اثر محافظتی کلیوی پیش درمان عدس بلوگا برای آسیب ایسکمی- پرفیوژن مجدد

سینگ اوک لی،¹ پس یونگ چون،²یون های لی،²بومی کیم،²بوهیون یون،² و همکاران

زمینه و هدف. آسیب ایسکمی/ریپرفیوژن (I/R)، ناشی از حادکلیهخسارتباعث تغییرات هیستوپاتولوژیک، آپوپتوز سلول توبول، التهاب، اکسیداسیون و از دست دادن عملکرد کلیه می شود. ما اثرات محافظتی در برابر آسیب I/R پیش تیمار عدس بلوگا را ارزیابی کردیم. مواد و روش ها. موش ها به چهار گروه تقسیم شدند: گروه های درمان عدس بلوگا معمولی، درمان نشده، کم (2 میلی گرم) و دوز بالا (8 میلی گرم). عدس بلوگا به مدت 2 هفته به صورت خوراکی و به دنبال آن ایسکمی کلیوی دو طرفه به مدت 20 دقیقه و خونرسانی مجدد به مدت 30 دقیقه تجویز شد. نمونه خون وکلیهبافت ها جمع آوری و تجزیه و تحلیل شدند تا عملکرد کلیه، هیستوپاتولوژی، سلول های اپیتلیال و اندوتلیال بررسی شود.خسارتآپوپتوز، استرس اکسیداتیو و پاسخ های التهابی. نتایج. گروه‌های تحت درمان عملکرد کلیوی را با سطوح نیتروژن اوره خون (BUN) و کراتینین به‌طور قابل‌توجهی در مقایسه با گروه‌های دیگر حفظ کردند. تجزیه و تحلیل هیستوپاتولوژیک کاهش آسیب لوله پروگزیمال و کاهش مولکول مرتبط با آسیب را نشان داد.کلیهترشح مولکول آسیب 1 (KIM-1) و لیپوکالین مرتبط با ژلاتیناز نوتروفیل (NGAL)) در گروه‌های تحت درمان در مقایسه با گروه‌های دیگر. سلول‌های مثبت (TUNEL-) و ترشح مولکول‌های مرتبط با آپوپتوز (Fas و کاسپاز 3) در گروه‌های از قبل تیمار شده در مقایسه با گروه‌های دیگر به طور قابل‌توجهی کاهش یافت. گروه‌های تحت درمان، بیان ژن مرتبط با ریزرگ‌ها (خوشه تمایز (CD31)) و بیان مولکول چسبندگی منفی (مولکول چسبندگی داخل سلولی 1 (ICAM{11}})) را نشان دادند. یک اثر آنتی اکسیدانی در گروه های قبل از تیمار با کاهش بیان مالون آلدهید (MDA) و افزایش ترشح آنزیم آنتی اکسیدانی (سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، گلوتاتیون (GSH) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPx) مشاهده شد. در گروه‌های تحت درمان، F4/80 به علاوه ماکروفاژها و نفوذ سلول‌های CD4 به علاوه T مهار شد و سطوح سیتوکین پیش التهابی (اینترلوکین (IL-) 1، IL{18}} و فاکتور نکروز تومور (TNF-)) کاهش یافت. با این حال، سطح سایتوکین های ضد التهابی (تبدیل کننده فاکتور رشد (TGF-)، IL{24}}، و IL{25}}) افزایش یافت. نتیجه گیری پیش تیمار عدس بلوگا اثرات محافظتی در برابر آسیب کلیوی ناشی از I/R از طریق فعالیت های ضد آپوپتوز، ضد التهابی و آنتی اکسیدانی نشان داد.

مخاطب:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche propiedadesدسرتیکولا جلوگیری می کندکلیهبیماری، برای دریافت نمونه اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

آسیب ایسکمی/ریپرفیوژن (I/R)، در حین نفرکتومی جزئی یا پیوند کلیه، باعث ایجاد حاد می شود.کلیهآسیب [1، 2] و ممکن است منجر به زوال غیر قابل برگشت عملکرد کلیه شود [3]. ایسکمی باعث ایجاد آپوپتوز در سلول های اپیتلیال لوله کلیوی می شود که پاسخ های التهابی سلول های بینابینی را تقویت می کند. خونرسانی مجدد باعث آسیب میکروواسکولار می شود، که مهاجرت سلول های التهابی را از طریق بیان فاکتور چسبندگی در سطح سلول های اندوتلیال ترویج می کند [4-8]. آسیب I/R همچنین باعث استرس اکسیداتیو، افزایش گونه های فعال اکسیژن (ROS) و کاهش فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانی [9] می شود که منجر به افزایش تولید فاکتورهای پیش التهابی [10]، فعال شدن مسیر کاسپاز و افزایش مرگ سلولی آپوپتوز می شود. در نهایت باعث از دست دادن عملکرد کلیه می شود [11]. برای جلوگیری از آسیب کلیوی ناشی از I/R، استفاده از عوامل آنتی اکسیدانی با عملکردهای ضد التهابی و ضد آپوپتوز پیشنهاد شده است [10-14].

ارقام عدس (سبز، قرمز، فرانسوی یا بلوگا) حاوی ترکیبات فعال زیستی مختلف، به ویژه آنتی اکسیدان ها هستند [15]. محتوای کل پلی فنل و فلاونوئید آنها به ترتیب از 27.30 تا 30.30 میلی گرم (معادل اسید تانیک) در گرم تا 13.14 تا 16.29 میلی گرم (معادل کوئرستین) در گرم است [16]. نشان داده شده است که عدس بلوگا دارای محتوای پلی فنل بسیار بالا و اثرات مهارکننده ROS است [16]. تیم ما اثرات آنتی اکسیدانی عدس را با استفاده از آزمایش رده سلولی کبد در شرایط آزمایشگاهی گزارش کرد [16]. عدس بلوگا در مقایسه با سایر ارقام عدس، اثرات محافظتی قابل توجهی در برابر سمیت سلولی ناشی از الکل در سلول‌های AML نشان داد. اثرات ضد التهابی عدس بلوگا نیز در سلول های RAW264.7 تیمار شده با لیپوپلی ساکارید مشاهده شد [17]. تیمار عدس بلوگا به طور قابل‌توجهی تولید اکسید نیتریک (NO) و بیان NO سنتاز القایی (iNOS) را از طریق تنظیم دگرگونی فاکتور هسته‌ای E{20}} (Nrf2-) هِم واسطه‌ای کاهش داد. مسیر اکسیژناز-1 (HO{23}}). این آزمایشات آزمایشگاهی اثرات آنتی اکسیدانی و ضد التهابی عدس بلوگا را پیشنهاد کردند.

برای گسترش کاربردهای عدس بلوگا، ما آنها را روی یک مدل موش آسیب I/R کلیه اعمال کردیم و اثرات محافظتی کلیوی را ارزیابی کردیم. برای این آزمایش، عدس بلوگا به مدت 2 هفته، به عنوان یک پیش درمانی، به دنبال ایسکمی به مدت 20 دقیقه و خونرسانی مجدد به مدت 30 دقیقه تجویز شد. اثرات محافظتی کلیوی پیش تیمار عدس بلوگا با تجزیه و تحلیل عملکرد کلیه، هیستوپاتولوژی، آسیب سلول های اپیتلیال و اندوتلیال، آپوپتوز، استرس اکسیداتیو، و پاسخ های التهابی تأیید شد. ما فرض کردیم که پیش درمانی با عدس بلوگا از آسیب کلیوی ناشی از I/R از طریق فعالیت های آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و ضد آپوپتوز جلوگیری می کند.

2. مواد و روشها

2.1. گروه های حیوانی و شرایط درمان

تمام مراحل با استفاده از یک پروتکل حیوانی انجام شد که توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات موسسه دانشگاه Yeungnam (AEC{0}}) تأیید شده است. موش ها (ICR، 8 هفته، نر، 23 تا 25 گرم، اورینت، سئونگنام، کره) به طور تصادفی به 4 گروه زیر (n =7 در هر گروه) تقسیم شدند: (1) گروه کنترل عادی، نرمال. (2) درمان نشده، گروه درمان شده با نمک. (3) با دوز کم (2mg/100μL سالین/-موش BioMed Research International)، 14-گروه پیش درمانی عدس بلوگا خوراکی روزانه. و (4) عدس بلوگا با دوز بالا (8mg/100μL سالین/موش)، 14-روزانه خوراکی عدس بلوگا، گروه قبل از درمان. عدس بلوگا توسط پروفسور سینگ اوک لی (دانشگاه Keimyung، Daegu، کره) ارائه شد و تهیه عصاره و تجزیه و تحلیل ترکیبات زیست فعال در مطالعه قبلی گزارش شده بود [16]. پس از درمان، حیوانات در وضعیت مستعد قرار گرفتند و تحت بیهوشی قرار گرفتند و یک برش پشتی ایجاد شد [1]. شریان کلیوی و وریدهای هر دو کلیه با یک گیره عروقی به مدت 20 دقیقه و به دنبال آن خونرسانی مجدد به مدت 30 دقیقه، طبق پروتکلی که قبلا شرح داده شده بود، مسدود شد [18، 19]. خون با سوراخ قلب جمع آوری شد و کلیه ها استخراج شد. کلیه ها با سالین بافر فسفات شسته شدند. یک کلیه برای استخراج RNA و پروتئین استفاده شد، در حالی که کلیه دیگر برای تجزیه و تحلیل بافت شناسی استفاده شد.

2.2. آنالیزهای هیستوپاتولوژیک و ایمونوهیستوشیمی (IHC).

بررسی‌های هیستوپاتولوژیک با استفاده از رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) انجام شد و آسیب‌ها بر اساس عوامل زیر ارزیابی شدند: وجود سلول‌های لوله‌ای که به داخل لومن می‌افتند، از دست دادن هسته در سلول‌های لایه‌برداری شده، بقایای مجرا، فضای مجرای فروپاشیده، و نفوذ سلول‌های ایمنی . امتیاز توسط یک متخصص پاتولوژی به دست آمد: امتیاز 0، بدون آسیب لوله‌ای. نمره 1،<10% of="" tubules="" injured;="" score="" 2,="" 10–25%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 3,="" 25–50%="" of="" tubules="" injured;="" score="" 4,="" 50–74%="" of="" tubules="" injured;="" and="" score="" 5,="">75 درصد لوله ها آسیب دیده اند. برای تجزیه و تحلیل IHC، کلیه با 4 درصد پارافورمالدئید تثبیت شد و نمونه‌های تعبیه‌شده در پارافین به بخش‌های 5 میکرومتری برش داده شدند. رنگ آمیزی H&E و IHC طبق فرآیندهای معمول انجام شد. نشانگرهای آنتی بادی اولیه علیه سلول ایمنی (F4/80 و خوشه تمایز 8 (CD8)، Abcam، Cambridge، UK) و سلول اندوتلیال (CD31 و مولکول چسبندگی داخل سلولی 1 (ICAM{10}})، Abcam) در بخش‌ها اعمال شد. ، به مدت 24 ساعت در 4 درجه (رقت 1:200)، به دنبال آن آنتی بادی ثانویه (Alexa Fluor 594, Life Technology, Waltham, MA, USA) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق و 4′,6-diamidino{ {19}}فنیلندول (DAPI) برای رنگ‌آمیزی هسته‌ها استفاده شد.

2.3. سنجش پروتئین.

برای تجزیه و تحلیل عملکرد کلیه، سرم بدون ضد انعقاد جدا شد و غلظت کراتینین سرم و نیتروژن اوره خون (BUN) با استفاده از کیت سنجش رنگ سنجی کراتینین و کیت سنجش اوره کوانتی کروم (BioAssay Systems LLC, Hayward, CA, USA) شناسایی شد. )، به ترتیب. برای ارزیابی آسیب توبول/رگ کلیه، استرس اکسیداتیو، آنزیم های آنتی اکسیدانی و آپوپتوز، بافت کلیه با هر بافر مربوطه همگن شد. برای تجزیه و تحلیل آسیب سلول های اپیتلیال توبول کلیوی، غلظت مولکول آسیب کلیه-1 (KIM-1) و لیپوکالین مرتبط با ژلاتیناز نوتروفیل (NGAL) با استفاده از روش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA) (USCN Life Science Inc) مورد ارزیابی قرار گرفت. .، ووهان، چین). برای تجزیه و تحلیل آپوپتوز، غلظت Fas و کاسپاز 3 با استفاده از کیت های ELISA مربوطه (Abcam) اندازه گیری شد. برای ارزیابی استرس اکسیداتیو، سطوح مالون آلدئید (MDA) با استفاده از کیت سنجش MDA (موسسه تحقیقاتی مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ، نانجینگ، چین) اندازه‌گیری شد. آنزیم های آنتی اکسیدانی، از جمله سوپراکسید دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، گلوتاتیون (GSH) و گلوتاتیون پراکسیداز (GPx)، با استفاده از کیت سنجش کل SOD (موسسه تحقیقاتی مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ)، یک کیت سنجش CAT اندازه گیری شدند. موسسه تحقیقاتی مهندسی زیستی نانجینگ جیانچنگ)، به ترتیب کیت سنجش فلورومتریک GSH و کیت سنجش GPx (BioVision Inc.). تمام کیت ها طبق دستورالعمل سازنده استفاده شدند.

2.4. تجزیه و تحلیل بیان ژن.

RNA کل با معرف TRIZol استخراج شد و cDNA از 20 میکروگرم RNA کل با استفاده از کیت سنتز cDNA (Invitrogen، Waltham، MA، USA) سنتز شد. شرایط Real-time PCR به شرح زیر بود: 95 درجه برای 10 دقیقه، به دنبال آن 40 سیکل 95 درجه برای 10 ثانیه، 60 درجه برای 50 ثانیه، و 72 درجه برای 20 ثانیه. تقویت ژن با استفاده از SYBR سبز تشخیص داده شد و از روش 2-ΔΔCt برای تجزیه و تحلیل بیان استفاده شد. آزمایش‌ها در سه تکرار با استفاده از توالی‌های آغازگر زیر انجام شد: اینترلوکین- (IL-) 1 , 5'-gcccatccctgagactcat-3' و 5'-aggccacagg- tattttgtcg-3'; IL-6، 5'-agttgccttcttgggactga-3' و 5' -tccacgatttcccagagaac-3'; فاکتور نکروز تومور- (TNF-) , 5'-agcccccagtctgtatcctt-3' and 5'-ctccctttgcagaactcagg-3'; تبدیل کننده فاکتور رشد- (TGF-) , 5'-tggttgtagaggg- caaggac-3' and 5'-ttgcttcagctccacagaga-3'; IL-10، 5' -acctggtagaagtgatgccc-3' و 5'-agggtcttcagcttctcacc-3'; IL- 22، 5'-tccaacttccagcagccata-3' و 5'-tagcactgactcctcggaac- 3'; و گلیسرآلدئید 3'-فسفات دهیدروژناز (GAPDH)، 5'-tgtgtccgtcgtggatctga-3' و 5'-cctgcttcac- caccttcttga-3'.

2.5. سنجش تونل.

برای ارزیابی آپوپتوز، یک سنجش با واسطه TdT dUTP nick-end labeling (TUNEL) با استفاده از کیت تشخیص آپوپتوز (Chemicon، بدفورد، MA، ایالات متحده آمریکا) به دنبال دستورالعمل‌های سازنده انجام شد. به طور خلاصه، لام‌های پارافین‌زدایی شده و هیدراته شده با 2{6} ug/mL پروتئیناز K در دمای 37 درجه به مدت 15 ساعت هضم شدند تا پروتئین‌ها حذف شوند و با 3.0 درصد پراکسید هیدروژن برای خاموش کردن پراکسیداز درون‌زا تیمار شدند. اسلایدها در بافر تعادل 1x TdT غوطه ور شدند و قدرت کاری آنزیم TdT به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه اضافه شد. یک مزدوج ضد دیگوکسیژنین به مدت 30 دقیقه به انتهای DNA 3'-OH اعمال شد و رنگ با استفاده از یک بستر پراکسیداز به مدت 3 دقیقه ایجاد شد. پس از درمان DAPI، اسلایدها نصب شدند. هسته های TUNEL مثبت در تمام زمینه های بینایی در هر نمونه بافت، زیر بزرگنمایی 200 برابر شمارش شدند.

2.6. تحلیل آماری.

همه مقادیر به صورت میانگین ± انحراف استاندارد بیان می شوند. تفاوت‌های معنی‌دار برای گروه آسیب کلیوی I/R و گروه‌های پیش‌درمان عدس بلوگا-I/R با استفاده از آنالیز واریانس، و به دنبال آن آزمون تعقیبی توکی، در SPSS (بسته آماری برای علوم اجتماعی نسخه 9) ارزیابی شد. 2}}؛ شیکاگو، IL، ایالات متحده). مقادیر p < 0.05="" معنی="" دار="" در="" نظر="" گرفته="">

فواید سالسا سیستانچ

3. نتایج

3.1. اثرات پیش درمانی عدس بلوگا بر عملکرد کلیه.

هر دو گروه پیش درمان شده اثرات محافظتی قابل توجهی در برابر آسیب I/R نشان دادند (شکل 1). میانگین غلظت BUN و کراتینین سرم در گروه درمان نشده به ترتیب mg/dL 7:29 ± 89:92 و 0:16 ± 0:48 mg/dL بود. گروه‌های تحت درمان به‌طور قابل‌توجهی کاهش BUN (کم: 22:6±3:67mg/dL؛ زیاد: 21:6±3:17mg/dL) و کراتینین سرم (کم: 0:25±{{19}) نشان دادند. }:04mg/dL؛ بالا: 0:23 ± 0:04mg/dL) غلظت در مقایسه با گروه درمان نشده (p<0:01), and="" no="" significant="" differences="" were="" observed="" between="" the="" two="" pretreatment="" groups.="" these="" results="" indicated="" that="" pretreatment="" with="" beluga="" lentils="" can="" protect="" against="" acute="" renal="" functional="">

3.2. اثرات پیش درمانی عدس بلوگا بر آسیب سلول های اپیتلیال لوله ای و آپوپتوز.

آسیب لوله‌ای، به‌ویژه آتروفی سلول‌های اپیتلیال، اغلب در مدولای خارجی کلیه مشاهده شد، و از دست دادن هسته سلول لایه‌برداری شده، بقایای مجرا روی لوله کلیوی، فروپاشی فضای مجرا، و نفوذ نوتروفیل‌های بینابینی گاهی در کلیه‌ها شناسایی شد. گروه درمان نشده (شکل 2(a)). در مقابل، کلیه‌های گروه‌های تحت درمان، مورفولوژی سلولی تقریباً طبیعی را نشان دادند و آسیب لوله‌ای در گروه با دوز بالا کمتر از گروه با دوز پایین مشاهده شد. وقتی آسیب به صورت درصد در واحد سطح بیان شد، امتیاز آسیب در گروه‌های پیش‌درمان شده کاهش یافت (کم: 2:0±0:93؛ زیاد: 1:5± {{{{ 11}}:53) در مقایسه با گروه درمان نشده (2:87 ± 1:25) (شکل 2(b)). هنگام بررسی ترشح KIM{18}} و NGAL (شکل 2 (c))، نتایج ELISA نشان داد که محتوای KIM{20}} در گروه‌های تحت درمان کاهش یافته است (کم: 1، 199:42 ± 922:83 pg/ میلی گرم؛ بالا: 278:26 ± 1827:83 pg/mg) در مقایسه با گروه درمان نشده (184:49 ± 1977:83 pg/mg). بیان NGAL در گروه با دوز بالا (pg/mg 19:95 ± 489:34) در مقایسه با گروه با دوز پایین (527:36 ± 15: 19 pg/mL) و درمان نشده (15 ± 537:05) به طور قابل توجهی کاهش یافت: 70 pg/mg) گروه ها (ص<>

اینکه آیا آسیب سلول های اپیتلیال لوله ای باعث آپوپتوز شده است یا خیر، مورد بررسی قرار گرفت. آپوپتوز سلولی با تشخیص DNA کروموزومی تکه تکه شده، با استفاده از روش TUNEL ارزیابی شد (شکل 2(d)). سلول‌های TUNEL مثبت به ندرت در گروه‌های تحت درمان مشاهده شدند (کم: 1:22 ± 5:{4}}؛ بالا: 1:09 ± 2:25). در مقابل، گروه درمان نشده تعداد نسبتاً افزایش یافته سلول های TUNEL مثبت را در ناحیه بیرونی مدولا (16:77 ± 47:50) نشان داد (p<0:01), showing="" apoptotic="" bodies="" that="" extruded="" into="" the="" tubular="" lumen="" (figure="" 2(e)).="" when="" the="" secretion="" of="" apoptosis-related="" molecules="" (fas="" and="" caspase="" 3)="" was="" analyzed="" by="" elisa="" (figure="" 2(f)),="" fas="" expression="" was="" high:="" 3:96="" ±="" 0:55ng/mg)="" compared="" with="" that="" in="" the="" untreated="" group="" (7:10="" ±="" 0:87ng/mg),="" and="" caspase="" 3="" expression="" showed="" similar="" results="" (low:="" 8:44="" ±="" 2:05ng/mg;="" high:="" 8:25="" ±="" 1:28ng/="" mg;="" and="" untreated:="" 11:99="" ±="" 0:63ng/mg)="" (p=""><0:05). these="" results="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="">

آپوپتوز سلول های اپیتلیال لوله ای ناشی از I/R.

3.3. اثرات پیش درمانی عدس بلوگا بر آسیب سلول های اندوتلیال.

اثرات پیش تیمار عدس بلوگا بر سلول های اندوتلیال توسط IHC با استفاده از آنتی بادی CD31 تأیید شد (شکل 3(a)). در گروه نرمال، رگ‌های خونی CD{3} مثبت شناسایی شدند، اما سلول‌های CD{4} مثبت در گروه درمان‌نشده شناسایی نشدند، که نشان‌دهنده اختلال عروقی ناشی از I/R است. گروه قبل از درمان با دوز بالا سلول‌های CD{7} مثبت را در مویرگ‌های اطراف لوله‌ای نشان دادند، که نشان‌دهنده اثر محافظتی رگ دوز بالای پیش تیمار عدس بلوگا است. سلول‌های اندوتلیال با شناسایی ICAM، یک مولکول چسبنده، مورد بررسی قرار گرفتند و سلول‌های مثبت بیشتر در ناحیه لوله‌ای گروه درمان‌نشده (46:4±41:7 سلول/اسلاید) در مقایسه با گروه‌های از قبل تیمار شده شناسایی شدند. کم: 5:77 ± 1:01 سلول/اسلاید؛ زیاد: 3:72 ± 1:05 سلول/- اسلاید) (شکل 3(b)). این نتایج نشان داد که پیش تیمار عدس بلوگا باعث حفظ مویرگ ها و مهار فعال شدن مولکول چسبندگی در سطح سلول های اندوتلیال می شود.

3.4. اثرات پیش تیمار عدس بلوگا بر استرس اکسیداتیو.

To evaluate the antioxidant effects of beluga lentil pretreat- ment, MDA, SOD, CAT, GSH, and GPx levels were detected by ELISA (Figure 4). MDA levels decreased in the pretreated groups (low: 0:85 ± 0:23nmol/mg; high: 0:81 ± 0:22nmol/ mg) compared with that in the untreated group (0:96 ± 0:11nmol/mg) (p >0:05) (Figure 4(a)). However, the antioxidant enzyme activities increased in the pretreated groups (Figure 4(b)) compared with those in the untreated group (p >{{{{20}}}}:05)، برای SOD (کم: 36{32}}:21 ± 56:42U/mL؛ بالا: 362:7{{ 36}} ± 70:32U/mL؛ و تیمار نشده: 333:52 ± 41:58U/mL)، CAT (کم: 3:64 ± 1:09nmol/g؛ زیاد: 0:76nmol/g ± 3:21. و تیمار نشده: 3:18 ± 0:40 نانومول بر گرم)، GSH (کم: 0:53 ± 4:13 نانومول در میلی گرم؛ بالا: 0:69 ± 4:56 نانومول بر میلی گرم؛ و تیمار نشده: 0 ± 3:59 :53nmol/mg)، و GPx (کم: 198:89 ± 48:43U/ug؛ بالا: 219:61 ± 138:08U/ug؛ و درمان نشده: 165:14 ± 34:73U/ug). اگرچه این تفاوت ها از نظر آماری معنی دار نبودند، اما این نتایج نشان می دهد که پیش تیمار عدس بلوگا با افزایش قدرت آنتی اکسیدانی در کلیه ها از استرس اکسیداتیو کلیوی ناشی از I/R جلوگیری می کند.

3.5. اثرات پیش درمانی عدس بلوگا بر نفوذ سلول های ایمنی، سیتوکین ها و التهاب. نفوذ ماکروفاژ (F4/80 plus) و سلول T (CD4 پلاس) و انتشار سیتوکین های پیش التهابی (IL{6}}، IL{7}} و TNF-) برای ارزیابی التهاب ناشی از آپوپتوز مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. سلول های ایمنی نفوذ کننده F4/80 plus و CD4 plus در گروه های پیش تیمار نسبت به گروه درمان نشده، همانطور که با تجزیه و تحلیل IHC ارزیابی شد، مشاهده شد (شکل 5(a)). تجزیه و تحلیل Real-time PCR نشان داد که سطوح mRNA کلیوی سیتوکین های پیش التهابی (IL{15}}، TNF- و IL 6) در گروه قبل از درمان در مقایسه با گروه بدون درمان کاهش یافته است (شکل 5 (b) )). با این حال، سطوح mRNA سیتوکین های ضد التهابی (TGF- و IL{22}}) در گروه های تحت درمان در مقایسه با گروه درمان نشده، به جز IL{23}} افزایش یافت (شکل 5(c)). این نتایج نشان داد که آسیب التهابی ناشی از I/R در کلیه ها ممکن است با پیش درمانی عدس بلوگا به دلیل اثرات ضد التهابی پیش گیری شود، اگرچه IL{28}} تحت تأثیر قرار نگرفت.

مکمل آنتوسیانین

4. بحث

آسیب کلیوی ناشی از I/R به طور سنتی با کاهش سریع عملکرد کلیه مشخص می شود [20]. عملکرد کلیه را می توان با استفاده از مقادیر BUN و کراتینین سرم، که محصولات نهایی متابولیک نیتروژنی هستند که عملکرد فیلتر گلومرولی را نشان می دهند، تخمین زد [21]. گروه درمان نشده مقادیر BUN (89:92 ± 7:29mg/dL) و کراتینین (0:48±{{20}}:16mg/dL) را به طور قابل توجهی افزایش داد که نشان دهنده نارسایی عملکردی کلیه است. القا شده توسط I/R. با این حال، گروه‌های تحت درمان با عدس بلوگا به طور قابل‌توجهی کاهش BUN (کم: 22:6±3:67mg/dL؛ زیاد: 21:6±3:17mg/dL) و کراتینین سرم (کم: 0) را نشان دادند: 25 ± 0: 04 میلی گرم در دسی لیتر؛ بالا: 0:04 ± 0:23 میلی گرم در دسی لیتر) مقادیر (p<0:01) compared="" with="" those="" in="" the="" untreated="" group.="" these="" values="" are="" similar="" to="" those="" observed="" in="" normal="" mice="" (male,="" 6wks;="" bun:="" 22:68="" ±="" 3:05mg/dl;="" creatinine:="" 0:25="" ±="" 0:06mg/dl)="" [22].="" the="" significantly="" decreased="" bun="" and="" serum="" creatinine="" values="" observed="" in="" the="" pretreated="" groups="" relative="" to="" the="" untreated="" group="" indicated="" that="" beluga="" lentil="" pretreatment="" exerted="" protective="" effects="" on="" renal="" function="" against="" i/r-induced="" renal="">

کاهش عملکرد کلیه نشان دهنده مشکلات فیلتراسیون گلومرولی ناشی از نشت پشت فیلتر گلومرولی در سراسر اپیتلیوم لوله ای است که نشان دهنده ناحیه ای است که شدیدترین آسیب را توسط I/R وارد می کند [23]. I/R منجر به از دست دادن هسته سلولی لایه برداری شده، بقایای مجرا در لوله کلیوی و فروپاشی فضاهای مجرا در سلول های اپیتلیال لوله ای شد. گروه‌های تحت درمان، آسیب توبولی هیستوپاتولوژیک را به صورت وابسته به دوز کاهش دادند. آسیب توبول هیستوپاتولوژیک مشاهده شده با ارزیابی نشانگرهای مولکولی، KIM{2}} و NGAL [24] تأیید شد. KIM یک گیرنده فسفاتیدیل سرین است که به عنوان یک مولکول شناسایی سلولی آپوپتوز عمل می کند و یک سلول آسیب دیده را به لیزوزوم برای فاگوسیتوز سلول آپوپتوز/نکروز، پاکسازی بقایای آپوپتوز و محدودیت پاسخ پیش التهابی به لیزوزوم منتقل می کند [25]. NGAL یک پروتئین سیدروفور کوچک است که به ژلاتینازهای مشتق شده از نوتروفیل های انسانی متصل می شود. NGAL به ندرت در کلیه‌های طبیعی بیان می‌شود، اما آسیب‌های کلیوی حاد، ایسکمیک یا سمی منجر به ترشح NGAL توسط سلول‌های اپیتلیال در لوله‌های پروگزیمال/دیستال می‌شود و غلظت NGAL را در ادرار و خون افزایش می‌دهد. بنابراین، NGAL می تواند به عنوان یک بیومارکر جدید برای نارسایی حاد کلیوی ناشی از I/R استفاده شود [26]. گروه‌های تحت درمان کاهش ترشح KIM{8}} و NGAL را نشان دادند و گروه پیش‌درمان با دوز بالا کاهش قابل‌توجهی در ترشح NGAL در مقایسه با گروه بدون درمان نشان دادند. کاهش مشاهده‌شده در آسیب لوله‌ای و KIM{10}} و ترشح پروتئین NGAL نشان داد که پیش تیمار عدس بلوگا اثرات محافظتی در برابر آسیب سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای ناشی از I/R دارد.

هنگامی که آسیب I/R شدید باشد، سلول های آسیب دیده از طریق مسیر آپوپتوز پاک می شوند که یک مکانیسم پاتوفیزیولوژیک مرگ سلولی است [27]. آسیب DNA اختصاصی آپوپتوز را می توان از طریق روش TUNEL تشخیص داد.

سلول های TUNEL مثبت اغلب در گروه درمان نشده مشاهده شد، در حالی که گروه های پیش تیمار شده با عدس بلوگا به طور قابل توجهی کاهش تعداد سلول های TUNEL مثبت را به روشی وابسته به دوز نشان دادند. این شواهد بافت شناسی آپوپتوز با بررسی عبارات Fas و کاسپاز 3 تایید شد. Fas لیگاندی است که به گیرنده مرگ سلولی متصل می شود و در ابتدا در طول مرگ برنامه ریزی شده سلولی مشاهده می شود [28]. کاسپاز 3 یک آنزیم اجرایی درون سلولی مسیر مرگ سلولی آپوپتوز است که منجر به تشکیل بدن آپوپتوز می شود [29]. سنتز پروتئین Fas و کاسپاز 3 به طور قابل توجهی در گروه تحت درمان در مقایسه با گروه درمان نشده کاهش یافت، که تأیید می کند که پیش تیمار عدس بلوگا می تواند انتقال سیگنال آپوپتوتیک را به دنبال آسیب I/R مهار کند.

آسیب I/R همچنین باعث از بین رفتن ریزرگ های کلیوی می شود [30] و منجر به تغییرات پاتوهیستولوژیک در سلول های اندوتلیال می شود [20]. آسیب ریزرگ کلیوی با استفاده از یک آنتی بادی علیه CD31، یک نشانگر سلول اندوتلیال [30] شناسایی شد. بیان CD31 در گروه درمان نشده تشخیص داده نشد، که نشان دهنده از دست دادن رگ های ریز کلیوی است. با این حال، گروه با دوز بالا بیان CD31 مثبت را نشان داد، با تراکم عروقی مشابهی که در گروه عادی مشاهده شد، که نشان داد پیش تیمار عدس بلوگا، در دوزهای بالا، یک اثر محافظتی بر حفظ سلول‌های اندوتلیال اعمال می‌کند. سلول‌های اندوتلیال آسیب‌دیده، مولکول‌های چسبنده اندوتلیوم-لکوسیت، مانند ICAM{9}} [31] را بیان می‌کنند. افزایش مولکول های چسبندگی می تواند منجر به فعال شدن لکوسیت، انسداد مویرگی، تولید سیتوکین و پاسخ های پیش التهابی شود [32]. گروه درمان نشده بیان ICAM{13} مثبتی را نشان داد، که بیانگر افزایش بیان مولکول چسبندگی ناشی از آسیب سلول های اندوتلیال است. با این حال، گروه تحت درمان با دوز بالا بیان ICAM{15} منفی را نشان داد، که نشان‌دهنده اثرات محافظتی پیش تیمار عدس بلوگا برای حفظ سلول‌های اندوتلیال، هم از نظر عملکردی و هم از نظر فیزیولوژیکی است. ساختارهای عروقی حفظ شده می‌توانند جریان خون ثابتی را فراهم کنند، اکسیژن و مواد مغذی را به بافت‌ها و سلول‌های آسیب دیده توسط I/R می‌رسانند و به بازیابی عملکردی و بافت‌شناسی کلیه کمک می‌کنند.

خونرسانی مجدد، اکسیژن رسانی به سلول های آسیب دیده را بازیابی می کند، که می تواند باعث بیان آنزیم های مرتبط با استرس اکسیداتیو شود که اکسیژن را به ROS تبدیل می کند [33]. ROS محصولاتی ناپایدار و بسیار واکنش‌پذیر هستند که رادیکال‌های آزاد تولید می‌کنند که از طریق تغییر در پروتئین‌های سلولی، لیپیدها و اسیدهای نوکلئیک باعث آسیب DNA، آپوپتوز و نکروز می‌شوند. رادیکال های آزاد به اسیدهای چرب غیر اشباع در غشای سلولی آسیب می رسانند و در نتیجه پراکسیداسیون لیپیدی ایجاد می شود [34]. پراکسید لیپید سپس به MDA تجزیه می شود که فعالیت آنزیم های آنتی اکسیدانی مانند SOD، GPx، GSH و CAT را کاهش می دهد [35]. SOD تبدیل سوپراکسید به اکسیژن و پراکسید هیدروژن را کاتالیز می کند که توسط CAT بیشتر تجزیه می شود. GPx یک آنزیم آنتی اکسیدانی کلیدی است که پراکسید را با استفاده از GSH از بین می برد. GSH می تواند محصولات اکسیداتیو مختلف را در ترکیب با GPx سم زدایی کند. سطح آنزیم MDA و آنتی اکسیدان یک رابطه معکوس را در آنالیز ELISA نشان داد. در گروه‌های تحت تیمار، بیان MDA نسبتاً کم بود، اما آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در مقایسه با سطوح مربوطه خود در گروه درمان‌نشده به شدت بیان شد.

این نتایج نشان داد که پیش تیمار عدس بلوگا می‌تواند آسیب کلیوی ناشی از I/R را با مسدود کردن مسیر استرس اکسیداتیو، از طریق مهار پراکسیداسیون لیپید غشایی و فعال‌سازی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی، کاهش دهد.

خونرسانی مجدد همچنین باعث فعال شدن سلول های اندوتلیال عروقی می شود که منجر به بیان ICAM{0}} در سطح سلول می شود. ICAM بیان‌شده از طریق آنتی‌ژن مرتبط با عملکرد لنفوسیت (LFA{4}}) با نوتروفیل‌ها متصل می‌شود، که منجر به اتصال نوتروفیل‌ها به سلول‌های اندوتلیال، نفوذ نوتروفیل‌ها و ترشح مواد التهابی می‌شود. سیتوکین ها توسط نوتروفیل ها [36]. پس از ظهور نوتروفیل ها در ناحیه آسیب دیده، نفوذ ماکروفاژها به اضافه F4/80 رخ می دهد. ماکروفاژها بسته به زمان و محیط اطراف به فنوتیپ های M1 پیش التهابی و M2 ضد التهابی متمایز می شوند. ماکروفاژهای M1 سیتوکین های پیش التهابی (IL{12}}، TNF- و IL{14}}) ترشح می کنند که با آسیب کلیوی ناشی از I/R مرتبط هستند، در حالی که ماکروفاژهای M2 سیتوکین های ضد التهابی ترشح می کنند (TGF-، IL{ {19}}، و IL{20}}) [37، 38]. ماکروفاژها همچنین باعث تحریک سلول های CD4 به علاوه T می شوند. سلول های T فعال اینترفرون (IFN-) را سنتز می کنند که پاسخ ایمنی را از طریق فعال سازی ماکروفاژ M1 تقویت می کند [39]. در این مطالعه، گروه‌های پیش تیمار شده با عدس بلوگا اثرات مهاری در برابر نفوذ سلول‌های F4/80 به علاوه ماکروفاژ و CD4 پلاس T در ناحیه قشر کلیه نشان دادند که منجر به کاهش بیان IL{31}}، IL{32}}، و TNF- mRNA و بیان افزایش یافته TGF-، IL{35}}، و IL{36}} mRNA. این نتایج نشان داد که پیش تیمار عدس بلوگا می تواند پاسخ التهابی را با مهار نفوذ سلول های ایمنی و کاهش بیان سیتوکین های التهابی کاهش دهد.

5. نتیجه گیری ها

به طور خلاصه، گروه‌های پیش تیمار عدس بلوگا کاهش آسیب لوله پروگزیمال، کاهش ترشح مولکولی مرتبط با آسیب، کاهش سلول‌های TUNEL مثبت، کاهش ترشح مولکول مرتبط با آپوپتوز، بیان ریزرگ‌ها مثبت، بیان نشانگر چسبندگی منفی، اثر آنتی‌اکسیدانی و مهار التهاب را نشان دادند. پاسخ. بنابراین، پیش تیمار عدس بلوگا اثرات محافظتی در برابر آسیب کلیوی ناشی از I/R از طریق فعالیت های ضد آپوپتوز، ضد التهابی و آنتی اکسیدانی داشت. بر اساس نتایج این مطالعه، عملکرد کلیه را می توان با استفاده از درمان های عدس بلوگا در موقعیت های بالینی مرتبط با آسیب های I/R، مانند نفرکتومی جزئی، حفظ کرد.

مکمل های فلاونوئیدی در کلیه

در دسترس بودن داده ها

داده ها در صورت درخواست در دسترس هستند.

افشای

چکیده مقاله در هفتاد و دومین نشست سالانه انجمن اورولوژی کره گزارش شد.

تضاد علاقه

هیچ تضاد منافعی وجود ندارد.

مشارکت نویسندگان

سینگ اوک لی و سو یانگ چون به طور مساوی در این کار مشارکت داشتند.

قدردانی

این کار توسط کمک مالی موسسه تحقیقات زیست پزشکی از بیمارستان دانشگاه ملی کیونگ پوک (2019) پشتیبانی شد.

1گروه علوم و فناوری غذایی، دانشگاه کیمیونگ، Daegu 42601، جمهوری کره

2 موسسه تحقیقات زیست پزشکی، بیمارستان دانشگاه ملی کیونگ پوک، Daegu 41940، جمهوری کره

3 بخش تیم پشتیبانی تحقیقات حیوانات آزمایشگاهی، بیمارستان دانشگاه یونگنام، Daegu 42415، جمهوری کره

4 گروه پزشکی داخلی، کالج پزشکی دانشگاه یونگنام، Daegu 42415، جمهوری کره

5 گروه اورولوژی، دانشکده پزشکی، دانشگاه ملی کیونگ پوک، Daegu 41566، جمهوری کره

6 گروه آسیب شناسی، دانشکده پزشکی، دانشگاه ملی کیونگ پوک، Daegu 41566، جمهوری کره

7 گروه اورولوژی، کالج پزشکی دانشگاه یونگنام، Daegu 42415، جمهوری کره

منابع

[1] SY Chun، DH Kim، JS Kim، و همکاران، "یک شکاف پشتی جدید به روش نفرکتومی جزئی غیر ایسکمیک برای بازسازی بافت کلیوی در مدل موش"، مهندسی بافت و پزشکی احیا کننده، جلد. 15، نه 4، صفحات 453-466،2018.

[2] M. Agrawal و R. Swartz، "نارسایی حاد کلیه"، American Family Physician, vol. 61، شماره 7، ص 2077-2088، 2000.

[3] KR Tuttle، "نفروپاتی ایسکمیک"، نظر فعلی در نفرولوژی و فشار خون، جلد. 10، نه 2، صص 167- 173،2001.

[4] K. Singbartl و K. Ley، "محافظت از نارسایی حاد کلیوی ناشی از ایسکمی- خونرسانی مجدد با مسدود کردن E-selectin"، Critical Care Medicine، جلد. 28، شماره 7، ص 2507- 2514، 2000.

[5] M. Takada، KC Nadeau، GD Shaw، KA Marquette، و NL Tilney، "آبشار مولکول چسبندگی سیتوکین در آسیب ایسکمی/ریپرفیوژن مجدد کلیه موش صحرایی. مهار توسط لیگاند P-سلکتین محلول،" مجله تحقیقات بالینی، جلد. 99، شماره 11، صفحات 2682-2890، 1997.

[6] J. Niu، J. Wu، X. Li، و F. Zhang، "ارتباط بین گیرنده اندوتلین-1/اندوتلین A و التهاب در کلیه های موش به دنبال ایسکمی حاد/پرفیوژن مجدد"، گزارش های پزشکی مولکولی، جلد . 11، نه 5، صفحات 3981-3987، 2015.

[7] L. Wang، X. Liu، H. Chen و همکاران، "اثر پراکسید II بر آپوپتوز ناشی از ایسکمی کلیوی/آسیب خونرسانی مجدد در موش‌ها"، Experimental and Therapeutic Medicine، جلد. 9، نه 3، صفحات 817-822، 2015.

[8] ب. دانگ، اچ. 9، نه 10، مقاله e110944، 2014.

[9] DL Cruthirds، L. Novak، KM Akhi، PW Sanders، JA Thompson، و LA MacMillan-Crow، "اهداف میتوکندری استرس اکسیداتیو در طول ایسکمی/پرفیوژن مجدد کلیه"، Archives of biochemistry and biophysics، جلد. 412، شماره 1، صفحات 27-33، 2003.

[10] B. Yang، S. Jain، IZ Pawluczyk، و همکاران، "التهاب و فعال سازی کاسپاز در طولانی مدت ایسکمی کلیوی / آسیب خونرسانی مجدد و سرکوب سیستم ایمنی در موش ها،" کلیه بین المللی، جلد. 68، شماره 5، صفحات 2050-2067، 2005.

[11] HH Wu، TY Hsiao، CT Chien، و MK Lai، "تهویه ایسکمیک توسط دوره های کوتاه خونرسانی مجدد، ایسکمی کلیوی/آپوپتوز ناشی از پرفیوژن مجدد و اتوفاژی را در موش تضعیف می کند." Journal of Biomedical Science, vol. 16، شماره 1، 2009.

[12] EM El Morsy، MA احمد، و AA Ahmed، "تضعیف آسیب ایسکمی کلیوی / خونرسانی مجدد توسط پیش شرطی سازی عصاره açai در یک مدل موش،" Life Sciences, vol. 123، صفحات 35-42، 2015.

[13] H. Ilhan، M. Eroglu، V. Inal، و همکاران، "اکسیژن درمانی هایپرباریک استرس اکسیداتیو و آسیب بافتی را در آسیب ایسکمی کلیوی/آسیب خونرسانی مجدد در موش ها کاهش می دهد،" Renal Failure, vol. 34، شماره 10، ص 1305– 1308، 2012.

[14] H. Chen، B. Xing، X. Liu، و همکاران، "پیش شرطی سازی اکسیداتیو اوزون، التهاب و آپوپتوز را در مدل موش آسیب ایسکمی کلیوی / خونرسانی مجدد مهار می کند"، مجله اروپایی فارماکولوژی، جلد. 581، شماره 3، صفحات 306-314، 2008.

[15] BJ Xu، SH Yuan و SK Chang، "تجزیه و تحلیل مقایسه ای ترکیب فنلی، ظرفیت آنتی اکسیدانی، و رنگ حبوبات فصل سرد و سایر حبوبات غذایی انتخاب شده"، مجله علوم غذایی، جلد. 72، شماره 2، صفحات S167–S177، 2007.

[16] SO Lee و SH Lee، "محتوای پلی فنول و فعالیت های آنتی اکسیدانی عصاره عدس از ارقام مختلف"، مجله انجمن کره ای علوم و تغذیه کره، جلد. 45، شماره 7، ص 973-979، 2016.

[17] SO Lee و SH Lee، "Nrf2-واسطه اثر ضد التهابی عصاره متانولی از عدس بلوگا در سلول‌های RAW264.7 درمان‌شده با LPS،" در سمپوزیوم بین‌المللی KFN و نشست سالانه 2018، ص. 7}}، بوسان، کره، 2018.

[18] EE Hesketh، A. Czopek، M. Clay، و همکاران، "آسیب کلیه ایسکمی-پرفیوژن مجدد: مدل موش آسیب و بازسازی،" JoVE (ژورنال تجربیات تجسمی)، شماره. 88، ص. 8، 2014.

[19] Q. Wei و Z. Dong، "مدل موش آسیب حاد کلیه ایسکمیک: نکات فنی و ترفندها"، مجله آمریکایی فیزیولوژی-فیزیولوژی کلیه، جلد. 303، شماره 11، صفحات F1487– F1494، 2012.

[20] JV Bonventre و L. Yang، "پاتوفیزیولوژی سلولی آسیب حاد کلیه ایسکمیک"، مجله تحقیقات بالینی، جلد. 121، شماره 11، صفحات 4210-4221، 2011.