تثبیت همزمان اسکلت سلولی اکتین در سلول های متعدد نفرون خاص از کلیه در برابر آسیب های مختلف محافظت می کند.

بیماری های مزمن کلیهوآسیب حاد کلیهمکانیکی هستندبیماری های کلیوی مشخص. در حالی که بیماری های مزمن کلیوی باآسیب پودوسیت, آسیب حاد کلیهسلول های اپیتلیال لوله های کلیوی را تحت تاثیر قرار می دهد. با وجود این تفاوت ها،یک ویژگی اصلیاز هر دوبیماری های کلیوی حاد و مزمناسکلت سلولی اکتینی است که تنظیم نشده است. ما این را نشان داده ایمفعال سازی فارماکولوژیک GTPase دینامینآسیب پودوسیت را بهبود می بخشدمدل های موش بیماری های مزمن کلیویتوسطترویج پلیمریزاسیون اکتین. در اینجا نقش دینامین را در تعدیل سختی و قطبیت مشخص می کنیمسلول های اپیتلیال لوله های کلیویبا اتصال عرضی رشته های اکتین به شبکه های شاخه دار. فعال سازی قابلیت اتصال عرضی دینامین توسط یک آگونیست مولکولی کوچک، قشر اکتومیوزین غشای آپیکال را در برابر آسیب تثبیت می کند، که به نوبه خودعملکرد کلیه را حفظ می کنددر مدل های مختلف موش آسیب حاد کلیه قابل توجه است که آگونیست دینامین به طور همزمان پودوسیت وآسیب لوله ایدر مدل موش ژنتیکی سندرم آلپورت. مطالعه ما شواهدی را برای امکان‌سنجی ارائه می‌کند و آن را برجسته می‌کندمزایای درمان‌های کلی‌نگر جدید محافظ نفرون.

برای اطلاع از فرمولاسیون گیاهی سیستانچ که در آسیب حاد کلیوی مفید است، اینجا را کلیک کنید.

اینعلل اصلی آسیب حاد کلیه(AKI) هستندایسکمی, هیپوکسی، یاسمیت کلیوی 1. در حالی که می توان آن را معکوس کرد، AKI یک مشکل مهم مراقبت های بهداشتی با مرگ و میر بالا و بدون درمان قطعی است. صرف نظر از علت آن، AKI در درجه اول به سلول های اپیتلیال پلاریزه توبول های کلیوی آسیب می رساند که میکروویل های آپیکال آن ها مرز برس لوله ای را تشکیل می دهند که در هماهنگی الکترولیت ضروری و انتقال آب شرکت می کند. یک ویژگی مورفولوژیکی اولیه AKI از دست دادن مرز قلم مو و قطبیت سلولی به دلیل تجزیه قشر اکتومیوزین در غشای آپیکال است.

ایجاد و حفظ قطبیت سلولی شامل آبشارهای سیگنالینگ، قاچاق غشاء و پویایی اسکلت سلولی است که همه آنها بسیار هماهنگ هستند. سازماندهی غشای آپیکال تا حد زیادی توسط معماری شبکه‌های اکتومیوزین تعیین می‌شود. در حالی که موتورهای میوزین II به عنوان مولد اولیه سفتی قشر مغز در نظر گرفته می شوند، معماری قشر اکتومیوزین توسط تعداد بی شماری از پروتئین های اتصال دهنده اکتین (ABPs) ایجاد شده است.

علاوه بر ABP های شناخته شده، مرز برس توبول های کلیوی به شدت غنی شده با dynamin8 است، یک GTPase که بیشتر به دلیل نقشش در اندوسیتوز شناخته شده است. Dynamin تمایل ذاتی به مونتاژ در حالت های الیگومریزاسیون متعدد مانند دایمرها، تترامرها، حلقه ها و مارپیچ ها دارد. ما برای اولین بار فعل و انفعالات مستقیم دینامین-اکتین را شناسایی کردیم و نشان دادیم که الیگومریزاسیون دینامین، پلیمریزاسیون اکتین را در podocytes11،12، سلول‌های تخصصی ضروری برای انتخاب فیلتر کلیه، تنظیم می‌کند. با استفاده از مدل‌های موشی CKD، نشان داده‌ایم که فعال‌سازی پلیمریزاسیون اکتین وابسته به دینامین با بازگرداندن ساختار و عملکرد منحصربه‌فرد آنها آسیب سلولی را معکوس می‌کند.

در اینجا ما نشان می دهیم که درسلول های اپیتلیال لوله های کلیوی، دینامین اکتین رشته ای (F-actin) را به شبکه های شاخه ای پیوند می دهد. قابلیت اتصال متقابل Dynamin با حالت الیگومریزاسیون و طول F-اکتین مشخص می شود. فعال‌سازی دارویی الیگومریزاسیون دینامین با تثبیت شبکه‌های اکتین و در نتیجه یکپارچگی سلولی با AKI مقابله می‌کند، که تا حدی از سلول‌های اپیتلیال کلیه در برابر آسیب ناشی از استرس اکسیداتیو محافظت می‌کند. مطالعه ما قشر اکتومیوزین غشای آپیکال سلول توبولار کلیوی را به عنوان یک هدف قابل دارو در AKI از طریق دینامین به عنوان یک پروکسی شناسایی می کند.

الیگومریزاسیون Results Dynamin سفتی و مورفولوژی غشای آپیکال را ایجاد می کند.

برای بررسی نقش فعل و انفعالات دینامین-اکتین در سلول‌های اپیتلیال لوله‌ای کلیوی پلاریزه، از Bis-T{1}}، یک فعال کننده آلوستریک الیگومریزاسیون دینامین وابسته به اکتین در یک سیستم بازسازی شده، در سلول‌های11،13، و در کل ارگانیسم 12. فنوتیپ‌های سلولی در سلول‌های کلیه سگ مدین داربی (MDCK) با پیروی از وضعیت F-اکتین و الگوی رنگ‌آمیزی پروتئین اتصال محکم zonula occludens-1 (ZO{10}}) مورد ارزیابی قرار گرفت. بیومارکر قطبیت سلولی در نظر گرفته می شود. سیتوکالاسین D (CytoD) و لاترونکولین A (LatA)، مهارکننده‌های شناخته شده پلیمریزاسیون اکتین، سطوح F-اکتین را کاهش دادند و رنگ‌آمیزی ناپیوسته ZO{12}} را القا کردند (شکل تکمیلی 1a). در مقابل، Bis-T{15}} باعث افزایش جزئی در سطوح F-اکتین بدون هیچ تأثیری بر رنگ‌آمیزی ZO{17}} شد. افزودن Bis-T{19}} قبل و نه بعد از LatA، سطح F-اکتین و قطبیت سلول را تا حدی حفظ کرد. نه وسیله نقلیه DMSO و نه دینول 14 بازدارنده دینامین هیچ اثری از خود نشان ندادند (شکل تکمیلی 1a).

میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) به ما این امکان را داد که تغییرات مورفولوژی سلولی ناشی از دارو را با تمرکز بر غشای آپیکال تجسم کنیم (شکل 1a). میانگین ارتفاع سلول های MDCK 2±11 میکرومتر و میانگین طول میکروویلی ها 2.2 ± 0}.63.63 میکرومتر بود (جدول 1)، که در محدوده مشاهده شده در کلیه است. LatA ارتفاع سلول و طول میکروویلی‌ها را کاهش داد و میکروویلی‌های توزیع شده یکنواخت را به خوشه‌ها منتقل کرد، در حالی که Bis-T{11}} اثرات معکوس را ایجاد کرد (جدول 1، شکل 1a). وقتی قبل از LatA اضافه شد، Bis-T{15}} تا حدی ارتفاع سلول و طول میکروویلی را حفظ کرد. از آنجایی که میکروویلی‌ها کنترل طول بسیار خوبی را نشان می‌دهند که توسط اکتین قشری در پایه 16 آنها تعریف شده است، این داده‌ها شواهدی را ارائه می‌دهند که Bis-T{18}} قشر اکتومیوزین را در غشای آپیکال تغییر داده است.

برای تعیین اثر دقیق Bis-T-23 بر روی اکتین قشر مغز، ما قشر اکتومیوزین را در لایه لایه با استفاده از میکروسکوپ الکترونی ماکت پلاتین (PR-EM) مشاهده کردیم. LatA چگالی شبکه‌های اکتین را کاهش داد و این اثر تا حدی با افزودن Bis-T{4}} قبل از LatA لغو شد (شکل 1b). از آنجایی که LatA با جداسازی مونومرهای اکتین، پلیمریزاسیون رشته اکتین را تسریع می‌کند، سپس بررسی کردیم که آیا حفظ مشاهده شده قشر اکتومیوزین توسط Bis-T{7}} به دلیل تأثیر مثبت آن بر پلیمریزاسیون اکتین است یا خیر. بر خلاف تحریک قوی پلیمریزاسیون اکتین مشاهده شده در عصاره سلولی 10،11، Bis-T{11}} تنها به طور جزئی پلیمریزاسیون اکتین را در عصاره سلولی MDCK افزایش داد (شکل تکمیلی 1b). به طور مشابه، کاهش ایمنی دینامین درون زا-2 (Dyn2) از عصاره یا مهار فعالیت GTPase آن توسط داینود منجر به اختلال حاشیه ای پلیمریزاسیون اکتین شد (شکل تکمیلی 1c). در حالی که LatA و CytoD به طور قابل توجهی پلیمریزاسیون اکتین را مختل کردند، افزودن Bis-T{17}} قبل از LatA یا CytoD قادر به غلبه بر اثرات بازدارندگی آنها نبود (شکل تکمیلی 1d، e). جاسپلاکینولید، دارویی که با تحریک هسته زایی رشته اکتین، پلیمریزاسیون اکتین را القا می کند، سطح کلی پلیمریزاسیون را به طور قابل توجهی افزایش نداد (شکل تکمیلی 1d)، که نشان می دهد لیز سلولی MDCK یک سطح تقریباً حداکثری از اکتین پلیمریزه شده را نشان می دهد. با هم، این داده ها نشان داد که اثرات Bis-T{23}} بر مورفولوژی غشای آپیکال در سلول های MDCK توسط مکانیسمی غیر از پلیمریزاسیون اکتین هدایت می شود.

با توجه به دانش رایج در مورد محلی سازی غنی شده Dyn2 و F-actin در مرز براش سلول های اپیتلیال کلیه و نقش دینامین در اندوسیتوز، در مرحله بعدی بررسی کردیم که آیا Bis-T{4}} به طور غیرمستقیم از طریق تغییرات در اندوسیتوز بر اکتین تأثیر می گذارد یا خیر. همانطور که انتظار می رفت، هر دو Dyn2 و F-actin در قشر اکتومیوزین در زیر غشای آپیکال، درون میکروویلی ها، و در حفره های پوشش داده شده با کلاترین (CCPs)، که با شکل و اندازه متمایز آنها تعریف شده اند، به طور مشترک موضعی شدند (شکل تکمیلی 1f). ما پویایی CCP ها را با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کل (TIRF) بررسی کردیم. Bis-T{13}}، حتی در بالاترین غلظت خود، تأثیری بر توزیع طول عمر CCPها نداشت، در حالی که دینول تعداد CCPهای مولد را کاهش داد (شکل تکمیلی 1g). این عدم همبستگی بین سطح اندوسیتوز و تغییرات در مورفولوژی سلولی نشان می‌دهد که Bis-T{16}} اکتین قشر مغز را بدون تأثیر بر نقش دینامین در اندوسیتوز هدف قرار می‌دهد.

از آنجایی که قطبیت سلول های کلیوی توسط معماری و انقباض پایدار شبکه های اکتومیوزین حفظ می شود، که سفتی سلول را در غشای آپیکال ایجاد می کند، سپس سفتی سلول را با استفاده از میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM) اندازه گیری کردیم. سیستم Nanowizard IV و نرم افزار تجزیه و تحلیل JPK برای تعیین تغییرات در Modulus21 یانگ در تنظیمات آزمایشی مختلف مورد استفاده قرار گرفت (شکل تکمیلی 2a). درمان با LatA منجر به کاهش قابل توجهی در سفتی تماس سلول-سلول و سفتی سلول آپیکال در سلول های MDCK شد (شکل 1c-e). در مقابل، Bis-T{5}} به طور قابل توجهی سفتی سلول را در مقایسه با وسیله نقلیه DMSO افزایش داد (شکل 1c-e)، مطابق با اثرات مثبت آن بر ارتفاع سلول، تعداد میکروویلی ها، و تراکم شبکه های اکتین (جدول 1 و شکل 1b)22. افزودن Bis-T{11}} قبل از LatA به شدت اثر منفی LatA را بر سفتی سلول کاهش داد (شکل 1c–e)، مطابق با تأثیر مثبت Bis-T-23 بر روی شبکه‌های اکتین و مورفولوژی سلول آپیکال (جدول 1، شکل 1b).

شکل 1 الیگومریزاسیون دینامین سفتی سلول را با تأثیر بر معماری اکتین در سلول های اپیتلیال کلیه تعریف می کند. تصاویر SEM نماینده سلول‌های MDCK تیمار شده با DMSO (0.1%) یا Bis-T-23 (30 μM، 0.1% DMSO) برای 1 0 دقیقه قبل از افزودن DMSO (0.1%) یا LatA (0.2 μM, 0}.1% DMSO) برای 2{{23} } دقیقه تصاویر بزرگ شده از داخل ها (مناطق با جعبه نارنجی) آرایش، توزیع و تراکم میکروویلی ها را در غشای آپیکال نشان می دهد. ب تصاویر PR-EM نماینده سلولهای MDCK که در (الف) توضیح داده شده است. تصاویر تغییراتی را در سازماندهی قشر اکتومیوزین در سلول های MDCK در شرایط نشان داده شده نشان می دهد. c تصاویری از نقشه های مدول یانگ از سلول های MDCK که در (الف) توضیح داده شده است. d، e نمودارهای میله ای نشان دهنده مدول یانگ است که سفتی سلول را در محل اتصال سلول به سلول (d) یا در غشای آپیکال (e) اندازه گیری می کند. هر نماد نشان دهنده سختی متوسط ​​یک سلول است. نتایج نشان داده شده در d، e از حداقل 1{25}} سلول از حداقل سه ظرف کشت تولید شد. نوارهای خطا، میانگین ± SD (*P کمتر یا مساوی 0.05، **P کمتر یا مساوی 0.01، ***P کمتر یا مساوی 0.001، ****P کمتر یا مساوی 0.0001، جفت نشده آزمون t دو دم). ns، قابل توجه نیست.

ما همچنین سفتی سلول را با استفاده از سیستم BioScope II به عنوان یک رویکرد تجربی جایگزین برای AFM تعیین کرده‌ایم. در این نمونه، منحنی‌های فرورفتگی نیرو با استفاده از مدل دیشر و همکاران محاسبه‌شده با نرم‌افزار Matlab23 به‌دست آمدند. روندهای مشابهی با توجه به سفتی سلول برای تعامل بین LatA و Bis-T{2}} ثبت شد (شکل تکمیلی 2b, 2c). علاوه بر این، داینود هیچ تأثیری بر سفتی سلول نشان نداد، در حالی که CytoD به طور قابل توجهی سفتی سلول را کاهش داد (شکل تکمیلی 2d، e)، مطابق با فنوتیپ‌های اکتین آن‌ها (تکملی شکل 1a). این داده ها با هم ارتباط بین وضعیت قشر اکتومیوزین، سفتی سلولی، مورفولوژی غشای آپیکال و قطبیت سلول را ایجاد می کنند. این یافته ها همچنین به طور قانع کننده ای نقش الیگومریزاسیون دینامین را در تعیین پارامترهای مکانیکی قطبیت سلول های اپیتلیال از طریق تأثیر آن بر قشر اکتومیوزین نشان می دهد.

Dynamin رشته های اکتین را به شبکه های شاخه ای متصل می کند که زیربنای قطبیت سلولی است. به منظور روشن کردن مکانیسم مولکولی که توسط آن الیگومریزاسیون دینامین بر معماری قشر اکتومیوزین تأثیر می‌گذارد، در مرحله بعد اثر دینامین را بر روی رشته‌های اکتین در یک سیستم بازسازی‌شده بررسی کردیم. بر اساس فرضیه فعلی، طول رشته های اکتین نحوه اتصال عرضی آنها را مشخص می کند. از آنجایی که طول متوسط ​​رشته‌های اکتین قشری در یک شبکه در لبه اصلی بین 100 تا 150 نانومتر مربع است، ما تأثیرات دینامین را بر سازمان‌دهی رشته‌های کوتاه‌تر تولید شده از درپوش کردن F-اکتین با ژل‌سولین (Gsn-actin) بررسی کردیم (شکل 2). 2 الف). افزودن Dyn2 منجر به تشکیل شبکه های بزرگ و منشعب شد (شکل 2b, c). بر اساس اندازه‌ها و شکل‌های Dyn2 نوترکیب (شکل 2d)، شبکه‌ها عمدتاً توسط دایمرهای Dyn2 (Dyn2DIMER) و تترامرها (Dyn2TETRA) تشکیل شدند که با چندین رشته اکتین در تعامل بودند (شکل 2e): Dyn2DIMER به دو رشته متصل است. Dyn2TETRA تا چهار رشته و Dyn2RING تا شش رشته را متصل کرد. بزرگنمایی کم تصاویر نشان داد که شبکه های وابسته به دینامین الگویی از اشکال حلقه مانند کوچکتر و بزرگتر را تشکیل می دهند (شکل 2c).

برای ارتباط مشاهدات از سیستم بازسازی شده با نقش دینامین در سلول‌ها، در مرحله بعد، محلی‌سازی Dyn2 درون‌زا را روی شبکه‌های اکتین قشر مغز با استفاده از یک آنتی‌بادی ضد Dyn2 مونوکلونال و سپس یک آنتی‌بادی ثانویه کونژوگه با طلا تعیین کردیم (شکل تکمیلی 3a-c). همانطور که در سیستم بازسازی شده مشاهده می شود، دینامین با تعداد مشخصی از F-اکتین در شبکه های شاخه دار مرتبط است (شکل 2f). این داده‌ها با هم، فعالیت جدیدی از دینامین را شناسایی می‌کنند که F-اکتین را به شبکه‌های شاخه‌ای پیوند می‌دهد.

برای ارتباط بین قابلیت اتصال متقابل دینامین و اثر محافظتی Bis-T-23 بر روی قشر اکتومیوزین و مورفولوژی غشای آپیکال، در مرحله بعد اثرات Bis-T{4}} را بر واسطه دینامین بررسی کردیم. شبکه ها در سیستم های بازسازی شده (شکل 3a). بر اساس نمودارهای کانتور، که نمایش توپوگرافی از چگالی رشته های مختلف را ارائه می دهد، Bis T{7}} چگالی کلی شبکه را افزایش داد (شکل 3a)، که می تواند با افزایش تعداد F-اکتین متصل به دینامین توضیح داده شود. افزایش الیگومریزاسیون آن علاوه بر این، رشته‌های کوتاه‌تر دینامین قوی‌تر از F-اکتین بلند به هم متصل می‌شوند (شکل 3a-c)، که نشان می‌دهد توانایی دینامین برای تشکیل شبکه‌های شاخه‌دار با وضعیت الیگومریزاسیون آن و طول رشته‌های اکتین تعریف می‌شود. توانایی پیوند متقابل رشته‌های اکتین به شبکه‌ها توسط دو ایزوفرم دینامین، که همه جا Dyn2 بیان می‌شوند و دینامین اختصاصی نورون-1 (Dyn1) مشترک بود (شکل 3b, c).

خدمات حمایتی Wecistanche - بزرگترین صادرکننده سیستانچ در چین:

ایمیل:wallence.suen@wecistanche.com

واتساپ/تلفن:+86 15292862950

فروشگاه:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop