اثرات حفاظتی و مکانیسم‌های پروسیانیدین‌ها بر بیماری پارکینسون In Vivo و In Vitro قسمت 2

لطفا تماس بگیریدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

2.7. اثرات رایانه های شخصی بر استرس اکسیداتیو گورخرماهی لارا تیمار شده با MPTP

درمان لاروهای گورخرماهی با PC باعث کاهش تشکیل ROS درون سلولی ناشی از MPTP شد (شکل 7a,b). علاوه بر این، نتایج سنجش پراکسیداسیون لیپیدی نشان داد که قرار گرفتن در معرض PC (16 میکروگرم بر میلی‌لیتر) سطوح MDA ناشی از MPTP را در لارو ماهی گورخری مسدود می‌کند (شکل 7c). علاوه بر این، کاهش ناشی از MPTP در فعالیت GSH-Px با درمان PC (شکل 7d) (شکل 7d) معکوس شد و رایانه‌های شخصی (4،8 و 16 میکروگرم بر میلی‌لیتر) کاهش‌های ناشی از MPTP در CAT و SOD را افزایش داد. فعالیت (شکل 7e,f).

Figure 7. Effects of PCs on oxidative stress of zebrafish larvae treated with MPTP. (a)ROS levels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured via imageJ software;(c) MDA levels;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart.The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

خواهشمند است برای آگاهی بیشتر اینجا را کلیک کنید

2.8. اثرات رایانه‌های شخصی بر Nr2/ARE Patlhroay در زبراماهی لاروآ ناشی از MPTP

درمان لارو گورخرماهی با رایانه های شخصی بر این فرض تاکید کرد که فعال شدن مسیرهای Nr2/ARE در خواص حفاظتی با واسطه PC نقش دارد. بیان نشانگرهای Nrf2، HO{3}}، NQO1، GCLC و GCLM در مقایسه با قرار گرفتن در معرض MPTP به تنهایی توسط تیمار PC افزایش یافت (شکل 8a-e).

Figure 8. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPTP-induced zebrafish larvae. (a) Nrf2 levels;(b)HO-1 levels;(c)NQO1 levels;(d) GCLClevels;(e) GCLM levels. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. بحث

رایانه‌های شخصی توانایی مهار رادیکال قوی و فعالیت آنتی‌اکسیدانی را نشان می‌دهند و استرس اکسیداتیو ناشی از تولید بیش از حد ROS یا/و سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانی مختل شده، نقش مهمی در PD دارد[37-39]. با این حال، اینکه رایانه های شخصی می توانند از طریق اثرات آنتی اکسیدانی نقش محافظت کننده عصبی را ایفا کنند، هنوز مشخص نیست. این تحقیق با هدف بررسی مکانیسم مولکولی رایانه های شخصی در برابر مدل های PD القا شده با MPP به علاوه /MPTP انجام شد.

سیستانچ می تواند ایمنی را بهبود بخشد

در این مطالعه، در مقایسه با گروه MPP plus /MPTP-alone، رایانه های شخصی به طور قابل توجهی سطح فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی (از جمله GSH-Px، CAT و SOD) را افزایش دادند و سطوح ROS و MDA را کاهش دادند. یافته‌های فعلی با مطالعه قبلی مطابقت دارد که نشان می‌دهد یک مکمل کم PC از طریق رژیم غذایی، فعالیت‌های GSH-Px، CAT و SOD را در خوک‌های از شیر گرفته شده بهبود می‌بخشد [40]. مطالعه دیگری همچنین نشان می دهد که رایانه های شخصی به طور قابل توجهی فعالیت های CAT و SOD را افزایش می دهند و محتوای MDA را کاهش می دهند، در نتیجه کیفیت اسپرم بز را بهبود می بخشند [41]. این یافته ها نشان می دهد که رایانه های شخصی یک اثر محافظتی بر آسیب اکسیداتیو سلول های عصبی دارند. علاوه بر این، رایانه‌های شخصی زنده‌مانی سلولی را در مقایسه با گروه MPP به‌علاوه تنها در سلول‌های PC12 ناشی از MPP به‌علاوه، افزایش قابل‌توجهی مسافت کل جابه‌جا شده و کاهش تراکم سلولی TH به علاوه نسبت به گروه MPTP در لاروهای گورخرماهی ناشی از MPTP کردند. این داده ها نشان می دهد که رایانه های شخصی اثر محافظتی بر سلول های عصبی دارند.

ما همچنین مشاهده کردیم که رایانه های شخصی به طور قابل توجهی تجمع Nrf2 هسته ای را در مقایسه با MPP plus به تنهایی در سلول های PC12 افزایش دادند. در واقع، رایانه های شخصی به طور قابل توجهی سطوح بیان NQO1، HO{3}}، GCLM و GCLC را افزایش دادند[42]. علاوه بر این، خاموش کردن ژن Nfr2 از طریق Nrf2 siRNA برای بررسی نقش فعال‌سازی Nrf2/ARE در محافظت عصبی با واسطه رایانه‌های شخصی در برابر آسیب اکسیداتیو ناشی از MPP به اضافه استفاده شد: سلول‌های ترانسفکت‌شده با siRNA Nrf کاهش قابل توجهی در بیان Nrf2 نشان دادند. این مطالعه کنونی همچنین نشان داد که ناک اوت Nrf2 هر دو حفاظت با واسطه رایانه‌های شخصی را در برابر آسیب‌های درمان شده با MPP در زنده‌مانی سلول و اثرات آنتی‌اکسیدانی رایانه‌های شخصی لغو کرد. این نتایج با مطالعه قبلی مطابقت دارد که نشان می‌دهد بهبود فعال‌سازی مسیر Nrf2/ARE به محافظت عصبی کمک می‌کند [43].

مسیر Nrf2/ARE یک مسیر آنتی اکسیدانی قابل توجه است [44-46]. به طور معمول، Nrf2 در سیتوپلاسم قرار دارد، جایی که به پروتئین بازدارنده، Keapl [47،48] متصل می شود. هنگامی که سلول ها تحت استرس اکسیداتیو قرار می گیرند، Nrf2 از Keap1 جدا می شود، سیستم دفاعی آنتی اکسیدانی درون زا را آغاز می کند و متعاقباً به هسته منتقل می شود [46،49،50]. سپس با ARE تعامل می‌کند تا یک سری از ژن‌های محافظ سلولی و آنتی‌اکسیدان، از جمله GCLC، GCLM، NQO1، و HO را فعال کند. در پاسخ به استرس اکسیداتیو، Nrf2 از Keap1 در سیتوزول جدا می‌شود و سپس به هسته منتقل می‌شود و به دنباله ARE متصل می‌شود تا رونویسی ژن‌های محافظ سرما را فعال کند [{16}}]. نتایج کنونی نشان می‌دهد که رایانه‌های شخصی می‌توانند مسیر Nrf2/ARE را فعال کنند، Nrf2 را از سیتوپلاسم به هسته منتقل کنند، در هسته تجمع کنند، بیان GCLC، GCLM، NOO1 و HO را تنظیم کنند و توانایی را بهبود بخشند. سلول ها برای مقاومت در برابر استرس اکسیداتیو در واقع، مسیر Nrf2/ARE ممکن است یک هدف دارویی رایانه‌های شخصی برای پیشگیری از PD باشد.

4. مواد و روش ها

4.1. ترکیبات شیمیایی و معرف ها

نمایندگان MPP plus و MPTP از سیگما (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) و کیت شمارش سلولی{0}} از Beyotime (شانگهای، چین) خریداری شد. کامپیوترهای شخصی، کیت های تشخیصی دی کلروفلورسین دی استات، MDA، GSH-Px، SOD و CAT همگی از Solarbio (پکن، چین) به دست آمدند. RNAiso Plus، PrimeScriptTMRT Reagent Kit با پاک کن gDNA، و SYBRPremix Ex TaqTMⅡI از تاکارا (شیگا، ژاپن) خریداری شد. Nrf{5}}siRNA، کنترل-siRNA، و Lipofectamine 2000 از GenePharma (شانگهای، چین) به دست آمد. در نهایت، آنتی بادی های اولیه Nrf2، HO{9}}، GCLC، GCLM، NAD(P)H: NQO1، Lamin B، GAPDH، Antityrosine Hydroxylase (TH) و آنتی بادی های ثانویه مربوطه از Proteintech (ووهان، چین) به دست آمدند. ).

4.2. کشت سلولی

سلول های PC12 از مجموعه ملی کشت های سلولی تأیید شده به دست آمد. سلول ها در DMEM تکمیل شده با 10 درصد سرم جنین گاو و پنی سیلین-استرپتومایسین (100 U/mL؛ 100 ug/mL) در انکوباتور اتمسفر مرطوب در دمای 37 درجه با 5 درصد CO2 نگهداری شدند [59].

4.3. سنجش زنده ماندن سلولی

سلول‌های PC12 (سلول 104×1/چاه) با 1،2 or4ug/mLof PCsor deprenvl (30 میکرومولار) به مدت 24 ساعت انکوبه شدند و سپس با 1.5 میلی‌مولار MPP پلاس به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. سپس 10 میکرولیتر محلول کیت شمارش سلولی به هر چاهک اضافه شد و به مدت 1 ساعت انکوبه شد. جذب در 450 نانومتر اندازه‌گیری شد [60].

4.4. نگهداری از ماهی

تأییدیه اخلاقی برای استفاده از حیوانات توسط کمیته حفاظت از حیوانات و استفاده از مرکز حیوانات آزمایشی، دانشگاه ژجیانگ (ZJU20200125) اعطا شد. گورخرماهی بالغ (سویه AB) از مرکز حیوانات آزمایشگاهی دانشگاه ژجیانگ (هانگ ژو، چین) به دست آمد و در دمای 1±28 درجه تحت چرخه 14 ساعت نور/10 ساعت تاریکی نگهداری شد. ماهی دو بار در روز با ناپلی آرتمیا تغذیه می شد [61]. برای تولید جنین، گورخرماهی بالغ یک شبه در مخازن پرورش به نسبت نر به ماده 1:1 قرار داده شد. تخم ریزی پس از روشن شدن چراغ ها در صبح روز بعد و تکمیل در 2 ساعت آغاز شد. جنین ها در آب جنین (13.7 میلی مولار NaCl، 540 میکرومولار KCl، 25 میکرومولار Na2HPOA44 uM KHPOA، 300 میکرومولار CaCl2، 100 میکرومولار MgSO، 420 میکرومولار NaHCO3، pH 7.4） 【3 【2） در دمای 2 درجه سانتیگراد رشد کردند.

4.5. اندازه گیری ROS

برای اندازه‌گیری تولید ROS، سلول‌های PC12 (2×104 سلول/چاه) به مدت 24 ساعت در معرض 1،2 یا 4 میکروگرم بر میلی‌لیتر PC یا دپرنیل (30 میکرومولار) قرار گرفتند و سپس با 1.5 میلی‌مولار MPPt انکوبه شدند. به مدت 24 ساعت 【64】. سلول ها در شرایط تاریک به مدت 30 دقیقه در معرض 10 میکرومولار محلول 2'،7'-Dichlorofluorescin diacetate قرار گرفتند. سپس محلول رنگ خارج شد و سلول ها با سالین بافر فسفات (PBS) 3 بار شسته شدند. تصاویر سلول ها با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری Olympus (المپوس، پایتخت توکیو، ژاپن) مشاهده شد. شدت فلورسانس سلول ها با استفاده از نرم افزار Image J v1.8.0 (Olympus، پایتخت توکیو، ژاپن) اندازه گیری شد. نتایج به صورت درصدی از مساحت مناطق ROS در گروه کنترل بیان می شود.

برای اندازه گیری تولید ROS، لاروهای گورخرماهی در 3 روز پس از لقاح (dpf) در معرض دپرنیل (40 میکرومولار) یا 4،8 یا 16 میکروگرم در میلی لیتر از رایانه های شخصی با یا بدون 400 میکرومولار MPTP به مدت 4 روز قرار گرفتند. لاروهای گورخرماهی در 7 dpf به یک صفحه چاهی (10 لارو در هر گروه) منتقل شدند، با محلول 20 میکرومولار 2',7'-Dichlorofluorescin دی استات تیمار شدند و به مدت 60 دقیقه در تاریکی در دمای 28.5 درجه انکوبه شدند [65] ]. سپس لاروها سه بار با محیط جنینی شسته شدند تا دی استات 2',7'-Dichlorofluorescin اضافی حذف شود. تصاویر لاروهای رنگ آمیزی شده با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری Olympus مشاهده شد. شدت فلورسانس لارو فردی با استفاده از نرم افزار Image J اندازه گیری شد. نتایج به صورت درصدی از مساحت مناطق ROS در گروه کنترل بیان می شود. 4.6. ارزیابی MDA، GSH-Px، SOD و CAT

سلول‌های PC12 (2×104 سلول در چاه) به مدت 24 ساعت در معرض 1،2 یا 4 میکروگرم بر میلی‌لیتر PC یا دپرنیل (30 میکرومولار) قرار گرفتند و سپس با 1.5 میلی‌مولار MPP پلاس به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. سپس 1 میلی لیتر عصاره به سلول های 4×10 درجه اضافه شد و سلول ها با سانتریفیوژ اولتراسونیک در 8000 دور در دقیقه در 4 درجه به مدت 10 دقیقه شکسته شدند. سپس مایع رویی برای آزمایش روی یخ گذاشته شد و معرف‌هایی برای تعیین MDA، GSH-Px، SOD و CAT به ترتیب اضافه شدند. هر شاخص در سه تکرار تکرار شد.

لاروهای گورخرماهی در 3dpf با دپرنیل (4{7}} میکرومولار) یا 4،8 یا 16 میکروگرم در میلی لیتر از رایانه های شخصی با یا بدون 4{9}} 0 میکرومولار MPTP به مدت 4 روز انکوبه شدند. سپس 0.05 گرم از بافت لارو گورخرماهی و 0.5 میلی لیتر عصاره در حمام یخ همگن شده و سپس در دمای 4 درجه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی برای آزمایش روی یخ گذاشته شد. معرف‌ها به ترتیب برای تعیین MDA، GSH-Px، SOD و CAT اضافه شدند. هر شاخص در سه تکرار تکرار شد.

4.7. تهیه پروتئین کامل سلولی، سیتوپلاسمی و هسته ای

برای استخراج پروتئین کل سلولی، سلول ها جمع آوری و با بافر لیز RIPA حاوی 1 درصد PMSF و 1 درصد کوکتل بازدارنده پروتئاز به مدت 30 دقیقه روی یخ انکوبه شدند. لیزهای سلولی سانتریفیوژ شدند و مایع رویی جمع آوری و ذخیره شد. برای آماده سازی شکنش درون سلولی، نمونه های سلولی با استفاده از کیت استخراج پروتئین هسته ای و سیتوپلاسمی پردازش شدند. محتوای پروتئین با استفاده از روش BCA (بیوتیم، شانگهای، چین) مورد سنجش قرار گرفت.

4.8. انتقال siRNA Nrf2

Nrf2-siRNA برای از بین بردن Nrf2 استفاده شد. طبق دستورالعمل، سلول‌های PC12 با Nrf{3}}siRNA (80 نانومولار) یا کنترل-siRNA با استفاده از Lipofectamine 2000 ترانسفکت شدند. 4.9. وسترن بلاتینگ

نمونه های پروتئینی توسط SDS-PAGE تجزیه و به غشاهای پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) منتقل شدند. بلات ها در معرض آنتی بادی های اولیه مناسب قرار گرفتند: Nrf2، Keap1، HO{4}}، NQO1، GCLC، GCLM، Lamin B، GAPDH و آنتی بادی های ثانویه کونژوگه با پراکسیداز. نوارهای پروتئینی با استفاده از ECL (Beyotime، شانگهای، چین) به علاوه معرف‌های تشخیص وسترن بلات مشاهده شدند [36،43].

4.10. تست رفتاری حرکتی

لاروهای گورخرماهی در 3dpf با دپرنیل (40 میکرومولار) یا 4،8 یا 16 میکروگرم در میلی لیتر از رایانه های شخصی با یا بدون 400 میکرومولار MPTP به مدت 4 روز انکوبه شدند. سپس گورخرماهی 7 dpf در صفحات چاهی (1 ماهی در هر چاه و 12 لارو در هر گروه) قرار داده شد و کل مسافتی که هر ماهی بیش از 10 دقیقه شنا کرد، ثبت شد. رفتار گورخرماهی با استفاده از یک سیستم ردیابی خودکار ویدیویی (Any-maze 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, USA) پایش و تجزیه و تحلیل شد[66].

4.11. استخراج RNA کل، رونویسی معکوس، و واکنش زنجیره ای پلیمراز کمی در زمان واقعی

RNA با استفاده از RNAiso Plus طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. رونویسی معکوس RNA با استفاده از کیت معرف PrimeScriptTMRT با پاک کن gDNA انجام شد، طبق دستورالعمل سازنده. تجزیه و تحلیل کمی PCR در زمان واقعی بر روی یک سیستم Real-Time PCR Applied Biosystems ViATM 7 با استفاده از SYBRPremix Ex TaqTM II (Takara، Shiga، ژاپن) انجام شد. اکتین به عنوان ژن مرجع و بیان ژن نسبی با استفاده از روش 2-△Ct محاسبه شد. توالی پرایمرهای مورد استفاده در تحقیق در جدول 1 آورده شده است.

4.12. زبراماهی آنتی تیروزین هیدروکسیلاز (TH) رنگ آمیزی ایمنی تمام کوه

لاروهای گورخرماهی در dpf 1 با دپرنیل (4{13}} میکرومولار) یا 4،8 یا 16 میکروگرم بر میلی‌لیتر از رایانه‌های شخصی با یا بدون 400 میکرومولار MPTP به مدت 2 روز (10 دسته ماهی/گروه) انکوبه شدند. لاروها با 4 درصد پارافورمالدئید در PBS به مدت 30 دقیقه تثبیت شدند. پس از تثبیت، آنها برای رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی کل کوهی TH [67] تحت درمان قرار گرفتند. در دمای اتاق، 2 درصد (v/o) سرم بره و 0.1 درصد (w/ø) آلبومین سرم گاو (BSA) به مدت 1 ساعت در سالین Tween{16}}(PBST) بافر فسفات مسدود شد. سپس آنها در بافر مسدود کننده در معرض آنتی قرار گرفتندتیروزینآنتی بادی هیدروکسیلاز (1:200 رقیق شده، Proteintech) به مدت 2 ساعت، و سپس 6 بار با PBST شستشو داده می شود. مرحله نهایی رنگ آمیزی ایمنی تمام کوه در بافر رنگ آمیزی با 488 ضد خرگوش بز (1:500) به مدت 1 ساعت انجام شد و دوباره با PBST شسته شد. پس از توسعه رنگ کافی، گورخرماهی با 3.5 درصد به صورت تخت قرار گرفتمتیل سلولزو با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزری Olympus تصویربرداری شده است.

4.13. تحلیل آماری

برای مقایسه میانگین‌های گروه‌های مختلف از آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) و سپس آزمون مقایسه چندگانه توکی استفاده شد. Graphpad Prism v6.01 (نرم افزار GraphPad, San Diego, CA, USA) برای تجزیه و تحلیل آماری و رسم نمودارها استفاده شد.

5. نتیجه گیری ها

در نتیجه، یافته‌های ما نشان می‌دهد که رایانه‌های شخصی از طریق فعال‌سازی مسیر Nrf2/ARE و پایین‌دست آن، اثرات محافظتی عصبی را اعمال می‌کنند.سم زداییوآنتی اکسیدان آنزیم ها. روی هم رفته، این بینش ها نشان می دهد که رایانه های شخصی ممکن است برای درمان PD مفید باشند.

این مقاله از Molecules 2021, 26, 5558 استخراج شده است. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules