کیلو ولت بررسی شدند.

تحلیل آماریمقادیر به صورت میانگین ± خطای استاندارد (se) بیان می شوند. نتایج با استفاده از آزمون ناپارامتری Mann-Whitney U-test مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت (P < 0.05).="" از="" آزمون="" کروسکال-والیس="" برای="" مقایسه="" سه="" یا="" چند="" جمعیت="" استفاده="" شد="" و="" پس="" از="" مشاهده="" تفاوت‌های="" معنی‌دار،="" مقایسه‌های="" چندگانه="" با="" استفاده="" از="" روش="" شفه="" انجام="" شد="" (05/0="">< 0).="" همبستگی="" بین="" دو="" پارامتر="" با="" استفاده="" از="" آزمون="" ضریب="" همبستگی="" رتبه="" ای="" اسپیرمن="" مورد="" تجزیه="" و="" تحلیل="" قرار="" گرفت="" (05/0=""> P).

نتایج

TIL ها و GL ها در کلیه های مسدود موش های جوانما ابتدا TILs و GLs را در کلیه‌های شم و UUO موش‌های جوان که برای دوره‌های زمانی مختلف در معرض انسداد قرار داشتند، بررسی کردیم. در حالی که کلیه‌های تحت عمل جراحی توبولواینترستیتیوم طبیعی را نشان دادند (شکل 1A)، کلیه‌های انسدادی پس از 2 روز UUO TIL را نشان دادند و با گشاد شدن لوله‌ها مشخص شدند. برخی از لوله ها نیز حاوی گچ ادراری بودند. چنین ضایعاتی با پیشرفت انسداد افزایش می یابد (شکل 1A). GLs، به طور عمده گلومرولواسکلروز، در مرحله آخر در 21 روز پس از UUO مشاهده شد و با رسوب مواد پریودیک اسید شیف (PAS) مثبت مشخص شد. ساختار گلومرولی هم در کلیه های شم و هم در کلیه های اولیه UUO (2، 7 و 11 روز) طبیعی بود (شکل 1B). تعداد سلول‌های گلومرولی تا روز بعد از انسداد افزایش می‌یابد و در روز{13} در کلیه‌های UUO کاهش می‌یابد (شکل 1C). تجمع مزانژیال گلومرولی از 7 روز پس از انسداد افزایش می یابد (شکل 1D).

در 21 روز پس از انسداد در مرکز گلومرول کلیه های UUO وجود نداشت (شکل 1F). واکنش زنجیره ای پلیمراز کاهش قابل توجهی در PFMs (Nphs1 و Synpo) در کلیه های UUO 21 روز پس از انسداد نشان داد (شکل 1G). علاوه بر این، تجزیه و تحلیل SEM فرآیندهای طبیعی پا پودوسیت (PFPs) را در کلیه‌های شم نشان داد. با این حال، 21 روز پس از انسداد، حذف PFP و ساختارهای میکروویلو مانند در کلیه های UUO گزارش شد (شکل 1H). این نتایج روی هم نشان می‌دهد که 21 روز پس از انسداد، آسیب پودوسیت در کلیه انسدادی وجود دارد.

سلول های ایمنی نفوذی در کلیه انسدادی وجود ندارند ما قبلا نشان داده ایم که آسیب سلولی با سلول های ایمنی نفوذی در گلومرول ارتباط دارد (13، 16، 18). بنابراین، ما نفوذ سلول‌های B و T و همچنین ماکروفاژها در TILs و GL کلیه‌های شم و UUO را بررسی کردیم (شکل 2). تعداد زیادی سلول B، T و ماکروفاژهای نفوذی در TILهای کلیه های UUO در تمام روزهای پس از انسداد مشاهده شد، اما آنها تقریباً در گلومرول های کلیه های شم و UUO وجود نداشتند یا کم بودند (شکل 2A-E). تعداد سلول های B، T و ماکروفاژها در گلومرول بسیار کم بود (داده ها نشان داده نشده است) اما به طور قابل توجهی در گلومرول ها بیشتر بود.

توبولواینترستیتیوم کلیه های 2-، 7-، 11- و 21-روزه در مقایسه با کلیه های ساختگی (شکل 2F). بنابراین، نفوذ سلول های ایمنی ممکن است به توسعه TILs در کلیه انسداد کمک کند. با این حال، عوامل دیگری ممکن است با توسعه GL مرتبط باشند.

بیان اعضای مختلف خانواده TLR و سایتوکاین‌های پایین‌دست در کلیه‌های تحت عمل و انسداد موش‌های جوان مطالعات قبلی بیان بیشتری از TLR‌های مختلف را در سلول‌های پادوسیت کلیه‌های بیمار نشان داده‌اند (15، 16، 19، 20). جالب توجه است، داده‌های ما بیانگر به‌طور قابل‌توجهی بالاتری از Tlr8 و Tlr9 در گلومرول‌های جدا شده از گروه روز UUO نسبت به گلومرول‌های گروه شم را نشان داد (شکل 3A). علاوه بر این، ما بیان سایتوکاین‌های پایین‌دستی اعضای خانواده TLR را در گلومرول‌های گروه‌های شم و UUO 21-روز بررسی کردیم و یک دگرگونی قابل‌توجه در بیان ژن‌های کدکننده اینترلوکین 1 بتا (Il1b) و اینترلوکین 6 یافتیم. (Il6) در گروه UUO در مقایسه با گروه شم (شکل 3B).

TLR8 همزمان با PFM موضعی شد، از آنجایی که بیان Tlr8 و Tlr9 در گلومرول‌های جدا شده از کلیه انسدادی بالا بود، ما محلی‌سازی آنها را با رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس بررسی کردیم. پروتئین TLR8 در کلیه‌های تحت عمل شم شناسایی نشد (شکل 4A) اما با سیناپتوپودین PFM در کلیه UUO کلوکالیزه شد (شکل 4B). علاوه بر این، ما نتوانستیم بیان پروتئین TLR9 را در کلیه از موش‌های شمع یا UUO تشخیص دهیم (داده‌ها نشان داده نشده است).

تولید IL1b از پودوسیت ها در کلیه مسدود شده موش های جوان همانطور که در شکل 3B نشان داده شده است، بیان Il1b گلومرولی (سیتوکین پایین دستی از خانواده TLR) در کلیه UUO در 21 روز به طور قابل توجهی بیشتر از کلیه ساختگی بود. بنابراین، ما منبع IL1b در گلومرول کلیه‌های UUO را با رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس بررسی کردیم. بیان پروتئین IL1b در گلومرول کلیه های ساختگی مشاهده نشد اما در گلومرول کلیه های UUO مشاهده شد (شکل 4C، D). علاوه بر این، IL1b با پودوسین PFM کلوکالیزه شد (شکل 4D).

در UUOکلیهدر 21 روز از آن در شمکلیهبنابراین، ما منبع IL1b در گلومرول کلیه‌های UUO را با رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس بررسی کردیم. بیان پروتئین IL1b در گلومرول های شم مشاهده نشدکلیه هااما در گلومرول UUO مشاهده شدکلیه ها(شکل 4C، D). علاوه بر این، IL1b با پودوسین PFM کلوکالیزه شد (شکل 4D).

افزایش سطح لیگاند درون زا Tlr8 در موش های مدل ON مطالعه قبلی نشان داد که miR{1}} به عنوان لیگاند برای TLR8 عمل می کند (21). بنابراین، ما هر دو سطح گلومرولی و سرمی miR-21 را بین گروه‌های شم و UUO 21-روز مقایسه کردیم. جالب توجه است که گروه روز UUO به طور قابل توجهی سطوح miR گلومرولی-21 بالاتری نسبت به گروه شم نشان داد (05/0 < {0)،="" با="" این="" حال،="" تمایل="" فزاینده="" mir="" سرم{="" {10}}="" در="" گروه="" قبلی="" نسبت="" به="" گروه="" دوم="" مشاهده="" شد="" (p="0.06)" (شکل="">

همبستگی بیان Tlr8 با لیگاند miR-21 و PFMهای آن در انسدادکلیههمانطور که در جدول 3 نشان داده شده است، ما یک همبستگی مثبت معنادار بین بیان گلومرولی mRNA Tlr8 و لیگاند درون زا آن (miR{2}}) و همچنین سایتوکین های پایین دست Il1b و Il6 مشاهده کردیم. از سوی دیگر، یک همبستگی منفی بین mRNA Tlr8 و PFMs Nphs1 و Synpo مشهود بود.

تحریک in vitro گلومرول ها با miR{{0}} Mimic بیان Tlr8 و سیتوکین های پایین دست آن را فعال می کند بیان Tlr8 تمایل به افزایش داشت (P=0.06) اما سیتوکین های پایین دست آن (Ifng و Il1b) به طور قابل توجهی (05/0 و 01/0 P <) در گلومرول موش های شم افزایش یافت.

درمان با تقلید miR-21 در مقایسه با گلومرول‌های موش‌های تحت درمان با PBS و تقلید کنترل منفی (شکل 5A). با این حال، هیچ ارتباط معنی‌داری بین بیان Tlr8 و سیتوکین‌های پایین دست آن در گلومرول‌های موش‌های شم پس از درمان با میمیک‌ها مشاهده نشد (جدول 4). بیان Tlr8 و سیتوکین های پایین دست آن به طور قابل توجهی در گلومرول UUO بالاتر بود.کلیه ها، به دنبال درمان با miR{0}} تقلید از موارد موجود در گلومرول UUOکلیه هاتحت درمان با PBS و تقلید کنترل منفی (شکل 5B). ارتباط معنی‌داری بین بیان Tlr8 و سایتوکاین‌های پایین‌دست آن در گلومرول‌های کلیه‌های UUO پس از درمان با میمیک‌ها تشخیص داده شد که نشان‌دهنده فعال‌سازی بیشتر مسیر Tlr{2}}فاکتور هسته‌ای واسطه‌شده کاپا B (NF-kB) و ترشح سیتوکین های پیش التهابی در کلیه انسدادی (جدول 4).

محلی سازی TLR8 و آسیب پودوسیت در کلیه های جانبی موش های جوانکلیه‌های تحت عمل شم گلومرول طبیعی را نشان دادند، در حالی که کلیه‌های جانبی دارای هیپرتروفی گلومرولی، افزایش تعداد سلول‌های گلومرولی و اتساع مویرگ‌های گلومرولی بودند (شکل 6A). گلومرول های کلیه های تحت عمل شم برای بیان سیناپتوپودین مثبت بودند و فاقد بیان TLR8 بودند (شکل 6B). از سوی دیگر، کلیه های جانبی بیان سیناپتوپودین را در مرکز گلومرول ها از دست دادند اما بیان TLR8 را در امتداد سرعت گلومرولی نشان دادند (شکل 6C). علاوه بر این، پروتئین TLR8 با سیناپتوپودین هم‌زمان موضعی شد (شکل 6C). کلیه های تحت عمل شم بیان طبیعی پودوسین را نشان دادند اما بیان IL1b را در گلومرول ها نشان ندادند (شکل 6D). با این حال، گلومرول‌های داخل کلیه جانبی بیان پودوسین را در مرکز از دست دادند اما بیان IL1b را در امتداد سرعت گلومرولی داشتند (شکل 6E). علاوه بر این، پروتئین IL1b با پودوسین کلوکالیزه شد (شکل 6E). تجزیه و تحلیل SEM PFP های طبیعی را در کلیه های موش تحت عمل شم نشان داد، اما PFP effacement و ساختارهای میکروویل مانند در کلیه های جانبی قابل مشاهده بودند (شکل 6F).

محلی سازی TLR8 و آسیب پودوسیت در کلیه های انسدادی و جانبی موش های مسنکلیه های تحت عمل شم بیان طبیعی سیناپتوپودین را نشان دادند اما هیچ رنگ آمیزی برای پروتئین TLR8 در گلومرول های خود نشان ندادند (شکل 7A). جالب توجه است که کلیه های جانبی و UUO بیان سیناپتوپودین را در مرکز گلومرول ها از دست دادند اما بیان TLR8 را در امتداد رته گلومرولی حفظ کردند (شکل 7B، C). پروتئین TLR8 با سیناپتوپودین در کلیه‌های جانبی و UUO کلوکالیزه شد (شکل‌های 7B، C). کلیه های تحت عمل شم به طور مشابه بیان طبیعی پودوسین را نشان دادند اما هیچ بیان IL1b در گلومرول های خود نداشتند (شکل 7D). از سوی دیگر، کلیه های جانبی و UUO بیان پودوسین را در مرکز گلومرول ها از دست دادند، اما بیان IL1b را در امتداد رته گلومرولی نشان دادند (شکل 7E، F). رنگ‌آمیزی مثبت با پودوسین در گلومرول‌های کلیه‌های جانبی و UUO کلوکالیزه می‌شود (شکل‌های 7E، F). بررسی SEM PFP های طبیعی را در کلیه های موش تحت عمل شم، لایه برداری PFP و ساختارهای شبیه میکروویلوس در کلیه های جانبی و UUO موش های پیر نشان داد (شکل 7G).

بحثبر

شیوع در نوزادان و همچنین در افراد مسن (4-7) شایع است. از این رو، ما موش‌های پیر و جوان را در معرض UUO قرار دادیم تا شرایط ON افراد گروه‌های سنی مختلف را تقلید کنیم و TILs و GLs را بررسی کردیم. در کلیه انسداد، پیشرفت TILs در مرحله اولیه انسداد (2 روز) مشهود بود. با این حال، پیشرفت GLs همراه با آسیب podocyte در مرحله بعد مشاهده شد. کلیه جانبی GLs و آسیب پودوسیت را همزمان نشان داد. این مشاهدات نشان می‌دهد که آسیب پودوسیت هم در کلیه‌های انسدادی و هم در کلیه‌های جانبی رخ می‌دهد، اگرچه آسیب اولیه ممکن است متفاوت باشد. مطالعات قبلی ما ارتباط بین آسیب پودوسیت و نفوذ سلول های ایمنی در گلومرول را برجسته کرده است (13، 16، 18). با این حال، انفیلتراسیون سلول های ایمنی به گلومرول کلیه های شم یا انسداد در مطالعه حاضر مشاهده نشد. بنابراین، ما دخالت سایر عوامل را در آسیب پودوسیت در کلیه انسداد در نظر گرفتیم. ما فرض کردیم که سیگنال‌های خطر (DAMPs یا PAMP) که منشأ گردش خون دارند یا از اپیتلیوم لوله‌ای آسیب‌دیده ناشی می‌شوند، ممکن است به دلیل مکان منحصر به فرد آن در گلومرول، به آسیب سلول‌های پودوسیت در ON کمک کنند. نکته مهم، نشان داده شده است که تعامل بین DAMPs و TLRs نقش مهمی در پاتوژنز بیماری های غیر عفونی ایفا می کند (15). اعضای مختلف خانواده TLR بر روی غشای پلاسمایی سلولی یا وزیکول‌های درون سلولی بیان می‌شوند (22) و به‌عنوان حسگرهای ایمنی ذاتی مشخص می‌شوند که به طور موثر DAMP یا PAMP را تشخیص می‌دهند. پس از فعال شدن توسط DAMP یا PAMP مربوطه، TLR ها بیان سایتوکاین های پایین دست را از طریق مسیر NF-kB افزایش دادند و سیستم دفاعی میزبان را القا کردند (22). علاوه بر این، DAMP ها حضور آسیب بافتی را به سلول های ایمنی یا سلول های ذاتی محلی منتقل می کنند و در نتیجه آسیب بافت را تشدید می کنند (23-26). نکته مهم، تمام TLR ها مسیر NF-kB را فعال می کنند که بیان مجموعه ای از ژن های سیتوکین التهابی را کنترل می کند (27). علاوه بر این، فعال شدن TLRها مسیرهای پایین دست آنها را برای فعال کردن NF-kB، که مسئول التهاب است و با پاتوژنز بافت های آسیب دیده مرتبط است، سیگنال می دهد (28). شیچیتا و همکاران فعل و انفعالات پاتولوژیک بین لیگاندهای درون زا و TLR2 یا TLR4 را نشان داد که به آسیب مغزی ایسکمیک کمک می کند (25). مطالعات قبلی همچنین توانایی اعضای خانواده TLR را برای القای TILs در کلیه (TLR2، 4، 5، 7، و 11) و GLs (TLR1-6، 8، و 9) نشان داده اند (17، 29-33). ). در مطالعه حاضر، آسیب پودوسیت را در کلیه های انسدادی و جانبی پیدا کردیم و آن را روشن کردیم

نقش اعضای مختلف خانواده TLR که ممکن است در آسیب پودوسیت نقش داشته باشد (15، 16، 19، 20). همانطور که ما فرض کردیم، بیان گلومرولی Tlr8 و Tlr9 در گلومرول‌های جدا شده از کلیه UUO نسبت به موش‌های تحت عمل شم بالاتر بود. علاوه بر این، بیان گلومرولی سیتوکین های التهابی مربوط به مسیر NF-kB، از جمله Il1b و Il6، در کلیه UUO در 21 روز پس از انسداد بیشتر بود. بنابراین، به این نتیجه رسیدیم که مسیر NF-kB با واسطه TLR نقش مهمی در پاتوژنز GL در کلیه انسدادی ایفا می کند. برخلاف سایر اعضای خانواده TLR، TLR8 و TLR9 در اندوزوم سلول ها شناسایی می شوند. TLR8 RNA های تک رشته ای و RNA های دو رشته ای کوتاه را از میکروارگانیسم ها تشخیص می دهد و تولید چندین سایتوکین با واسطه NF-kB را فعال می کند (22). از سوی دیگر، TLR9 DNA های دو رشته ای را تشخیص می دهد و مسیر NF-kB را برای تولید سیتوکین های پایین دست فعال می کند (16، 34). در این مطالعه، ما تنها colocalization پروتئین TLR8 همراه با سیناپتوپودین PFM در گلومرول ها را شناسایی کردیم. مطالعات قبلی ما همچنین نشان داده‌اند که هر دو TLR8 و TLR9 با PFMها کلوکالیزه می‌شوند و تولید سیتوکین‌های التهابی با واسطه NF-kB را فعال می‌کنند تا آسیب پودوسیت را القا کنند (15، 16). علاوه بر این، مطالعات دیگر همبستگی پاتولوژیک بین مسیرهای با واسطه TLR و آسیب سلولی در شرایط آزمایشگاهی را نشان داده‌اند (34، 35). بناس و همکاران برهمکنش TLR4 در پودوسیت ها با سیستم ایمنی در طول توسعه GL را نشان داد (35). بنابراین، پودوسیت ها ممکن است از طریق مسیرهای با واسطه TLR به نظارت ایمنی کمک کنند. در این مطالعه، هم بیان ژن TLR8 و هم محلی‌سازی پروتئین را در پودوسیت‌های کلیه انسدادی و همچنین بیان بالاتر سیتوکین‌های پایین‌دست در گلومرول را نشان دادیم. بنابراین، نتیجه می‌گیریم که مسیرهای واسطه‌شده TLR{40}}از طریق آسیب سلولی در کلیه انسداد به توسعه GL کمک می‌کنند.

مطالعه قبلی نشان داد که miR{0}}، یک لیگاند درون‌زای TLR8، می‌تواند به TLR8 در آندوزوم‌های سلولی برسد و به آن متصل شود، که در آن می‌تواند فعال‌سازی با واسطه TLR مسیر NFkB و ترشح سیتوکین‌های پیش التهابی را القا کند. (21). در مطالعه حاضر، ما سطوح بالاتری از miR گلومرولی-21 و همچنین سطوح بالای miR{6}} سرم را در کلیه UUO نسبت به گروه کنترل ساختگی پیدا کردیم و ارتباط آن را با بیان گلومرولی Tlr8 نشان دادیم. . جالب توجه است که گلومرول‌های کلیه‌های UUO تحت درمان با mimic miR{8}} بیان بالاتری از Tlr8 و سایتوکاین‌های پایین‌دست آن را در مقایسه با گلومرول‌های موش‌های شم که با miR{10}} درمان شده بودند، نشان دادند که نشان‌دهنده افزایش در دسترس بودن miR درون‌زا است. -21 از بافت‌های آسیب‌دیده در کلیه انسدادی و فعال‌سازی بیان بیش از حد Tlr8 در کلیه‌های UUO در مقایسه با یک شم. با هم، نتیجه می‌گیریم که حجم بالاتری از miR{13}} در کلیه انسدادی به اندوزوم‌های پودوسیت‌ها می‌رسد و باعث فعال‌سازی واسطه‌ای مسیر NF-kB و ترشح سیتوکین‌های پیش التهابی با Tlr{14}}می‌شود. این سیتوکین ها به نوبه خود در توسعه GL از طریق آسیب پودوسیت شرکت می کنند.

IL1b یکی از سایتوکین های مهم پایین دست مسیر NF-kB است که عمدتاً توسط سلول های پادوسیت در گلومرول در شرایط بیماری تولید می شود. مطالعات قبلی نشان داده‌اند که IL1b با کاهش PFM باعث آسیب سلول‌های بدن می‌شود (36، 37). در مطالعه حاضر، ما بیان گلومرولی Il1b و کلوکالیزه شدن آن با PFM را نشان دادیم که بیان کاهش یافته را نشان داد. علاوه بر این، بیان گلومرولی Il1b با Tlr8 ارتباط داشت و تمایل به ارتباط با بیان PFMs (Nphs1 و Synpo) داشت. بنابراین، این نتایج نشان می دهد که عوامل پایین دست Tlr8، از جمله Il1b و Il6، ممکن است با کاهش بیان PFM باعث آسیب پودوسیت در کلیه انسداد شده شوند.

کلیه‌های جانبی موش‌های جوان نیز GL و از دست دادن PFM را نشان دادند. این نتیجه توسط SEM تایید شد که آسیب پودوسیت را در کلیه جانبی نشان داد. ما همچنین سطوح بالاتری از miR{0}} سرم را در مدل ماوس ON پیدا کردیم. علاوه بر این، پروتئین IL1b با PFM هم موضعی شد. این نتایج نشان می‌دهد که miR{3}} سرم با TLR8 در پودوسیت‌های کلیه جانبی تعامل می‌کند و تولید سیتوکین‌های پایین‌دستی را فعال می‌کند که به نوبه خود عملکرد پودوسیت و آسیب پودوسیت را کاهش می‌دهد. آسیب پودوسیت نیز در کلیه های انسدادی و جانبی موش های پیر از طریق مکانیسمی مشابه آنچه در موش های جوان مشاهده شد مشاهده شد.

در نتیجه (شکل 8)، بیان گلومرولی miR-21 به دنبال انسداد یک طرفه حالب افزایش می‌یابد، که در آن با TLR8 در پودوسیت‌ها تعامل می‌کند و باعث تولید سایتوکین‌های پایین‌دست (Il1b و Il6) می‌شود که نشان دهنده فعال شدن مسیر NF-kB است. سطوح بالاتر سیتوکین ها باعث کاهش PFM می شود که منجر به آسیب سلولی و متعاقب آن ایجاد GL می شود. افزایش سطح سرمی miR{6}} TLR8 را در سلولهای پادوسیت کلیه جانبی فعال می کند و GLها را از طریق آسیب سلولی القاء می کند. بنابراین، این مطالعه به وضوح توسعه GL را در کلیه‌های انسدادی و جانبی از طریق آسیب سلولی بدن به دنبال بیان بیش از حد Tlr8 نشان می‌دهد.