تعیین سریع همزمان شش مولفه موثر در سیستانچ توبولوزا با طیف‌سنجی مادون قرمز نزدیک

1. معرفی

Cistanche (Hoffmg. Et Link) یک جنس فانروگامیک چند ساله از خانواده گیاهان Orobanchaceae است. بسیاری از گونه های متعلق به جنس Cistanche برای هزاران سال در چین به عنوان یک گیاه دارویی مورد استفاده قرار گرفته اند. به عنوان یک تونیک برتر شهرت داشته باشد. و به «جنسینگ صحراها» معروف هستند. Cistanche tubulosa انگل اجباری ریشه گیاه چند ساله Tamarix chinensis است. در فارماکوپه چینی به عنوان منبع معتبر ثبت شده استCistanches Herba(نام چینی: Roucongrong) از نسخه 2005. تحقیقات فارماکولوژیک مدرن روی گونه های سیستانچ در دهه 1980 آغاز شد. بررسی های فارماکولوژیک نشان داد که عصاره گیاه سیستانچ دارای طیف وسیعی از فعالیت ها از جمله درمان کمبود کلیه و یبوست پیری، تقویت توانایی یادگیری و به خاطر سپردن، ضد بیماری آلزایمر، تقویت ایمنی، ضد پیری، ضد خستگی و غیره است. در سه دهه اخیر، مطالعات فارماکولوژیک جامع و سیستماتیک با تحقیقات فیتوشیمیایی ترکیب شده است تا اساس مادی اثرات مفید ریشه گیاه سیستانچ را روشن کند. این بررسی ها نشان می دهد که گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید (PhGs) اجزای اصلی مؤثر در گیاهان سیستانچ هستند که نقش کلیدی در درمان کمبود کلیه، ناتوانی جنسی، ضد پیری و ضد بیماری آلزایمر دارند. محتویات دو PhG (اکیناکوزید و ورباسکوزید) در فارماکوپه چینی مورد نیاز بود. در همین حال، کربوهیدرات هایی مانند مانیتول، ساکارز، گلوکز و فروکتوز در گیاهان سیستانچی دارای عملکرد ملین و خوشه های کربوهیدراتی هستند.گیاهان سیستانچبرای درمان یبوست استفاده شده است.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA برای افزایش تستوسترون PHGS75% ECH 30% ACT 12%

منابع وحشی C. tubulosa عمدتا در منطقه اطراف صحرای Taklamakan در جنوب منطقه خودمختار سین کیانگ در چین توزیع شده است. مانند بسیاری از گونه های دیگر که به عنوان داروهای سنتی چینی (TCM) استفاده می شوند، C. tubulosa ارزش اقتصادی زیادی دارد و به دلیل جمع آوری بیش از حد در زیستگاه وحشی خود تقریباً منقرض شده است. کشت C. tubulosa در دهه 1990 در چین برای اطمینان از تامین مواد خام گیاه Cistanches Herba و همچنین حفاظت از منابع گیاهی وحشی آغاز شد. از سال 2017، نزدیک به 13 هزار هکتار C. tubulosa کشت شده در استان هوتان در سین کیانگ وجود دارد. پیشرفت در فناوری کاشت برای گسترش کشت و همچنین بهبود کیفیت C. tubulosa مورد نیاز است.

هدف اولیه از کشت C. tubulosa تولید Cistanches Herba است که سرشار از آن اجزای موثر است. با این حال، محتویات اجزای موثر درCistanches Herbaمانند PhGs و الیگوساکاریدها می توانند به طور قابل توجهی تحت تأثیر عوامل زیادی در طول تولید قرار گیرند. یک سیستم تشخیص بلادرنگ کیفیت C. tubulosa باید مورد بررسی قرار گیرد. بنابراین، توسعه یک روش توان عملیاتی بالا برای برآورده کردن الزامات تجزیه و تحلیل تعداد زیادی از نمونه ها در یک دوره کوتاه ضروری است. به طور سنتی، تعیین آن اجزای مؤثر اولیه، مانند PhGs و کربوهیدرات‌ها، در C. tubulosa معمولاً با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) به دست می‌آمد. اگرچه دقیق و قابل اعتماد است، اما برای جمع آوری و پردازش داده ها زمان بر و پر زحمت است. علاوه بر این، زمان و تلاش زیادی نیز برای آماده‌سازی نمونه مورد نیاز است که معمولاً شامل پودر کردن، استخراج و فیلتر کردن آزمایش‌های HPLC است. بنابراین، برای به دست آوردن حجم نسبتاً زیادی از داده ها، به یک اصل روشن و ابزاری با کارکرد آسان نیاز است. خوشبختانه، طیف‌سنجی فروسرخ نزدیک (NIRS) به طور گسترده برای ارزیابی محصولات کشاورزی، مواد غذایی، نمونه‌های پزشکی و محصولات دارویی استفاده شده است، زیرا سریع و همچنین غیرمخرب است. بنابراین، NIRS می‌تواند دقیقاً با الزامات اندازه‌گیری کارآمد TCMها مطابقت داشته باشد، و جای تعجب نیست که NIRS برای شناسایی کیفی و تعیین کمیت ترکیبات در TCMها استفاده شده است.

در این پژوهش، محتویات شش مؤلفه مؤثر شاملاکیناکوزید، ورباسکوزید، مانیتول، ساکارز، گلوکز و فروکتوزدر 116 دسته از نمونه‌های C. tubulosa که از استان هوتان در سین‌کیانگ در سال‌های 2013-2015 جمع‌آوری شد، ابتدا توسط HPLC تعیین شد. سپس مدل‌های کالیبراسیون این شش مؤلفه با روش رگرسیون حداقل مربعات جزئی (PLSR) ایجاد شد. سپس این مدل‌ها با ضرایب همبستگی و خطاهای پیش‌بینی در مجموعه‌های کالیبراسیون اعتبارسنجی شدند. نتایج نشان داد که روش توسعه یافته می تواند به عنوان یک روش قابل اعتماد برای تجزیه و تحلیل کمی C. tubulosa استفاده شود.

2. نتایج

2.1. آنالیز HPLC

مطالب ازاکیناکوزید و ورباسکوزیدبا یک روش HPLC-UV به خوبی تعریف شده در ادبیات تعیین شد و چهار کربوهیدرات (مانیتول، ساکارز، گلوکز و فروکتوز) با روش HPLC-ELSD به خوبی تعریف شده در ادبیات برای تمام 116 نمونه تعیین شد. روش های آماده سازی و تعیین نمونه در بخش های 3.1 و 3.3 توضیح داده شد. شکل 1 کروماتوگرام های مشخصه استانداردهای مخلوط را نشان می دهد. مشاهده می‌شود که هر شش مؤلفه مؤثر در پایه از هم جدا شده‌اند و بنابراین می‌توانند کمیت شوند. روش HPLC قبل از آزمایش نمونه تایید شد. نتایج اصلی روش HPLC در جدول 1 آمده است. یک رابطه خطی مطلوب (r=0.9998) و بازیابی (98.5%) از روش تعیین اکیناکوزید در نتایج نشان داده شده است، همان نتیجه هر پنج مورد اجزاء. بنابراین، محتویات شش مؤلفه مؤثر را می توان به طور دقیق تعیین کرد. تمام محدوده های محتوای تعیین شده در جدول 1 خلاصه شده است.

2.2. تجزیه و تحلیل NIRS

شکل 2 طیف NIR (4{3}}-10،000 cm-1) نمونه های C. tubulosa را نشان می دهد. پیک های جذب قابل توجهی از 4000 سانتی متر-1 تا 7500 سانتی متر-1 در همه نمونه ها ظاهر شد، در حالی که نوسانات ملایم از 7500 سانتی متر-1 تا 10000 سانتی متر-1 ظاهر شد. رانش خط پایه طیف های NIR به این دلیل رخ داد که نمونه به راحتی تحت تأثیر عواملی مانند اندازه ذرات و رنگ قرار گرفت (شکل 2A). پیش تیمارهای ریاضی طیف ها برای کاهش تأثیر اطلاعات غیر ضروری تا حدی مورد استفاده قرار گرفت. پیش تیمارهای ریاضی شامل مشتق اول (اشتقاق اول)، مشتق دوم (اشتقاق دوم)، واریته نرمال استاندارد (SNV)، و تصحیح پراکندگی ضربی (MSC) بود. شکل 2B اشتقاق دوم طیف NIR از C. tubulosa را نشان می دهد و تغییرات قابل توجهی که از سه ناحیه، 4000-4500 cm-1، 5000-5500 cm-1، و 7000-7500 cm-1 رخ داده است، مشاهده شده است.

2.3. ایجاد مدلهای کالیبراسیون کمی

رگرسیون حداقل مربعات جزئی (PLSR) یک روش مدل سازی کلاسیک است و به دلیل کیفیت بالای نتایج به طور گسترده در مدل های کمی استفاده شده است. از مزایای PLSR می توان به توانایی پیش بینی خوب و سادگی نسبی آن اشاره کرد. PLSR همچنین به طور گسترده ای در ایجاد مدل های کالیبراسیون کمی TCM ها استفاده شده است [25]. بر اساس طیف های NIR پیش تیمار شده، یک مدل تجزیه و تحلیل کمی NIR برای شش جزء موثر در C. tubulosa با استفاده از روش PLSR با داده های تجزیه و تحلیل HPLC به عنوان مقادیر واقعی ایجاد شد. 116 نمونه به طور تصادفی به مجموعه های کالیبراسیون و اعتبار سنجی با نسبت 3:1 تقسیم شدند. مناسب ترین شرایط برای کالیبراسیون با RMSEC پایین و ضریب همبستگی بالا انتخاب شد.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای بهبود عملکرد جنسی PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.3.1. انتخاب باند موج برای مدل های کالیبراسیون

انتخاب یک باند موج مناسب گام مهمی برای ساخت مدل کالیبراسیون بود. در این مطالعه، طیف بازه NIR 4000-7500 سانتی متر-1 (توصیه شده توسط نرم افزار تحلیلگر TQ) و 4{14}}-10000 سانتی متر-1 با یکدیگر مقایسه شد. مشاهده شد که این محدوده برای کالیبراسیون در بازه زمانی بین 4000 سانتی متر-1 و 7500 سانتی متر-1 از جدول 2 نامناسب است. بنابراین، در مطالعه حاضر، فواصل طیفی برای شش ترکیب شیمیایی همه از بازه زمانی انتخاب شدند. 4000 تا 10000 سانتی متر-1 با مقایسه عملکرد RMSEC و ضریب همبستگی.

2.3.2. انتخاب تعداد بهینه فاکتورها برای مدل های کالیبراسیون

PLSR حداکثر میزان تغییرپذیری در داده ها را با کاهش ابعاد داده های طیفی با محاسبه عوامل توضیح می دهد. مشکل "عدم تناسب" به دلیل اطلاعات ناکافی که ناشی از تعداد محدودی از عوامل بود ظاهر شد. با این حال، انتخاب فاکتورهای بزرگتر از مقادیر بهینه معرفی شده در مدل، مشکل «بیش از حد برازش» را به همراه خواهد داشت. "عدم تناسب" یا "بیش از حد برازش" قدرت پیش بینی مدل های ایجاد شده را کاهش می دهد [22]. شکل 3 رابطه بین RMSECV و فاکتورها را برای هر شش ترکیب نشان می دهد. بنابراین، ما آن عوامل مربوط به پایین ترین مقادیر RMSECV را انتخاب کردیم. انتخاب بهینه عوامل برای مدل های کالیبراسیون در جدول 3 فهرست شده است.

2.3.3. انتخاب پیش تصفیه طیفی برای مدل های کالیبراسیون

یکی دیگر از عوامل تأثیرگذار مهم برای مدل‌های کالیبراسیون، پیش تصفیه طیفی است که با هدف کاهش تأثیر پراکندگی و رانش خط پایه، افزایش نسبت سیگنال به نویز و حذف تغییرات نامنظم انجام می‌شود. روش‌های تصحیح پراکندگی ضربی (MSC) و متغیر نرمال استاندارد (SNV) برای از بین بردن تأثیر پراکندگی تابش استفاده شد. برای حل اثرات رانش خط مبنا، طیف مشتق 1 و 2 مقایسه شد و مشتق دوم انتخاب شد. برای اثر مطلوب، طیف‌ها را با الگوریتم فیلتر Savitzky-Golay (SG) قبل از استخراج برای جلوگیری از بزرگ‌نمایی نویز صاف کردیم. جدول 3 اطلاعات مربوط به پیش تصفیه طیفی و نتایج آن را برای مدل های کالیبراسیون نشان می دهد.

2.4. ارزیابی مدل های تثبیت شده

یک مدل کالیبراسیون NIRS خوب باید مقادیر RMSEC و RMSEP پایین و همچنین ضریب همبستگی بالا (r) و تفاوت های کوچک بین RMSEC و RMSEP داشته باشد. مدل‌های کالیبراسیون شش ترکیب انتخابی طبق رویه‌های ذکر شده در بالا ایجاد شد (جدول 3). مقادیر RMSEC و r برای مجموعه کالیبراسیون اکیناکوزید به ترتیب 27.6 و 0.9808 بود. پارامترهای عملکرد سایر مدل‌های ترکیب شیمیایی در جدول 3 فهرست شده‌اند که از آن می‌توان نتیجه گرفت که مدل‌های ایجاد شده نتایج پیش‌بینی رضایت‌بخشی را نشان می‌دهند و می‌توانند برای تجزیه و تحلیل کمی سریع C. tubulosa استفاده شوند. نمودارهای پراکندگی شش ترکیب شیمیایی در شکل 4 نشان داده شده است تا مدل های کالیبراسیون را توصیفی تر و به صورت بصری مشاهده کنند. همانطور که در شکل 4 نشان داده شده است، تفاوت های جزئی بین مقادیر پیش بینی و اندازه گیری رخ داده است، زیرا اکثر نقاط در اطراف منحنی رگرسیون با معادله ای به عنوان y=x توزیع شده اند. بنابراین، عملکردهای پیش بینی عالی در شکل 4 مشاهده شد.

3. مواد و روشها

3.1. آماده سازی نمونه

یکصد و شانزده نمونه C. tubulosa از استان هوتان در منطقه خودمختار سین کیانگ از سال 2013 تا 2015 جمع‌آوری شد. همه نمونه‌ها کشت شدند، اما در مراحل مختلف رشد جمع‌آوری شدند. وزن تازه نمونه ها از 20 گرم تا 1000 گرم متغیر بود. پس از خشک شدن در آفتاب، نمونه های خشک شده خرد شده و از طریق الک مش 60- الک شدند.

3.2. مجموعه داده های طیف سنجی NIR

طیف NIR نمونه‌ها در بازه 8 سانتی‌متر-1 در ناحیه طیفی 4000-10000 سانتی‌متر-1 با سیستم Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) مجهز به جمع‌آوری شد. یک آداپتور بازتابی فیبر نوری دستی. هر طیف با میانگین 64 اسکن به دست آمد. همه نمونه‌ها قبل از اسکن طیف‌های NIR در دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد) قرار گرفتند تا اطمینان حاصل شود که نمونه‌ها در همان دما تجزیه و تحلیل شده‌اند. رطوبت در آزمایشگاه در سطح محیطی نگه داشته شد.

توبولوزای طبیعی سیستانچی برای بهبود عملکرد کلیه PHGS75% ECH 30% ACT 12%

3.3. جمع آوری داده های HPLC

3.3.1. آماده سازی استخراج

یک گرم پودر C. tubulosa با 50 میلی لیتر متانول 50 درصد در یک فلاسک مخروطی با فراصوت (500 وات، 40 کیلوهرتز) به مدت 30 دقیقه استخراج شد. عصاره در دمای 4◦C نگهداری شد. مایع رویی عصاره فیلتر شد تا نمونه ای برای آنالیز HPLC بدست آید.

3.3.2. تعیین همزمان Echinacoside و Verbascoside با HPLC-UV

تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی مایع بر روی یک سیستم UHPLC Shimadzu (Shimadzu، کیوتو، ژاپن) انجام شد که شامل دو واحد حلال LC-20ADXR، یک پمپ LC{1}AD، یک SIL{2}}ACXR خودکار است. نمونه‌بردار، یک کوره ستونی CTO{3}}AC، یک آشکارساز SPD-M20A DAD، یک دستگاه گاززدایی DGU-20A3R، و یک کنترلر CBM-20.

یک ستون ES کربوهیدرات Grace Prevail (150 × 2.1 میلی‌متر، 2.7 میلی‌متر) که برای جداسازی‌های کروماتوگرافی استفاده شد در دمای 35 درجه سانتیگراد نگهداری شد. فاز متحرک شامل استونیتریل (A) و 0.1% اسید فرمیک آبی (B) بود و با برنامه گرادیان به شرح زیر تحویل داده شد: 0-7 دقیقه، گرادیان خطی 10-20% آ؛ 7-15 دقیقه، 20٪ A; و 15-20 دقیقه، گرادیان خطی 20-10٪ A. سرعت جریان فاز متحرک 0.4 میلی لیتر در دقیقه بود. مانیتورینگ UV در 330 نانومتر انجام شد.

3.3.3. تعیین همزمان مانیتول، ساکارز، گلوکز و فروکتوز با HPLC-ELSD

HPLC بر روی یک سیستم LC سری Agilent 1100 (پالو آلتو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) متشکل از گاززدایی G1322A، یک پمپ چهارتایی G1311A، یک نمونه گیری خودکار G1311A، یک کنترل کننده دمای ستون G1316A و یک آشکارساز DAD G1315B انجام شد.

یک ستون ES کربوهیدرات Sigma Prevail (4.6 × 250 میلی متر، 5 میکرومتر) برای جداسازی کروماتوگرافی استفاده شد و در دمای ستون 25 ◦C نگهداری شد. فاز متحرک از استونیتریل و آب (77:23، حجم / حجم) و متحد ایزوکراتیک با سرعت جریان 0.7 میلی لیتر در دقیقه تشکیل شده است. پساب با استفاده از آشکارساز پراکندگی نور تبخیری (ELSD) با پارامترهای پیش فرض کنترل شد.

3.4. پردازش داده ها

TQ Analyst (نسخه 8.0، Thermo Scientific، Madison، WI، USA) برای انجام تقسیم مجموعه های کالیبراسیون و اعتبارسنجی، پیش تصفیه ریاضی طیف ها، ایجاد مدل های کالیبراسیون و سایر محاسبات استفاده شد. . از Origin (نسخه 9.1) برای ساخت فیگورها استفاده شده است.

4. نتیجه گیری

در این مطالعه، ما یک روش سریع و غیر مخرب برای تجزیه و تحلیل همزمان پیشنهاد کردیماکیناکوزید، ورباسکوزید، مانیتول، ساکارز، گلوکز و فروکتوزکه درC. tubulosaتوسط NIRS. تجزیه و تحلیل مقادیر RMSEC، ضریب همبستگی، RMSEP و Rp نشان داد که از مدل‌های کمی NIR می‌توان برای پیش‌بینی دقیق محتویات شش مؤلفه مؤثر انتخاب‌شده درC. tubulosa. در مقایسه با HPLC، روش NIRS گزارش شده در این مطالعه می تواند باعث صرفه جویی قابل توجهی در کار و زمان شود، در حالی که توانایی تجزیه و تحلیل کمی رضایت بخش را حفظ می کند. بنابراین، روش گزارش شده در اینجا پتانسیل استفاده در کنترل کیفیت را داردC. tubulosaو در نتیجه برای هدایت توسعه کشت و فناوری فرآیند برایC. tubulosa.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای بهبود عملکرد جنسی PHGS75% ECH 30% ACT 12%