اثرات محافظتی سیستانچ در برابر تخریب کلاژن فیبروبلاست پوستی ناشی از H2O2/UVB از طریق Hsa-microRNA{4}}توسط سیگنالینگ TGF/Smad Ⅱ

بحث

در این مطالعه، ما شناسایی کردیم کهنقش حفاظتی سیستانچاز طریق تضعیف hsa-miR- 4535 که Smad4 را هدف قرار می دهد، انجام می شود، بنابراین سیگنالینگ Smad2/3/4 و همچنین سنتز کلاژن در پوست در معرض H2O2/ آسیب پوستی ناشی از UVB درونکشتگاهیوفارسی. یافته های ما را می توان به عنوان شش نکته اصلی خلاصه کرد: (1) H ضعیف شده سیستانچ2O2القای پیری سلول HS68 اما نه آپوپتوز در دوز 30 میکرومولار. (2) اچ2O2/ناشی از UVBداخل سلولی و میتوکندریl تشکیل ROS و عدم تعادل MMP به دنبال معکوس شددرمان سیستانچ; (3) سیستانچ سیگنالینگ TGF/Smad و همچنین فعالسازی کمپلکس Samd2/3/4 را در H به طور قابل توجهی افزایش داد.2O2سلول های در معرض (4) تنظیم مثبت hsa-miR-4535 توسط H2O2/UVB به دنبال آن سرکوب شددرمان سیستانچ; (5) hsa-miR{2}} در تنظیم سیگنالینگ TGF /Smad توسطهدف قرار دادن Smad4 به سنتز کلاژن مختل در H2O2/ سلول های در معرض UVB؛ (6)کاربرد موضعی سیستانچبر رویپوست پشتی برهنهموش به طور قابل توجهی کاهش UVB ناشی ازپیری پوست,تشکیل چین و چروک, هیپرپلازی پوست, و نقصمسیرهای سیگنالینگ TGF / Smad.

شکل 10. اثر cistanche بر آسیب نوری پوست برهنه موش C57BL6/J ناشی از UVB. (الف) رویه شماتیک آزمایشات حیوانی. پوست پشتی موش های برهنه چهار هفته ای C57BL6/J (n=6) ​​در معرض اشعه UVB قرار گرفت و هر دو روز یک بار به مدت 8 هفته تحت درمان با سیستانچ قرار گرفت (B). موش ها به دلیل قرار گرفتن در معرض UVB، و به دنبال آن استفاده موضعی از سیستانچ.

برای اطلاع از درمان سیستانچ برای کاهش P پوست اینجا را کلیک کنیدآسیب داغ

شکل 11. کاربرد موضعی cistanche ناشی از UVB را کاهش می دهدهیپرپلازی پوستو تخریب کلاژن در پوست پشتی موش برهنه C57BL6/J. بافت های پوست به صورت سریال برش داده شد و با H&E، تری کروم ماسون و ایمونوهیستوشیمی برای p-Smad2/3 Smad4 و -gal رنگ آمیزی شد. رنگ آمیزی H&E ضخامت اپیدرمی را نشان داد. فلش های قرمز دو سر نشان دهنده ضخیم شدن اپیدرم است. رنگ آمیزی تری کروم ماسون محتوای فیبر کلاژن را در لایه های پوستی نشان داد. فیبرهای کلاژن آبی به نظر می رسند. LD، دوز کم؛ HD، دوز بالا.

سیستانچگزارش شده است که خواص ضد آپوپتوتیک و آنتی اکسیدانی در سلول های مختلف مانند کراتینوسیت ها و کاردیومیوسیت ها نشان داده است [13، 39، 40]. تجویز خوراکی سیستانچ به طور موثری آسیب کبدی ناشی از استرپتوزوتوسین را در موش های دیابتی با کاهش آسیب اکسیداتیو میتوکندری و افزایش سیگنالینگ آنتی اکسیدانی Nrf2 سرکوب کرد [13، 41]. مطالعات دیگر نشان داده اند که سیستانچ با کاهش استرس اکسیداتیو و التهاب، سمیت کبدی ناشی از سیکلوفسفامید و سمیت کلیوی ناشی از سیس پلاتین را بهبود می بخشد [42، 43]. قرار گرفتن فیبروبلاست های پوستی در معرض UVB یا H2O2 منجر به تجمع ROS در میتوکندری می شود که منجر به تکه تکه شدن میتوکندری و پیری سلولی می شود [44]. مطالعه قبلی نشان داد که میتوکندری های تکه تکه شده تولید کلاژن را مختل می کند [45]. مطالعه ما نشان داد که سیستانچ دارای توانایی مهار رادیکالی برای جلوگیری از عدم تعادل پتانسیل غشای میتوکندری ناشی از ROS و تجمع ROS در سلول‌های القا شده از UVB و H2O است. (شکل 3A-3C). مطالعات اخیر گزارش داده اند که فیبروبلاست های پوستی مسئول سازماندهی محیط غنی از ECM هستند.

شکل 12. اثرات cistanche بر سیگنالینگ TGF /Smad و بیان hsa-miR-4535 در موش های تحت تابش UVB. سطوح mRNA (A و B) hsa-miR-4535 و Smad4 از پوست پشتی موش‌های در معرض UVB با استفاده از qRT-PCR شناسایی شد. (C) سطح پروتئین TGF، p-smad2/3، و Smad4 در بافت‌های پوست پشتی با وسترن بلات شناسایی شد. توبولین به عنوان کنترل بارگذاری استفاده شد. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار ارائه می شوند. کمی نتایج نشان داده شده است. *P < 0.05، **P < 0.{20}}1 در مقابل گروه کنترل وسیله نقلیه. #P <0.05، ##P <0.01 در مقابل UVB + گروه خودرو.

عمدتا شامل کلاژن نوع I و III است [46]. هموستاز کلاژن نوع I و III اساساً مسئول حفظ حمایت ساختاری و مکانیکی پوست است [47]. شواهد جدید حاکی از آن است که ROS فراوان در طول پیری تولید می‌شود، که منجر به از بین رفتن تدریجی بسته‌های کلاژن در لایه‌های پوستی می‌شود و در نتیجه، به شکل‌گیری چین و چروک به دلیل اختلال در مسیر TGF / Smad و بیان MMP افزایش می‌یابد [48، 49].با واسطه سیستانشفعال سازی سیگنالینگ TGF/Smad باعث تولید کلاژن می شود که یکپارچگی پوست را حفظ می کند. با این حال، اثرات متفاوتی در سلول های سرطانی دارد. در سرطان کبد،سیستانک درمانیبا فعال کردن سیگنالینگ TGF/Smad، تکثیر سلولی HepG2 را مهار کرد [50]. در مقابل، سیستانچ سیگنالینگ TGF/Smad را مهار کرد و همچنین Smad3 را غیرفعال کرد که منجر به مهار رشد سلول‌های سرطانی پروستات و پانکراس شد [51]. با این حال، نقش cistanche در سیگنالینگ TGF /Smad درفیبروبلاست های پوستیناشناخته ماند در اینجا، مشاهده کردیم که سیستانچ بیان COL1A1 و COL3A1 را که در سلول‌های تیمار شده با H2O2/UVB از طریق فعال‌سازی سیگنال‌دهی TGF/Smad کاهش می‌یابد، تنظیم مثبت می‌کند (شکل 4A-4C، 8E، 9A). علاوه بر این، القای MMP{11}} توسط H2O2/UVB به دنبال درمان سیستانچ معکوس شد (شکل 4A، 9A). یافته‌های ما نشان می‌دهد که سیستانچ با فعال کردن سیگنال‌دهی TGF/Smad و القای تولید کلاژن، از فیبروبلاست‌های پوستی در برابر آسیب‌های ناشی از H2O2/UVB محافظت می‌کند.

توسعه کلاژن درم پوستیک فرآیند فیزیولوژیکی پیچیده است و نشان داده شده است که تنظیم با واسطه microRNA به بازسازی و سازماندهی ECM کمک می کند [23، 52، 53]. کلاژن، الاستین و اسید هیالورونیک (HA) سه پروتئین اصلی هستند که یکپارچگی پوست را حفظ می کنند. شواهد انباشته نشان می دهد که چندین microRNA از طریق تنظیم ECM در پیری پوست نقش دارند. miR{4}}a در فیبروبلاست‌های پوستی انسان پیر تنظیم شد و کلاژن XVI را قادر ساخت تا اجزای ECM را تعدیل کند [54]. جالب توجه است که بیان بالای miR-23a-3 می‌تواند با سرکوب مستقیم هیالورونان سنتاز ۲، یکی از ایزوآنزیم‌های HA سنتاز گذرنده که HA را سنتز می‌کند، پیری پوستی را القا کند [21]. اخیراً، ترکیبات طبیعی مختلفی گزارش شده است که پیری پوست را از طریق تنظیم microRNA کاهش می‌دهند [55-57]. علاوه بر این، سیستانچ در تنظیم microRNA در کلانژیوکارسینوما و سرطان کبد نقش داشته و باعث سرکوب رشد سلولی و متاستاز می شود [58، 59]. تا کنون، هیچ مطالعه ای مکانیسم مولکولی، مانند تنظیم microRNA، را شناسایی نکرده استسیستانک درمان شدهسلول های فیبروبلاست پوستی پوست انسان در اینجا، ما پروفایل های آرایه microRNA را برای شناسایی چندین microRNA که بین کنترل و 30 میکرومولار متفاوت بودند، تجزیه و تحلیل کردیم.سیستانک درمان شدهگروه ها (شکل 5A). با استفاده از پایگاه های داده miRDB و TargetScanHuman، Smad4 را به عنوان hsa-miR پیش بینی کردیم-4535هدف mRNA (شکل 5B). بیان hsa-miR{2}} به دنبال درمان سیستانش در سلول های القا شده با H2O2/UVB کاهش یافت (شکل 6C، 9B). در مقابل، بیان هدف آن، mRNA-Smad4، به طور قابل‌توجهی در سلول‌های در معرض H2O2/UVB مهار شد و پس از درمان سیستانچ افزایش یافت (شکل 6D، 9C). مطالعات گوناگونی نشان داد که ROS به عنوان یک فاکتورهای رونویسی ناشی از استرس، مانند p53، NF-kB و HIF [60] عمل می کند. بنابراین، ما استنباط کردیم که miRNA های خاصی را می توان از طریق تنظیم این عوامل رونویسی تعدیل کرد. با استفاده از پایگاه داده سایت اتصال فاکتور رونویسی (PROMO)، ما شناسایی کردیم که یک عنصر اتصال p53 فرضی در پروموتر hsa-miR{21}} وجود دارد. مطالعه آینده ما بر تنظیم رونویسی p53 در پروموتر hsa-miR{24}} متمرکز خواهد بود. علاوه بر این، تخریب کلاژن ناشی از H2O در سلول‌های hsa miR{27} که بیش از حد بیان می‌شوند یا سلول‌های ترانسفکت‌شده si-Smad4 حتی پس از درمان سیستانچ قابل کاهش نیست (شکل 8C، 8E). این یافته‌ها دخالت hsa-miR{33}} را در تنظیم سنتز کلاژن با هدف قرار دادن Smad4 تأیید می‌کنند.

شکل 13. نمودار شماتیک مکانیسم عمل cistanche. سیستانچ مسیرهای سنتز کلاژن TGF/Smad را با کاهش H2O2-ha-microRNA القا شده{4}} برای بهبود پیری نور در فیبروبلاست پوستی پوست انسان افزایش می‌دهد. اختصارات: ECM: ماتریکس خارج سلولی. TGF: تبدیل فاکتور رشد یافته بتا. TRI: گیرنده TGF نوع I. T RII: گیرنده TGF نوع II.

در نتیجه، یافته‌های ما نشان داد که سیستانچ در برابر تولید ROS ناشی از H2O2/UVB، عدم تعادل MMP، پیری سلولی و تخریب کلاژن در فیبروبلاست‌های پوستی انسان محافظت می‌کند. اثرات محافظتی درمو سیستانچ با مهار hsa-miR{4}} و فعال شدن کمپلکس Smad2/3/4 برای افزایش سنتز کلاژن همراه بود. فعال‌سازی پیچیده Smad2/3/4 توسط hsa-miR{12}} از طریق اتصال به Smad4-3'-UTR تنظیم شد. بنابراین، مکانیسم حفاظتی سیستانچ در برابر آسیب پوستی ناشی از H2O2/UVB ممکن است شامل مهار سنتز Smad4/کلاژن توسط hsa-miR باشد{20}}

مواد و روش ها

کشت سلولی و درمان

فیبروبلاست های پوستی انسانی HS68 از مجموعه Bioresource و مرکز تحقیقات (BCRC، Hsinchu، تایوان) به دست آمد و در محیط ضروری اصلاح شده Dulbecco (DMEM، Thermo Fisher Scientific، MA، USA) حاوی 10 درصد سرم جنین گاو (Invitrogen، CA، USA) نگهداری شد. 2 میلی مولار ال-گلوتامین (سیگما آلدریچ، MO، ایالات متحده آمریکا)، 100 واحد در میلی لیتر پنی سیلین (سیگما-آلدریچ) و 100 میکروگرم در میلی لیتر استرپتومایسین (سیگما آلدریچ) در دمای 37 درجه و 5 درصد CO2. برای ارزیابی اثر سیستانچ در برابر آسیب سلولی ناشی از H2O{12}، سلول‌های HS68 با 200 میکرومولار H2O2 به مدت 1 ساعت تیمار شدند و سپس با سیستانچ (282200، Sigma-Aldrich) به مدت 23 ساعت تیمار شدند. سلول ها با PBS شسته شده و قبل از قرار گرفتن در معرض UVB در 1 میلی لیتر PBS تازه قرار داده شدند. برای تابش UVB، سلول ها در معرض یک لامپ متقابل (CX-2000، Upland، CA، USA) و لامپ های UVB با شدت mJ/cm2 40 قرار گرفتند و سپس با سیستانش تیمار شدند.

سنجش MTT

بقای سلول HS68 پس از درمان با استفاده از روش MTT اندازه گیری شد. سلول‌های HS68 در صفحات چاهی کاشته شدند و با 200 میکرومولار H2O2 به مدت 1 ساعت تحت تابش 40 میلی‌ژول بر سانتی‌متر مربع UVB قرار گرفتند و سپس با غلظت‌های مختلف سیستانش انکوبه شدند (10, 20، 30 میکرومولار) به مدت 23 ساعت. پس از 24 ساعت، محیط کشت با 100 میکرولیتر MTT (3-(4،5-دی متیل تیازول-2- yl)-2،}5-دی فنیل تترازولیوم بروماید) جایگزین شد. محلول (0.5 میلی گرم در میلی لیتر؛ محلول ذخیره 5 میلی گرم در میلی لیتر در PBS با محیط کشت تا 0.5 میلی گرم در میلی لیتر) به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه رقیق شد. سپس فورمازان ارغوانی رنگ در 100 میکرولیتر دی متیل سولفوکسید (DMSO) حل شد و چگالی نوری در طول موج 570 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) اندازه‌گیری شد.

انتقال گذرا

تجزیه و تحلیل ریزآرایه

سنجش گزارشگر لوسیفراز

سلول ها به ترتیب با سازه های گزارشگر لوسیفراز نوع وحشی و جهش یافته Smad4-3'-UTR-WT یا Smad4-3'-UTR-MT و پلاسمیدهای لوسیفراز کنترل داخلی ترانسفکت شدند. پس از ترانسفکشن، فعالیت‌های لوسیفراز توسط یک سیستم سنجش لوسیفراز Dual-Glo (Promega، Sunnyvale، CA، USA) طبق دستورالعمل‌های سازنده شناسایی شد. صفحات بر روی یک لومینومتر میکروپلیت Reporter (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA) خوانده شد. فعالیت های نسبی لوسیفراز به آنزیم رنلا لوسیفراز نرمال شد.

تجزیه و تحلیل وسترن بلات

سلول ها با استفاده از 1× سالین بافر فسفات (PBS) شسته شدند و در بافر لیز (5{6}} میلی مولار Tris-base (pH7.5)، {{1{36}}}}.5 مولار NaCl، لیز شدند. 1 میلی‌مولار EDTA (PH 8.0)، 1 میلی‌مولار - مرکاپتواتانول، 1 درصد NP{14}}، گلیسرول 1 درصد و قرص‌های کوکتل مهارکننده پروتئاز (Roche Molecular Biochemicals، Upper Bavaria، آلمان) به مدت 30 دقیقه روی یخ و سپس سانتریفیوژ شد. 12،{18}} × گرم به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه، سوپرناتانت ها در لوله های میکرو سانتریفیوژ 1.5 میلی لیتری جمع آوری شدند. غلظت پروتئین در این سوپرناتانت ها به روش برادفورد (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) تعیین شد. حاوی مقادیر مساوی پروتئین (20 میکروگرم) از طریق الکتروفورز ژل دودسیل سولفات-پلی آکریل آمید سدیم شیب 6 تا 12 درصد (SDS-PAGE) جدا شد و سپس بر روی غشاهای پلی وینیلیدین دی فلوراید (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA) منتقل شد. غشاها با استفاده از بافر مسدود کننده (5 درصد شیر خشک بدون چربی، 20 میلی مولار Tris-HCl، pH 7.6، 150 میلی مولار NaCl و 0.1 درصد Tween 20) به مدت 1 ساعت در RT مسدود شدند. سپس غشاها با آنتی بادی های اولیه انکوبه شدند (1: 1,000 رقت) در برابر TGF 1 (sc-31609, Santa Cruz, CA, USA), p-smad2/3 (sc- 11769, Santa Cruz), Smad4 (sc{{ 50}}، سانتا کروز)،COL1A1 (sc-28657، سانتا کروز)، COL3A1 (sc-271249،سانتا کروز)، p16 (10883-1-AP، Proteintech)، p21 (sc{ {60}}، سانتا کروز)، MMP-1 (sc-1731، سانتا کروز)، GAPDH (sc-32233، سانتا کروز)، و هیستون H1 (sc-10806 ، سانتا کروز) در طول شب در 4 درجه. سپس با آنتی‌بادی‌های ثانویه مناسب (رقت 1:80)، ضد خرگوش (A0545)، ضد موش (A9044)، یا ضد بز (A5420) IgG (بیوتکنولوژی سانتا کروز) به مدت 1 ساعت در RT انکوبه شدند. بلات های ایمنی با سوبسترای پراکسیداز ترب (HRP) با نورتابی شیمیایی (ECL) افزایش یافته (HRP) با استفاده از ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare Life Sciences، Little Chalfont، UK) شناسایی شدند.

استخراج پروتئین هسته ای

استخراج RNA و qRT-PCR

RNA کل با استفاده از کیت تجاری Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research Corporation، CA، USA) طبق پروتکل سازنده [65، 66] استخراج شد. miRNA ها با استفاده از کیت سنتز cDNA miRNA (تاکارا، شیگا، ژاپن) همانطور که قبلا توضیح داده شد، به cDNA رونویسی معکوس شدند [16، 67]. بیان hsa-miR-4535 و Smad4 توسط PCR بلادرنگ در یک سیستم LightCycler 96 (روش، بازل، سوئیس) با استفاده از پروتکل استاندارد LightCycler 480 SYBR Green I Master شناسایی شد. واکنش 1{18}} میکرولیتری PCR شامل 2 میکرولیتر cDNA، 5 میکرولیتر 2× SyberGreen PCR Mix، 0.5 میکرولیتر پرایمر فوروارد (10 میکرومولار)، 0.5 میکرولیتر پرایمر معکوس (10 میکرومولار)، و 2 میکرولیتر ddH2O بود. تمام واکنش ها در سه تکرار اجرا شد. برای تشخیص mRNA، چرخه آستانه (Ct) برای هر ژن تعیین شد و بیان هر ژن نسبت به GAPDH به صورت 2ΔCt که ΔCt=(ژن Cttarget - CtGAPDH) محاسبه شد. برای تشخیص miRNA، Ct برای هر ژن تعیین شد و بیان هر ژن نسبت به U6 rRNA به صورت 2ΔCt که ΔCt=(Cthsa-miR-4535 - CtU6 rRNA) محاسبه شد. پرایمرهای رو به جلو (F) و معکوس (R) مورد استفاده برای تشخیص بیان miRNA و mRNA عبارت بودند از: hsa-miR{32}} (3'-CAGGG TCGGUCCA5'). human-Smad4 (F'-TGACCCAAA CATCACCTTCA، R'- ATACGTGGACCCTTCTG GA)؛ انسان-GAPDH (F'-ACCCAGAAGACTGTGGA TGG، R'-TTCAGCTCAGGGATGACCTT)؛ mouse-Smad4 (''-GTGGAAGCCACAGGAATGTT، R'-CCCA CTGAAGGACATTCGAT); ماوس-GAPDH (F'-CCTT CCACAATGCCAAAGTT، R'-GGGTGTGAACCA CGAGAAAT).

تجزیه و تحلیل ایمونوفلورسانس