R. Vesicarius L. اثر محافظتی نفرو در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از سیس پلاتین دارد

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

دکتر محمود حسن¹، اکثر. سایلا تسمین²، احمد م. الشحاوی³مونا ام السیهی⁴، دکتر ابورضا¹و Ariful Haque^2*

خلاصه

زمینه:سیس پلاتین یک داروی ضد سرطان برجسته است، اما استفاده از آن به دلیل سمیت کلیوی شدید به میزان قابل توجهی کاهش یافته است. R. vicarious L. یک سبزی برگی است که دارای پتانسیل ضد رگ زایی، ضد التهابی، ضد تکثیر، محافظت از کبد و محافظت از نفر است. بنابراین، این مطالعه به منظور بررسی عصاره متانولی آن (RVE) از نظر اثر محافظتی نفرو طراحی شد.

مواد و روش ها:در درجه اول، در شرایط آزمایشگاهی، فعالیت آنتی اکسیدانی RVE بر اساس استعداد مهار رادیکال آزاد 2، 2-دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل (DPPH) تایید شد. پس از آن، موش‌های نر سوئیس آلبینو با سیس پلاتین (2.5 میلی‌گرم بر کیلوگرم) به مدت 5 روز متوالی برای القای سمیت کلیوی تحت درمان قرار گرفتند. بهبودی از سمیت کلیوی با درمان حیوانات با RVE (25، 50 و 100 میلی گرم بر کیلوگرم) به صورت داخل صفاقی (IP) برای 5 روز متوالی مورد بررسی قرار گرفت. پس از اتمام درمان، موش‌ها قربانی شدند و کلیه‌ها جمع‌آوری شدند. بخشی از آن در بافر فسفات سدیم برای ارزیابی سطح مالون دی‌آلدئید (MDA) همگن شد، بخشی دیگر برای ارزیابی بیان ژن (NQO1، p53 و Bcl{12}}) استفاده شد. علاوه بر این، ظرفیت خنثی‌سازی پراکسید هیدروژن (H2O2) RVE در سلول‌های HK{15}} در شرایط آزمایشگاهی مورد ارزیابی قرار گرفت. در نهایت، فیتوکمیکال‌های زیست فعال در RVE با استفاده از کروماتوگرافی گازی - طیف‌سنجی جرمی (GC-MS) تعیین شدند.

نتایج:RVE فعالیت آنتی اکسیدانی در شرایط آزمایشگاهی را به صورت وابسته به دوز با مقدار IC50 ug/ml 37.39 ± 1.89 نشان داد.

درمان با RVE به طور قابل توجهی (p < {{0}}.05)="" باعث="" کاهش="" محتوای="" mda="" در="" بافت="" کلیه="" شد.="" علاوه="" بر="" این،="" بیان="" ژن‌های="" nqo،="" p53="" و="" bcl{3}}="" به‌طور="" معنی‌داری=""><) به‌دلیل="" تجویز="" rve="" به="" صورت="" وابسته="" به="" دوز="" کاهش="" یافت.="" rve="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" (p=""><0.05) سطح="" h2o2="" را="" در="" سلول‌های="" hk{11}}="" به="" تقریباً="" نرمال="" معکوس="" کرد.="" از="" gc-ms،="" ده="" ترکیب="" شامل="" سه="" آنتی="" اکسیدان="" شناخته="" شده="" "4h-pyran{15}}one،="" 2،="" 3-dihydro-3،5-dihydroxy-6-methyl-"="" "هگزادکانوئیک="" اسید"="" و="" "اسکوالن"="" شناسایی="" شدند.="" این="" عصاره="" سرشار="" از="" یک="" آلکالوئید="" "{22}}دوکوزنامید"="">

نتیجه:به طور کلی، RVE دارای یک اثر محافظتی در برابر آسیب کلیه ناشی از سیس پلاتین است.

کلید واژه ها:سیس پلاتین، R. vicarious، موش، کلیه، سلول‌های HK{0}}، استرس اکسیداتیو، ژن NQO1

Cistanche deserticola از بیماری کلیوی جلوگیری می کند، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

مقدمه

استرس اکسیداتیو نتیجه عدم تناسب بین تشکیل گونه های فعال اکسیژن (ROS) و مکانیسم های دفاعی آنتی اکسیدانی منظم است [1]. واکنش‌های بیوشیمیایی منظم، قرار گرفتن مکرر در معرض محیط نامطلوب، و مصرف زیاد بیگانه‌بیوتیک‌ها منجر به تولید ROS می‌شود [1]. ROS با بقایای سیستئین مولکولهای سیگنالینگ حساس به ردوکس از جمله فاکتورهای رونویسی، پروتئین تیروزین فسفاتازها و پروتئین کینازها تعامل دارد. در نتیجه، اکسیداسیون گروه‌های تیول روی این باقیمانده‌ها به تغییرات پروتئین‌های هدف، اقدامات بیولوژیکی، ظرفیت‌های سیگنال‌دهی، ایمنی و الگوهای سلولی زنده/مرده کمک می‌کند [2]. گونه های شیمیایی حاوی اکسیژن که دارای خواص واکنشی هستند به عنوان ROS شناخته می شوند که به ترتیب شامل رادیکال های آزاد و مولکول های غیر رادیکال مانند سوپراکسید و H2O2 هستند [3]. استرس اکسیداتیو ناشی از ROS با علت بیماری های متعدد از جمله سرطان مرتبط است. لوسمی حاد میلوئیدی (AML) رشد سرطانی سلول های خونی در داخل مغز استخوان است. رویدادهای سلولی و مولکولی زمینه‌ای AML شامل آسیب DNA، تکثیر کلونال، افزایش مرگ سلولی و بی‌ثباتی ژنتیکی بیشتر است که نتیجه استرس اکسیداتیو ناشی از ROS است [4]. فیزیولوژی انسان دارای مکانیسم‌های متعددی است که می‌تواند آنتی‌اکسیدان‌ها را برای محافظت در برابر استرس اکسیداتیو که منجر به محافظت از سلول‌ها در برابر اثرات سمی و کمک به پیشگیری از بیماری می‌شود، تولید کند. با این حال، سلول ها مکانیسم های درون زا را برای مقابله با استرس اکسیداتیو و حفظ ROS مورد نیاز توسعه می دهند [6].

NAD(P)H: کینون اکسیدوردوکتاز 1 (NQO1) یک فلاوآنزیم [7] است که می تواند احیا دو یا چهار الکترونی را کاتالیز کند و از این خاصیت برای سم زدایی کینین ها استفاده می کند [8]. این می تواند با کنار گذاشتن چرخه ردوکس و با کاهش تولید رادیکال های آزاد از سلول ها در برابر آسیب اکسیداتیو محافظت کند [8]. علاوه بر سم‌زدایی بیگانه‌بیوتیک، NQO1 همچنین در خنثی‌سازی سوپراکسید، مدولاسیون تخریب پروتئازومی p53 [9]، مهار Bcl{10}} [10] و افزایش حساسیت به آسیب سلولی نقش دارد [11].

سیس پلاتین اولین داروی ضد سرطانی است که توسط سازمان غذا و دارو (FDA) تایید شده است [12]. سیس پلاتین با القای استرس اکسیداتیو و بیان بیش از حد ژن p53 سرکوبگر تومور آپوپتوز را اعمال می کند [12]. چندین اثر نامطلوب از جمله سمیت کلیوی، سمیت کبدی، سمیت گوارشی، سمیت گوش، سرکوب سلولی، و سمیت عصبی نتیجه استرس اکسیداتیو ناشی از سیس پلاتین است [12]. این عوارض جانبی به طور قابل توجهی استفاده از سیس پلاتین را کاهش داده است، اگرچه دارای فعالیت ضد سرطانی برجسته است. سیس پلاتین برای القای استرس اکسیداتیو و سرکوب ژن NQO1 در کلیه موش ها شناخته شده است [13]. بنابراین، جستجو و اعتبارسنجی برای منابع طبیعی موثر آنتی اکسیدان ها در حال تبدیل شدن به یک منطقه آگاهی است. مصرف آنتی اکسیدان های غذایی مشتق شده از گیاهان مانند فلاونوئیدها، کاروتنوئیدها و ترکیبات فنلی ممکن است منجر به محافظت در برابر بیماری های قلبی عروقی، آب مروارید و سرطان شود [14].

R. vicarious (Polygonaceae) در بنگالی به عنوان "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" شناخته می شود [15]. در مناطق بیابانی و نیمه بیابانی آسیا، استرالیا و شمال آفریقا رشد می کند [16]. این گیاه در بنگلادش در حال انقراض است که کمی مطالعه شده است. در بنگلادش، مردم پس از پختن با نمک، ادویه های مختلف و روغن، کل گیاه را به عنوان سبزی مصرف می کنند. گاهی اوقات، افراد تنها از برگ های تازه در سالاد مخلوط به عنوان جایگزین کاهو استفاده می کنند. برگ خام کمی ترش است، اما بعد از پختن به شدت ترش می شود. علاوه بر این، معمولاً تعداد کمی از برگ ها را در طی پخت و پز در ظروف ماهی مخلوط می کنند تا طعم کمی اسیدی داشته باشند.

این گیاه به عنوان یک گیاه دارویی و گیاهی در سراسر جهان مورد استفاده قرار می گیرد [17]. برگ ها و دانه ها به ترتیب به عنوان پادزهر برای زهر مار و عقرب استفاده می شوند [17]. در درمان عامیانه، R. vicarious از دیرباز در درمان بیماری های کبدی، هضم بد، یبوست، انبوه، استفراغ، نفخ، ناراحتی های قلبی، دردها، اختلالات طحال، سوء هاضمه، دندان درد، برونشیت، آسم، گال، لوکودرما و به عنوان یک ملین، معده آور، اشتها آور، مقوی، مدر و ضد درد [18]. این گیاه دارای ترکیبات بیولوژیکی مهم متعددی از جمله فلاونوئیدها، آنتراکینون ها، کاروتنوئیدها، ویتامین ها، لیپیدها و اسیدهای آلی است که به عنوان عوامل آنتی اکسیدانی، ضد میکروبی و ضد سرطانی شناخته می شوند [19]. هر قسمت از این گیاه حاوی کوئرستین (فلاونوئیدها) به مقدار زیاد است [15]. این گیاه حاوی 0.25 میلی گرم ویتامین A، 1.33 میلی گرم ویتامین C، 2.37 میلی گرم ویتامین E [15]، 3.38 میلی گرم فلاونوئید و 5.66 میلی گرم پلی فنل [20] در هر 100 گرم وزن خشک است.

شحات و همکاران [21] اثرات ضد رگ زایی و ضد تکثیری عصاره متانولی (80 درصد) قسمت هوایی R. را در برابر سرطان کبد در مدل موش نشان دادند. مطالعه دیگری پتانسیل ضد رگ زایی عصاره R. vicarious را در شرایط آزمایشگاهی نشان داد [22]. عصاره متانولی کل R. vicarious از سمیت کبدی ناشی از تتراکلرید کربن در داخل بدن محافظت می کند [23]. اثر ضد التهابی در خرگوش توسط عصاره متانولی برگ R. vicarious مشهود است [24]. یک مطالعه اخیر [25] اثر محافظتی نفروپاتی عصاره اتانولی تکه تکه شده R. ​​را در برابر سمیت جنتامایسین و دی کرومات پتاسیم گزارش کرد.

با در نظر گرفتن اطلاعات بالا، هدف ما بررسی اثر عصاره‌های جایگزین R. (RVE) از نظر بازیابی از سمیت کلیوی ناشی از سیس پلاتین از طریق حفظ بیان ژن NQO1 در یک مدل حیوانی بود.

مزایای سلامتی سیستانچ: درمان بیماری های کلیوی

مواد و روش ها

مواد شیمیایی و معرف ها

سیس پلاتین و 2، 2-دی فنیل-1-پیکریل هیدرازیل (DPPH) از SIGMA-ALDRICH (ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند.

کیت سنجش رنگ سنجی کراتینین (شناسه محصول – 700460) از کیمن کمیکال (ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)، سرم جنین گاوی (FBS) و آنتی بیوتیک (10،{3}} U/mL پنی سیلین و 10،000 ug/mL استرپتومایسین) از Gibco (آزمایشگاه های Gibco، ایالات متحده آمریکا). کیت سنجش ROS-Glo™ H2O2 و GoTaq® qPCR Master Mix از Promega (ایالات متحده آمریکا) تهیه شد. کیت رونویسی معکوس TIAN-Script M-MLV از TIANGEN (چین) و پرایمرها از IDT (Integrated DNA Technologies، مالزی) خریداری شد. تمام مواد شیمیایی و معرف های دیگر مورد استفاده در این آزمایش از درجه تحلیلی بودند.

جمع آوری نمونه گیاهی و تهیه عصاره

گیاهان جایگزین R. تازه از یک بازار محلی در Sonadighi، Rajshahi، بنگلادش خریداری شدند. نمونه گیاهی توسط دکتر احمد هومیان کبیر، گروه گیاه شناسی، دانشگاه راجشاهی، بنگلادش شناسایی و تایید شد. یک نمونه تحت شماره کوپن 00095 در هرباریوم گروه گیاه شناسی دانشگاه رجشاهی نگهداری شد. اندام های هوایی گیاه را تمیز کرده، در دمای 37 درجه خشک کرده و با استفاده از خشک کن الکترونیکی به صورت پودر درشت آسیاب شده و در ظرف در بسته در دمای 4 درجه نگهداری می شود. پودر ریز (10 گرم) در متانول (500 میلی لیتر) حل شد. محتوا به مدت 10 دقیقه در فرکانس 20 کیلوهرتز (Soni-prep 150, China) فراصوت شد. فیلتراسیون عصاره با استفاده از کاغذ صافی الیاف شیشه (Macherey NAGEL، GmBH، آلمانی) با دستگاه فیلتر DURAN (آلمانی) انجام شد. در نهایت، فیلتر با استفاده از خشک کن انجمادی (VirTis Benchtop Pro، SP SCIENTIFIC، USA) تغلیظ شد. عصاره در نهایت RVE نام گرفت.

تست فعالیت آنتی اکسیدانی در شرایط آزمایشگاهی

ظرفیت آنتی اکسیدانی in vitro RVE بر اساس مهار DPPH همانطور که قبلاً [26] توضیح داده شد با کمی تغییر انجام شد. توانایی مهار رادیکال DPPH RVE بر اساس تبدیل رنگ بنفش DPPH به رنگ زرد ارزیابی شد. مخلوط واکنش در هر لوله میکرو سانتریفیوژ (2 میلی‌لیتر) شامل 950 میکرولیتر محلول متانولی از رادیکال‌های DPPH (0.1 میلی‌مولار) و 50 میکرولیتر RVE از پنج غلظت مختلف (200، 500، 1000، 2000 و 4000 میکروگرم) بود. / میلی لیتر متانول) برای ایجاد غلظت های نهایی 10، 25، 50، 100 و 200 میکروگرم در میلی لیتر. لوله دیگری حاوی 50 میکرولیتر متانول و 950 میکرولیتر محلول متانولی DPPH به عنوان شاهد نگهداری شد. لوله های آزمایش به مدت 30 دقیقه در مکانی تاریک قرار گرفتند. جذب مخلوط ها در طول موج 517 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر UV-VIS GENESYS 10S (Thermo SCIENTIFIC، USA) گرفته شد. در نهایت، درصد فعالیت مهار رادیکال (RSA) بر اساس تغییر رنگ DPPH با استفاده از فرمول زیر درصد RSA=[(ADPPH - ARVE)/ADPPH] × 100 محاسبه شد که در آن ADPPH جذب محلول DPPH است. (کنترل) و ARVE جذب محلول RVE است. غلظتی که در آن RVE منجر به 50 درصد RSA می‌شود، به عنوان مقدار IC50 نامیده می‌شود و با استفاده از نموداری که درصد RSA را در برابر غلظت‌های مختلف RVE مورد استفاده قرار می‌دهد، محاسبه شد.

حیوانات آزمایشی و طراحی آزمایشی

موش های نر آلبینو سوئیسی 42 روزه (30 تا 32 گرم وزن بدن) به مدت 1 هفته قبل از شروع آزمایش در یک اتاق (دمای حدود 2 ± 25 درجه و رطوبت 50 درصد، چرخه تاریکی / روشنایی 12 ساعت) سازگار شدند. آب آشامیدنی و غذا به صورت آزاد ارائه شد.

موش ها به طور تصادفی به هشت گروه (n {{0}}) تقسیم شدند. گروه اول (شاهد) با 0.2 میلی‌لیتر 0.9 درصد نمک طعام تحت درمان قرار گرفتند. چهار گروه بعدی با سیس پلاتین 2.5 میلی گرم بر کیلوگرم به مدت 5 روز در فاصله 24 ساعت تحت درمان قرار گرفتند. پس از تجویز سیس پلاتین، یک گروه (گروه دوم) بدون درمان باقی ماندند و به عنوان گروه کنترل تحت استرس قرار گرفتند. گروه سوم، چهارم و پنجم با RVE به ترتیب 25، 50 و 100 میلی گرم بر کیلوگرم به مدت 5 روز تحت درمان قرار گرفتند. سه گروه دیگر تنها با مقادیر 25، 50 و 100 میلی گرم بر کیلوگرم به مدت 5 روز تحت درمان با RVE قرار گرفتند. سیس پلاتین و RVE در آب مقطر حل شدند. تمام درمان ها به صورت داخل صفاقی داده شد. پس از 24 ساعت از آخرین درمان، حیوانات به دنبال دررفتگی دهانه رحم کشته شدند [25]. سپس صفاق با قیچی باز شد، خون پس از سوراخ قلب و کلیه ها با استفاده از فورسپس جمع آوری شد. خون برای بررسی سطح کراتینین در سرم قرار گرفت. کلیه ها تحت ارزیابی سطح مالون دی آلدئید و بیان ژن قرار گرفتند.

اندازه گیری کراتینین سرم

کراتینین سرم با استفاده از کیت سنجش رنگ سنجی کراتینین-700,460 (Cayman Chemical، USA) طبق پروتکل سازنده ارائه شده همراه با کیت اندازه گیری شد.

اندازه گیری پراکسیداسیون لیپیدی کلیه

مالون دی آلدئید (MDA) محصول نهایی پراکسیداسیون لیپید در بافت کلیه است و معمولاً به عنوان شاخص تولید ROS اندازه گیری می شود. با این حال، سطح MDA در بافت کلیه طبق یک مطالعه قبلی اندازه گیری شد [27]. ابتدا بافت کلیه در بافر فسفات سدیم ({2}}.1 M، pH 7.4) همگن شد. محلول واکنشی شامل 0.8 درصد اسید تیوباربیتوریک (1.5 میلی لیتر)، 8.1 درصد SDS (200 میکرولیتر)، 20 درصد (pH 3.5) اسید استیک (1.5 میلی لیتر) و dH2O (600 میکرولیتر) به 100 اضافه شد. میکرولیتر از بافت همگن شده، و مخلوط سپس در دمای 95 درجه به مدت 1 ساعت انکوبه شد. پس از سرد شدن، مخلوط ها در 10،{24}} گرم به مدت 10 دقیقه در 4 درجه سانتریفیوژ شدند و جذب مایع رویی در طول موج 532 نانومتر با استاندارد 1، 1، 3، 3- تترا متوکسی پروپان اندازه گیری شد. مقدار پروتئین کل با استفاده از کیت سنجش پروتئین برادفورد (BIO-RAD، ایالات متحده آمریکا) و با مقایسه آن با آلبومین سرم استاندارد گاوی (BSA) اندازه‌گیری شد. شدت پراکسیدهای لیپیدی به صورت نانومول (nM) MDA در هر میلی گرم (میلی گرم) پروتئین بیان شد.

واکنش زنجیره ای پلیمراز بلادرنگ (Real-time PCR)

PCR بلادرنگ همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد [28، 29]. RNA کل از بافت کلیه با استفاده از معرف TRIZol® (Invitrogen) طبق پروتکل ارائه شده توسط سازنده جدا شد. سپس RNA جدا شده (1 میکروگرم) به cDNA تبدیل شد. ابتدا 2 میکرولیتر هگزامر تصادفی (10 میکرومولار)، 2 میکرولیتر dNTPs (10 میلی‌مولار)، 1 ug RNA و HO بدون نوکلئاز تا 15 میکرولیتر گرفته شد و به مدت 5 دقیقه در دمای 70 درجه انکوبه شد. مخلوط فوراً به مدت 2 دقیقه روی یخ قرار گرفت. سپس 4 میکرولیتر بافر رشته اول (5x) و 1 میکرولیتر M-MLV رونوشت معکوس در هر لوله اضافه شد و به مدت 10 دقیقه و 50 انکوبه شد.

دقیقه در 25 درجه و 42 درجه به ترتیب. در نهایت، آنزیم M-MLV معکوس ترانس کریپتاز با انکوبه کردن مخلوط در دمای 95 درجه به مدت 5 دقیقه غیرفعال شد. محصولات cDNA سنتز شده برای تعیین کمیت بیان ژن NQO1، p53 و Bcl{9}} با استفاده از پرایمرهای خاص، تحت PCR بلادرنگ قرار گرفتند (جدول 1). هر واکنش (1{14}} میکرولیتر) در سه تکرار شامل 5 میکرولیتر GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega، USA)، 0.5 میکرولیتر (10 میلی‌مولار) از هر پرایمر، 3 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز و 1 میکرولیتر cDNA در 48-صفحه واکنش چاه. چرخه حرارتی با استفاده از یک دستگاه PCR بلادرنگ (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, USA) با شرایط دوچرخه‌سواری زیر انجام شد: 95 درجه برای 10 دقیقه و سپس 40 سیکل 95 درجه برای 30 ثانیه، 50 درجه برای 30 ثانیه و 72 درجه برای 25 ثانیه. ویژگی واکنش های PCR با تجزیه و تحلیل منحنی مذاب در 95 درجه برای 15 ثانیه، 45 درجه برای 15 ثانیه و 95 درجه برای 15 ثانیه تأیید شد. ویژگی واکنش های PCR با تجزیه و تحلیل منحنی مذاب در 95 درجه برای 15 ثانیه، 45 درجه برای 15 ثانیه و 95 درجه برای 15 ثانیه تأیید شد. کمی سازی نسبی بیان ژن با استفاده از ژن GAPDH درون زا به عنوان کنترل بر اساس روش ΔΔCq انجام شد.

کشت و درمان سلولی

رده سلولی اپیتلیال لوله پروگزیمال کلیه انسان، سلول‌های HK{0}}، در DMEM حاوی 10 درصد FBS و آنتی‌بیوتیک (50 واحد در میلی‌لیتر پنی‌سیلین و 50 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین) در انکوباتور با 5 درصد CO2 و 95 نگهداری شدند. درصد رطوبت در 37 درجه

سنجش اندازه گیری H2O2

سطح H2O2 در سلول‌های HK{2}} با استفاده از کیت سنجش ROS-Glo™ H2O2 (Promega، ایالات متحده آمریکا) طبق پروتکل ارائه‌شده توسط سازنده کیت برآورد شد. سلول‌های HK-2 (1000 سلول) در 70 میکرولیتر DMEM در چاهک‌های صفحه میکروتیتر چاهک قرار گرفتند. پس از اجازه اتصال سلول ها به سطح دیوار، 10 میکرولیتر DMEM از چاه های صفحه میکروتیتر با 10 میکرولیتر سیس پلاتین (25 میکرومولار در DMEM) جایگزین شد و به مدت 12 ساعت در انکوباتور نگهداری شد. سپس، 10 میکرولیتر RVE اضافه شد تا غلظت‌های نهایی 125، 250 و 500 میکروگرم بر میلی‌لیتر در DMEM ایجاد شود و برای 12 ساعت دیگر انکوبه شد. پس از آن، 20 میکرولیتر محلول بستر H2O2 و 100 میکرولیتر محلول تشخیص ROS-Glo™ به هر چاه اضافه شد. واکنش در دمای اتاق به مدت 20 دقیقه انکوبه شد. در نهایت، لومینسانس با استفاده از لومینومتر GloMax (Promega، ایالات متحده آمریکا) اندازه گیری شد.

تجزیه و تحلیل GC-MS

آنالیز GC-MS RVE (محلول در متانول) همانطور که قبلاً توضیح داده شد [3{12}}] با استفاده از GCMS- QP202{29}} (SHIMADZU) شامل یک نمونه‌بر خودکار (AOC{12}) انجام شد. {5}}s)، یک انژکتور خودکار (AOC-20i)، و یک کروماتوگرافی گازی (GC-2010 Plus) متصل به یک طیف سنج جرمی مجهز به SH-Rxi{{1{{ 37}}}}ستون مویرگی Sil MS (3{41}} m × 0.25 میکرومتر ID × 0.25 میکرومتر DF). گاز حامل هلیم در سرعت جریان ثابت 1.72 میلی لیتر در دقیقه نگه داشته شد و حجم تزریق 5 میکرولیتر با نسبت تقسیم 10:1 قرار گرفت. دمای انژکتور در 220 درجه نگه داشته شد، دمای منبع یونی 280 درجه بود، دمای فر از 80 درجه (2 دقیقه نگه دارید) با افزایش 5 درجه در دقیقه به 150 درجه (زمان نگهداری 5.0) برنامه ریزی شد. دقیقه)، سپس 5 درجه در دقیقه تا 280 درجه، که با 8 دقیقه ایزوترمال در 280 درجه خاتمه می یابد. طیف جرمی در 1.5 کیلو ولت با فاصله اسکن 0.5 ثانیه گرفته شد و نمونه در محدوده 45-350 m/z اجرا شد. تاخیر حلال از 0 تا 3 دقیقه و کل زمان اجرای GC-MS 55 دقیقه بود. غلظت نسبی ترکیبات شناسایی شده با مقایسه میانگین سطح پیک آن با مساحت کل اندازه گیری شد. تفسیر طیف جرم در GC-MS با استفاده از پایگاه‌های داده استاندارد و فناوری موسسه ملی (NIST) شامل NIST08، NIST08 و NIST14 انجام شد.

تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل های آماری با استفاده از ANOVA به دنبال آزمون T3 Dunnett با استفاده از نرم افزار IBM SPPS (نسخه 20) انجام شد. داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) بیان می شوند. مقایسه معنی دار در ص<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">

نتایج

تست فعالیت آنتی اکسیدانی در شرایط آزمایشگاهی

اگرچه قبلاً RVE برای داشتن فعالیت آنتی اکسیدانی گزارش شده بود، ما فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره خود را با استفاده از ظرفیت مهار رادیکال آزاد DPPH دوباره بررسی کردیم. RVE DPPH را وابسته به دوز خنثی کرد (شکل 1). RVE فعالیت آنتی اکسیدانی قابل توجهی را در شرایط آزمایشگاهی نشان داد و مقدار IC50 محاسبه شده RVE 1.89 ± 37.39 میکروگرم در میلی لیتر بود.

اندازه گیری کراتینین سرم

سطح کراتینین سرم در موش ها به طور معنی داری (05/0p < {{{0}}})="" پس="" از="" تجویز="" سیس="" پلاتین="" افزایش="" یافت="" (جدول="" 2).="" درمان="" با="" rve="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" (p=""><0.05) سطح="" کراتینین="" را="" به="" روشی="" وابسته="" به="" دوز="" بهبود="" بخشید="" (جدول="">

اندازه گیری پراکسیداسیون لیپیدی کلیه

در مقایسه با کنترل، سیس پلاتین به طور قابل توجهی (p < {{0}}.05)="" محتوای="" mda="" را="" در="" بافت="" کلیوی="" موش="" افزایش="" داد="" (جدول="" 3).="" در="" مقابل،="" درمان="" rve="" به="" طور="" قابل="" توجهی="" (p=""><0.05) mda="" را="" به="" روشی="" وابسته="" به="" دوز="" تقریباً="" به="" حالت="" عادی="" بازگرداند="" (جدول="">

Real-time PCR

سیس پلاتین به طور قابل توجهی (p < {0}}.05)="" بیان="" mrna="" nqo1="" را="" تا="" 0="" کاهش="" داد.15-برابر="" شد="" و="" mrna="" p53="" و="" bcl-2="" را="" افزایش="" داد.="" بیان="" با="" 24="" و="" 4.{9}}به="" ترتیب="" (شکل="" 2).="" rve="" بطور="" قابل="" توجهی="" (p="">< 0.{35}}5)="" بیان="" mrna="" nqo1،="" p53="" و="" bcl{15}}="" را="" به="" شکل="" وابسته="" به="" دوز="" کاهش="" داد="" (شکل="" 2).="" در="" مقایسه="" با="" تنها="" گروه="" تحت="" درمان="" با="" سیس="" پلاتین،="" بیان="" mrna="" nqo1="" به="" میزان="" 3.57،="" 6.36="" و="" 9="" افزایش="" یافت.="" mg/kg="" rve،="" به="" ترتیب="" (شکل="" 2a).="" مجدداً،="" بیان="" mrna="" p53="" به="" ترتیب="" به="" میزان="" 0.63،="" 0.46="" و="" 0.{36}}="" برابر="" با="" 25،="" 50="" و="" 100="" mg/kg="" rve="" کاهش="" یافت="" (شکل="" 2b).="" بیان="" mrna="" bcl{41}}="" نیز="" به="" ترتیب="" 0.71،="" 0.40،="" و="" 0.{47}}برابر="" 25،="" 50="" و="" 100="" mg/kg="" rve="" کاهش="" یافت="" (شکل="" 2c).="" اما،="" هیچ="" تغییر="" معنی‌داری="" (05/0p="">) در سطح بیان ژن‌های NQO1، p53 و Bcl{56}} به دلیل درمان با RVE یافت نشد (شکل 3).

H₂O₂سنجش اندازه گیری

در سنجش اندازه گیری H2O2، H₂O₂سطح متناسب با لومینسانس در نظر گرفته شد. تجویز سیس پلاتین به طور قابل توجهی (p < {{0}}.{11}}5)="" سطح="" h2o2="" را="" 2.{5}="" برابر="" افزایش="" داد="" (شکل="" 4).="" درمان="" با="" rve="" بطور="" قابل="" توجهی="" کاهش="" یافت="" (p="">< 0.05)="" سطح="" h2o2="" 0.25،="" 0.38،="" و="" 0.{16}}="" برابر="" با="" 125،="" 250="" و="" 500="" ug/ml،="" به="">

تجزیه و تحلیل GC-MS

در مجموع 10 ترکیب (جدول 4 و شکل 5) شامل "ایزوبورنئول، پنتا متیل دیسیلانیل اتر (الکل سسکوی ترپن)"، "تیمین (نوکلئوباز پیریمیدین)"، "4H-Py-ran-4-یک، 2،{{ 8}}دی هیدرو-3،{10}}دی هیدروکسی-6-متیل (ساپونین)، "هگزادکانوئیک اسید، متیل استر (متیل استر اسید چرب)"، "9،{14}} اکتادکادینوئیک اسید، متیل استر (متیل استر اسید چرب)»، «9-اسید اکتادسنوئیک (Z)-، متیل استر (متیل استر اسید چرب)»، «متیل استئارات (متیل اسید چرب)»، «دی ایزوکتیل فتالات» (استر)»، «{17}}دوکوزنامید، (Z)- (آلکالوئید)»، و «اسکوالن (تری ترپن)» در RVE شناسایی شدند.

مزایای cistanche tubolosa: کاهش چربی خون

بحث

آنتی اکسیدان های طبیعی و مصنوعی به طور جامع مورد مطالعه قرار گرفته اند و مشخص شده اند که برای پیشگیری یا بهبود سمیت در فیزیولوژی حیوانی کاربردی هستند [31]. مکمل‌های آنتی‌اکسیدان جزء تشکیل‌دهنده‌ای هستند که یا از طریق سنتز شیمیایی یا استخراج از غذاهای طبیعی ایجاد می‌شوند، اما از نظر ترکیب با آنتی‌اکسیدان‌های موجود در غذا یکسان نیستند [5]. بنابراین، نظرات در طول زمان از هم جدا می شود که آیا آنتی اکسیدان های مصنوعی مزایای سلامتی مشابه آنتی اکسیدان های طبیعی دارند یا خیر [32]. میل به کاهش استفاده از مکمل های آنتی اکسیدانی مصنوعی و جستجوی منابع جایگزین، ارزان، تجدید پذیر، طبیعی و احتمالاً ایمن تر از آنتی اکسیدان های طبیعی موثر در راه است.

یکی از مهم‌ترین مکانیسم‌ها، مسیر مرتبط با فاکتور هسته‌ای اریتروئید-2 (Nrf2) است که عموماً از سلول‌ها در برابر استرس اکسیداتیو ناشی از استرس‌های برون‌زا یا درون‌زا محافظت می‌کند [27]. آنتی اکسیدان های موثر بیان Nrf2 را القا می کنند، که بیشتر به درون هسته حرکت می کند و به عنصر پاسخ آنتی اکسیدانی (ARE) متصل می شود که بیان ژن سم زدایی فاز II و آنتی اکسیدان NQO1 را تحریک می کند [33، 34]. NQO1 به طور گسترده و متفاوت به روشی خاص بافت بیان می شود. NQO1 یک فلاوپروتئین آنتی اکسیدانی سیتوزولی است که کاهش الکترونی کینون ها به هیدروکینون ها را کاتالیز می کند و در نتیجه سم زدایی الکتروفیل ها و پیش بینی چرخه ردوکس را پیش بینی می کند [35]. طبق یک مطالعه قبلی [36]، -lapachone NQO1 را فعال می کند، که سطح NAD پلاس داخل سلولی را بیشتر افزایش می دهد و از کلیه در برابر آسیب حاد ناشی از سیس پلاتین محافظت می کند.

سیس پلاتین به دلیل ایجاد آسیب در غشای فیلتراسیون گلومرولی از طریق استرس اکسیداتیو، التهاب و آپوپتوز شناخته شده است که در مجموع منجر به کاهش نرخ فیلتراسیون گلومرولی و از دست دادن نفوذپذیری طبیعی غشاء می شود [37]. بنابراین سطح کراتینین سرم افزایش یافت. کراتینین سرم یکی از نشانگرهای بالقوه عملکرد کلیه است. درمان سیس پلاتین باعث افزایش محتوای MDA در بافت کلیه شد که محصول ثانویه پراکسیداسیون لیپیدی است و این گزارش با مطالعات قبلی ثابت است [27، 35، 37، 38]. درمان با RVE به طور قابل توجهی محتوای MDA را در بافت کلیه کاهش داد. در همان زمان، سطح کراتینین نیز کاهش یافت که نشان دهنده اثر بهبود بخش RVE است.

علاوه بر این، بیان NQO1 به طور قابل توجهی کاهش یافت و بیان p53 و Bcl{2}} پس از مواجهه با سیس پلاتین به طور معنی‌داری افزایش یافت. از نظر بیان NQO1 و p53 در داخل بدن، نتیجه ما با مطالعه قبلی مطابقت دارد [13]. مطالعه اخیر [39] نشان داد که سیس پلاتین به طور قابل توجهی بیان Bcl{7}} را در کلیه موش کاهش می دهد، اما به طور شگفت انگیزی ما افزایش بیان را پیدا کردیم. این تفاوت ممکن است نتیجه تفاوت دوز [40] باشد زیرا محمد و همکاران [39] از mg/kg 8 به مدت 12 روز استفاده کردند، در حالی که ما از mg/kg 2.5 تنها برای 5 روز استفاده کردیم. مطالعه دیگری [41] بیان کرد که سیس پلاتین ممکن است بیان Bcl{16}} را در دوزهای غیر سیتوتوکسیک افزایش دهد. دوباره، افزایش بیان Bcl{18}} سلول ها را نسبت به استرس اکسیداتیو حساس می کند [40].

با این حال، بیان p53 در شرایط فیزیولوژیکی نرمال کم است، اما انتظار می رود که پس از درمان با سیس پلاتین، تنظیم شود زیرا این عامل شیمی درمانی مبتنی بر پلاتین، مسیر آپوپتوز وابسته به p53 را فعال می کند. هنگامی که ما موش ها را با سیس پلاتین درمان کردیم، p53 در کلیه موش ها به طور قابل توجهی در مقایسه با کنترل افزایش یافت. یک پروتوآنکوژن دیگر Bcl-2 نیز با سطح بیان NQO1 در ارتباط است. با تقلید از بیان p53، ما همچنین دریافتیم که سطوح Bcl- 2 با درمان سیس پلاتین افزایش یافت، اما پس از درمان با RVE به طور قابل توجهی پوشش داده شد. این ممکن است، در پاسخ به استرس اکسیداتیو، ژن p53 فعال می شود و منجر به توقف چرخه سلولی، پیری یا آپوپتوز می شود [6]. با سم زدایی، بیان بیش از حد NQO1 اغلب با آپوپتوز در سلول های سرطانی مرتبط است [10]، اگرچه مکانیسم اساسی آپوپتوز و بیان بیش از حد NQO1 هنوز بحث برانگیز است. علاوه بر این، در کارسینوم سلول‌های کبدی، بیان بیش از حد NQO1 بیان Bcl{18}} را کاهش می‌دهد [10]. پروتوآنکوژن Bcl{21}} نیز مانند همبستگی p53 با بیان NQO1 دارد. p53 یک فاکتور رونویسی خاص توالی است که توسط انواع متعددی از استرس سلولی فعال می شود [42]، در حالی که بیان بیش از حد Bcl{27}} به عنوان تثبیت کننده منافذ میتوکندری برای تسهیل آزادسازی سیتوکروم-c بر استرس اکسیداتیو عمل می کند [12]. در مورد ما، ما هر دو پاسخ ژن را با درمان سیس پلاتین در بافت طبیعی کلیه بررسی کردیم و افزایش بیان آنها را یافتیم. درمان RVE بیان p53 و Bcl{32}} را به روش وابسته به دوز تقریباً به حالت عادی برگرداند. این نوع لغو بیان Bcl{34}} نیز با استفاده از روبنده ROS Trolox [43] نشان داده شد. علاوه بر این، سطح H2O2 نیز در سلول‌های HK{38}} به دلیل درمان با سیس پلاتین در شرایط آزمایشگاهی افزایش قابل توجهی داشت. پس از درمان با RVE، سطح H2O2 به طور قابل توجهی به حدود نرمال بازگردانده شد. این ممکن است به دلیل تأثیر درمان RVE باشد که بیان NQO1 را افزایش داد [44]، که محافظت در برابر استرس اکسیداتیو [6] را اعمال می کند.

کروماتوگرام GC-MS وجود ده ترکیب در RVE را تایید کرد. از این میان، "4H-Pyran- 4-one، 2، 3-dihydro-3،5-dihydroxy-6-methyl-، "Hexadecanoic acid" و " اسکوالن" آنتی اکسیدان های معروفی هستند [45-47]. این سه ترکیب در مجموع احتمالا یک اثر هم افزایی نفروپروتکتیو اعمال می کنند. مطالعات قبلی همچنین در مورد القای بیان NQO1 توسط ویتامین A [48]، ویتامین C [49]، ویتامین E [50]، فلاونوئیدها [51] و پلی فنل ها [50] گزارش کردند. بنابراین، این گزارش نشان می دهد که آیا این عصاره خاص حاوی ویتامین A، ویتامین C، ویتامین E، فلاونوئیدها و پلی فنل است یا خیر.

نتیجه

یافته کلی نشان می دهد که RVE از نظر فیزیولوژیکی در محافظت از کلیه ها از آسیب ناشی از سیس پلاتین موثر است. بنابراین، روشن کردن ترکیبات دقیق مسئول کاهش سمیت کلیوی ناشی از سیس پلاتین که ممکن است برای کاربردهای انسانی مفید باشد، بسیار مهم است.

عصاره cistanche tubolosa

قدردانی

نویسندگان از شورای تحقیقات علمی و صنعتی بنگلادش (BCSIR)، شعبه راجشاهی برای ارائه پشتیبانی آزمایشگاهی برای تعیین کمیت RNA تشکر می کنند.

مشارکت نویسندگان

MMH طراحی آزمایشی، آزمایش، تجزیه و تحلیل داده‌ها و آماده‌سازی، نوشتن و ویرایش دست‌نوشته، بازنگری و پیش‌نویس نسخه‌های خطی را انجام داد. MST و MME آزمایش و تجزیه و تحلیل داده ها را انجام دادند. AME & MAR در نظارت و منابع مشارکت داشتند. ق مسئولیت مفهوم سازی، نظارت، منابع و ویرایش نسخه خطی را بر عهده داشت. همه نویسندگان

نسخه خطی را بررسی کرد. نویسندگان نسخه نهایی را خوانده و تایید کردند.

منابع مالی

کار فعلی توسط پژوهشگران دانشگاه طائف با شماره پروژه پشتیبان (TURSP - 2020/75)، دانشگاه طائف، طائف، عربستان سعودی تأمین مالی شده است.

در دسترس بودن داده ها و مواد.

تمام داده های مربوطه موجود است و می تواند در صورت درخواست به نویسنده مربوطه ارائه شود.

اعلامیه ها

تایید اخلاق و رضایت برای شرکت

اصول اخلاقی انجام این آزمایش توسط کمیته سازمانی حیوانات، اخلاق پزشکی، ایمنی زیستی و امنیت زیستی (IAMEBBC)، مؤسسه علوم زیستی (IBSc)، دانشگاه رجشاهی تأیید شد و تحت یادداشت شماره 31/{1} ارائه شد. }IAMEBBC/IBSc. تمامی روش ها بر اساس دستورالعمل ها و مقررات ارائه شده توسط کمیته اخلاقی فوق الذکر انجام شد. این مطالعه مطابق با دستورالعمل‌های ARRIVE (تحقیقات حیوانی: گزارش آزمایش‌های درون تنی) انجام شد. "رضایت شرکت" برای این مطالعه کاربردی ندارد.

مشخصات نویسنده

1 آزمایشگاه بیولوژی مولکولی و علوم پروتئین، گروه مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژی، دانشکده علوم حیات و زمین، دانشگاه راجشاهی، راجشاهی 6205، بنگلادش. 2 آزمایشگاه آسیب شناسی مولکولی، موسسه علوم زیستی، دانشگاه راجشاهی، راجشاهی 6205، بنگلادش. 3 گروه بیوتکنولوژی، دانشکده علوم، دانشگاه طائف، صندوق پستی 11099، طائف 21944، عربستان سعودی. 4گروه ژنتیک، دانشکده کشاورزی، دانشگاه اسکندریه، اسکندریه 21545، مصر.

منابع

1. Bagchi K، Puri S. رادیکال های آزاد و آنتی اکسیدان ها در سلامت و بیماری: بررسی. شرق مدیتر بهداشت J. 1998؛ 4: 350-60.

2. Koh EM، Lee EK، Song CH، Song J، Chung HY، Chae CH، و همکاران. فرولات، جزء فعال جوانه گندم، عدم تعادل PTK/PTP ناشی از استرس اکسیداتیو و غیر فعال سازی PP2A را بهبود می بخشد. Toxicol Res. 2018؛ 34 (4): 333-41.

3. حسن ع.، ابراهیم ری. برخی از پروفایل های ژنتیکی در کبد ارلیخ موش های حامل تومور را تحت استرس تابش آسیت می کنند. J Radiat Res Appl Sci. 2014؛ 7 (2): 188-97.

4. Zhou FL، Zhang WG، Wei YC، Meng S، Bai GG، Wang BY، و همکاران. دخالت استرس اکسیداتیو در عود لوسمی میلوئید حاد. جی بیول شیمی. 2010؛ 285 (20): 15010-5.

5. Pham-Huy LA، He H، Pham-Huy C. رادیکال های آزاد، آنتی اکسیدان ها در بیماری ها و سلامتی. Int J Biomed Sci. 2008؛ 4:89-96.

6. Srijiwangsa P، Na-Bangchang K. نقش NAD (P) H-quinone oxidoreductase 1 (NQO1) در پیشرفت سرطان و مقاومت شیمیایی. J Clin Exp Oncol. 2017؛ 6: 1-6.

7. Siegel D، Yan C، Ross D. NAD (P) H: کینون اکسیدوردوکتاز 1 (NQO1) در حساسیت و مقاومت به کینون های ضد تومور. بیوشیم فارماکول. 2012؛ 83 (8): 1033-40.

8. Dinkova-Kostova AT، Talalay P. NAD (P) H: گیرنده کینون اکسیدوردوکتاز 1 (NQO1)، یک آنزیم آنتی اکسیدانی چند منظوره و محافظ سلولی فوق العاده همه کاره. Arch Biochem Biophys. 2010؛ 501 (1): 116-23.

9. Cullen JJ، Hinkhouse MM، Grady M، Gaut AW، Liu J، Zhang YP، و همکاران. مهار دیکومارول از NADPH: کینون اکسیدوردوکتاز باعث مهار رشد سرطان پانکراس از طریق مکانیسم سوپراکسید می شود. سرطان Res. 2003؛ 63 (17): 5513-20.

10. Zhang X، Han K، Yuan DH، Meng CY. بیان بیش از حد NAD (P) H: کینون اکسیدوردوکتاز 1 با فعال کردن مسیر AMPK/PGC{2}} از تکثیر سلول‌های کارسینومای سلولی و آپوپتوز ناشی از آن جلوگیری می‌کند. DNA سلول بیول. 2017؛ 36 (4): 256-63.

11. Zeekpudsa P، Kukongviriyapan V، Senggunprai L، Sripa B، Prawan A. سرکوب NAD (P) H-quinone oxidoreductase 1 حساسیت سلول های کلانژیوکارسینوما را به عوامل شیمی درمانی افزایش داد. J Exp Clin Cancer Res. 2014؛ 33 (1): 1-13.

12. Dasari S، Tchounwou PB. سیس پلاتین در درمان سرطان: مکانیسم های اثر مولکولی Eur J Pharmacol. 2014؛ 740: 364-78.

13. Zhu X، Jiang X، Li A، Zhao Z، Li S. S-Allylmercaptocysteine ​​از طریق سرکوب آپوپتوز، استرس اکسیداتیو و التهاب، سمیت کلیوی ناشی از سیس پلاتین را کاهش می دهد. مواد مغذی. 2017؛ 9 (2): 166.

14. Matkowski A. کشت در شرایط آزمایشگاهی برای تولید آنتی اکسیدان ها - بررسی. Biotechnol Adv. 2008؛ 26 (6): 548-60.

15. البکری ع.ا، مصطفی حم، علم ع.ا. فعالیت آنتی اکسیدانی Rumex vicarious L. در مرحله رویشی رشد. آسیایی جی فارم کلین Res. 2012؛ 5:111-7.

16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) در استرالیا: یک تجدید نظر. نویتسیا. 1984؛ 5:75-122.

17. Shahat AA، Alsaid MS، Alyahya MA، Higgins M، Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: فعالیت القاکننده کینون اکسیدوردوکتاز 1 برخی از گیاهان دارویی عربستان سعودی. Planta Med. 2013؛ 79 (06): 459-64.

18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. مشخصات ترکیبات زیست فعال Rumex vicarious L. J Food Sci. 2011؛ ​​76 (8): C1195-202.

19. Barbosa-Filho JM، Alencar AA، Nunes XP، Tomaz AC، Sena-Filho JG، Athayde- Filho PF، و همکاران. منابع آلفا، بتا، گاما، دلتا و اپسیلون کاروتن: مروری بر قرن بیستم. سوتین Rev. 2008؛ 18 (1): 135-54.

20. Laouini SE، Ouahrani MR. غربالگری فیتوشیمیایی، فعالیت آنتی اکسیدانی و ضد باکتریایی عصاره Rumex vicarious L. in vitro. Results Study Science: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017؛ 18:367-76.