اثرات تعدیل کننده ROS پلی فنول های لینگون بری (Vaccinium Vitis-idaea L.) بر هیپرتروفی سلول های چربی چاق و اختلال عملکرد اندوتلیال عروقی قسمت 1

لطفا کلیک کنیدoscar.xiao@wecistanche.comبرای اطلاعات بیشتر

خلاصه:استرس اکسیداتیو و ترشح آدیپوسیتوکین نامنظم همراه با بافت چربی هیپرتروفی شده باعث التهاب مزمن می شود که منجر به اختلال عملکرد اندوتلیال عروقی می شود. مطالعه حاضر توانایی فراکسیون های آنتوسیانین (ACN) و غیر آنتوسیانین پلی فنل (PP) از میوه لینگون بری را در کاهش هیپرتروفی بافت چربی و اختلال عملکرد اندوتلیال با استفاده از سلول های چربی 3T3-L1 و سلول های اندوتلیال ورید ناف انسانی (HUVEC) بررسی کرد. این مطالعه نشان داد که کسر PP با افزایش بیان آنزیم آنتی اکسیدانی (SOD2) و مهار بیان آنزیم اکسیدان (NOX4، iNOS) باعث کاهش تولید ROS درون سلولی در سلول‌های چربی هیپرتروفی شد. علاوه بر این، فراکسیون های PP و ACN باعث کاهش محتوای تری گلیسیرید در سلول های چربی همراه با کاهش بیان ژن های لیپوژنیک مانند aP2، FAS و DAGT1 شد. درمان با هر دو فراکسیون بیان mRNA و ترشح پروتئین آدیپوکین‌های کلیدی را در سلول‌های چربی هیپرتروفی تعدیل کرد. بیان و ترشح لپتین و آدیپونکتین، به ترتیب، کاهش و تنظیم مثبت بود. علاوه بر این، فراکسیون‌های PP و ACN با مهار بیان ژن‌های پیش‌التهابی (IL{12}}، IL-1) و مولکول‌های چسبندگی (VCAM{{{- -، پاسخ التهابی را در HUVECهای القا شده با TNF کاهش دادند. 14}}، ICAM{15}}، SELE). نتایج به‌دست‌آمده نشان می‌دهد که مصرف میوه لینگونبری غنی از پلی‌فنل ممکن است به پیشگیری و درمان چاقی و اختلال عملکرد اندوتلیال به دلیل اثرات آنتی‌اکسیدانی و ضد التهابی آن‌ها کمک کند.

کلید واژه ها:پلی فنول ها؛ آنتوسیانین ها؛لینگونبری; پتانسیل آنتی اکسیدانی; ضد چاقی؛ ضد التهاب؛عصاره cistanche tubulosa;3T3-Ll adipocytes; هیپرتروفی؛آدیپوکین ها; اختلال عملکرد اندوتلیال

لطفا برای دانستن بیشتر اینجا را کلیک کنید

1. مقدمه

چاقی یک عامل خطر مستقل برای بیماری های قلبی عروقی و یکی از علل اصلی افزایش خطر ابتلا به دیس لیپیدمی، مقاومت به انسولین، فشار خون بالا و آترواسکلروز در بزرگسالان و کودکان است [1]. در چاقی، بافت چربی سفید (WAT) با تجمع بیش از حد چربی در سلول‌های چربی هیپرتروفی شده، ناکارآمد می‌شود، که منجر به التهاب مزمن، استرس اکسیداتیو، و ترشح آدی‌پوکینی نامنظم می‌شود که به دیابت نوع 2 کمک می‌کند و همچنین به طور مستقل با اختلال عملکرد اندوتلیال کرونر مرتبط است. ، 3]. سلول های چربی هیپرتروفیک عامل اساسی ارتباط بین تعادل انرژی مثبت، دیابت و بیماری های متابولیک قلبی هستند [2]. WAT به عنوان یک اندام غدد درون ریز عمل می کند و از طریق آدیپوکین ها و سیتوکین های ترشح شده، گفتگوی متقابل بین WAT احشایی یا زیر جلدی و بافت های قلبی عروقی را واسطه می کند.cistanche tubulosa redditآدیپوکین هایی مانند لپتین، آدیپونکتین و رزیستین، سیتوکین ها، TNF-، IL-1، IL-6، IL-8 و MCP{4}} و گونه های فعال اکسیژن و نیتروژن ( ROS و RNS) از طریق مکانیسم‌های مستقیم و غیرمستقیم بر رشد اختلال عملکرد اندوتلیال تأثیر می‌گذارند [4]. علاوه بر این، بافت چربی اطراف عروقی (PVAT)، عمدتاً از افراد چاق، باعث التهاب موضعی و اختلال عملکرد اندوتلیال می شود.

PVAT با تولید ترکیبات وازواکتیو مانند آدیپوکین ها، ROS و اکسید نیتریک (NO) به هموستاز عروقی کمک می کند. با ترشح طیف وسیعی از مولکول‌های فعال زیستی، PVAT بر انقباض، تکثیر و مهاجرت سلول‌های ماهیچه صاف عروق تأثیر می‌گذارد [4].

سیستانچ می تواند ایمنی را بهبود بخشد

سلول های اندوتلیال که دیواره داخلی عروق را پوشانده اند، عملکردهای هموستاتیک را تنظیم می کنند و اختلال عملکرد آنها پیش بینی کننده اولیه آترواسکلروز و بیماری های قلبی عروقی است [5]. استرس اکسیداتیو به فعال سازی سلول های اندوتلیال کمک می کند، آن را برای چسبندگی، نفوذ و فعال سازی سلول های ایمنی آماده می کند و منجر به یک فنوتیپ التهابی درجه پایین در عروق می شود [5،6]. ROS می تواند شل شدن مجدد عروقی وابسته به اندوتلیوم را از طریق افزایش تخریب NO تغییر دهد [6]. اختلال عملکرد اندوتلیال را می توان معکوس کرد، که ممکن است پیشرفت آترواسکلروز را به تاخیر بیاندازد یا حتی از پیشرفت آن جلوگیری کند و عملکرد شریانی را بهبود بخشد و بروز حوادث قلبی عروقی را کاهش دهد. مطالعات بالینی اخیر نشان داده‌اند که درمان‌های غیردارویی و دارویی که چاقی و مقاومت به انسولین را هدف قرار می‌دهند، عملکرد اندوتلیال را بهبود می‌بخشند و التهاب با درجه پایین را کاهش می‌دهند [7]. این یافته ها ارتباط بین چاقی، مقاومت به انسولین و اختلال عملکرد اندوتلیال را نشان داده است. بنابراین، کاهش عملکرد پاتولوژیک چربی در چاقی باید هدف پیشگیری از بیماری های قلبی عروقی باشد. استراتژی‌های درمانی و تغذیه‌ای که استرس اکسیداتیو و التهاب را در بافت چربی هیپرتروفی شده کاهش می‌دهند، ممکن است به یک هدف کلیدی برای پیشگیری از بیماری‌های قلبی عروقی تبدیل شوند [7].

توت ها منابع غنی پلی فنول ها مانند فلاونول ها، اسیدهای فنولیک و آنتوسیانین ها هستند و مطالعات اپیدمیولوژیک ارتباط بین افزایش مصرف میوه توت با کاهش چاقی و بیماری های قلبی عروقی را گزارش کرده اند. میوه‌های توت به عنوان آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی شناخته می‌شوند و به دلیل پتانسیل آنتی‌اکسیدانی بالایی که دارند، به طور فزاینده‌ای از آن‌ها به عنوان غذاهای کاربردی طبیعی یاد می‌شوند [9]. لینگون بری ها به عنوان "سوپرمیوه ها" طبقه بندی می شوند که به ویژه سرشار از آنتی اکسیدان هایی مانند ویتامین های C، A و E (توکوفرول) و پلی فنول ها هستند [10]. مطالعات in vitro و in vivo اثرات مفید مختلف لینگون بری مانند ضد التهاب [11]، آنتی اکسیدان [11] و فعالیت های ضد تکثیر را نشان داده اند [8،9]. علاوه بر این، لینگون بری از چاقی ناشی از رژیم غذایی و التهاب درجه پایین در حیوانات دیابتی جلوگیری می کند [12]. مطالعه قبلی ما پتانسیل ضد التهابی عصاره آبی میوه لینگونبری در حال خشک کردن انجمادی را نشان داد[11]. عصاره بیان ژن های پیش التهابی (IL{15}}، MCP-1 و IL-1) و ضد التهابی (IL{19}}) را در TNF ملتهب تنظیم کرد{20} }القای 3T3-آدیپوسیت L1 و سرکوب پاسخ التهابی در ماکروفاژهای فعال شده RAW 264.7 با کاهش بیان واسطه‌های پیش التهابی (TNF-، IL{28}}، IL{29}}، MCP{30). }}، iNOS، COX-2). علاوه بر این، اثرات آنتی اکسیدانی قابل توجهی در سلول های چربی ملتهب تیمار شده با عصاره میوه lingonberry مشاهده شد. تجمع ROS درون سلولی در نتیجه افزایش بیان آنزیم‌های دفاعی آنتی‌اکسیدانی (SOD، کاتالاز، GPx) و مهار آنزیم پرواکسیدان (NADPH اکسیداز 4) کاهش یافت[11].

مطالعه حاضر توانایی آنتوسیانین (ACN) و غیر آنتوسیانین پلی فنل (PP) را برای پیشگیری و درمان چاقی هیپرتروفیک و اختلال عملکرد اندوتلیال تقلید شده در مدل‌های آزمایشگاهی بررسی کرد. اثر بخش‌های ACN و PP بر مسیرهای مولکولی در استرس اکسیداتیو، التهاب، و ترشح آدیپوکین نامنظم در سلول‌های چربی 3T3-L1 هیپرتروفی چاق مورد بررسی قرار گرفت. پتانسیل محافظتی در برابر اختلال عملکرد اندوتلیال با استفاده از سلول‌های اندوتلیال ورید ناف انسانی (HUVECs) القا شده با TNF-X ارزیابی شد.

2. مواد و روشها

2.1. تهیه فراکسیون های پلی فنول آنتوسیانین و غیر آنتوسیانین

میوه منجمد لینگونبری (Vaccinium Vitis-idea L.) به دست آمده از شرکت DANEX (PHU"DANEX، Wielen، لهستان) به خمیر میوه همگن شد، سپس در درجه {1} منجمد شد و در معرض خشک کردن انجمادی قرار گرفت. طبق روشی که قبلا توضیح داده شد[11]. پودر میوه در محلول آبی 75/0 درصد (v/v) اسید استیک 0 معلق شد. نسبت جامدات (g) و استخراج کننده (mL) 1:10 بود. پس از اختلاط در یک میکسر ورتکس برای دهه 30، سوسپانسیون در یک حمام صوتی (5 دقیقه، 20 درجه) قرار داده شد. مجدداً مخلوط استخراج شده در یک میکسر ورتکس به مدت 30 ثانیه به هم زده شد و در دمای 20 درجه باقی ماند.

پس از 10 دقیقه، نمونه در 3600×g (10 دقیقه، 20 درجه) سانتریفیوژ شد و مایع رویی به‌دست‌آمده جمع‌آوری شد. عصاره‌گیر تازه در جامدات باقی‌مانده ریخته شد تا مرحله دوم استخراج آغاز شود. روال مرحله دوم نیز مانند مرحله اول بود. عصاره های هر دو مرحله با هم ترکیب شدند و در 12×g سانتریفیوژ شدند تا بقایای ریز میوه حذف شوند.

در مرحله بعدی آماده سازی فراکشن، حذف قندها و اسیدهای آلی از عصاره انجام شد. جداسازی با سیستم کروماتوگرافی AKTA Explorer 100 Air (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) مجهز به ستون شیشه ای XK 26/20 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) انجام شد ). ستون با 40 میلی لیتر رزین جاذب ماکرو متخلخل آمبرلیت XAD{4}} HP (DuPont، Wilmington، DE، ایالات متحده آمریکا) پر شد. قبل از آلودگی به ستون، محلول (50 میلی لیتر از عصاره به دست آمده در مرحله استخراج) با استفاده از یک فیلتر سرنگی با اندازه منافذ 0.{7}} (Millex-HV Durapore PVDF) با پیش فیلتر الیاف شیشه (Merck) فیلتر شد. میلیپور، برلینگتون، MA، ایالات متحده آمریکا). سه شوینده استفاده شد: A-5 درصد (v/o) اسید فرمیک، B- متانول، و C-0.1 درصد (u/o) اسید فرمیک. محلول های اسید فرمیک با مخلوط کردن مقدار مناسب اسید فرمیک با آب دیونیزه تهیه شد. سرعت جریان شوینده در 5 میلی لیتر در دقیقه تنظیم شد. در طول جداسازی، برنامه کروماتوگرافی زیر به کار گرفته شد: تعادل ستون: 95 درصد A، 5 درصد B، 3 CV (حجم ستون). تزریق نمونه-50 میلی لیتر از عصاره. شستشوی مواد غیر متصل-1: 100 درصد C,6 CV; شستشوی مواد غیر متصل-2: 100 درصد A,1 CV؛ شستشو: 20 درصد A, 80 درصد B,5 CV؛ شستشوی ستون: 100 درصد B، 2.5 CV.

کل پساب مرحله شستشو که میزان جذب را نشان می دهد (در λ{{0}}}، 320 و 520 نانومتر) نظارت می شود، با استفاده از یک اواپراتور چرخشی در دمای 30 درجه تا خشک شدن تبخیر شد (Laborota 4003 HB control, Heidolph, آلمان) مواد جامد در محلول آبی 0.75 درصد (o/o) اسید استیک حل شد و محلول به ویال های شیشه ای منتقل شد و در درجه -85 منجمد شد و سپس در خشک کن انجمادی بتا {{8} قرار داده شد. }}. 15 درجه) خشک کردن نهایی در دمای 22 درجه به مدت 8 ساعت بدون کنترل فشار انجام شد و فرآورده های جامد در ویال های مهر و موم شده در زیر اتمسفر نیتروژن در دمای {19}} درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

محتوای جامد ویال در محلول آب 5 درصد (o/o) اسید فرمیک حل شد و با استفاده از فیلتر اندازه منافذ {45- میکرومتر (Merck Millipore) فیلتر شد. جداسازی آنتوسیانین ها از سایر ترکیبات پلی فنل موجود در نمونه ها با استفاده از کروماتوگرافی AKTA Explorer 100 Air مجهز به آشکارساز UV/VIS و ستون Agilent Zorbax SB C18 (250×21.2 میلی متر) انجام شد. جداسازی در دمای 20 درجه انجام شد. سرعت جریان فاز مایع 21 میلی لیتر در دقیقه بود. دو شوینده استفاده شد: A{10}} درصد (v/v) اسید فرمیک در آب و B-متانول. پس از تعادل ستون (95 درصد A، 5 درصد B، 3 CV) و تزریق نمونه در حجم 2 میلی لیتر، جداسازی در یک گرادیان پیچیده انجام شد. برنامه گرادیان به این صورت بود: 5 درصد B-0.5 CV;20 درصد B-2 CV;20 درصد B-1.2 CV;30 درصد B-3. 5 CV;30 درصد B-1.2CV;45 درصد B-3.5 CV;45 درصد B-1.2CV;100 درصد B-2.5 CV;100 درصد B-2.5 CV. پساب با جذب در λ=520 نانومتر جمع‌آوری شد و به عنوان یک کسر آنتوسیانین (ACN) نشان داده شد. جریان خروجی نشان‌دهنده جذب در 入=320 نانومتر نیز جمع‌آوری شد و به عنوان بخش پلی فنل غیر آنتوسیانین (PP) نشان داده شد. هر دو فراکسیون تبخیر شدند، در محلول آبی اسید استیک حل شدند، در انجماد خشک شدند و همانطور که در بالا توضیح داده شد ذخیره شدند. تمام مواد شیمیایی مورد استفاده برای تهیه فراکسیون های ACN و PP از سیگما آلدریچ (گروه مرک، پوزنان، لهستان) خریداری شد.

2.2. شناسایی و کمیت پلی فنول در فراکسیون های ACN و PP

ترکیب پلی فنول فراکسیون های ACN و PP با روش HPLC-DAD-ESI-MS بر روی یک سیستم HPLC سری Agilent 1200 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) مجهز به آشکارساز آرایه دیود نوری G1315D و کوپلینگ آنلاین تجزیه و تحلیل شد. با سیستم MS زمان پرواز Agilent 6224. جداسازی‌های کروماتوگرافی روی یک ستون 150×2.1 میلی‌متری 3- میکرومتر C18 (فناوری‌های کروماتوگرافی پیشرفته، آبردین، اسکاتلند) انجام شد. یک مطالعه قبلا منتشر شده جزئیات شرایط جداسازی (فاز متحرک، برنامه شستشوی گرادیان، سرعت جریان، حجم تزریق نمونه) [11].

کروماتوگرام های HPLC در طول موج 280325355 و 520 نانومتر ثبت شد که به ترتیب برای تشخیص فلاوان اول ها، مشتقات هیدروکسی سینامیک اسید، فلاونول ها و آنتوسیانین ها توصیه می شود.

ترکیبات پلی فنول در فراکسیون های ACN و PP به عنوان معادل های سیانیدین{0}}O-گلوکوزید (آنتوسیانین ها)، کاتچین ((اپی)کاتچین و پروسیانیدین ها)، 4-هیدروکسی بنزوئیک اسید (مشتقات اسید هیدروکسی بنزوئیک)، اسید فرولیک تعیین شد. (مشتق اسید فرولیک)، اسید کلروژنیک (3-اسید O-کافئوئیلکینیک)، اسید p-کوماریک (مشتق اسید کوماریک)، تری هیدروکسی بنزوئیک اسید- اسید گالیک (بنزوئیک اسید و مشتقات آربوتین) و کورستین (گلیکوزیدهای کوئرستین) . همه نمونه ها در سه تکرار از محلول های آماده شده مستقل از فراکسیون های ACN و PP تزریق شدند.

پس از عبور از آشکارساز DAD، شستشوی ستون به سیستم MS مجهز به منبع یونیزاسیون الکترواسپری (ESI) که در حالت یون مثبت و یون منفی کار می‌کرد، هدایت شد. مقاله‌ای که قبلاً منتشر شده بود، پارامترهای ESI-MS مورد استفاده برای شناسایی ترکیبات فنلی در بخش‌های ACN و PP را ارائه می‌کند [11]. کنترل ابزار، جمع آوری داده ها و تجزیه و تحلیل با نرم افزار MassHunter B.04.{3}} (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA) به دست آمد. سیگما آلدریچ استانداردهای فنلی و دیگر معرف‌ها را برای آنالیز HPLC/DAD/MS ارائه کرد.

2.3. کشت و درمان 3T3-L1 Adipocyte

سلولهای 3T3-L1 پیش آدیپوسیت موش از مجموعه کشت نوع آمریکایی (ATCC، CL{3}}) به دست آمد. سلول ها در 37 درجه تحت 5 درصد CO، اتمسفر در محیط کشت عقاب اصلاح شده Dulbecco (DMEM) (سیگما آلدریچ، پوزنان، لهستان) با 1{17}} درصد (o/o) سرم جنین گاو (FBS) کشت شدند. (Gibco، Thermo Fisher Scientific Polska، ورشو، لهستان) مکمل. پیش‌آدیپوسیت‌های 3T{9}L1 تحت فرآیند تمایز طبق پروتکلی که قبلاً توضیح داده شد [11] قرار گرفتند. پرآدیپوسیت ها با تراکم 2.5×104سلول در سانتی متر مربع در صفحات چاهک کاشته شدند و تا زمانی که به محل تلاقی رسیدند کشت داده شدند. سپس آنها به مدت 2 روز توسط مخلوط تمایزی که حاوی 0.25 میکرومولار دگزامتازون (سیگما آلدریچ، پوزنان، لهستان)، 0.5 میلی مولار 3-ایزوبوتیل{23}}متیل گزانتین (سیگما-آلدریچ، پوزنان، لهستان) بود تحریک شدند. و 1 میکرومولار انسولین (سیگما آلدریچ، پوزنان، لهستان) در DMEM با 10 درصد FBS. محیط با DMEM مکمل با 10 درصد FBS و 1 میکرومولار انسولین جایگزین شد. پس از 2 روز، محیط کشت با DMEM با افزودن 10 درصد FBS جایگزین شد و در فواصل زمانی {32}}روز تازه شد تا زمانی که آنالیز در روز 12.3T{35}}L1 چربی به مدت 24 ساعت با فراکسیون های ACN و PP در غلظت های 5، 10 و 20 میکروگرم در میلی لیتر.

2.4. فرهنگ و درمان HUVEC

سلول های اندوتلیال ورید ناف انسانی (HUVECs) از ATCC(CRL{{0}}) به دست آمدند. HUVECها در F{1}}Kmedium (ATCC) همراه با 10 درصد FBS (Gibco)، مکمل رشد سلول‌های اندوتلیال از بافت عصبی گاو (30 میکروگرم در میلی‌لیتر) (سیگما آلدریچ، پوزنان، لهستان) و هپارین کشت شدند. 100 گرم در میلی لیتر) (سیگما آلدریچ، پوزنان، لهستان). HUVECها با تراکم 6×103 سلول در سانتی‌متر مربع بر روی صفحات چاهی پوشیده شده با محلول کلاژن دم موش (سیگما آلدریچ، پوزنان، لهستان) کاشته شدند. سپس 24-ساعت کشت HUVECs به مدت 3 ساعت در معرض فراکسیون های ACN و PP در غلظت های 0.1،1 و 10 ug/mL قرار گرفتند و متعاقباً با TNF- (10ng/mL) (سیگما آلدریچ، پوزنان) تیمار شدند. ، لهستان) برای 3 ساعت اضافی برای القای التهاب.

2.5. سنجش زنده ماندن سلولی

زنده ماندن سلول های چربی 3T{1}}L1 هیپرتروفی شده و HUVECهای القاء شده با TNF، درمان نشده و تحت درمان با کسرهای ACN و PP، با استفاده از MTT(3-(4،{{7) تجزیه و تحلیل شد. سنجش }}دی متیل تیازول-2-یل)-25-دی فنیل تترازولیوم بروماید (سیگما-آلدریچ، پوزنان، لهستان) به دنبال روشی که قبلاً توضیح داده شد[13]. غلظت‌های پایین فراکسیون‌های ACN و PP اعمال‌شده برای تیمار سلولی بر رنگ محیط و قرائت جذب در آزمون MTT تأثیری نداشت.

2.6. تعیین تولید ROS داخل سلولی

تولید ROS در سلول‌های چربی 3T{1}L1 با استفاده از روش نیترو آبی تترازولیوم (NBT) بر اساس روشی که قبلاً توضیح داده شد اندازه‌گیری شد [14]. پس از 90-دقیقه انکوباسیون در محلول 0.2 درصد NBT (سیگما آلدریچ، پوزنان، لهستان)، سلول ها با سالین بافر فسفات شسته و با متانول تثبیت شدند. پس از استخراج فرمازان با استفاده از KOH و DMSO، جذب در 620 نانومتر خوانده شد (Tecan Infinite M200، Tecan Group Ltd.، Männedorf، سوئیس).

2.7. اندازه گیری محتوای لیپید داخل سلولی

تأثیر فراکسیون‌های PP و ACN بر محتوای چربی در سلول‌های چربی هیپرتروفی شده با روش رنگ‌آمیزی Oil Red O (Sigma-Aldrich, Poznan, Poland) که قبلاً توضیح داده شد [13] و با اندازه‌گیری تری گلیسیرید کل (TG) با استفاده از کیت سنجش چربی تعیین شد. سیگما آلدریچ، پوزنان، لهستان) مطابق با دستورالعمل سازنده. محتوای TG داخل سلولی با استفاده از روش آنزیمی تعیین شد. یک محصول رنگ سنجی مربوط به TG موجود در 570nm اندازه گیری شد. غلظت TG بر اساس منحنی رسم شده برای استاندارد TG محاسبه شد.

2.8. استخراج RNA و تجزیه و تحلیل PCR در زمان واقعی

3T3-L1 چربی و HUVECs با TRI-Reagent (سیگما آلدریچ، پوزنان، لهستان) برای جداسازی RNA کل تیمار شدند. سنتز cDNA رشته اول با 1 میکروگرم RNA کل با استفاده از کیت سنتز cDNA رشته اول رونویسی (Roche Diagnostics، لهستان) بر اساس دستورالعمل سازنده انجام شد. کمی سازی بیان ژن با استفاده از یک سیستم PCR بلادرنگ انجام شد (SmartCycler DX Real-time PCR System Cepheid, Sunnyvale, CA, USA). پرایمرهای معکوس (5 μM/1 میکرولیتر) و SYBR⑧ Master Mix (12.5 میکرولیتر) را انتخاب کنید (Life Technologies، Carlsbad، CA، USA). 10 دقیقه و به دنبال آن 40 سیکل PCR: 40 ثانیه در 95 درجه، 30 ثانیه در 59 درجه سانتیگراد، و 30 ثانیه در 72 درجه. بیان ژن نسبی با استفاده از روش 2-△ACT محاسبه شد. سطوح رونوشت به -اکتین نرمال شد. برای سلولهای چربی 3T{28}}L1 و GAPDH برای HUVECها بیان mRNA نسبی به صورت تغییر برابر در مقایسه با سلولهای شاهد (درمان نشده) بیان شد.تمام واکنشها در سه تکرار انجام شد.

2.9.تعیین تولید آدیپوکین

غلظت لپتین و آدیپونکتین با کیت های الایزا (سیگما آلدریچ، پوزنان، لهستان) طبق پروتکل های سازنده اندازه گیری شد. کمی سازی با استفاده از کالیبراسیون استانداردها انجام شد. هر استاندارد و نمونه در سه تکرار مورد سنجش قرار گرفت. ضرایب تنوع بین آزمون و درون آزمون به ترتیب برای لپتین 12.5 و 9.3 درصد و برای آدیپونکتین 11.2 درصد و 7.9 درصد محاسبه شد.

2.10. تجزیه و تحلیل آماری

تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار STATISTICA نسخه 13.3 (Stat-soft, Inc., Tulsa, OK, USA) انجام شد. از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) و آزمون تعقیبی توکی برای تخمین تفاوت بین مقادیر میانگین گروه های چندگانه استفاده شد. آزمون لوین فرض برابری واریانس ها را تأیید کرد. معنی داری آماری در p<>

3. نتایج و بحث

3.1. ترکیب پلی فنول در فراکسیون های ACN و PP Lingonberry

این مطالعه بر روی دو فرآورده پلی فنلی جدا شده از میوه انگور بری متمرکز بود: بخش آنتوسیانین ACN و بخش غیر آنتوسیانین PP. پروفایل های پلی فنل در فراکسیون های ACN و PP تعیین شده بر اساس آنالیز HPLC-DAD-ESI-MS در جدول 1 ارائه شده است. کسر ACN شامل سه ترکیب اصلی آنتوسیانین موجود در عصاره میوه لینگونبری [11] است که مشتقات مبتنی بر سیانیدین هستند. از جمله 3-O-galactoside (82.5 درصد)،3-O-arabinoside (13.{14}}%)، و 3-O-glucoside (4.5 درصد) (جدول 1A) .

جدول 1. ترکیبات شناسایی شده در بخش آنتوسیانین (ACN) (A) و غیر آنتوسیانین پلی فنول (PP) بخش (B) از میوه انگور به دست آمد.

The purity of ACN preparation was evaluated at 97.3%; among the non-anthocyanin constituents, 1-O-Benzoyl-β-glucose was identified by HPLC-ESI-MS analysis in positive ion mode (precursor ion at m/z307.079, production at m/z 185.0432). The PP fraction contained polyphenolic compounds belonging to three predominant groups: Flavan-3-ols, hydroxycinnamic acid derivatives, and flavonols, which accounted for 40.4%, 22.8%, and 31.0%, respectively. In addition, the anthocyanin compounds' residue (5.8%)was detected in the PP fraction with cyanidin-3-O-galactoside as dominant anthocyanin, cyanidin-pentoxide, and cyanidin 3-O-(6"-acetyl)-glucoside (Table 1B), trace amounts of which have been identified previously in the original lingonberry fruit extract [11]. In the PP fraction, the following polyphenols were quantified in a significant amount (>5 درصد ): پروسیانیدین های نوع A و B، کاتچین، 3-O-caffeoylquinic acid، ferulic acid-hexoside، quercetin و مشتقات آن (3-O-galactoside،3-O- آرابینوفورانوسید، 3-O-rhamnoside). جدول 1B داده های طیفی جرمی همه ترکیبات پلی فنلی را نشان می دهد که به طور آزمایشی در بخش PP میوه lingonberry شناسایی شده اند.

این مقاله از Nutrients 2021, 13, 885 7 استخراج شده است.