آموزش ترس قبلی، جذب سریع خاطرات ترس جدید را مستقیماً در شبکه‌های قشر مغز امکان‌پذیر می‌سازد.

طراحی تجربی

تکرارپذیری داده ها با تکرارهای مختلف ارزیابی شد (جدول S1). اولین آزمایش‌های غیرفعال‌سازی CNQX در Te2 (شکل 1A-1C) در تعداد تکرار بیشتری انجام شد، زیرا آنها اولین آزمایش‌هایی بودند که ما انجام دادیم و برای آزمایش فرضیه اصلی مطالعه‌مان خدمت کردند. حیوانات به طور پیشینی به گروه های رفتاری مختلف به شیوه ای متعادل از وزن اختصاص داده شدند. حیوانات نر از یک نوزاد به طور تصادفی به هر گروه آزمایشی تقسیم شدند. ما ابتدا به فرضیه اصلی مطالعه خود پرداختیم، به عنوان مثال، غیرفعال شدن قشر مغز ممکن است به طور متفاوتی بر تثبیت یک حافظه ترس جدید در موش‌های آزمایشگاهی ساده و در حیواناتی که یک رویداد ترس قبلی را یاد گرفته‌اند، تأثیر بگذارد.

حیوانات نر حافظه بسیار قوی دارند زیرا غریزه بقا و تمایل قوی تری برای تولید مثل دارند. حیواناتی که در طبیعت زنده می مانند باید اطلاعات جغرافیایی زیادی، انواع غذا، ردپای شکارچیان و مکان اعضای گروه را به خاطر بسپارند تا بهتر با محیط سازگار شوند و از زندگی محافظت کنند.

به عنوان مثال، شیرهای نر باید وضعیت کل قلمرو، روابط عضویت و مکان رقبا را برای محافظت از قلمرو و وضعیت خود به خاطر بسپارند. گورخرهای نر برای زنده ماندن و تولید مثل باید محل منابع آب و غذا در علفزار را به خاطر بسپارند. یک شرکت نوشابه‌سازی آگهی‌ای را منتشر کرد که نشان می‌داد یک خرس قطبی نر می‌تواند یک غواص و عطر منحصر به فردش را به خاطر بیاورد تا دفعه بعد که او را دیدند، او را شناسایی کند.

بنابراین، حیوانات نر باید از نظر حفاظت از قلمرو خود، تهیه غذای کافی و تولید مثل فرزندان، حافظه قوی داشته باشند. این همچنین آنها را به موضوعات مهمی در تحقیقات انسانی تبدیل می کند، به عنوان مثال، برای کشف بیماری هایی مانند اختلال حافظه و بیماری آلزایمر.

در دنیای انسان ها نیز می توانیم از خاطره حیوانات نر الهام بگیریم. قرار گرفتن مداوم در معرض چیزهای جدید، یادگیری مداوم و تفکر می تواند حافظه و سازگاری ما را تقویت کند و استانداردهای زندگی و کارایی ما را بهبود بخشد. بنابراین، بیایید از حیوانات نر بیاموزیم، به جمع آوری دانش و تجربه ادامه دهیم، غرایز قوی بقا و تمایلات باروری داشته باشیم و آینده ای بهتر بسازیم. مشاهده می شود که باید حافظه خود را تقویت کنیم. Cistanche deserticola می تواند به طور قابل توجهی حافظه را بهبود بخشد زیرا Cistanche deserticola یک ماده دارویی سنتی چینی با اثرات منحصر به فرد بسیاری است که یکی از آنها بهبود حافظه است. اثربخشی گوشت چرخ کرده از ترکیبات فعال مختلفی که شامل اسید، پلی ساکاریدها، فلاونوئیدها و غیره است، ناشی می شود. این مواد می توانند به طرق مختلف سلامت مغز را تقویت کنند.

روی روش های بهبود عملکرد مغز کلیک کنید

در صورت وجود اختلاف آماری بین این گروه‌ها، در نهایت گروه‌های کنترل اضافی را از طریق تزریق سالین انجام دادیم. رویکرد مشابهی برای آزمایش‌های اپتوژنتیکی اعمال شد، که در آن گروه کنترل AAV تنها پس از تشخیص تفاوت‌های آماری بین موش‌های ساده و قبلاً آموزش دیده انجام شد. این برنامه‌های آزمایشی به ما امکان می‌داد از گروه‌های کنترل غیرضروری و استفاده از حیوانات غیرضروری اجتناب کنیم، موضوعی کلیدی در قوانین اروپایی و ایتالیایی در مورد آزمایش‌های حیوانی (اصل 3 Rs).

رویه های رفتاری

تمام آزمایش ها در فاز نوری روز (8 صبح تا 4 بعد از ظهر) انجام شد. حیوانات به طور جداگانه از مرکز به اتاق های آزمایشی در سطل های شفاف کوچک مختلف بسته به نیازهای آزمایشی منتقل شدند.

آموزش شنوایی: اولین جلسه رفتاری. حیوانات دارای ترس شنوایی (CS{1}}CS2). در این گروه، موش‌ها به آرامی از قفس خانه‌شان خارج شدند و از اتاق مسکن به اتاق عایق صدا منتقل شدند. هنگامی که در آنجا، حیوانات در داخل دستگاه تهویه متشکل از یک قفس سیاه و سفید مستطیلی (35 × 40 سانتی متر) مجهز به شبکه میله های فولادی ضد زنگ (قطر 1 سانتی متر، با فاصله 1.5 سانتی متر از هم) متصل به یک دستگاه ضربه گیر قرار گرفتند.

موش ها به مدت 1 دقیقه بدون مزاحمت رها شدند. پس از این زمان، 7 محرک شرطی (CSs) متشکل از یک تن خالص فرکانس 15 کیلوهرتز (هر کدام 15 ثانیه مدت، 8{7}} دسی بل، فاصله آزمایشی 36 ثانیه) اجرا شد. 1 ثانیه آخر هر تن با یک US دردناک (0.5 میلی آمپر، 1 ثانیه) جفت شد. در پایان جلسه تهویه، موش ها به قفس خانه خود بازگردانده شدند.

حیوانات فقط شوک (shock-CS2). در این گروه، موش ها به طور مشابه در داخل دستگاه تهویه یکسان قرار گرفتند. بلافاصله پس از آن، هر موش بلافاصله پس از دیگری تحت 7-شوک پا (1 ثانیه، 0.5 میلی آمپر) قرار گرفت. در پایان تحریک، حیوانات به قفس خانه خود بازگردانده شدند. ماندگاری زمانی در قفس تهویه کمتر از 9 ثانیه بود. مطالعات قبلی نشان داد که این روش امکان اجتناب از فرآیندهای ارتباطی بین محرک های دردناک و محرک های حسی را فراهم می کند [29،30].

حیوانات دارای ترس بو (بوی-CS2). در این گروه، موش‌ها در داخل همان قفس مستطیلی مشکی استفاده شده در گروه‌های آزمایشی فوق قرار داده شدند و به یک دستگاه تحویل شوک متصل شدند. موش ها به مدت 2 دقیقه بدون مزاحمت رها شدند. پس از این زمان، 7 CS متشکل از بوی وانیل (10 s مدت زمان هر یک، فاصله آزمایشی 24 ثانیه) تجویز شد. 1 ثانیه آخر هر بو با یک US دردناک (0.5 میلی آمپر، 1 ثانیه) جفت شد. ماژول تهویه در نزدیکی یک منبع تهویه قرار داده شد تا از تداوم محرک های تحویلی پس از جبران آنها جلوگیری شود. قفس با یک شبکه بالایی تضمین شد. بوها با استفاده از یک بویایی سنج جریان-رقت ارائه شد. هوای تمیز (1.5 لیتر در دقیقه) به یک شیر برقی هدایت می‌شود که هنگام کار، هوا را به یک بطری 15 میلی‌لیتری حاوی 10 میلی‌لیتر بوی وانیل منتقل می‌کند.

حیوانات فقط تن (Tone-CS2). موش‌های این گروه در داخل همان قفس سیاه قرار گرفتند و با صدای 15- کیلوهرتز (7 محرک، مدت زمان 15 ثانیه، 36 ثانیه ITI) در غیاب ایالات متحده ارائه شدند.

حیوانات از قبل در معرض (Tone-CS1-CS2). موش‌ها در داخل قفس تهویه‌کننده قرار گرفتند و 1 دقیقه بعد، 20 بار با صدای 15- کیلوهرتز به تنهایی ارائه شدند، و 24 ساعت بعد همان تن با ایالات متحده که به CS1 تبدیل شد جفت شد.

حیواناتی که دارای ترس با صدای سفید هستند (WN-CS2). در این گروه، موش‌ها داخل قفس سیاه مستطیل شکل قرار گرفتند و به مدت 1 دقیقه بدون مزاحمت رها شدند. پس از این زمان، 7 CS متشکل از یک WN (مدت هر 15 ثانیه، 75 دسی‌بل، فاصله بین آزمایش‌ها 36 ثانیه) تجویز شد. 1 ثانیه آخر هر تن با یک US دردناک جفت شد (0.5 میلی آمپر، 1 ثانیه). در پایان جلسه تهویه، موش ها به قفس خانه خود بازگردانده شدند.

یادگیری ترس شنیداری: آموزش رفتاری دوم. دو هفته پس از رویه‌هایی که در پاراگراف بالا توضیح داده شد، حیوانات در یکی دیگر از وظایف شرطی‌سازی ترس شنوایی متفاوت آموزش دیدند. موش‌ها مانند کار قبلی ما [10] در یک جعبه اسکنر استاندارد قرار داده شدند و به مدت 2 دقیقه بدون مزاحمت رها شدند. پس از این زمان، 7 CS شامل تون های خالص فرکانس 3 کیلوهرتز (هر کدام 8 ثانیه مدت، 80 دسی بل، فاصله بین آزمایشی 22 ثانیه) تحویل داده شد. 1 ثانیه آخر هر تن با یک US دردناک (0.5 میلی آمپر، 1 ثانیه) جفت شد. در پایان جلسه تهویه، موش ها به قفس خانه خود بازگردانده شدند.

ترس از حفظ حافظه حفظ حافظه ترس شنوایی که اخیراً در CS2 (3 کیلوهرتز) به دست آمده بود، 4 روز بعد آزمایش شد. برای آزمایشات اپتوژنتیک، آزمایش حافظه اخیر با تحویل لیزر 24 ساعت پس از یادگیری CS{4}}ایالات متحده در قیاس با فاصله زمانی که در آن غیرفعال سازی قشر مغز از طریق تجویز CNQX انجام شد (یعنی 24 ساعت پس از آن) انجام شد. آموزش). موش‌ها به دستگاهی متفاوت از دستگاهی که برای شرطی‌سازی استفاده می‌شود عادت کردند و در اتاقی متفاوت قرار گرفتند تا از رفتار ترس شرطی به نشانه‌های زمینه‌ای اجتناب کنند [10،62].

دستگاه جدید متشکل از یک قفس پلاستیکی شفاف با یک طرف رنگ‌آمیزی مشکی بود که در داخل یک جعبه تضعیف صدا مجهز به یک فن خروجی قرار داشت که هوای بدبو را از محفظه حذف می‌کرد و صدای پس‌زمینه 60 دسی‌بل را ایجاد می‌کرد. حیوانات در طول جلسه عادت دادن به حیوانات اجازه یافتند تا روزی 5 دقیقه در قفس کاوش کنند. در روز آزمون حفظ حافظه ترس، پس از 2 دقیقه کاوش رایگان، ما 4 CS2 از 3 کیلوهرتز (8 ثانیه تا 22 ITI) تحویل دادیم که هیچ ایالات متحده آن را دنبال نکرد.

در صورت نیاز آزمایشی، موش‌ها برای حفظ حافظه ترس از راه دور، که 2 هفته قبل از دومین آزمایش شرطی کردن ترس شنوایی به دست آمد، مورد آزمایش قرار گرفتند. برای این منظور، 7 روز پس از آزمون حفظ حافظه ترس با صدای 3-کیلوهرتز، حیوانات در یک محیط جدید (یک قفس راه راه سیاه و سفید) قرار گرفتند و سپس با صدای 15- کیلوهرتز ارائه شدند. چهار تن در فواصل 36 ثانیه ارائه شد.

آموزش متنی: اولین جلسه رفتاری. گروه شرطی سازی ترس زمینه ای (CtxA-CtxB). در این گروه، موش‌ها به آرامی از قفس خانه‌شان خارج شدند، در سطل قرار گرفتند و از اتاق مسکن به اتاق عایق صدا منتقل شدند. هنگامی که آنجا، حیوانات در داخل دستگاه تهویه متشکل از قفس مستطیلی مشکی فوق الذکر، مجهز به شبکه میله های فولادی ضد زنگ متصل به یک راه اندازی شوک قرار گرفتند. موش ها به مدت 1 دقیقه بدون مزاحمت رها شدند. پس از این زمان، 5 US (0.5 میلی آمپر، 1 ثانیه) با فواصل زمانی 51 ثانیه تجویز شد. در پایان جلسه، حیوانات به قفس خانه خود بازگردانده شدند.

گروه فقط شوک (shock-CtxB). موش‌ها، پس از قرار گرفتن در داخل دستگاه تهویه‌کننده، بلافاصله یکی پس از دیگری 5-شوک پا (1 ثانیه، 0.5 میلی آمپر) دریافت کردند. ماندگاری زمانی در قفس تهویه کمتر از 7 ثانیه بود. مطالعات قبلی نشان داد که این روش امکان اجتناب از فرآیندهای ارتباطی بین محرک های دردناک و محرک های حسی را فراهم می کند [29،30].

گروه فقط شوک (shock-CtxB). موش‌ها، پس از قرار گرفتن در داخل دستگاه تهویه‌کننده، بلافاصله یکی پس از دیگری 5-شوک پا (1 ثانیه، 0.5 میلی آمپر) دریافت کردند. ماندگاری زمانی در قفس تهویه کمتر از 7 ثانیه بود. مطالعات قبلی نشان داد که این روش امکان اجتناب از فرآیندهای ارتباطی بین محرک های دردناک و محرک های حسی را فراهم می کند [29،30].

شرطی سازی ترس زمینه ای جدید و حفظ حافظه ترس اخیر دو هفته پس از روش‌هایی که در پاراگراف بالا توضیح داده شد، به همه گروه‌ها آموزش داده شد تا یک محیط متنی جدید (ماژول جعبه اسکینر، قرار داده شده در اتاقی متفاوت) با یک US دردناک (0.5 میلی آمپر، 1 ثانیه) . هر حیوان در داخل اتاقک جدید قرار داده شد و به مدت 2 دقیقه بدون مزاحمت رها شد. سپس در معرض 5 US جدا شده با فواصل 30 ثانیه قرار گرفت.

حفظ حافظه ترس متنی 4 روز پس از روش شرطی سازی ترس با قرار دادن مجدد موش ها در محفظه جعبه اسکینر به مدت 3 دقیقه مورد آزمایش قرار گرفت. برای آزمایشات اپتوژنتیک، آزمایش حافظه اخیر با تحویل لیزر 24 ساعت پس از یادگیری CtxB-US در قیاس با فاصله زمانی که در آن غیرفعال سازی قشر مغز از طریق تجویز CNQX انجام شد (یعنی 24 ساعت پس از آموزش) انجام شد. در صورت نیاز آزمایشی، موش ها برای حفظ حافظه ترس از راه دور با قرار دادن حیوانات در زمینه جفت شده در ایالات متحده 2 هفته قبل از انجمن جدید آزمایش شدند.

حیوانات در 2 سطل مختلف به اتاق های تهویه با توجه به روش های مختلف زمینه ای حمل شدند.

اندازه گیری انجماد. در تمام روش‌های تجربی، ارزیابی احتباس حافظه ترس به عنوان یک پاسخ انجماد [10] تعیین شد که به‌عنوان فقدان کامل تحرک جسمانی به جز حرکات تنفسی تحلیل شد. برای هر حیوان، مدت زمان (بر حسب ثانیه) صرف شده در انجماد توسط 2 ناظر مستقل که برای گروه های حیوانی کور شده بودند به صورت آفلاین اندازه گیری شد.

روش های جراحی

برای تجویز مواد انتخابی در محل‌های هدف، موش‌ها با ایزوفلوران بیهوش شدند: القای 4% [vol/vol] در 2 L/min هوای پزشکی انجام شد و تا نوردهی مداوم در 2% [vol/vol] گسترش یافت. هنگامی که موش ها در دستگاه استریوتاکسیک سوار شدند.

برشی روی جمجمه ایجاد شد و سوراخ‌های سوراخ کوچکی ایجاد شد تا امکان نفوذ سوزن تزریق 28-گیج فراهم شود. یک 10- سرنگ ul Hamilton نصب شده بر روی یک پمپ تزریق برای تحویل مواد استفاده شد. پس از تزریق، سوزن به مدت 3 دقیقه دیگر در جای خود باقی ماند. سپس برش را با گیره‌های زخم از جنس استنلس استیل بستند و به حیوان تزریق زیر جلدی کتوپروفن ضددرد/ضد التهاب (2 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن) داده شد و حیوان تا زمان بهبودی از بیهوشی گرم و تحت نظر نگه داشته شد.

همانطور که در مطالعات قبلی [10،32-34]، کانولاسیون حیوانات غیر ضروری بود، با ترکیبات فعال که مستقیماً به صورت استریوتاکسی تجویز می شدند. این روش سودمند است زیرا از ترومای جراحی ذاتی روش کانولاسیون دائمی اجتناب می شود، بنابراین تروما را به یک نفوذ سوزن محدود می کند [10،32-34]. در واقع، بیهوشی عمومی به طور قابل توجهی بر تثبیت حافظه تأثیر نمی گذارد [10،32-34]. برای اطمینان از اینکه زمان تجویز ترکیبات مربوط به کارآزمایی یادگیری دقیق است به طوری که موش ها ترکیبات انتخابی را حدود 1 ساعت و حدود 1 روز پس از تمرین دریافت کردند، بیهوشی ایزوفلوران 5 دقیقه قبل از زمان تزریق برنامه ریزی شده، به عنوان مثال، در 55 سالگی القا شد. دقیقه در موش‌ها 60 دقیقه پس از تمرین و 23 ساعت و 55 دقیقه در حیوانات تزریق شده در 24 ساعت پس از تمرین. هر موش تهویه شده و سپس به طور جداگانه عمل شد. حیوانات متعلق به گروه‌های رفتاری مختلف به روشی درهم‌تنیده دستکاری شدند.

مهارکننده انتخابی گیرنده های گلوتامات AMPA/کائینات CNQX ({{0}}سیانو-7-نیتروکینوکسالین-2،3-دیون) (Tocris, 10 ng) /ul) [2{16}}،21] در محلول نمکی استریل (NaCl، 0.9%) حل شد و با HCl به pH 7.4 تنظیم شد. مهارکننده سنتز پروتئین آنیزومایسین (Merck، 125 ug/ul) در HCl هم مولار حل شد، با سالین استریل رقیق شد و با NaOH به PH 7.4 تنظیم شد. سالین استریل (0.9 درصد NaCl) به عنوان کنترل وسیله نقلیه استفاده شد. این مواد به صورت دوطرفه با سرعت 0.1 ul/min و حجم 0.5 ul در هر محل در مختصات استریوتاکسیک زیر که از Paxinos و Watson اطلس [26] گرفته شده بود، با میدان قشر Te2 به اطلس Zilles [25] تزریق شدند:

قشر شنوایی ثانویه (Te2): 1) AP: -5،8 L: ± 7،2 DV: -6. 2) AP: -6، 8 L: ± 7،2 DV: -6.

قشر کمربندی قدامی (ACC): 1) AP: +2، 5 L: ±0، 6 DV: -2،2. 2) AP: +3،7 L: ±0،6 DV: -2،2.

حجم تزریق ({0}}.5 ul در هر محل) بر اساس مطالعات قبلی که در آن ترکیبات فعال در Te2 [10،34] و ACC [55،63] در موش‌های صحرایی بالغ تزریق شد، انتخاب شد.

برای غیرفعال کردن هیپوکامپ پشتی، ترکیبات فعال با حجم 0.6 ul در هر محل در مختصات استریوتاکسی زیر تزریق شد:

هیپوکامپ پشتی: 1) AP: -2،8 L: ±1،6 DV: -3،3. 2) AP: -4،2 L: ± 2،6 DV: -3.

ضایعات برگشت ناپذیر هیپوکامپ پشتی با تجویز NMDA (Tocris، 18 ug/ul، محلول در محلول سالین استریل، 0،4 ul در هر محل) با سرعت 0.1 ul/ ایجاد شد. دقیقه در نقاط مختصات فوق. همان مختصات برای گروه شاهد تزریق شده با نمک و حیوانات شم استفاده شد.

رتروبیدهای قرمز (Lumafluor، رقت 1:2 در سالین، 0.6 ul) در BLA با توجه به مختصات زیر تزریق شد: AP: -2.8. L: ± 5.4; DV: -8.3.

در پایان آزمایش‌ها، مسیرهای سوزنی در مورد تزریق‌های CNQX، آنیزوماسین یا سالین یا گسترش ضایعات در مورد تزریق NMDA از نظر بافت‌شناسی تأیید شد. موش‌ها عمیقاً بیهوش شدند و با فرمالدئید 4 درصد به صورت داخل قلب پرفیوژن شدند. مغز آنها در 30 میکرومتر بر روی یک کرایوستات برش داده شد. مقاطع سریال رنگ آمیزی شده با Nissl با استفاده از روش مرسوم تهیه شد و مقاطع از نظر بافت شناسی زیر میکروسکوپ بزرگنمایی شده در 2.5× تأیید شدند.

آزمایشات اپتوژنتیک

تزریق ویروس ویروس مرتبط با آدنو AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-گیلاس و ناقل کنترل AAV5:CaMKII -cherry از دانشگاه کارولینای شمالی وکتور هسته (چپل هیل، کارولینای شمالی، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. این جمله Viraltiterwas5:8 تیتر ویروسی 5.8 × 10^12 vg/ml برای هر دو ویروس بود. استفاده از پروموتر CaMKII بیان ترانس ژن را به نفع نورون های هرمی قادر می سازد. ویروس‌ها در فریزر 8-0 درجه سانتیگراد قرار گرفتند. تزریق‌های ویروسی که Te2 یا ACC را هدف قرار می‌دهند در مختصات استریوتاکسی بالا در حجم 0.5 ul برای هر سوراخ انجام شد. ویروس با سرعت 0.1 ul/min تزریق شد و سوزن به مدت 5 دقیقه دیگر در جای خود باقی ماند. تزریق ویروس 4 هفته قبل از آزمایش اپتوژنتیک انجام شد.

روشنایی.

فیبرهای نوری (Plexon، هسته 200/230 میکرومتر، طول 10 میلی متر) به صورت دو طرفه در BLA (AP=2.8-، L=± 5.4، V=-8.2 میلی متر) کاشته شدند. از برگما). مهار اپتوژنتیکی برآمدگی‌های Te2 به BLA یا پیش‌بینی‌های ACC به BLA با استفاده از سیستم تحریک اپتوژنتیک PlexBright همراه با دیود لیزر (تکنولوژی‌های لیزرگلو) به دست آمد. نور زرد (589 نانومتر) تولید شده و از یک فیبر نوری عبور می کند. چگالی توان تخمین زده شده در نوک فیبر نوری 10 تا 15 مگاوات برای روشنایی مکان های برآمدگی بود. در طول حفظ حافظه ترس، تابش نور 4 ثانیه قبل از شروع تون آغاز شد، در سراسر تن ادامه داشت، و 4 ثانیه پس از تنظیم تن متوقف شد. حیوانات متعلق به گروه‌های شرطی‌سازی ترس متنی در طول کل کاوش زمینه (3 دقیقه) تحریک نور دریافت کردند. موش ها به مدت 2 روز قبل از آزمایش حفظ حافظه با پچ کورد آشنا شدند.

ایمونوهیستوشیمی. پس از اتمام آزمایش‌های اپتوژنتیک، موش‌ها عمیقاً بیهوش شدند و برای بررسی انتشار ویروس به صورت داخل قلب با 4% PAF پرفیوژن شدند. مغزها تشریح شد، یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد و در نهایت به ساکارز 30 درصد منتقل شد. مقاطع تاج (30 میکرومتر) بر روی یک کرایوستات برش داده شد و در PBS جمع آوری شد. بخش های شناور آزاد در محلول مسدود کننده به مدت 1 ساعت در RT انکوبه شدند. سپس در محلول مسدودکننده به مدت یک شب در RT در آنتی بادی مونوکلونال اولیه موش ضد mCherry (رقت 1:500، Abcam) انکوبه شدند. پس از آن، بخش ها با PBS شسته شدند و به مدت 1 ساعت در RT با آنتی بادی ضد موش AlexaFluor{9}} فلورسنت ثانویه (1:600، Invitrogen) رقیق شده در PBS انکوبه شدند. مقاطع در PBS شسته شدند، با محیط های نصب حاوی DAPI (بردار) سوار شدند و روکش ها لیز شدند.

مغز موش هایی که تحت تزریق NMDA قرار گرفتند به طور مشابه جمع آوری شد. بخش‌های شناور آزاد، پس از چندین بار شستشو، با آنتی‌بادی مونوکلونال مونوکلونال اولیه ضد نیون (1:1،{4}} رقت، مرک) در محلول مسدودکننده در طول شب در دمای اتاق انکوبه شدند. پس از آن، بخش ها با PBS شسته شدند و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق با آنتی بادی ضد موش اسب بیوتینیله (1:2{13}}0 رقت، وکتور) انکوبه شدند. کمپلکس آویدین-بیوتین (کمپلکس ABC 1:100، وکتور، 2 ساعت و نیم انکوباسیون) به دی آمینو بنزیدین (0.03٪، مرک) برای رنگ آمیزی نیون کوپل شد. سپس بخش ها در PBS شسته شده و به لام های پوشش داده شده با ژلاتین منتقل شدند، آبگیری شدند و با یک ورقه پوششی پوشانده شدند.

بخش‌های Te2 از موش‌های تزریق شده با مهره‌های یکپارچهسازی با سیستمعامل تحت انکوباسیون با آنتی‌بادی ضد فاس خرگوش پلی کلونال اولیه (1:2،{5}}، سیگنالینگ سلولی) در محلول مسدودکننده در طول شب در RT قرار گرفتند. متعاقباً، برش‌ها با PBS شسته شدند و به مدت 1 ساعت در RT با ضد خرگوش Alexa 488 (1:1،{11}}، Invitrogen، در PBS) انکوبه شدند. در نهایت، بخش‌های نشاندار شده با ایمنی در PBS شسته شدند، روی لام‌های پوشش‌داده‌شده با ژلاتین نصب شدند و با یک محیط نصب تکمیل‌شده با DAPI پوشانده شدند.

میکروسکوپی

برچسب‌گذاری mCherry با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال Zeiss Airyscan مورد بررسی قرار گرفت: از دو لیزر (4{11}}5 و 561 نانومتر) استفاده شد که هر کدام مربوط به طیف اوج انتشار برای DAPI (رنگ‌آمیزی Nissl برای هسته‌های سلولی) و Alexa 568 (mCherry) بود. )، به ترتیب. برای تجزیه و تحلیل انتشار ویروس در محل های تزریق، میکروگراف های Te2 و ACC به عنوان تصاویر موزاییکی به دست آمد (هر تک با استفاده از یک هدف 10 × به دست آمد). پایانه‌های آکسون در BLA با استفاده از یک هدف 40× به عنوان یک پشته z از 10 بخش، با فاصله 1 میکرومتر از هم (159 میکرومتر مربع؛ کسر زوم، 1.0) تجزیه و تحلیل شدند.

برای حیواناتی که با رتروبید تزریق شده بودند و تحت برچسب‌گذاری cFos قرار گرفتند، تصاویر با بزرگنمایی 4{4}}× (مربع 159 میکرومتر؛ کسر بزرگنمایی، 1.0) با 3 لیزر مختلف، مربوط به طیف انتشار اوج گرفته شد. به ترتیب برای DAPI (رنگ‌آمیزی Nissl برای هسته‌های سلول)، AlexaFluor 488 (cFos) و Texas Red (Retrobeads). بخش های 0.7 میکرومتر در امتداد یک پشته Z 10- میکرومتر به دست آمد. تعداد هسته‌های بیان‌کننده cFos، با مهره‌ها، و دو مثبت (مجوره‌های cFos+ نشان‌دار) برای هر حیوان در ناحیه Te2 در مختصات قدامی خلفی از 6.7 تا 7.3 میلی‌متر از برگما اندازه‌گیری شد [10]. سپس داده‌ها برای تولید میانگین هر حیوان به‌طور میانگین محاسبه شد و نتایج به صورت آماری با هم مقایسه شدند. تصاویر مقاطع با رنگ‌آمیزی DAB Neun با استفاده از نرم‌افزار Neurolucida متصل به میکروسکوپ از طریق یک دوربین CCD رنگی [10] تجزیه و تحلیل شد.

تجزیه و تحلیل داده ها و معیارهای خروج

n برای هر گروه بر اساس مطالعات قبلی ما [10،16،17]، کارهایی که قبلاً در این زمینه منتشر شده بود (به عنوان مراجع برای ACC [6،22،55] و Te2 [10،59] مراجعه کنید)، پیش از این تعیین شد. و از طریق برآوردهای G-power مطابق جدول زیر (جدول 1):

برای هر تجزیه و تحلیل، ما میانگین نهایی تعداد 8 تا 10 حیوان را برای هر گروه برآورد کردیم. گروه ها با کنترل های داخلی در همان جلسه آزمایشی اجرا شدند (جدول S1). با توجه به تنوع روش‌های جراحی و رفتاری، تعداد بیشتری از آزمودنی‌های تجربی (تا 15 درصد بیشتر) را که در برخی موارد معیارهای آزمایشی را برآورده می‌کردند و شامل می‌شدند، به‌طور پیشینی وارد کردیم، بنابراین از حذف خودسرانه اجتناب کردیم. در مورد مطالعات هیپوکامپ، برای ارزیابی اثرات تزریق‌های NMDA و CNQX در فواصل زمانی مشخص، ما تعداد کل حیوانات کنترل را بین موش‌هایی که با وسیله نقلیه و شم عمل می‌کردند در بین گروه‌های مختلف متعادل کردیم.

تجزیه و تحلیل رفتاری، بازرسی‌های بافت‌شناسی و شمارش سلولی کورکورانه انجام شد. حیوانات با محلی سازی ناکافی مسیر سوزن یا ضایعه در مورد ضایعات برگشت ناپذیر NMDA از تجزیه و تحلیل داده ها حذف شدند (جدول S1). در مطالعات فارماکولوژیک، ما 57 حیوان را در مجموع 465 حیوان به دلیل قرار دادن نادرست سوزن حذف کردیم (22/255 برای Te2، 31/179 برای ACC، و 4/31 برای هیپوکامپ). در مطالعات ردیابی، بر روی 21 حیوان، ما 3 مورد را که در آن‌ها تزریق دانه‌های رتروبید BLA را از دست داده بودند، حذف کردیم. در مطالعات اپتوژنتیک Te2، در مجموع 30 حیوان، 1 موش را حذف کردیم، زیرا محل قرارگیری فیبرهای نوری بالای ناحیه هدف، 1 موش صحرایی نبود. به هر حال، ویروس در Te2 و 2 موش وجود نداشت زیرا انتشار ویروس به ترتیب کمتر از 4.7٪ و 5.3٪ از ناحیه Te2 در محل های تزریق بود. در موش های وارد شده در تجزیه و تحلیل آماری، حداقل انتشار ویروس 39.6٪ در مختصات استریوتاکسی قدامی و 50.2٪ در مختصات استریوتاکسی خلفی تر بود.

به طور مشابه، در آزمایش‌های اپتوژنتیک ACC، در مجموع 32 حیوان، 2 موش از بین رفتند زیرا قرارگیری فیبرهای نوری بالاتر از ناحیه هدف نبود. دو موش به دلیل وجود نداشتن ویروس در ACC، 1 حیوان به دلیل وجود ویروس در قشر حرکتی ثانویه مجاور، و 1 موش به دلیل انتشار ویروس کمتر از 2.3٪ از ناحیه ACC در محل‌های تزریق حذف شدند. در موش های باقی مانده، حداقل انتشار ویروس 33.3٪ در مختصات استریوتاکسی قدامی و 42.2٪ در مختصات خلفی تر بود.

در مطالعات ضایعات NMDA، ضایعات عمدتاً ناحیه CA1 هیپوکامپ پشتی را هدف قرار می‌دهند. حداقل (قرمز) و حداکثر گسترش (صورتی) ضایعات هیپوکامپ در کل ناحیه هیپوکامپ پشتی به ترتیب 23.2% و 53.5% در مختصات استریوتاکسی قدامی و 28.3% و 62.3% در مختصات خلفی تر بود. در مجموع از 73 حیوان، 4 موش به دلیل وجود نداشتن ضایعه حذف شدند، در حالی که 3 حیوان دیگر دور انداخته شدند زیرا گسترش ضایعات کمتر از 5 بود.{13}}% (یعنی 4.8%, 4.3%, 3.1 %) مربوط به ناحیه هیپوکامپ در 2 مختصات.

تجزیه و تحلیل کانتور ناحیه از طریق بازرسی بصری و کمی سازی دستی با استفاده از ابزار ناحیه-کانتور نرم افزار ZEN 3 انجام شد.{2}}. سپس مقادیر مساحت در کل مساحت منطقه نرمال شد. مختصات استریوتاکسیک Te2، ACC و هیپوکامپ بر اساس اطلس Paxinos [26] و در مورد Te2، با میدان قشر به اطلس Zilles [25] ارجاع شده است.

تحلیل آماری

تمام داده ها به صورت میانگین ± SEM ارائه می شوند. همه داده ها با آزمون Levene برای برابری واریانس ها رد شدند. بنابراین، آمار پارامتریک در تمام آزمایش‌ها به کار گرفته شد. داده‌های 2 گروه با استفاده از آزمون‌های t-paired Student 2-تست مقایسه شدند. مقایسه‌های چند گروهی با استفاده از آزمون ANOVA راهنما با آزمون تعقیبی توکی مورد ارزیابی قرار گرفت. برای پرداختن به تفاوت‌های بین گروه‌ها و درون گروه‌ها، ما یک مدل ANOVA با طرح ترکیبی 3×2 را با یک گروه (CS{8}}CS2، Tone-CS1-CS2، WN-CS2) به عنوان بین- محاسبه کردیم. متغیر موضوع و شرط (قبل و بعد از شرطی سازی اخیر + تزریق) به عنوان متغیر درون آزمودنی ها. در جایی که تعامل گروه × شرط معنادار بود، ما یک تحلیل اثرات اصلی ساده انجام دادیم و هر p-value را با اصلاح بونفرونی تنظیم کردیم. برای هر مدل ANOVA مختلط، ما فرض کرویت را از طریق تست کرویت Mauchly ارزیابی کردیم.

پارامترهای آماری (یعنی مقدار دقیق n برای هر گروه، SEM، آزمون آماری، اندازه اثر و مقدار دقیق p) در افسانه ها گزارش شده است. برای اندازه‌های نمونه مساوی، اندازه‌های اثر برای آزمون‌های t جفت‌نشده با محاسبه d کوهن یا d گلس با توجه به شباهت SDs در حالی که، برای اندازه‌های نمونه مختلف، Hedges'g تعیین شد. همبستگی بین تعداد سلول و انجماد با استفاده از ضریب پیرسون محاسبه شد. برای تعیین اینکه آیا داده‌ها مفروضات رویکرد آماری را برآورده می‌کنند، فرضیه صفر را در سطح 05.05 < 0 رد کردیم. تمام تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از SPSS Statistics 22 (IBM) انجام شد.

اطلاعات پشتیبانی

S1 شکل. بزرگنمایی مسیرهای سوزن Te2 (A) و قشر ACC (B) تزریق شده با CNQX، به عنوان نمونه انتخاب شده است. (C) هنگامی که 2 هفته پس از عمل با همان زمینه نشان داده شد، حیوانات فقط شوک پاسخ ترس پایینی را نشان دادند، که نشان می‌دهد این روش باعث انجماد شرطی در زمینه‌ای که شوک داده شده است، نیست. (د) نتایج مشابهی مانند شکل 1 با متعادل کردن 2 تن به کار رفته به عنوان CS (CS1، 3 کیلوهرتز و CS2، 15 کیلوهرتز) به دست آمد (تست دانشجویی، t(14)=3}.44، p {{ 13}}.0040، Glass's d=4.14). (E) در موش‌های تهویه‌شده با بو-CS، انجماد به بو، 2 هفته پس از تهویه، بالا بود، حتی اگر در یک محیط متفاوت در مورد زمینه تهویه آزمایش شود، بنابراین نشان می‌دهد که ترس به طور خاص با این تحویل نشانه مرتبط است. میله های مقیاس، 300 میکرومتر. ��P <0.01. همه داده ها میانگین و SEM هستند. داده های خلاصه برای S1 Fig را می توان در اطلاعات پشتیبان در فایلی به نام S1 Supporting Figure Data پیدا کرد. (TIF)

شکل S2 تزریق CNQX حفظ خاطرات ترس شنوایی اخیر را در موش‌هایی که تعمیم ترس تنها با یک تن قبل از قرار گرفتن در معرض یا با استفاده از صدای نویز سفید به عنوان CS1 کاهش یافت، مختل کرد. ANOVA 3 × 2 mixed-design ANOVA (اثر اصلی گروه: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4، η{12}}. 236، اثر اصلی شرط: F(1،42)=0.161، p=0.691، η{20}}.004، گروه × برهمکنش شرط F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) نشان داد که انجماد تا تون 3 کیلوهرتز قبل از ارتباط آن با ایالات متحده کمتر بود در حیواناتی که تون 15 کیلوهرتز را قبل از جفت شدن 15 کیلوهرتز-آمریکا دریافت کرده‌اند (n=10، p=0.001) یا در موش‌هایی که به نویز سفید (n=13) مشروط شده‌اند. , p=0.008) در مقایسه با حیوانات CS{41} CS2 (n=22) که پاسخ تعمیم ترس متغیری را نشان دادند. با این حال، پس از یادگیری CS-US و تزریق cnqx در قشر Te2، حافظه ترس اخیر در همه گروه‌ها مختل شد (05/0p>). اثر اصلی ساده در درون گروه ها (قبل و بعد از یادگیری CS-US به دنبال تزریق cnqx): CS{49}}CS2, p=0.025; Tone-CS{54}}CS2, p=0.189; WN-CS2، p=0.347) �P <0.05، ��P <0.01. همه داده ها میانگین و SEM هستند. داده های خلاصه برای S2 Fig را می توان در اطلاعات پشتیبانی در فایلی با نام S1 Supporting Figure Data پیدا کرد. (TIF)

S3 شکل (الف) نمونه تصادفی تزریق رتروبیدها که BLA را هدف قرار می دهد. (B و C) نمونه هایی از قرارگیری فیبر نوری در بالای BLA حیوانات تزریق شده با وکتورهای AAV در Te2 (B) و قشر ACC (C). میله های مقیاس، 500 میکرومتر.

قدردانی

ما از دکتر E. Manassero برای حمایت و راهنمایی مستمرشان تشکر می کنیم.

مشارکت های نویسنده

مفهوم سازی: جولیا کونسینا، آناماریا رنا، بندیتو ساکتی.

سرپرستی داده ها: جولیا کونسینا، لویزلا میلانو، بندیتو ساکتی.

تحلیل رسمی: جولیا کونسینا، آناماریا رنا، لویزلا میلانو.

جذب سرمایه: جولیا کونسینا، بندیتو ساکتی.

تحقیق: جولیا کونسینا، آناماریا رنا، لویزلا میلانو.

روش شناسی: جولیا کونسینا، آناماریا رنا، لویزلا میلانو.

سرپرست: Benedetto Sacchetti.

اعتبارسنجی: بندیتو ساکتی.

نگارش – پیش نویس اصلی: جولیا کونسینا، بندیتو ساکتی.

نگارش – نقد و ویرایش: آناماریا رنا، لویزلا میلانو.

منابع
1. فرانکلند PW، Bontempi B. سازماندهی خاطرات اخیر و دور. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119-130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. عصب‌شناسی تثبیت‌ها، یا اینکه انگرام چقدر پایدار است؟ Annu Rev Psychol. 2004; 55:51-86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR، Genzel L، Wixted JT، Morris RG. تثبیت حافظه Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. آلوارز پی، اسکوایر ال آر. تثبیت حافظه و لوب تمپورال داخلی: یک مدل شبکه ساده Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041-7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL، McNaughton BL، O'Reilly RC. چرا سیستم های یادگیری مکمل در هیپوکامپ و نئوکورتکس وجود دارد: بینش هایی از موفقیت ها و شکست های مدل های پیوندگرای یادگیری و حافظه. Psychol Rev. 1995; 102:419-457.

For more information:1950477648nn@gmail.com