لیپوکالین ترشحی مرتبط با نوتروفیل ژلاتیناز در مقایسه با فرم غیر ترشحی، توانایی قوی تری برای مهار بزرگ شدن کیست سلول های ADPKD نشان می دهد.

کلمات کلیدی: ADPKD؛لیپوکالین مرتبط با ژلاتیناز نوتروفیل; فرهنگ سه بعدی

گیاهان جدید برای

1. مقدمه

بیماری کلیه پلی کیستیک (PKD)، یکی از شایع ترین بیماری های ارثی، با ایجاد کیست های پر از مایع در امتداد بخش های متعدد نفرون مشخص می شود [1]. ADPKD رایج ترین شکل PKD است، که یک PKD بزرگسالان است که اکثر بیماران تا چهل سالگی علائم آن را بروز نمی دهند [2]. ADPKD نتیجه جهش در ژن های PKD1 (85%) یا PKD2 (15%) است که به ترتیب پلی سیستین{8}} (PC1) و پلی سیستین{10}} (PC2) را رمزگذاری می کنند [3،4]. نقص در PC1 یا PC2 با افزایش غیرطبیعی در تکثیر سلول های اپیتلیال کلیه همراه است و بیشتر باعث تشکیل کیست می شود [5-7]. با پیشرفت ADPKD، کیست ها بزرگ شده و ساختار طبیعی کلیه را مختل می کنند و در نهایت منجر به نارسایی کلیه می شود. با این حال، مکانیسم درگیر در ADPKD پیچیده است و هنوز باید مورد بررسی قرار گیرد. از دست دادن عملکردی PC1 و/یا PC2 در ADPKD منجر به کاهش غلظت کلسیم درون سلولی، کاهش آدنیلیل سیکلاز حساس به کلسیم (AC) و بیشتر منجر به افزایش سطح آدنوزین مونوفسفات حلقوی داخل سلولی (cAMP) می شود [8،9]. cAMP با فعال کردن پروتئین کیناز A (PKA) و مسیر پایین دست Ras/B-Raf/MEK/ERK، تکثیر سلول های اپیتلیال و ترشح مایع را برای ترویج بزرگ شدن کیست تحریک می کند [10،11]. نشان داده شده است که اختلالات اتوفاژی در گورخرماهی ADPKD و موش در شرایط آزمایشگاهی [12] و مدل‌های in vivo موش [13] رخ می‌دهد. اتوفاژی یک مکانیسم حیاتی است که هموستاز سلولی و اندام را با تخریب و بازیافت اندامک‌ها، پروتئین‌های با عمر طولانی و مواد مغذی حفظ می‌کند [14،15]. گفتگوی متقاطع بین مسیر mTOR مسیرهای اتوفاژی و آپوپتوز رخ می دهد که در PKD تنظیم نشده است [16]. درمان با فعال کننده های اتوفاژی، مانند راپامایسین و کاربامازپین، می تواند به طور قابل توجهی تشکیل کیست را کاهش دهد [12]. قبلا یک مدل موش ADPKD به نام Pkd1L3/L3 (در پس‌زمینه ژنتیکی C57BL/6) [17] با قرار دادن یک سایت loxP و یک کاست mc{41}-کنار loxP در اینترون‌های 30 و 34 ژن Pkd1 ایجاد کردیم. به ترتیب (L3 به معنی سه جایگاه loxP در آلل)، برای ایجاد جهش ژن شرطی. موش‌های Pkd1L3/L3 سطوح پایین (20 درصد کنترل) PC1 را تولید کردند که باعث رشد تهاجمی کیست و گسترش حجم کلیه با افزایش سن شد [17]. علاوه بر این، یک مدل سلولی ADPKD (رده سلولی 2L3) با انتقال ویروس SV40 سلول‌های اپیتلیال اولیه کلیه از موش‌های Pkd1L3/L3 برای القای رده‌های سلولی جاودانه ایجاد شد [18].

لیپوکالین مرتبط با ژلاتیناز نوتروفیل (NGAL)، یک پروتئین ترشحی 22-kD، به عنوان یک نشانگر زیستی برای آسیب های کلیوی، از جمله PKD در بزرگسالان [19] (اما نه در کودکان [20])، بیماری مزمن کلیوی [21] در نظر گرفته می شود. و ایسکمی حاد کلیه [22]. مکانیسم افزایش پروتئین NGAL در ادرار بیمار مشخص نیست، پیشنهاد شده است که NGAL انباشته شده در ادرار به تحلیل رفتن سلول های اپیتلیال کلیه در نتیجه آسیب مربوط می شود [23]. برخی از مطالعات نشان داده اند که NGAL نقش محافظتی در برابر آسیب های کلیوی، محل ایسکمی [24]، و سرکوب پیشرفت کیست [25] ایفا می کند، در حالی که برخی از مطالعات نشان می دهند که NGAL ممکن است در پیشرفت کیست [26] و توسعه تومور نقش داشته باشد [27]. ]. گیرنده NGAL (NGAL-R، Slc22a17) در بافت های اپیتلیال متعدد، از جمله نفرون های کلیوی بیان می شود [28]. جفت شدن NGAL و NGAL-R می تواند آهن داخل سلولی را جدا کرده و آپوپتوز را بیشتر القا کند [29] که با استراتژی کاهش آهن سیستم ایمنی ذاتی در برابر عفونت باکتریایی مرتبط است [30].

نشان داده شده است که تجویز NGAL اگزوژن باعث افزایش آپوپتوز سلول های Pkd1-/- و کاهش بیشتر رشد کیست در شرایط آزمایشگاهی می شود [25]. در کار قبلی، ما موش‌های Pkd1L3/L3 × NGAL−/− و موش‌های Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg را با تلاقی موش‌های Pkd1L3/L3 با موش‌های حذفی NGAL و موش‌های تراریخته تولید کردیم [31]. ما دریافتیم که بیان بیش از حد NGAL در یک مدل موش ADPKD (موش‌های Pkd1L3/L3 × NGALTg/Tg) پیشرفت کیست را کاهش داده و طول عمر موش‌های Pkd1L3/L3 را طولانی‌تر می‌کند، همراه با تغییراتی در یک سری مسیرهای مولکولی درگیر در تکثیر، آپوپتوز، و فیبروز [31]. با این حال، مکانیسم اساسی اثرات NGAL در کاهش پیشرفت ADPKD همچنان مبهم است.

در این مطالعه، یک پلت فرم کشت سلولی سه بعدی برای آزمایش پیشرفت کیست سلول های اپیتلیال کلیوی Pkd1L3/L3 (سلول های 2L3) با افزودن پروتئین نوترکیب NGAL موش (mNGAL) یا بیان بیش از حد NGAL تراریخته در شرایط آزمایشگاهی ایجاد شد. علاوه بر این، اثرات ذهنی بر تکثیر، آپوپتوز، و مسیرهای مربوط به اتوفاژی مورد بررسی قرار گرفت. علاوه بر این، مکانیسم NGAL در سلول های 2L3 با بررسی اثرات بیان بیش از حد NGAL ترشح شده (pN + LS) و NGAL غیر ترشحی (pN - LS) در سلول های 2L3 روشن شد. اثر و مکانیسم قابل تصور پروتئین NGAL در سلول‌های ADPKD در این مطالعه تا حدی مورد بررسی قرار گرفت.

2. مواد و روشها

2.1. خطوط سلولی

رده سلولی Pkd1L3/L3 (2L3) با انتقال ویروس SV40 سلول های اپیتلیال کلیوی اولیه از موش های 2L3، یک مدل موش ADPKD، برای القای یک رده سلولی جاودانه ایجاد شد [17،18]. سلول های کلیوی اولیه در پاساژ دوم خود با استفاده از کیت جاودانگی ویروس Lenti SV40 (Capital Biosciences Inc., Gaithersburg, MD, USA) آلوده شدند. سلول ها در 5% CO2 در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و با پلی برن (8 میکروگرم بر میلی لیتر) یک شب در یک صفحه شش چاهی تیمار شدند. در روز بعد، مایع رویی ویروس دور ریخته شد و سلول ها در محیط تازه انکوبه شدند. پس از رسیدن به تلاقی، سلول ها در یک ظرف 10- سانتی متری با محیط کشت زیر کشت قرار گرفتند و سلول های پاساژ یک (P1) در نظر گرفته شدند. کلون‌های تبدیل‌شده SV انتخاب شدند و با استفاده از حلقه‌های شبیه‌سازی جدا شدند [17،18]. خط سلول M-1 (Pkd1+/+) خریداری شده از BCRC (Hsinchu، تایوان) به عنوان خط سلولی نوع وحشی استفاده شد.

2.2. کشت سلولی

سلول ها هر سه روز یکبار پاس می شدند. برای آزمایش IC50 mNGAL در سلول‌های ADPKD، سلول‌های 2L3 در {3}صفحه‌های چاهی (6000 سلول/چاه) با 500 میکرولیتر از محیطی که در بالا توضیح داده شد، کاشته شدند و برای انکوبه قرار گرفتند. 16 ساعت سپس سلول ها با mNGAL نوترکیب (0، 20، 40، 80، 160، 320 میکروگرم بر میلی لیتر) یا راپامایسین (1 میکرومولار، از سیگما، سنت لوئیس، MO، ایالات متحده) برای 0، 8،24، یا 48 دیگر تیمار شدند. h (n=4).

2.3. رنگ آمیزی لکتین

برای بررسی اینکه آیا سلول‌های M{0}} و 2L3 از توبول‌های کلیوی با منشأ مشابه هستند، رنگ‌آمیزی لکتین با لکتین تتراگونولوبوس لوتوس (LTL، که نشانگر لوله پروگزیمال متمایز شده با فلورسین است) و Dolichos biflorus agglutinin (DBA) که یک نشانگر مجرای جمع آوری متمایز با برچسب رودامین است) انجام شد. LTL و DBA از Vector Laboratories (Burlingame، CA، USA) خریداری شدند. برای مشاهده سلول‌ها، سلول‌های کشت‌داده‌شده روی پوشش پوششی با سالین بافر فسفات (PBS) سه بار به‌مدت 10 دقیقه شسته شدند و سپس با پارافورمالدئید 4 درصد (PFA) به مدت 30 دقیقه در PBS ثابت شدند. پس از نفوذپذیری با 0.4% Triton X{9}} در PBS (PBST) به مدت 20 دقیقه، سلولها با 10% سرم اسب در PBST به مدت 1.5 ساعت مسدود شدند. سلول ها با LTL (20 میکروگرم بر میلی لیتر) و DBA (20 میکروگرم بر میلی لیتر) به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد رنگ آمیزی شدند. هسته ها با DAPI (1 میکروگرم بر میلی لیتر) به مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی شدند. نمونه ها با PBST سه بار به مدت 10 دقیقه بین مراحل شستشو شدند.

2.4. لیز DNA و ژنوتیپ

برای ژنوتیپ ژن Pkd1، پرایمرهای PCR فوروارد (50 -TGTGTTGTTCTTTGTGGCAGTCAG-30) و معکوس (50 -ATTCTCAATGACTGACTTGGGCTC-30) برای تکثیر توالی‌های DNA ژنومی استفاده شد. نمونه ها در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه حرارت داده شدند و سپس 30 سیکل (94 درجه سانتیگراد برای 1 دقیقه، 56 درجه سانتیگراد برای 1 دقیقه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه) و سپس 72 درجه سانتیگراد برای 10 دقیقه و 25 درجه سانتیگراد انجام شد. C به مدت 5 دقیقه پس از تکثیر با PCR، محصولات DNA با رنگ بارگذاری 6× مخلوط و با استفاده از ژل آگارز 1% Tris-borate-EDTA (TBE) آنالیز شدند.

2.5. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بی‌درنگ رونویسی معکوس کمی (RT–qPCR)

RNA کل از رده سلولی با استفاده از کیت استخراج MagQu gDNA (MagQu، شهر جدید تایپه، تایوان) و سپس تیمار DNase I (Worthington، Lakewood، NJ، ایالات متحده آمریکا) جدا شد و در ddH2O در دمای 80- درجه سانتیگراد ذخیره شد. کیفیت و غلظت RNA با استفاده از ژل آگارز 1% TBE و اسپکتروفتومتر NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) تعیین شد. RNA الگو با استفاده از کیت سنتز cDNA رشته اول RevertAid (Thermo Fisher Scientific) در حضور مهارکننده RNase RNaseOUTTM (G-Biosciences, St. Louis, MO, USA) به cDNA معکوس رونویسی شد. هر واکنش در حجم کلی 20 میکرولیتر شامل RNA کل (100 نانوگرم)، پرایمر اولیگو (dT) 18 (1 میکرولیتر)، بافر واکنش 5X (4 میکرولیتر)، مهارکننده RNase RiboLock (20 واحد)، مخلوط dNTP (20 U) تهیه شد. 1 میلی مولار)، RevertAid Reverse Transcriptase (200 U)، و آب بدون نوکلئاز. برای سنتز cDNA رشته اول، نمونه ها در دمای 42 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت حرارت داده شدند و سپس واکنش با حرارت دادن در دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه پایان یافت.

کمی سازی بیان ژن با استفاده از سیستم PCR Real-Time StepOne (Applied Biosystems, Norwalk, CT, USA) انجام شد. هر نمونه در حجم کلی 20 میکرولیتر، شامل پرایمرهای ویژه ژن (100 نانومولار)، معکوس (100 نانومولار) (جدول 1)، الگوی cDNA (100 نانوگرم)، ORATM SEE qPCR Green ROX H Mix (1×) تهیه شد. ، high GmbH، Kraichtal، آلمان) و آب PCR. نمونه ها در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه حرارت داده شدند، سپس 40 سیکل (95 درجه سانتیگراد برای 5 ثانیه، 65 درجه سانتیگراد برای 25 ثانیه) و سپس تجزیه و تحلیل منحنی ذوب (95 درجه سانتیگراد برای 15 ثانیه، 60 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه). 95 ◦C به مدت 15 ثانیه) با استفاده از یک سیستم PCR Real-Time StepOne. داده ها با نرم افزار StepOne™ (v2.3) تجزیه و تحلیل شدند. بیان ژن Gapdh برای نرمال سازی استفاده شد.

2.6. سنجش زنده ماندن سلولی

زنده ماندن سلول ها با استفاده از تیازولیل بلو تترازولیوم بروماید (آزمایش MTT) (سیگما) تعیین شد. محلول MTT ({0}}.5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) به هر چاهک اضافه شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت انکوبه شد. برای حل شدن کریستال‌های فورمازان بنفش، پس از برداشتن به هر چاهک دی متیل سولفوکسید (DMSO, Sigma) اضافه شد. محیط و محلول MTT. چگالی نوری (OD) هر نمونه در طول موج 570 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا ریدر (Thermo Fisher Scientific) اندازه گیری شد.

2.7. سنجش تکثیر سلولی

سنجش تکثیر سلولی برمودئوکسی‌اوریدین (BrdU) (میلیپور، برلینگتون، MA، ایالات متحده آمریکا) برای تجزیه و تحلیل تکثیر سلول‌های M-1 و 2L3 انجام شد. برای مقایسه توانایی تکثیر سلول‌های M-1 و 2L3، سلول‌ها به مدت 24 ساعت در صفحات {6}چاهی (5 × 103 سلول در چاهک) کشت داده شدند. BrdU 2 ساعت قبل از پایان دوره جوجه کشی به محیط اضافه شد. برای بررسی تأثیر mNGAL بر تکثیر سلولی 2L3، سلول‌های 2L3 ابتدا در 96-صفحه‌های چاهک (2 × 103 سلول در چاه) به مدت 16 ساعت و سپس تیمار mNGAL برای 8، 24 و 48 ساعت دیگر کشت داده شدند. BrdU 2 ساعت قبل از پایان دوره کمون غذا به محیط اضافه شد. سپس سلول ها با محلول تثبیت کننده (200 میکرولیتر در چاه) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه و سپس با آنتی بادی تشخیص BrdU (100 میکرولیتر در چاه) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت و آنتی بادی ضد موش بز کونژوگه با پراکسیداز تثبیت شدند. (100 میکرولیتر در چاه) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه. سلول ها سه بار با Wash Buffer شسته شدند و بین مراحل فوق الذکر روی حوله کاغذی خشک شدند.

پس از انکوباسیون با سوبسترا پراکسیداز TMB (100 میکرولیتر در چاه) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه در تاریکی، واکنش با محلول توقف (100 میکرولیتر در چاهک) متوقف شد. در نهایت OD450 هر نمونه با استفاده از ELISA reader (Thermo Fisher Scientific) اندازه گیری شد.

2.8. سنجش آپوپتوز

برای تجزیه و تحلیل آپوپتوز با استفاده از فلوسایتومتری، سلول‌های 2L3 در 6-صفحه‌های چاهک (1.8 × 105 سلول/چاه) با محیط 2 میلی‌لیتر کاشته شدند و به مدت 16 ساعت انکوبه شدند. سپس سلول ها با mNGAL ({11}}، 600، 1200 میکروگرم در میلی لیتر) به مدت 0، 4 یا 12 ساعت دیگر تیمار شدند، جمع آوری و با Annexin V-FITC و PI (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) رنگ آمیزی شدند. ) برای تجزیه و تحلیل با فلوسیتومتری در 4 و 12 ساعت، به ترتیب (n=3، برای کنترل و mNGAL). برای ایجاد جبران و ربع قبل از تجزیه و تحلیل، سلول های رنگ آمیزی نشده، سلول های رنگ آمیزی شده با Annexin V-FITC تنها، و سلول های رنگ آمیزی شده با PI استفاده شد.

2.9. تجزیه و تحلیل وسترن بلات

سلول ها برداشت و با RIPA تکمیل شده با کوکتل بازدارنده پروتئاز (1:1{18}}0) و فسفاتاز (1:100) لیز شدند. پس از انکوباسیون به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد، لیزهای سلولی به مدت 15 دقیقه در 13400 × گرم (Eppendorf 5415R، هامبورگ، آلمان) در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. غلظت پروتئین با استفاده از روش BCA اندازه گیری شد. مقادیر مساوی پروتئین (25 میکروگرم پروتئین با رنگ بارگذاری 1:2) توسط SDS-PAGE (10%) به صورت الکتروفورزی جدا شد و به مدت 1 ساعت به غشاهای PVDF منتقل شد. سپس غشاها با 5% شیر بدون چربی در سالین تریس بافر با 0.1% Tween{20}} (TBST) به مدت 2 ساعت در دمای اتاق مسدود شدند. پس از شستن با TBST سه بار به مدت 10 دقیقه، غشاها با آنتی بادی های اولیه (جدول 2) یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شدند و به دنبال آن انکوباسیون {25}} ساعت با آنتی بادی های ثانویه کونژوگه با HRP (جدول 3).

2.10. کشت سلولی سه بعدی (کشت سه بعدی)

کشت سه بعدی با استفاده از ماتریکس ماتریژل (Corning، NY، USA) برای ارزیابی تشکیل کیست انجام شد. سلول‌های 2L3 در پلیت‌های چاهک (1000 سلول در چاهک) روی ماتریژل از پیش ساخته شده (40 درصد در محیط) کاشته شدند. پس از اینکه سلول ها به ژل چسبانده شدند، ماتریژل بیشتری به سلول ها اضافه شد تا یک الگوی ساندویچ مانند تشکیل شود (شکل 6). سلول ها در کشت سه بعدی در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 نگهداری شدند. سلول ها با فورسکولین (20 میلی مولار، سیگما) از روز 1 تا روز 3 برای القای تشکیل کیست تحت درمان قرار گرفتند. پس از القای تشکیل کیست با فورسکولین، سلول‌ها با یا بدون mNGAL (2 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) از روزهای 4 تا 8 تیمار شدند و محیط هر روز تغییر می‌کرد. تشکیل کیست هر روز زیر میکروسکوپ مشاهده شد و قطر، مساحت و تعداد کیست با ImageJ اندازه گیری شد. ایمونوسیتوشیمی (ICC) در روز هشتم روی صفحه یا روکش‌ها انجام شد. مشاهده کیست ها با میکروسکوپ کانفوکال (ZEISS، Oberkochen، آلمان) انجام شد.

2.11. ایمونوسیتوشیمی (ICC)

برای مشاهده کیست‌ها، کیست‌های کشت شده با ماتریژل در چاهک‌ها یا روی لپ‌های پوششی سه بار با PBS به مدت 1{3}} دقیقه شسته و سپس با پارافورمالدئید 4 درصد (PFA) به مدت 30 دقیقه در PBS ثابت شدند. پس از نفوذپذیری با 0.4٪ PBST به مدت 20 دقیقه، کیست ها با 10٪ سرم اسب در PBST به مدت 2 ساعت مسدود شدند. کیست ها با آنتی بادی های اولیه علیه E-cadherin (1:500؛ Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) و اکتین (1:1000؛ Millipore) یک شبه در دمای 4◦C رنگ آمیزی شدند و سپس با آنتی بادی ثانویه فلورسنت رنگ آمیزی شدند (جدول 3). در تاریکی به مدت 1 ساعت در دمای اتاق. هسته ها با DAPI (1 میکروگرم بر میلی لیتر) به مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی شدند. نمونه ها با PBST سه بار به مدت 10 دقیقه بین مراحل شستشو شدند.

2.12. میکروسکوپ کانفوکال

برای تأیید اینکه ساختارهای کروی مشاهده شده در کشت سه بعدی کیست هستند، ورقه های پوششی از کشت سه بعدی بر روی اسلایدها با محیط نصب Fluoromount-G (SouthernBiotech، بیرمنگام، AL، ایالات متحده آمریکا) سوار شدند و با استفاده از میکروسکوپ کانفوکال تصویربرداری شدند. تصویربرداری کانفوکال با هدف غوطه وری در روغن 63× انجام شد. مقاطع z نوری مختلف یک کیست 2L3 در کشت سه بعدی با استفاده از ماژول Z-stack در نرم افزار میکروسکوپ ZEISS ZEN (Oberkochen، آلمان) به دست آمد. بخش‌های نوری کیست‌ها با استفاده از نرم‌افزار میکروسکوپ ZEISS ZEN به صورت Z-stack یا ویدیوی سه‌بعدی بازسازی شدند.

2.13. ساخت پلاسمید و عفونت ویروسی

توالی NGAL موش (534 جفت باز) در وکتور pSecTag2B (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA) در چارچوب و پایین دست یک توالی رهبری زنجیره Igκ موش برای بیان بیش از حد پروتئین NGAL ترشح شده قرار داده شد. برعکس، توالی رهبر زنجیره Igκ موش در پلاسمید فوق الذکر برای بیان بیش از حد پروتئین NGAL ترشح نشده حذف شد. pSecTag2B-NGAL با یا بدون توالی رهبر (به ترتیب pN + LS یا pN - LS) برای مطالعه ارتباط بین NGAL و گیرنده NGAL طراحی شده است. برای اطمینان از درج صحیح ساختارها، NheI و NotI برای هضم pN + LS یا pN - LS با NEBuffer 2 (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت و سپس تجزیه و تحلیل با استفاده از 1٪ استفاده شد. ژل TBE.

برای تولید کلون های پایدار، سلول های 2L3 در محیط DMEM/F12 (300 میکرولیتر در چاه) همراه با 10 درصد FBS غیر فعال در برابر حرارت، 1 درصد P/S، پلی برن (8 میکروگرم بر میلی لیتر) و لنتی ویروس (200 میکرولیتر) در انکوبه شدند. یک صفحه چاه 6-در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت. سپس مایع رویی ویروس دور ریخته شد و سلول ها با PBS شسته شدند و با محیط تازه حاوی بلاستیدین (4 میکروگرم بر میلی لیتر) برای انتخاب سلول های آلوده انکوبه شدند. رسانه انتخاب هر 3 روز یکبار تغییر می کرد. سلول های آلوده یک هفته پس از انتخاب بلاستیدین برای وسترن بلات و RT-QPCR برای تجزیه و تحلیل سطح بیان mNGAL برداشت شدند.

2.14. سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA)

کمی سازی NGAL ترشح شده توسط سلول ها با استفاده از کیت الایزا ساندویچ فاز جامد لیپوکالین موش{{{0}} (Lcn2) (Thermo Fisher Scientific) انجام شد. محیط رویی سلول ها جمع آوری شد، برای حذف بقایای سلولی سانتریفیوژ شد و در دمای 8-0 ◦C نگهداری شد. برای منحنی استاندارد، رقت‌های سری 8× پروتئین NGAL استاندارد موش تهیه شد ({8}}، 0.024، 0.195، 1.563، 12.5، 100 نانوگرم در میلی‌لیتر). استانداردها (100 میکرولیتر در چاه) و نمونه‌ها (100 میکرولیتر در چاه از 10 میکروگرم پروتئین کل از لیزات سلولی یا مایع رویی رقیق نشده) به صفحه چاه 96- اضافه شدند و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2.5 ساعت انکوبه شدند. هر چاهک با کونژوگه بیوتین (100 میکرولیتر در چاه) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت و سپس با محلول استرپتاویدین-HPR (100 میکرولیتر در چاه) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 45 دقیقه با تکان دادن ملایم انکوبه شد. محلول دور ریخته شد و چاه با آن شسته شد

پس از انکوباسیون با سوبسترای TMB (100 میکرولیتر در چاه) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه در تاریکی، واکنش با افزودن محلول توقف (50 میکرولیتر در چاهک) متوقف شد. در نهایت OD450 هر نمونه با استفاده از ELISA reader (Thermo Fisher Scientific) اندازه گیری شد.

2.15. تجزیه و تحلیل آماری

همه داده ها به عنوان میانگین ± انحراف استاندارد (SD) نشان داده شده است. برای مقایسه میانگین‌های چندگانه، داده‌ها با استفاده از آزمون t-test و آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) با آزمون تعقیبی توکی در استودیو R مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. زمانی که مقدار p < 0.05 بود، تفاوت ها از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.