CD169 به علاوه ماکروفاژهای رزیدنت کلیه برای محافظت در برابر کاندیدیازیس سیستمیک حاد ضروری هستند

edmund.chen@wecistanche.com

مقدمهکاندیدیازیس سیستمیک چهارمین عفونت شایع بیمارستانی جریان خون است که تخمین زده می‌شود که هر ساله بیش از 250 بیمار بخش مراقبت‌های ویژه را تحت تأثیر قرار دهد، علی‌رغم اجرای اقدامات بهداشتی در بیمارستان‌ها (Delaloye & Calandra, 2014; Kullberg & Arendrup, 2015). اگرچه درمان فعلی این عفونت عمدتاً از داروهای ضد قارچی استفاده می‌کند، اما میزان مرگ و میر در میان بیماران به طور نگران‌کننده‌ای بالاست (40 تا 60 درصد) (Delaloye & Calandra، 2014؛ Bassetti و همکاران، 2018؛ Lamoth و همکاران، 2018). با این حال، هیچ واکسنی از نظر بالینی تا به امروز در دسترس نیست. با افزایش جمعیت بیماران بستری که از بیماری های مزمن رنج می برند و موارد در حال ظهور مقاومت به داروهای ضد قارچی، درک ایمنی میزبان در برابر چنین عفونتی در توسعه ایمونوتراپی برای بهبود یا تکمیل مداخلات ضد قارچی فعلی مهم خواهد بود (Armstrong-James et al, 2017; Desai; و همکاران، 2017؛ باستی و همکاران، 2018). فاگوسیت‌ها، به‌ویژه فاگوسیت‌های پلی‌مورفونوکلئر (نوتروفیل‌ها) که به‌عنوان بازیگر اصلی در ایمنی ضد قارچی مهاجم شناخته می‌شوند، از مکانیسم‌های مختلفی در کنترل عفونت‌های قارچی مانند فاگوسیتوز، آزادسازی گونه‌های فعال اکسیژن (ROS) و پروتئین‌های میکروب‌کشی (و تشکیل NETosis) استفاده می‌کنند. بورگارد، 2010؛ مانتوانی و همکاران، 2011). نقش محوری نوتروفیل ها در ایمنی کاندیدا توسط ارتباط بالینی نوتروپنی و نقص نوتروفیل به عنوان عوامل مستعد کننده برای کاندیدیازیس سیستمیک تأکید می شود (Lehrer & Cline, 1969; Wisplinghoff et al, 2004; Pfaller & Diekema, 200; Pfaller & Diekema, 2001, 200). . با این حال، نقش فاگوسیت های تک هسته ای مختلف در این عفونت در داخل بدن بسیار کمتر شناخته شده است، که تا حدی به دلیل فقدان ابزارهای موجود در تعیین ماکروفاژهای مختلف و زیرمجموعه های سلول های دندریتیک است.کلیه ها,که اندام های هدف اصلی کاندیدیازیس سیستمیک هستند (Schraml et al, 2013; Gottschalk & Kurts, 2015).

کلید واژه ها:کلیه; آسیب کلیه؛ بافت کلیه؛ قارچ کلیه؛ آسیب کلیوی؛ عملکرد کلیه

CISTANCHE عملکرد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

اهمیت ماکروفاژها در ایمنی مهاجم کاندیدا، تا جایی که ما می دانیم، اولین بار توسط لیوناکیس و همکاران (2013) به شدت نشان داده شده است. بهره گیری از موش های CX3CR1gfp/gfp، که در آن تعداد آنها ازکلیهلیوناکیس و همکاران (2013) نشان دادند که جمعیت ماکروفاژها به شدت کاهش می یابدکلیهماکروفاژهای ساکن مدافعان خط اول مهم در برابر حمله C. Albicans هستند (Lionakis et al, 2013). همچنین، به نظر می رسید که این ماکروفاژها در تنظیم جذب نوتروفیل درگیر هستندکلیه هادر طول عفونت کاندیدا (کانایاما و همکاران، 2015). علاوه بر ترویج پاکسازی قارچی، ماکروفاژها در این بیماری نقش دارندکلیهترمیم بافت (ترن و همکاران، 2015). CD169، همچنین به عنوان سیالواهزین یا لکتین 1 شبه ایمونوگلوبولین متصل شونده به اسید سیالیک (Siglec{5}}) نیز شناخته می شود، قبلاً گزارش شده است که نشانگر خاصی است که ماکروفاژهای ساکن بافت (TRMs) را در اندام های محیطی مختلف مانند ریه ها شناسایی می کند. ، طحال، کبد وکلیه ها(پورناما و همکاران، 2014؛ کاراساوا و همکاران، 2015؛ گوپتا و همکاران، 2016؛ سودووا و همکاران، 2017). جالب اینکه،کلیهCD169 به علاوه ماکروفاژها با تنظیم ایمنی، یا به سمت پیشرفت آسیب شناسی ایمنی یا رفع نقص ایمنی، بسته به مدل های بیماری/آسیب مرتبط بوده اند (Chavez-Galan et al, 2015). با این حال، اطلاعات کمی در مورد نقش عملکردی in vivo CD169 به علاوه ماکروفاژها در ایمنی سیستمیک کاندیدا وجود دارد. در اینجا، ما آن را نشان می دهیمکلیهCD169 plus ماکروفاژها تنظیم کننده های ایمنی مهم در عفونت سیستمیک حاد کاندیدا هستند. فقدان CD169 پلاس ماکروفاژها پاسخ IFN و تولید نوتروفیل ROS را کاهش می دهد.کلیه ها.در نتیجه، موش‌هایی که فاقد CD169 بعلاوه ماکروفاژها هستند، به عفونت کاندیدا با دوز پایین تسلیم می‌شوند و بار قارچی بسیار بالا و شدید را نشان می‌دهند.کلیهآسیب شناسی ایمنی

نتایج

CD169 plus plus ماکروفاژها زیرجمعیتی از TRMهای کلیوی هستندبرای بررسی TRM های کلیوی، ما از یک مدل موش تراریخته CD{0}}DTR استفاده کردیم که به طور خاص TRM ها را در درمان سم دیفتری (DT) به دلیل بیان CD169 آن ها از بین می برد (Purnama et al, 2014; Gupta et al, 2016; Chen & Ruedl). ، 2020). علاوه بر CD169، سطح بیان بالای F4/80 و سطح متوسط ​​CD11b در آنالیز سیتومتری همکار ما برای متمایز کردن TRM ها از سایر زیرجمعیت های ماکروفاژ استفاده شد (شنگ و همکاران، 2015) (شکل 1A). جالب است که تنها بخشی از جمعیت ازکلیهماکروفاژهای CD11bint F4/80hi در موش‌های تراریخته CD{3}}DTR تحت درمان با DT (شکل 1A و B) حذف شدند، که نشان‌دهنده ناهمگونی جمعیت ماکروفاژهای CD11bint F4/80hi درکلیهبه موازات مشاهدات ما، کاراساوا و همکاران (2015) همچنین اشاره کردند که تنها زیر مجموعه ای ازکلیهTRMs CD169 را بیان می کند (Karasawa et al, 2015). به طور خاص، آنها نشان دادند که CD169 به علاوه TRM ها عمدتاً در ناحیه بومی سازی می شوندکلیهناحیه مدولار، که با رنگ‌آمیزی‌های ایمونوفلورسانس ما تأیید می‌شود (شکل 1C).

در اینجا، ما اشاره کردیم که CD169 پلاس پلاس حذف شده سطوح نسبتاً پایین‌تری از F4/80 و CD11b (F4/80 به علاوه CD11b پلاس) را بیان می‌کنند، در حالی که TRM‌های کاهش‌یافته سطوح نسبتاً بالاتری از F4/80 و CD11b (F4/80 به علاوه پلاس) را بیان می‌کنند. به علاوه CD11b به علاوه پلاس). با این حال، این دو جمعیت TRM در موش‌های WT قابل تشخیص نیستند (شکل 1A). از این رو، بر اساس TRM های قطع شده و کاهش نیافته، ما آنها را به طور کلی به بخش I (Fr I) (CD169 به علاوه F4/80 به علاوه CD11b به علاوه) و کسر II (Fr II) (CD169 به علاوه F4/80 به علاوه به علاوه CD11b زیر دسته بندی کردیم. به علاوه به علاوه) جمعیت (شکل 1A و B). قابل توجه، کاهش قابل توجه و در عین حال ناچیز جمعیت Fr II در موش های CD{23}DTR همچنین نشان می دهد که برخی از جمعیت Fr II CD169 را بیان می کنند. نمایه فرسایش TRM در موش CD{25}}DTR با بیان رونوشت CD169 مطابقت دارد، که در آن جمعیت FrI سطح قابل توجهی بالاتری از CD169 را در مقایسه با جمعیت Fr II بیان می‌کند (شکل 1D). به همین ترتیب، سطوح بالاتر فاکتور رشد شبه EGF متصل به هپارین انسانی (HB-EGF)، گیرنده DT، در Fr I در مقایسه با Fr II TRM مشاهده شد و حساسیت آنها را به درمان DT توضیح می دهد (شکل 1E).

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

عدم وجود CD169 کلیه به علاوه ماکروفاژها مقاومت میزبان در برابر کاندیدیازیس منتشر را به شدت به خطر انداخت.برای ارزیابی اهمیت CD169 به علاوه ماکروفاژها، موش‌های CD{1}DTR و WT با دوز پایین 5 × 104 cfu C. Albicans به چالش کشیده شدند و بقای آنها به مدت 18 روز بررسی شد. در طول دوره عفونت، موش‌ها به‌طور مداوم با DT تحت درمان قرار گرفتند تا از تخریب مداوم جمعیت FrI در موش‌های CD169-DTR اطمینان حاصل شود (شکل S1). کاهش نسبی ماکروفاژهای FrI نیز در موش‌های WT آلوده در روز 3 پس از عفونت (pi) مشاهده شد (شکل 1F)، که می‌تواند نتیجه نکروپتوز ماکروفاژ باشد، رویدادی که گزارش شده است در طول عفونت‌های بیماری‌زا رخ می‌دهد (Lai et al. ، 2018؛ کائو و همکاران، 2019). برعکس، فرسایش کامل ماکروفاژهای FrI در موش‌های CD{11}DTR عمدتاً به دلیل آپوپتوز ناشی از درمان DT بود. با این وجود، تعداد ماکروفاژهای FrI در موش‌های CD{12}DTR به طور مداوم و قابل ملاحظه‌ای کمتر از موش‌های WT در طول دوره عفونت بود. از سوی دیگر، تعداد کل ماکروفاژهای Fr II بین موش‌های WT و CD{13}DTR آلوده قابل مقایسه بود (شکل 1F، پانل سمت راست). در نتیجه، موش‌های CD{15}DTR که فاقد TRMهای FrI هستند، به طور مشخصی نسبت به موش‌های WT آسیب‌پذیرتر بودند که با عفونت سیستمیک کاندیدا به چالش کشیده شدند (شکل 1G).

موش‌های CX3CR1gfp/gfp قبلاً برای بررسی عملکرد استفاده شده‌اندکلیهTRM به دلیل از دست دادن کل آنکلیهF4/80 به علاوه CD11b به علاوه جمعیت (لیوناکیس و همکاران، 2013). بنابراین، مقایسه بین موش‌های CX3CR1gfp/gfp و CD{6}DTR به ما امکان می‌دهد پیامدهای عملکردی بین از دست دادن جزئی و کلی جمعیت TRMs کلیوی را درک کنیم. برای دستیابی به این هدف، ما موش‌های CD169-DTR، CX3CR1gfp/gfp و WT را با C. Albicans 5×104 cfu آلوده کردیم. مشابه آنچه قبلا گزارش شده بود، موش‌های CX3CR1gfp/gfp فقدان کامل TRMهای کلیوی (هر دو جمعیت Fr I و II) را نشان دادند، در حالی که موش‌های CD{14}DTR کاهش مشخص‌تری از جمعیت Fr I را نشان دادند (شکل S2A و B ). به همین ترتیب، فقدان هر دو ماکروفاژ Fr I و II موش‌های CX3CR1gfp/gfp را بسیار مستعد ابتلا به کاندیدیازیس سیستمیک (شکل S2C) با بار قارچی کلیوی بسیار بالا در اوایل روز 1 pi در مقایسه با WT و CD آلوده کرد. }}موش DTR (شکل S2D). در مقابل، موش‌های CD{22}DTR مرگ‌ومیر کمتری نسبت به موش‌های CX3CR1gfp/gfp (شکل‌های 1G و S2C) نشان دادند.کلیهبار قارچی تنها به طور قابل توجهی بیشتر از موش WT آلوده در روز 10 بود (شکل 2A و B). از آنجایی که موش‌های CD{3}}DTR و CX3CR1gfp/gfp تحت درمان با DT فاقد TRM در سایر اندام‌ها هستند (Hochheiser و همکاران، 2013؛ Gupta و همکاران، 2016؛ لی و همکاران، 2018)، بارهای قارچی را در اندام‌های محیطی متعدد ارزیابی کردیم. ، به این معنا که،کلیه،مغز، قلب، ریه، کبد و طحال، در موش‌های WT، CD{0}DTR، و CX3CR1gfp/gfp آلوده در روز 1 پی، در هر دو موش CD{{4}DTR و CX3CR1gfp/gfp، کلیه‌ها تنها اندام هایی بودند که بار قارچی به طور مشخص بالاتری نسبت به بقیه اندام های مورد بررسی داشتند (شکل S2D). افزایش میزان بار کاندیدا در کلیه های CX3CR1gfp/gfp در روز اول، یافته های گزارش شده توسط Lionakis و همکاران (2013) را تایید می کند.کلیهTRM ها برای آن حیاتی هستندکلیهدفاع خط اول در برابر عفونت سیستمیک کاندیدا (لیوناکیس و همکاران، 2013).

از سوی دیگر،کلیهبار قارچی در موش‌های CD{0}DTR به‌طور قابل‌توجهی کمتر از موش‌های CX3CR1gfp/gfp بود، اما به طور مشخص بالاتر از WT آلوده نبود.کلیه هادر روز 1 پی (شکل S2D). از آنجایی که جمعیت Fr II در موش‌های CD169-DTR (شکل S2A و B) نسبتاً دست نخورده باقی می‌ماند، ما این سؤال را مطرح کردیم که آیا افزایش مقاومت مشاهده شده در موش‌های CD169-DTR، در مقایسه با موش‌های CX3CR1gfp/gfp، عمدتاً بود یا خیر. به دلیل باقیمانده ماکروفاژهای بدون کاهش Fr II کلیه که مانع از حمله بیشتر C. Albicans به لوله های کلیوی می شوند، منطقه ای که سلول های ایمنی بسیار کمی در طول حالت پایدار تشخیص داده شدند. برای این منظور، بار قارچی اندام‌های مختلف را در موش‌های WT و CD{8}}DTR در روزهای 1، 3، 6 و 10 pi بررسی کردیم (شکل 2). در اینجا، داده‌های ما وابستگی محدود به کلیه CD169 بعلاوه ماکروفاژها را در پاکسازی قارچی نشان داد، زیرا همه اندام‌ها، به جز کلیه‌ها، در موش‌های CD{16}}DTR تا روز 10 پی از C. Albicans پاکسازی شدند (شکل 2A) . جالب توجه است که علیرغم از بین رفتن زیرمجموعه Fr I، بار قارچی در موش‌های CD{19}} DTR به طور مشابه موش‌های WT آلوده (روز 0-6) (شکل 2A و B) افزایش یافت، که نشان‌دهنده حداقل نقش CD169 کلیوی پلاس پلاس است. ماکروفاژها در ایجاد دفاع خط اول در برابر این عفونت. تفاوت در بار قارچی کلیه بین موش‌های CD{25}DTR و WT تنها در روز 10 پی تشخیص داده شد، که در آن بار قارچی کلیه‌های تخلیه‌شده CD{27}به تشدید ادامه می‌یابد، در حالی که به نظر می‌رسد که در موش‌های WT وجود دارد. موجود یا پاک شده است (شکل 2B). بنابراین، داده‌های ما نقش ضروری CD169 به علاوه ماکروفاژها را در ایمنی کاندیدا کلیه نشان می‌دهد، اما احتمالاً سهم کمی در دفاع خط اول کلیوی در برابر چنین عفونتی دارد. به طور شگفت انگیزی، از آنجایی که موش های CX3CR1gfp/gfp فاقد هر دو ماکروفاژ FrI و Fr II بودند و حساسیت افزایش یافته را در اوایل روز 1 پی (شکل S2) نشان دادند، ما فرض کردیم که Fr II CD169 به علاوه ماکروفاژها عمدتاً مسئول مکانیسم ذاتی حیاتی قارچ های کلیوی اولیه هستند. کنترل.

موش‌های CD169-DTR از آسیب غیرقابل برگشت و پیشرونده کلیه در طول عفونت کاندیدا رنج بردنداز آنجایی که کلیه ها تنها اندام هایی بودند که C. آلبیکنس در طی عفونت در آن تجمع یافتند (شکل 2A)، ما در مرحله بعدی یک بررسی هیستوپاتولوژیک از مقاطع رنگ آمیزی شده با اسید پریودیک - شیف (PAS) (شکل 2C) - و H&E (شکل 3A و S3) انجام دادیم. از کلیه‌های WT و CD{4}DTR آلوده در روزهای 3، 6 و 10 پی در روز 3، علائم آسیب کلیوی و خونریزی در کلیه‌های CD169-DTR مشاهده شد (شکل S3A). در روز 6، کلیه‌های WT آلوده علائم جزئی آسیب لوله‌ای و اندوتلیال را نشان دادند، در حالی که کلیه‌های CD{12}DTR آلوده خونریزی‌های شدیدتر و نکروز لوله‌ای را نشان دادند (شکل S3B). در هر دو کلیه‌های WT و CD{14}DTR آلوده، به نظر می‌رسد که اکثر C. Albicans در لگن کلیه جمع می‌شوند (شکل 2C). قابل توجه، تجمع لکوسیت ها در محل در هر دو WT و وجود دارد

کلیه های CD169-DTR، نشان می دهد که رشد کنترل نشده C. Albicans در کلیه های CD169-DTR به دلیل عدم جذب لکوسیت ها نیست (شکل 2C و 4A). در روز 10، یکپارچگی ساختاری کلیه‌های CD{5}DTR بدتر شد، همراه با ظاهر بافت‌های فیبروتیک (شکل‌های 3A و S3C). به طور خاص، بزرگ شدن فضای بومن و ریزش برجسته سلول های اپیتلیال لوله ای و خوشه های لکوسیت در لومن برخی از لوله های کلیوی کلیه های CD{8}DTR به وضوح قابل مشاهده بود (شکل 3A). در مقابل، تا روز 10، به نظر می‌رسد که بیشتر نواحی کلیوی در کلیه‌های WT دست نخورده باقی می‌مانند، که نشان‌دهنده بهبودی از عفونت اولیه است (شکل 3A و S3C). به موازات آنالیزهای بافت شناسی کلیه، سطح مولکول آسیب کلیه-1 (Kim-1) را در کلیه WT و CD{15}} DTR آلوده، یک نوع-1 پروتئین گذرنده، ارزیابی کردیم. که در آن بیان آن تنها با آسیب در لوله‌های کلیوی افزایش می‌یابد (Ichimura و همکاران،

1998; هان و همکاران، 2002; بونونتر، 2009). داده‌های ما نشان داد که بیان Kim{3}} در کلیه‌های موش‌های CD{4}DTR آلوده به شدت بالاتر از WT آلوده در روز 10 pi بود (شکل 3B). علاوه بر این، یکپارچگی پوشش اندوتلیال در کلیه‌های موش‌های CD{7}}DTR به طور قابل‌توجهی ضعیف شده بود، همانطور که با مقدار بیشتری از Evan's Blue حفظ شده در کلیه‌های CD169-DTR مشهود بود (شکل 3C). قبلاً نشان داده شده بود که CD169 به علاوه ماکروفاژها ضد التهاب هستند، که در آن فقدان این ماکروفاژها منجر به التهاب بیش از حد در عفونت باکتریایی یا آسیب ایسکمی خونرسانی مجدد شد (Karasawa et al, 2015; Svedova et al, 2017). مطابق با این مدل‌ها، کلیه‌های موش‌های CD{16}}DTR با سطوح بالاتر التهاب (یعنی TNF-، G-CSF، و M-CSF) مرتبط بودند و مشخص شد که عملکرد کلیه به‌طور چشمگیری در معرض خطر قرار می‌گیرد.

فقدان CD169 کلیوی به علاوه ماکروفاژها به جذب سلول های موثر در طول عفونت کاندیدا آسیبی وارد نکرد.از آنجایی که پاکسازی ناکارآمد کاندیدا در کلیه‌های CD{{0}}}DTR می‌تواند به دلیل عدم جذب سلول‌های مؤثر باشد، ما نفوذ نوتروفیل و مونوسیتی را در کلیه‌های موش‌های WT و CD169-DTR بررسی کردیم. در روز 0، 1، 3، 6 و 10 پی مشابه مشاهدات بافت شناسی ما (شکل 2C)، عدم وجود ماکروفاژهای CD169 کلیه به علاوه FrI بر جذب لکوسیت ها در طول عفونت تأثیری نداشت (شکل 4A). درعوض، کلیه‌های CD{10}DTR با بیان بیشتر کموکاین‌های جذب کننده نوتروفیل و مونوسیت (مانند CXCL1، CXCL2، و CCL2) و مولکول‌های چسبنده سلولی (مانند ICAM{16}}) مرتبط بودند (شکل 4B) و سی). افزایش سطح کموکاین‌ها در کلیه CD{18}DTR، به‌طور بالقوه به دلیل رشد بی‌بند و باری C. Albicans، با افزایش میزان نفوذ سلول‌های ایمنی از روز 6 تا 10 پی‌پیوند مرتبط است، در مقابل، علائم کمی از C. آلبیکنس در کلیه های WT و سلول های ایمنی تا حد زیادی در روز 10 پی پاک شدند (شکل 2B و 4A). بنابراین، داده‌های ما نشان می‌دهد که CD169 کلیوی به علاوه ماکروفاژها بازیگران اصلی در به‌کارگیری سلول‌های مؤثر، به‌ویژه نوتروفیل‌ها، در طول عفونت کاندیدا نبوده‌اند.

نوتروفیل‌ها در کلیه‌های CD{{0}DTR تولید ROS کمتری تولید می‌کننددر مرحله بعد، ما به بررسی اینکه آیا فقدان CD169 به علاوه ماکروفاژها تأثیر نامطلوبی بر پاسخ کاندیداسیال میزبان در کلیه ها می گذارد، پرداختیم. برای این منظور، ما مقدار نوتروفیل‌ها و مونوسیت‌های تولیدکننده ROS را در کلیه‌های WT و CD{2}DTR آلوده در روز 6 پی - روزی که کلیه‌های WT و CD{4}DTR بار قارچی مشابهی را نشان دادند، ارزیابی کردیم. و نفوذ سلولی (شکل 2B و 4A). جالب توجه است که ما مقدار کمتری از نوتروفیل‌های تولیدکننده ROS، اما نه مونوسیت‌ها را در کلیه‌های CD{8}DTR در مقایسه با WT مشاهده کردیم (شکل 5A و B). به همین ترتیب، این نوتروفیل‌ها در کلیه‌های CD{10}DTR سطوح قابل‌توجهی پایین‌تری از ROS نسبت به کلیه‌های WT ایجاد کردند که نشان‌دهنده توانایی پایین‌تر از بین بردن نوتروفیل‌ها است (شکل 5C و D).

در مرحله بعد به دنبال این بودیم که مشخص کنیم آیا کاهش عملکرد کاندیداسیدیال در کلیه‌های CD{0}DTR با کاهش زنده‌مانی نوتروفیل‌ها همراه است یا خیر. با کمال تعجب، هر دو کلیه WT و CD{1}DTR آلوده نسبت مشابهی از انکسین PIneg V به همراه آپوپتوز و PI به علاوه انکسین V به همراه نوتروفیل های مرده را نشان دادند (شکل 5E و F). این نشان می‌دهد که زنده ماندن نوتروفیل‌ها یکی از عواملی نیست که به عملکرد کاندیدایی آن‌ها کمک می‌کند در کلیه‌های CD{3}}DTR بیان IFN کلیوی در غیاب CD169 به علاوه ماکروفاژها به طور قابل‌توجهی کمتر بود. ارتباط کلیرانس ناکارآمد کاندیدا و کاهش ROS سطح نوتروفیل‌های کلیه‌های CD{5}}DTR ما را بر آن داشت تا سطح بیان IFN در کلیه‌های WT و CD{6}} آلوده را در روز 6 پی بررسی کنیم. توانایی کاندیدایی نوتروفیل ها (Diamond و همکاران، 1991؛ Kullberg و همکاران، 1993؛ Stevenhagen & van Furth، 1993؛ Nader-Djalal & Zadeii، 1998). به طرز جالبی، ما کاهش بیان IFN کلیوی را در کلیه‌های CD{13}DTR آلوده با qPCR (شکل 6A) و همچنین با تجزیه و تحلیل سیتومتری (شکل 6B) مشاهده کردیم.

سلول های تولید کننده IFN به یک زنجیره کاپا سبک CD19int به علاوه جمعیت سلولی محدود می شونددر مرحله بعد، ما سعی کردیم نوع سلول های ایمنی را که IFN را در روز 6 پی تولید می کنند مشخص کنیم (شکل 7A). در کمال تعجب، این سلول های تولید کننده IFN عبارتند از Ly6CintLy6Glo، F4/80loCD11blo، MHCII به علاوه CD11clo، CD49bnegCD3neg و CD8negCD4neg، که نشان می دهد آنها لنفوسیت T، APC های کلاسیک و گرانولوسیت نیستند. در عوض، این سلول‌های تولیدکننده IFN، که به‌طور مشخص در کلیه‌های CD{14}DTR آلوده کاهش می‌یابند (شکل 7B)، MHCII، زنجیره سبک کاپا، و CD19int را بیان می‌کنند که نشان‌دهنده جمعیتی شبیه سلول‌های B است (شکل 7A) . از آنجایی که سلول‌های NK تعدیل‌کننده‌های مهمی برای تقویت مکانیسم‌های ضد قارچی فاگوسیت‌ها با ترشح IFN در عفونت‌های کاندیدا هستند (Bhatnagar et al, 2010; Costantini et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et al, 2014)، ما آخرین بار تلاش کردیم که سلول های NK برای تنظیم تولید IFN در این عفونت مورد نیاز هستند. برای این منظور، ما سلول‌های NK را در داخل بدن تخریب کردیم و سطح بیان IFN را در کلیه‌های آلوده در روزهای 2 و 6 پی ارزیابی کردیم. شکل S4A-C).

بحث

TRM ها واسطه پاسخ های ذاتی مهم در بیماری های عفونی مختلف هستند و به طور کلی به عنوان جمعیت F4/80hi و CD11b به علاوه شناخته می شوند. Sialoadhesin، همچنین به عنوان CD169 شناخته می شود، مشخص شد که تنها توسط زیر مجموعه ای از TRM در کلیه بیان می شود (Karasawa et al, 2015). با این حال، هیچ گزارش بعدی در مورد CD169 کلیه به همراه TRM وجود نداشت. داده های ما از یافته های اخیر حمایت می کند که TRM های کلیوی همگن نیستند و می توان آنها را به طور کلی به دو زیر مجموعه، یعنی F4/80 plus plus تقسیم کرد.

CD11b plus (CD169 plus plus ) TRM و F4/80 plus plus plus CD11b plus plus (CD169 plus ) TRM. با استفاده از موش‌های CX3CR1gfp/gfp و CD{8}DTR، به این نتیجه رسیدیم که هر دو CD169 پلاس پلاس TRM و CD169 پلاس TRM برای ایمنی سیستمیک کاندیدا ضروری هستند، که در آن هر زیر مجموعه عملکردهای متفاوتی را در ایمنی کلیوی کاندیدا نشان می‌دهد. به طور خاص، CD169 plus TRM در کنترل رشد C. albicans کلیه در مرحله بعدی عفونت حیاتی است، در حالی که CD169 plus TRM با محدود کردن رشد قارچ در مرحله اولیه عفونت، در دفاع خط اول کلیوی بسیار مهم است. به همین ترتیب، فقدان CD169 به علاوه TRM منجر به کاهش مشخص تولید ROS در نوتروفیل ها و IFN کلیه شد. تحقیقات بیشتر برای درک مکانیسم های عملکرد CD169 کلیه به علاوه TRM در کنترل رشد قارچ و تولید IFN ضروری است.

داده‌های ما نشان داد که کلیه اندام هدف اولیه است که در آن کاندیدا آلبیکنس باقی می‌ماند، و این با گزارش‌های قبلی که نشان‌دهنده اهمیت ایمنی کلیوی در کاندیدیازیس منتشر تجربی و مرگ‌ومیر موش‌های بعدی است مطابقت دارد (Spellberg)

و همکاران، 2003; MacCallum & Odds، 2005; لیوناکیس و همکاران، 2011; ناواراتنا و همکاران، 2012، 2019; هبکر و همکاران، 2016). به طور خاص، با وجود فرسایش TRMs در تمام اندام‌های محیطی در موش‌های CD{6}DTR، کلیه‌ها به‌عنوان تنها اندامی با C. Albicans باقی ماندند، از این رو نقش متمایز TRMs کلیه در ایمنی سیستمیک کاندیدا برجسته شد. اگرچه کلیه اندام هدف اصلی است که ممکن است به طور مداوم در همتایان انسانی منعکس نشود، اما اعتقاد بر این است که ایمنی کلیوی بخشی جدایی ناپذیر از مقاومت میزبان در برابر این عفونت است زیرا عفونت کلیوی کاندیدا در بیماران دچار نقص ایمنی مشاهده شده است (Lionakis, 2014; Xu & Shinohara، 2017). رشد کنترل نشده کاندیدا آلبیکنس در کلیه ها قبلاً به دلیل جذب آهسته یا تاخیری سلول های میلوئید ذاتی نسبت داده شده است (لیوناکیس و همکاران، 2011). با این حال، در مدل عفونت خود، ما نفوذ عملکردی سلول‌های ایمنی را در کلیه‌های موش WT مشاهده کردیم. علاوه بر این، CXCL1 و CCL2 در کلیه‌های WT آلوده به‌عنوان 12 ساعت پس از عفونت قابل تشخیص هستند و از جذب سریع سلول‌های میلوئیدی ذاتی حمایت می‌کنند (MacCallum و همکاران، 2009). همچنین گزارش شده است که استخدام سلول های ایمنی توسط ماکروفاژها، سلول های DC، اپیتلیال و اندوتلیال تنظیم می شود (Netea et al, 2002; Tuite et al, 2004; Tran et al, 2015). به طور خاص، نشان داده شده است که ماکروفاژها نوتروفیل ها را در مراحل اولیه عفونت از طریق بیان CXCL2 جذب می کنند (Kanayama و همکاران، 2015؛ Xu & Shinohara، 2017). با این وجود، موش‌های CD{20}DTR جذب سلولی مشابهی با موش‌های WT برای کلیه‌ها نشان دادند، که نشان می‌دهد هماهنگ‌سازی نفوذ سلولی توسط CD169 به علاوه TRMs آغاز یا به آن کمک نمی‌شود.

اخیراً، Karasawa و همکاران (2015) یک زیرمجموعه کوچک از مونوسیت های Ly6Clo کلیه را گزارش کردند که در عروق ساکن هستند که CD169 را بیان می کند (Karasawa et al, 2015) و همراه با CD169 به علاوه ماکروفاژها، نقش مهمی در جلوگیری از التهاب بیش از حد در ایسکمی کلیوی برانگیختند. آسیب خونرسانی مجدد TRM های مرتبط با عروق نیز در سایر اندام ها مانند روده (Honda et al, 2020) و بافت چربی (Silva et al, 2019) توصیف شده اند، جایی که آنها از تون و یکپارچگی عروق پشتیبانی می کنند (داده های منتشر نشده). بنابراین مونوسیت ها/TRM های مرتبط با عروق به طور بالقوه می توانند نقش مشابهی در کلیه داشته باشند و به پیشرفت کاندیدیازیس سیستمیک کمک کنند. درک ماکروفاژهای کلیوی به دلیل فقدان ابزارهای موجود و نشانگرهای فنوتیپی برای تعیین این فاگوسیت های تک هسته ای محدود شده است (Gottschalk & Kurts، 2015؛ Kurts et al، 2020). علیرغم تلاش برای درک ماکروفاژهای کلیوی از طریق مطالعات ردیابی نسب و رونویسی (Hochheiser et al, 2013; Cao et al, 2015; Munoz et al, 2019; Liu et al, 2020; Salei et al, 2020) بسیار کمتر برای عملکرد زیر مجموعه های TRM کلیوی در زمینه بیماری های عفونی شناخته شده است. اگرچه قبلاً نشان داده شده بود که ماکروفاژهای کلیوی قادر به محدود کردن مستقیم رشد و تهاجم C. albicans به توبول های کلیوی هستند، داده های ما نشان می دهد که زیر مجموعه CD169 به علاوه TRM در این مکانیسم های محافظتی اولیه شرکت نمی کند (مارسیل و همکاران، 2002؛ لیوناکیس). و همکاران، 2013؛ مونوز و همکاران، 2019). در عوض، داده‌های موش‌های CX3CR1gfp/gfp نشان می‌دهد که زیرمجموعه CD169 به علاوه TRM، جمعیت مؤثر اصلی برای ارائه دفاع اولیه کلیوی در برابر حمله C. Albicans است.

نوتروفیل‌ها سلول‌های مؤثر ذاتی یکپارچه در ایمنی کاندیدا هستند (Fulurija et al, 1996; Aratani et al, 1999; Netea et al, 2015) و بیمارانی که از نوتروپنی و نقص نوتروفیل رنج می‌برند در معرض خطر بالاتری برای کاندیدیازیس تهاجمی و لکنتیون هستند. 2013). اهمیت مسیر عامل کشنده اکسیداتیو با یافته‌ها مشخص می‌شود که بیماری مزمن گرانولوماتوز و کمبود میلوپراکسیداز، که در آن تولید ROS در نوتروفیل‌ها معیوب است، کشتن C. آلبیکنس را هم در بیماران و هم در موش‌ها مختل می‌کند (آراتانی و همکاران، 1999، 2002، Lehrer & کلین، 1969). به همین ترتیب، فقدان CD169 به علاوه TRMs که منجر به کاهش قابل توجهی از ROS به علاوه نوتروفیل ها شد، و به طور شگفت انگیزی نه مونوسیت ها، نشان می دهد که رشد کنترل نشده C. Albicans کلیه به احتمال زیاد به دلیل کاهش ظرفیت کشتن قارچی نوتروفیل ها بوده است.

سیستانچ درد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

اهمیت IFN در کاندیدیازیس سیستمیک در یک مدل تجربی موش به خوبی نشان داده شده است، که در آن کمبود IFN در موش های حذفی حساسیت آنها را به این عفونت افزایش می دهد (بالیش و همکاران، 1998؛ سنسی و همکاران، 1998؛ کاپوزتا و همکاران، 1998). علاوه بر این، نشان داده شده است که تجویز IFN ظرفیت کشتن فاگوسیتی و قارچی نوتروفیل‌ها و ماکروفاژها را افزایش می‌دهد، که به نوبه خود مقاومت بیماران را در برابر کاندیدیازیس تهاجمی بهبود می‌بخشد (Djeu و همکاران، 1986؛ Malmvall & Follin، 1993؛ Marodi و همکاران، 199). ). در مدل موش کاهش دهنده TRM، ما به طور مداوم کاهش IFN کلیه را در غیاب CD169 به علاوه TRM مشاهده کردیم، که نشان دهنده دخالت CD169 به علاوه TRM در شروع یا حفظ بیان IFN است. در حالی که نقش محافظتی IFN در کاندیدیازیس منتشر مشهود است، پاسخ محافظتی با واسطه IL در این مدل بیشتر بحث برانگیز بوده است (بالیش و همکاران، 1998؛ لاوین و همکاران، 1998؛ مک کالوم، 2009؛ کاشم و همکاران، 2015). ؛ Mengesha & Conti، 2017). با این وجود، ایمنی با واسطه IL برای کاندیدیازیس دهان و پوست ضروری است (Conti & Gaffen، 2010؛ Netea و همکاران، 2015؛ Mengesha & Conti، 2017). در مدل ما، فرسایش CD169 به علاوه TRM بر سطح بیان IL17 تأثیری نداشت. در واقع، ما بیان IL17 زیادی را در کلیه‌های WT آلوده مشاهده نکردیم (داده‌ها نشان داده نشده است). مشابه مشاهدات ما، LeibundGut-Landmann و همکاران (2007) مقدار قابل توجهی بالاتر از IFN نسبت به IL17 در موش WT آلوده گزارش کردند (LeibundGut-Landmann و همکاران، 2007)، که نشان می دهد ایمنی با واسطه IFN در کاندیدیازیس سیستمیک برجسته تر است. مطالعه دیگری که نقش مفید IFN را در ایمنی کاندیدا تایید کرد، حفاظتی بود که با انتقال سلول‌های Th1 تولیدکننده IFN، اما نه سلول‌های Th17 تولیدکننده IL در برابر کاندیدیازیس سیستمیک ایجاد شد (Kashem et al, 2015).

به عنوان اولین گام برای کشف همبستگی جالب بین CD169 به علاوه TRM، IFN، و نوتروفیل ها، آزمایش آزمایشی ما به دنبال آشکار کردن منبع سلولی IFN در مدل ما بود. سلول های NK که تولیدکنندگان اولیه IFN- هستند، نشان داده شده است که قادر به تشخیص C. Albicans و تقویت کشتار قارچی نوتروفیل ها از طریق ترشح IFN و GM-CSF هستند (Bhatnagar et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et al. همکاران، 2014؛ ویتنی و همکاران، 2014؛ Dom'ınguez-Andres و همکاران، 2017 ´). علاوه بر این، نشان داده شده است که 5 تا 10 درصد از سلول های NK در کلیه های آلوده به کاندیدا IFN تولید می کنند (Whitney et al, 2014). در کمال تعجب، ما سلول‌های IFN به علاوه NK را مشاهده نکردیم و در غیاب سلول‌های NK در مدل خود، تنظیم پایین IFN را مشاهده نکردیم. این اختلاف مشاهده شده می تواند به دلیل ارزیابی سلول های تولید کننده IFN در مقاطع زمانی مختلف باشد. به طور خاص، ما تولید IFN را در روز 6 pi ارزیابی کردیم، یک نقطه زمانی که در مقایسه با گروه Whitney بسیار دیرتر بود، یعنی 16h pi بود، بنابراین، سلول‌های NK ممکن است در حفظ تولید IFN برای این عفونت نقش نداشته باشند. جالب توجه است، Murciano و همکاران گزارش کردند که مخمرهای کشته شده C. Albicans آزادسازی IFN توسط سلول های NK را مهار می کنند (Murciano et al, 2006). یکی دیگر از دلایل احتمالی این اختلاف می تواند روش تجربی مورد استفاده برای بررسی ترشح IFN باشد. در این مقاله، مونسین، یک مهارکننده ترشح پروتئین، مستقیماً به موش ها تجویز شد و تولید IFN سلولی متعاقباً بدون انکوباسیون سلولی در شرایط خارج از بدن مورد ارزیابی قرار گرفت. از سوی دیگر، در مطالعه ویتنی و همکاران (2014)، قبل از IFN

در تجزیه و تحلیل، سلول‌های کلیوی ابتدا تهیه و در محیط کشت با یک مهارکننده ترشح پروتئین به مدت 7 ساعت انکوبه شدند (Whitney et al, 2014). با کمال تعجب، سایر زیرمجموعه های لنفوئیدی و میلوئیدی که در مطالعه ما بررسی شده اند، به ویژه CD169 به علاوه TRM، به نظر نمی رسد که IFN را بیان کنند، علیرغم مطالعاتی که ترشح مستقیم IFN توسط ماکروفاژها را گزارش می کنند (Bogdan & Schleicher, 2006). در عوض، داده‌های ما نشان می‌دهد که تولیدکنندگان عمده IFN محدود به جمعیت سلول‌های شبه B هستند. به طرز جالبی، زیرجمعیت مشابهی از سلول های B ذاتی تولید کننده IFN در تنظیم و شروع پاسخ ایمنی ذاتی اولیه عفونت های باکتریایی داخل سلولی حیاتی گزارش شده است (Bao et al, 2014; Krocova et al, 2020). علاوه بر این، سایر تحقیقات قبلی نشان داد که سلول‌های B بالغ، زمانی که توسط سلول‌های T آغاز می‌شوند و توسط پاتوژن‌ها یا لیگاندهای TLR تحریک می‌شوند، می‌توانند IFN ترشح کنند (گری و همکاران، 2007؛ لوند و راندال، 2010). اگرچه برای محور سلول B-IFN در عفونت‌های میکروبی غیرمعمول نیست، مطالعات آینده برای نمایه‌سازی جامع این جمعیت شبه IFN کلیوی به همراه سلول B و شناسایی ارتباط آن با CD169 به علاوه TRM در کلیه ضروری است. به طور خلاصه، نتیجه می گیریم که TRM های کلیوی را می توان بر اساس بیان CD169 به دو جمعیت عمده طبقه بندی کرد. مهمتر از همه، این دو زیرمجموعه دارای عملکردهای حفاظتی غیر اضافی در کاندیدیاز منتشر شده هستند، که بینش هایی را در مورد اساس سلولی ایمنی ذاتی میزبان محافظ در برابر C. Albicans ارائه می دهد. این افشاگری ها باید در طراحی آینده مداخلات درمانی مفید باشد.

مواد و روش ها

موشموش‌های تراریخته CD{0}DTR در آزمایشگاه ما در زمینه ژنتیکی BALB/c همانطور که قبلاً توضیح داده شد (Purnama et al, 2014) تولید شدند و متعاقباً با C57BL/6 برای 10 نسل تلاقی کردند. موش‌های CX3CR1gfp/gfp از آزمایشگاه جکسون خریداری شدند. موش‌های تراریخته CD{8}DTR C57BL/6، همراه با WT C57BL/6، تحت شرایط خاص عاری از پاتوژن در مرکز حیوانات دانشگاه فناوری نانیانگ (NTU) پرورش و نگهداری شدند. موش های نر (7 تا 10 هفتگی) برای عفونت کاندیدا استفاده شدند. همه آزمایش‌ها توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی تحت شماره ARF-SBS/NIE A{17}}AZ تأیید شد.

عفونت C. albicansجدایه بالینی C. Albicans سویه SC5314 بر روی یک صفحه عصاره مخمر-پپتون-دکستروز (YPD) به مدت 24 ساعت در دمای 30 درجه و به دنبال آن 16-18 ساعت در محیط کشت YPD کشت داده شد. سوسپانسیون C. albicans سانتریفیوژ شد، شسته شد و شمارش شد. برای عفونت، 5 × 104 cfu C. albicans داخل وریدی به هر موش تزریق شد. برای درمان rIFN، موش های آلوده روزانه با 10،{8}} U IFN نوترکیب (R&D Systems) تحت درمان قرار گرفتند. موش ها در طول دوره عفونت روزانه تحت نظر و وزن قرار گرفتند. DT با واسطه سم دیفتری و فرسایش با واسطه آنتی بادی (10 نانوگرم بر گرم وزن بدن) در PBS همراه با 1 درصد سرم موش تهیه شد. موش‌های CD{13}DTR و WT طبق طرح عفونت با DT به صورت IP تجویز شدند (شکل S1)

برای تخلیه سلول‌های NK، روزانه 100 میکروگرم آنتی‌بادی ضد موش NK1.1 (PK136؛ Invivomab) به موش‌ها تزریق شد.

آنالیز بار قارچیمغز، قلب، ریه‌ها، کبد، کلیه‌ها و طحال در زمان‌های مشخص شده عفونت جمع‌آوری شدند، وزن شدند و قبل از انکوبه شدن با 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر کلاژناز D در محیط هضم به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه، خرد شدند. نمونه ها بارها و بارها معلق شدند تا جایی که هیچ دانه ای قابل مشاهده نباشد. رقت سریال انجام شد و روی صفحات YPD قرار گرفت. پلیت ها به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه انکوبه شدند. CFU با شمارش دستی کلنی ها تعیین شد. بار قارچی به صورت CFU در هر گرم اندام بیان شد.

جمع آوری بافت، پردازش و جداسازی سوسپانسیون تک سلولیکلیه ها برداشت، چرخ شده و با 1 میلی گرم در میلی لیتر کلاژناز D در محیط هضم به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند. کلیه های خرد شده بارها و بارها به بالا و پایین پیپت می شدند تا جایی که هیچ دانه ای قابل رویت وجود نداشت. پس از سانتریفیوژ در 330 گرم به مدت 5 دقیقه، گلوله های سلولی با 5 میلی لیتر 35 درصد Percoll (GE Healthcare Life Science) مجدداً معلق شدند و در 600 گرم به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شدند. سوپرناتانت دور ریخته شد و گلوله های سلولی با 5- میلی لیتر بافر لیز RBC مجدداً معلق شدند. پس از لیز، سوسپانسیون های سلولی سانتریفیوژ و با IMDM 2 درصد مجدداً سوسپانسیون شدند. سوسپانسیون های تک سلولی تا استفاده بعدی در دمای 4 درجه نگهداری شدند. برای شمارش سلولی، مقدار کمی از سوسپانسیون های سلولی، از قبل مخلوط شده با تریپان بلو، با استفاده از هموسیتومتر شمارش شد. برای مرتب‌سازی سلولی، سوسپانسیون‌های تک سلولی کلیه با CD16/32 ضد موش (2.4G2، 1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) و به دنبال آن آنتی‌بادی‌های فلورسنت FL علیه آنتی‌ژن‌های سطحی موش CD45 (30F11)، F4/80 (BM8) انکوبه شدند. و CD11b (M1/70). سلول های رنگ آمیزی شده یک بار شسته شده و از فیلتر {30}} میکرومتر قبل از مرتب شدن بر روی یک مرتب کننده سلولی 4- لیزر BD FACSAria II (BD Bioscience) عبور داده شدند.

آنالیزهای فلوسایتومتری سوسپانسیون های تک سلولی با CD16/32 ضد موش ضد موش (2.4G2، 1 mg/ml) در دمای 4 درجه به مدت 15 دقیقه (1:100) در بافر FACS انکوبه شدند. (PBS مکمل با 2 درصد FCS) برای مسدود کردن گیرنده های Fc. برای رنگ‌آمیزی آنتی‌ژن‌های سطحی، سلول‌ها با آنتی‌بادی‌های کونژوگه با فلوروکروم علیه CD45 موش (30F11)، F4/80 (BM8)، CD11b (M1/70)، Ly6G (1A8)، و Ly6C (HK1.4) در 4 انکوبه شدند. درجه به مدت 20 دقیقه سلول‌های رنگ‌آمیزی یک‌بار شسته شدند و در بافر FACS برای اکتساب روی BD LSRFortesssa X{32}} (BD Biosciences) پنج لیزری معلق شدند. برای تشخیص سیتوکین داخل سلولی IFN، سوسپانسیون های تک سلولی کلیه از موش های تحت درمان با مسدودکننده ترشح پروتئین موننسین طبق پروتکل تهیه شد (سان و همکاران، 2009). به طور خلاصه، به هر موش 250 میکروگرم PBS حاوی 100 میکروگرم موننسین (M5273؛ Sigma-Aldrich)، 5 ساعت قبل از جداسازی اندام و آماده سازی متعاقب آن سوسپانسیون های تک سلولی کلیه تزریق شد. سلول ها با آنتی بادی CD16/32 ضد موش انکوبه شدند و سپس با آنتی بادی های فلورسنت علیه آنتی ژن سطحی موش CD45 (30F11)، CD11b (M1/70)، F4/80 (BM8)، Ly6G (1A8)، Ly6C (HK1) رنگ آمیزی شدند. .4)، CD3ε (145-2C11)، CD49b (HMa2)، CD19 (1D3)، CD4 (GK1.5)، CD8 (53.6-7)، CD11c (N418)، MHCII (M5/114.15.2) و زنجیره سبک lg κ (RMK-45). سلول های رنگ آمیزی شده یک بار با بافر FACS شسته شدند و سپس تثبیت (2 درصد PFA) و نفوذپذیری (0.05 درصد ساپونین) قبل از انکوبه شدن با آنتی بادی ضد IFN (1:500؛ BioLegend) در محلول ساپونین 0.05 درصد شسته شدند. سلول‌های رنگ‌آمیزی یک‌بار شسته شدند و در بافر FACS برای اکتساب روی BD LSRFortesssa X{90}} (BD Bioscience) پنج لیزری معلق شدند. برای تشخیص مرگ سلولی و آپوپتوز، سوسپانسیون‌های تک سلولی کلیه ابتدا با آنتی‌بادی CD16/32 ضد موش انکوبه شدند و سپس با آنتی‌بادی‌های فلورسنت علیه آنتی‌ژن سطحی موش CD45 (30F11), CD49b (HMa2), CD3ε ({101}) انکوبه شدند. }}C11)، CD11b (M1/70)، Ly6G (1A8)، و Ly6C (HK1.4). سلول های رنگ آمیزی شده یک بار با بافر FACS و 1 برابر بافر اتصال انکسین V (BioLegend) قبل از انکوبه شدن با انکسین V کونژوگه FITC طبق دستورالعمل سازنده (BioLegend) شسته شدند. سلول‌های رنگ‌آمیزی یک‌بار شسته شدند و در بافر 1× annexin V حاوی یدید پروپیدیوم (PI، 1 ug/ml) قبل از به‌دست‌آمدن روی BD LSRFortessa X{116}} (BD Bioscience) پنج لیزری مجدداً معلق شدند.

سنجش تشخیص ROSسوسپانسیون های تک سلولی شسته و با 2.5 ug/ml H2DFFDA، با یا بدون 100 ug/ml zymosan، به مدت 60 دقیقه در دمای 4 یا 37 درجه انکوبه شدند. سپس سلول ها دو بار با IMDM 2 درصد شسته و با آنتی بادی های نشاندار شده با فلوئوروکروم در دمای 4 درجه به مدت 20 دقیقه رنگ آمیزی شدند. سلول‌های رنگ‌آمیزی شسته و مجدداً در بافر FACS حاوی PI برای اکتساب روی BD LSRFortessa X{13}} (BD Bioscience) پنج لیزری معلق شدند. داده ها بر اساس سلول های مربوطه انکوبه شده در 4 درجه نرمال سازی شدند.

کراتینین سرمسرم های خون از موش ها در روز 10 پی جمع آوری شد، سطح کراتینین سرم با استفاده از کیت الایزای کروم (کراتینین) موش (Elabscience)، طبق دستورالعمل سازنده اندازه گیری شد.

سنجش آبی ایوانزنفوذپذیری عروق خونی مطابق با Radu و Chernoff (2{3}}13) ارزیابی شد. به طور خلاصه، موش‌های WT و CD{1}DTR غیرآلوده و آلوده با 2{9}}0 ul از 0.5 درصد Evans blue/PBS به صورت داخل وریدی تزریق شدند. 30 دقیقه بعد، موش‌ها معدوم شدند و اندام‌های آن‌ها جمع‌آوری، وزن شدند و در لوله‌های میکروفیوژ 100 درصد به مدت 48 ساعت انکوبه شدند. فرمامید تزریق شده با آبی ایوانز (0.5 میلی لیتر) بدون انتقال هیچ قطعه بافتی به کووت های پلی استایرن یکبار مصرف منتقل شد. جذب در 610 نانومتر ثبت شد و این مقادیر با وزن اندام ها نرمال شد.

تجزیه و تحلیل بافت شناسیبرای رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس، کلیه‌های برداشت شده در ترکیب دمای برش بهینه (OCT Tissue Tek) تعبیه شده و در دمای 80- درجه نگهداری شدند. بخش‌های 6- میکرومتر بریده شدند و به مدت 10 تا 15 دقیقه در استون ثابت شدند. بخش ها با Fc-block به مدت 20 دقیقه انکوبه شدند، شسته شدند و با آنتی بادی های فلورسنت FL به مدت 1 ساعت انکوبه شدند. سپس بخش های شسته شده با محیط نصب فلورسنت DAKO FL سوار شدند. تصاویر با استفاده از میکروسکوپ نیکون Eclipse 80i با بزرگنمایی 20× به دست آمد. برای رنگ‌آمیزی H&E و PAS، موش‌های حذف شده با 4 درصد PFA (Sigma-Aldrich) پرفیوژن شدند. کلیه های برداشت شده در 4 درصد PFA به مدت 24 ساعت در RT انکوبه شدند، آبگیری شدند و در پارافین جاسازی شدند (Paraplast Plus؛ Leica). سپس بلوک‌های تعبیه‌شده در پارافین به بخش‌های 6-μm تقسیم شدند. برش ها به مدت 20 دقیقه در زایلن پارافین زدایی و هیدراته شدند. برای رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E)، مقاطع با محلول مایر اصلاح‌شده هماتوکسیلین (Abcam) رنگ‌آمیزی شدند و با ائوزین (Sigma-Aldrich) رنگ‌آمیزی شدند. پس از پاکسازی با زایلن، مقاطع با DPX Mountant (SigmaAldrich) سوار شدند. برای رنگ‌آمیزی PAS، مقاطع با محلول اسید پریودیک (Abcam) انکوبه شدند، شسته شدند و با محلول شیف (Abcam) رنگ‌آمیزی شدند. پس از آن، مقاطع با محلول مایر اصلاح شده هماتوکسیلین (Abcam) ضد رنگ آمیزی شدند. پس از پاکسازی با زایلن، برش ها با مانتانت DPX (سیگما-آلدریچ) سوار شدند. تصاویر با استفاده از میکروسکوپ Eclipse 80i (Nikon) با نرم افزار Digital Sight DS-U3 (Nikon) و NIS-Elements D (Nikon) در بزرگنمایی 4×10×20×20× و 100× به دست آمد.

PCR کمی در زمان واقعیکلیه های برداشت شده بلافاصله در TRIZol (Thermo Fisher Scientific) با استفاده از هموژنایزر (CAT X360) همگن شدند. RNA ها طبق دستورالعمل سازنده (RNAsimple Total RNA kit; Tiangen Biotech Ltd) استخراج شدند. سنتز cDNA تک رشته ای از RNA خالص مطابق با دستورالعمل سازنده (Promega M-MLV reverse transcriptase) انجام شد. Real-time PCR طبق دستورالعمل سازنده با استفاده از پروتکل Primerdesign Precision FAST (Primerdesign Ltd) انجام شد. توالی پرایمر به شرح زیر بود: CXCL1; Fwd: ACTGCACCCAAACCGAAGTC، Rev: TGGGGACACACCTTTTAGCATCTT. CXCL2; Fwd: ACAGAAGTCATAGCCACTCTC، Rev: CCTTGCCTTTGTTCAGTATC. CCL2; Fwd: CATCCACGTGTTGGCTCA، Rev: GATCATCTTGCTGGTGAATGAGT. TNF- Fwd: TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG، Rev: GGTCTGGGCCATA GAACTGA. G-CSF; Fwd: GTGCTGCTGGAGCAGTTGT، Rev: TCGGGATCCCCAGAGAGT. GM-CSF; Fwd: GCATGTAGAGGCCATCAAAGA، Rev: CGGGTCTGCACACATGTTA. M-CSF; Fwd: GGTGGAACTGCCAGTA TAGAAAG، Rev: TCCCATATGTCTCCTTCCATAAA. IL10; Fwd: CAGAGCCACATGCTCCTAGA، Rev: TGTCCAGCTGGTCCTTTGTT. ICAM{12}}; Fwd: AGTCCGCTGTGCTTTGAG، Rev: AGGTCTCAGCTCCACACT. VCAM{13}}; Fwd: TCTTACCTGTGCGCTGTGAC، Rev: ACTGGATCTTCAGGGAAT GAGT. KIM{14}}; Fwd: AGATACCTGGAGTAATCACACTGAAG، Rev: TGA TAGCCACGGTGCTCA. CD169; Fwd: GCTGATACTGGCTTCTACTTCT، Rev: AGGTGGTCAGGTCTGGAGTAA. IFN- Fwd: CACGGCACAGTCATTGAAAG، Rev: CCAGTTCCTCCAGATATCCAAG. -اکتین؛ Fwd: AAGGCAACCGTGAAAAGAT، Rev: CTGTGGTACGACCAGAGGCATACA. hHB-EGF؛ Fwd: ATGACCACACAACCATCCTG، Rev: CCAGCAGACACAGACAG ATGACA