سایت آسیب‌پذیری در SARS-CoV-2 Spike آنتی‌بادی محافظتی گسترده‌ای را در برابر زیرمجموعه‌های آنتی ژنی متمایز Omicron ایجاد می‌کند

تکامل سریع سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) انواع Omicron بر نیاز به شناسایی آنتی‌بادی‌هایی با قابلیت‌های خنثی‌کننده گسترده برای اطلاع‌رسانی به درمان‌های مونوکلونال و استراتژی‌های واکسیناسیون در آینده تأکید کرده است. در اینجا، ما S{3}} را شناسایی کردیم، یک آنتی بادی خنثی کننده (bnAb) که محل اتصال گیرنده (RBS) را هدف قرار می دهد که از فردی که قبلاً قبل از انتشار به WT SARS-CoV آلوده شده بود مشتق شده بود. انواع نگرانی (VOCs). S{7}} خنثی سازی متقاطع گسترده ای را از همه انواع غالب نشان داد، از جمله D614G، Beta، Delta، Kappa، Mu، و Omicron (BA.1/BA.2/BA.2.75/BA.4/BA.5/ BL.1/XBB). علاوه بر این، S{17}} همسترها را در برابر چالش‌های in vivo با ویروس‌های WT، Delta و BA.1 محافظت کرد. تجزیه و تحلیل ساختاری نشان داد که این آنتی بادی یک اپی توپ کلاس 1/RBS-A را در حوزه اتصال گیرنده از طریق برهمکنش های متعدد آبگریز و قطبی با منطقه 3 تعیین کننده مکمل زنجیره سنگین خود (CDR-H3)، علاوه بر موتیف های رایج در CDR-H1/ هدف قرار می دهد. CDR-H2 آنتی بادی های کلاس 1/RBS-A. مهمتر از همه، این اپی توپ در حالت باز و پرفیوژن، یا در ساختارهای سنبله تثبیت‌شده هگزاپرولین (6P) در مقایسه با سازه‌های دیپرولین (2P) آسان‌تر بود. به طور کلی، S{33}} پتانسیل درمانی وسیعی را نشان می‌دهد و ممکن است طرح‌های واکسن هدف‌محور علیه انواع آینده SARS-CoV{36}} را نشان دهد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

معرفی

از زمان شروع همه‌گیری در دسامبر 2019، ویروس سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) منجر به بیش از 660 میلیون مورد بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) و بیش از 6.5 نفر شده است. میلیون مرگ در جهان اگرچه توسعه و توزیع سریع واکسن‌ها و داروهای درمانی تا حد زیادی اثر کووید-19 را مهار کرده است، ظهور انواع نگران کننده در گردش (VOCs) به دلیل پتانسیل فرار بیشتر سیستم ایمنی همچنان یک تهدید بزرگ است. و بیماری زایی را افزایش داد. نوع D614G اولین گونه ای بود که ظهور کرد و پس از آن به طور جهانی رایج شد. در مقایسه با WT، نوع D614G به جای افزایش بیماری زایی، قابلیت انتقال را افزایش داد و بنابراین بعید بود که اثربخشی واکسن ها را در آزمایشات بالینی کاهش دهد (1). بین ظهور D614G تا اکتبر 2021، 4 VOC مهم دیگر در سراسر جهان تکامل یافتند، از جمله آلفا، بتا، گاما و دلتا. در میان این گونه‌ها، دلتا به دلیل قابلیت انتقال، افزایش شدت بیماری و فرار نسبی ایمنی، به یک تهدید جهانی تبدیل شد، همانطور که با کاهش توانایی سرم پلی کلونال و mAbs برای خنثی کردن این سویه نشان داده شد (2-6). اندکی بعد، در نوامبر 2021، نوع Omicron شناسایی و به عنوان یک VOC جدید معرفی شد. این گونه دارای بیشترین تعداد جهش تا به امروز بود و به نظر می رسید که سریعتر از سویه های قبلی گسترش می یابد (7، 8). در حال حاضر، طیف گسترده‌ای از زیرشاخه‌های Omicron وجود دارد که منجر به موارد جدید COVID از نوشتن واریانت‌های Omicron می‌توانند به‌وسیله‌ای از مصونیت مرتبط با واکسن کووید{28}} شناسایی نشوند و در نتیجه قدرت خنثی‌کننده آنتی‌بادی‌های سرم را از افراد درحال نقاهت و واکسینه کامل mRNA و افرادی که با WT/BA.5 دو ظرفیتی جدید تقویت شده‌اند، به‌طور چشمگیری کاهش می‌دهند. واکسن mRNA (9، 10). به طور مشابه، انواع Omicron قادر به فرار از اتصال چند پادتن‌های درمانی مجوز استفاده اضطراری (EUA) بودند، حتی اگر قبلاً نشان داده شده بود که در برابر VOCهای قبلی مؤثر هستند (10-12). با توجه به کاهش خنثی سازی در برابر Omicron و ادامه تهدید VOC های آینده، نیاز فوری به شناسایی آنتی بادی های خنثی کننده گسترده و قوی وجود دارد که می توانند در برابر دودمان های متنوع و در حال تکامل SARS-CoV{38}} محافظت کنند. در این مطالعه، ما یک mAb واکنش دهنده به گیرنده متصل شونده قوی (RBD-Reactive) از خون محیطی یک فرد در حال نقاهت SARS-CoV{42}} شناسایی کردیم که به طور موثر آلفا، بتا، کاپا، دلتا، مو، و انواع Omicron (BA.1، BA.2، BA.2.75، BA.4، BA.5، BL.1 و XBB). این mAb، S{50}}، بارهای ویروسی BA.1 Omicron، Delta و WT را در ریه‌ها و مخاط بینی به دنبال چالش in vivo در همسترها کاهش داد. S{52}} به محل اتصال گیرنده (RBS) متصل می شود که وقتی RBD روی سنبله در روال بالا قرار دارد کاملاً در معرض دید قرار می گیرد. mAb از نقوش موجود در CDR-H1 و CDR-H2 استفاده می کند که در آنتی بادی های کلاس 1/RBS-A IGHV3-53/3-66 مشترک هستند (13، 14)، اما همچنین از طریق تماس های منحصر به فرد گسترده با CDR -H3 برای دور زدن جهش در سنبله های VOCs. این نشان می‌دهد که طراحی منطقی تقویت‌های واکسن آتی که انواع Omicron را پوشش می‌دهد باید اصلاح شود تا یک سنبله تثبیت‌شده در پیکربندی عمدتاً بالا ارائه شود تا به طور بهینه کلاس 1/RBS-A mAb‌هایی را که ویژگی‌های CDR-H3 مشابهی دارند، القا کند.

فواید سیستانچ - تقویت سیستم ایمنی

نتایج

جداسازی بادی‌آب‌های واکنش‌دهنده RBD که الگوهای متنوعی از خنثی‌سازی و قدرت را نشان می‌دهند. قبل از گسترش دودمان Omicron، ما قبلاً 43 mAbs را مشخص کردیم که اپی توپ‌های متمایز را روی پروتئین سنبله، از جمله دامنه N ترمینال (NTD)، RBD، و زیرواحد 2 (S2) هدف قرار می‌دهند. هیچ یک از این آنتی بادی ها قادر به خنثی کردن گونه های SARS-CoV-2 موجود در آن زمان نبودند (15). در این مطالعه، پانل اضافی از mAbهای واکنش‌دهنده RBD از 3 فرد با پاسخ‌دهی بالا بیان شد که پاسخ‌های IgG ضد اسپایک قوی را نصب کردند، همانطور که قبلاً تعریف شد (16) (جدول تکمیلی 1 و 3؛ مطالب تکمیلی در دسترس آنلاین با این مقاله. https://doi.org/10.1172/JCI166844DS1). اگرچه نسبت سلول‌های B متصل شونده به RBD در افراد با پاسخ‌دهی بالا در مقایسه با پاسخ‌دهندگان متوسط ​​و کم مشابه بود (شکل 1، A-C)، نرخ هایپرجهش سوماتیک زنجیره سنگین به طور قابل توجهی در گروه با پاسخ‌دهی بالا بیشتر بود (شکل 1). ، D و E)، نشان می دهد که این افراد ممکن است بالاترین پتانسیل تولید mAbs واکنش متقابل قوی را داشته باشند (16). این آنتی بادی ها بیشتر در برابر جهش یافته های RBD برای شناسایی طبقه بندی اپی توپ آنها مورد بررسی قرار گرفتند (17). در میان 14 mAb واکنش‌دهنده RBD، ما 4 mAbs کلاس 2، 2 mAbs کلاس 3 و 8 mAbs طبقه‌بندی‌نشده را شناسایی کردیم که کاهش اندک یا بدون کاهش در اتصال به جهش‌های کلیدی RBD آزمایش‌شده را نشان دادند (شکل 1F). لازم به ذکر است که آنتی بادی های کلاس 2، کلاس 3 و کلاس 4 تقریباً با اپی توپ های RBS BD، S309 و CR3022 مطابقت دارند که در مطالعات قبلی تعریف شده اند (13، 18). mAb های RBD کلاس 2 و 3 یک جهش RBD چند متغیره حاوی جایگزین های K417N/E484K/L452R/N501Y را شناسایی نکردند، یک RBD مصنوعی طراحی شده برای شامل جهش های کلیدی برای فرار ویروس (17، 18)، و همچنین هیچ واکنش متقابلی را به ویروس نشان ندادند. RBD SARS-CoV{54}} و سندرم تنفسی خاورمیانه (MERS)-CoV (شکل 1F). از نظر عملکردی، mAbs کلاس 2 و 3 RBD به شدت انواع D614G و Delta را خنثی کردند، اما فعالیت خنثی کننده در برابر بتا، کاپا و مو محدودتر بود (شکل 1G). هیچ یک از آنتی بادی های کلاس 2 یا 3 مورد سنجش، هیچ گونه Omicron آزمایش شده را خنثی نکرد.

در مقابل، اکثر mAbs طبقه بندی نشده به چند متغیر RBD متصل شده و به SARS-CoV-1 RBD واکنش متقابل نشان دادند (شکل 1F). در این میان، ما 3 mAbs، S451-1140، S626-161 و S728-1157 را شناسایی کردیم که قدرت خنثی‌سازی بالایی را در برابر D614G نشان دادند و بتا، دلتا، کاپا، مو، و متقاطع خنثی‌شده را نشان دادند. Omicron BA.1 با 99% غلظت بازدارنده (IC99) در محدوده 20-2500 نانوگرم در میلی لیتر (شکل 1G). با توجه به قدرت خنثی سازی گسترده این 3 mAbs، علاوه بر پلت فرم سنجش پلاک، ما همچنین فعالیت خنثی سازی را در برابر BA.2.75، BL.1 (BA.2.{22}}R346T)، BA.4 معتبر، ویروس‌های BA.5 و XBB با استفاده از تست خنثی‌سازی کاهش تمرکز (FRNT) (شکل 1G). از این میان، S{27}} فعالیت‌های خنثی‌کننده بالایی را در برابر پانل انواع Omicron از جمله BA.1، BA.2، BA.4، و BA.5 با IC99 تا 100 نانوگرم در میلی‌لیتر نشان داد که توسط یک اندازه‌گیری شده است. سنجش پلاک سناریوی مشابهی با استفاده از FRNT مشاهده شد که در آن S{34}} فعالیت خنثی سازی بالای خود را در برابر BA.2.75، BL.1، BA.4، BA.5، و XBB با IC50 در محدوده 8-300 نانوگرم حفظ کرد. / میلی لیتر (شکل 1G). S{44}} BA.1، BA.2، BA.2.75، و BL.1 را به شدت خنثی کرد، اما نه BA.4 و BA.5 را، همانطور که در هر دو پلت فرم سنجش خنثی سازی مشاهده شد. از سوی دیگر، S{52}} فعالیت خنثی کننده ای را در برابر انواع Omicron فراتر از نوع BA.1 نشان نداد (شکل 1G). اگرچه S{55}} قدرت خنثی‌سازی کمتری در برابر VOCهای آزمایش‌شده نسبت به ۲ آنتی‌بادی دیگر داشت، این تنها mAb بود که واکنش متقاطع را نه تنها به SARS CoV-1 RBD نشان داد، بلکه قادر بود خفاش را نیز خنثی کند. کروناویروس‌های WIV-1 و RsSHC014 (شکل 1، F و G). این داده‌ها نشان می‌دهند که S626-161 یک اپی توپ حفاظت‌شده را تشخیص می‌دهد که بین این دودمان‌های آربوویروس مشترک است، اما در سویه‌های BA.2 و بعد از آن وجود ندارد. علاوه بر این، در مقایسه با S728-1157 و S{451-1140، S626-161 دارای یک CDR-H3 طولانی‌تر است که می‌تواند قابلیت بهبودیافته‌ای برای شناسایی یک تکه باقی‌مانده به‌شدت حفاظت‌شده به اشتراک گذاشته شده در بین آربوویروس‌ها، همانطور که توضیح داده شد، ارائه دهد. در مطالعه قبلی (19) (شکل تکمیلی 1). هنگام مقایسه ژن های متغیر ایمونوگلوبولین سنگین (IGHV) و زنجیره سبک (IGLV یا IGKV) این 3 mAbs با پایگاه داده خنثی کننده SARS-CoV{73}} mAbs موجود (13، 15، 20-27)، متوجه شدیم که زنجیره سنگین ژن های متغیر مورد استفاده S{78}} (IGHV3-66)، S{80}} (IGHV3-23) و S{82}} (IGHV4-39) دارای قبلا گزارش شده بود که چندین آنتی بادی خنثی کننده قوی SARS-CoV{85}} را که RBD را هدف قرار می دهند، رمزگذاری می کند (21، 22، 28، 29). با این حال، تنها S{90}} دارای جفت‌های ژنی متغیر با زنجیره سنگین و سبک منحصر به فرد بود که در پایگاه داده گزارش نشده است (جدول تکمیلی 3)، که نشان می‌دهد یک کلونوتیپ عمومی نیست.

شکل 1. ویژگی‌های mAbs واکنش‌دهنده RBD جدا شده از کووید-19-افراد در حال نقاهت

این 3 mAbs (S451-1140، S{2}} و S728-1157) بیشتر مشخص شدند تا وسعت اتصال آنها در برابر VOCهای SARSCoV-2 تعیین شود (شکل 2، A و B) . نشان داده شده است که سنبله تثبیت‌شده با پیش‌فیوژن حاوی 2-جایگزینی‌های پرولین در زیرواحد S2 (2P؛ دیپرولین) در مقایسه با سنبله WT، ایمنی‌زایی برتری دارد و اساس چندین SARS-CoV کنونی است{11}} واکسن ها، از جمله واکسن های مبتنی بر mRNA (30، 31). اخیراً، پروتئین اسپایک تثبیت شده با 6 پرولین (6P؛ هگزاپرولین) گزارش شده است که بیان را تقویت کرده و حتی از ساختار اصلی دیپرولین پایدارتر است. در نتیجه، برای استفاده در نسل بعدی واکسن‌های کووید{17}} پیشنهاد شده است (32، 33). برای تعیین اینکه آیا تفاوت های آنتی ژنی بین سازه های دیپرولین و هگزاپرولین سنبله وجود دارد، هر دو ایمونوژن در پانل آزمایش ما گنجانده شدند. همانطور که توسط ELISA اندازه گیری شد، ما دریافتیم که 3 mAbs آنتی ژن سنبله 6P-WT را به میزان بیشتری در مقایسه با اسپایک WT{23}} متصل می کنند (شکل 2، A و B). همه 3 mAbs اتصال قابل مقایسه ای به اسپک های ویروس های آلفا، بتا، گاما و دلتا نسبت به WT{26}}P (شکل 2، A و B) نشان دادند. با این حال، واکنش های اتصال این 3 mAbs به طور قابل ملاحظه ای در برابر پانل آنتی ژن های خانواده Omicron کاهش یافت (شکل 2، B، و C). اتصال S{31}} به جهش‌های یافت شده در BA.1 و BA.2 حساس بود، که منجر به کاهش زیادی در اتصال و کاهش 31- برابری خنثی‌سازی در برابر این گونه‌ها در مقایسه با WT شد{35}} آنتی ژن P و ویروس D614G به ترتیب (شکل 2B). mAb خنثی کننده متقاطع sarbecovirus، S{39}} نیز 1.{41}} تا 3.{43}برابر کاهش اتصال به آنتی ژن BA.1 اسپایک را نشان داد، که ممکن است برای یک {{45} }کاهش برابری در فعالیت خنثی سازی در برابر BA.1 (شکل 1G و شکل 2، B و C). برای قوی ترین آنتی بادی خنثی کننده گسترده (bnAb)، S{49}}، اتصال به آنتی ژن های Omicron به میزان کمتری (از 1.{51}} تا 4.{53}} برابر) در مقایسه با WT{54}} P افزایش یافت و در فعالیت خنثی‌کننده تأثیری نداشت (شکل 1G و شکل 2، B و C). کاهش قابل توجهی در اتصال mAb خنثی کننده Omicron به سنبله BA.1 ممکن است به دلیل تغییر در تحرک آن و مربوط به بسته بندی محکم Omicron 3-ساختارهای پایین RBD و اولویت برای 1- همانطور که در مطالعه قبلی گزارش شده است، RBD را افزایش می دهد که به فرار از آنتی بادی ها کمک می کند (34). جهش‌های تثبیت‌کننده 2P و 6P همچنین در گونه‌های Omicron اثرات متفاوتی دارند که در آن همه 3 mAbs بیش از 2 را نشان دادند. نسخه، اما اتصال به اسپایک BA.2 و BA.4/5 6نسخه P را در مقایسه با نسخه‌های 2P آن‌ها به میزان 1.2 × تا 1.4 × اندکی افزایش داد، که نشان‌دهنده دسترسی کمی بهتر به mAb‌های خنثی‌کننده Omicron به نسخه‌های شش قطبی است. به خصوص برای سازه BA.1 سنبله. علاوه بر ELISA، تداخل سنجی لایه ای (BLI) برای تعیین کمیت نرخ اتصال و ثابت های تعادل (kon، koff، و KD) این 3 mAbs به پانلی از آنتی ژن های سنبله استفاده شد (شکل تکمیلی 2). نرخ شناسایی کن مربوط به اتصال آنتی ژن قطعه (Fab) به سنبله های هگزاپرولین 1.{83}} تا 3 بود.{85}}در مقایسه با سنبله های دیپرولین سریعتر است (شکل تکمیلی 2، B و C)، که نشان می دهد که آنتی‌بادی‌هایی که به ساختار 6P متصل می‌شوند، سریع‌تر از ساختار 2P ساخته می‌شوند. اگر اپی توپ ها در RBD در حالت باز روی سنبله هگزاپرولین در دسترس تر بودند، ممکن بود این مورد انتظار می رفت. به جز S{89}}، Fabs از سنبله هگزاپرولین آهسته‌تر جدا شد (کف کمتری داشت) نسبت به سنبله دیپرولین، به طوری که KD کلی نشان داد که S{90}} و S451-1140 به سنبله هگزاپرولین با میل ترکیبی بیشتر (شکل تکمیلی 2، B و C). افزایش اتصال به سنبله هگزاپرولین برای IgG دست نخورده با مدل برهمکنش 1:2 بیشتر قابل توجه بود همانطور که با S{95}} و S{96}} mAbs نشان داده شده است، مطابق با قرار گرفتن در معرض اپی توپ های متعدد با تثبیت 6P که امکان تثبیت 6P را فراهم می کند. اشتیاق بهبود یافته (شکل تکمیلی 2، A و C). روی هم رفته، این نتایج نشان می‌دهد که اپی توپ‌های مورد هدف ممکن است در سنبله تثبیت‌شده با 6P زمانی که RBD در حالت باز است، نسبتاً در دسترس‌تر باشند. سپس تحلیل‌های ساختاری برای تأیید این حدس انجام شد.

شکل 2. وسعت اتصال mAb های خنثی کننده Omicron

تجزیه و تحلیل ساختاری mAbs خنثی کننده گسترده به عنوان اولین تقریب از اپی توپ های محدود شده، از سنجش رقابت ELISA برای تعیین اینکه آیا این 3 mAbs خنثی کننده با پانل کنونی mAbs ما همپوشانی دارند، استفاده شد، مجموعه ای از mAbs با ویژگی های اپی توپ شناخته شده از مطالعات قبلی (15، 25، 35). و 2 mAbs دیگر که در حال حاضر در حال استفاده بالینی هستند، LY-CoV555 (Eli Lilly) (36) و REGN10933 (Regeneron) (37). محل‌های اتصال S{10}} و S728-1157 تا حدی با CC12.3 (23، 25)، یک آنتی‌بادی خنثی‌کننده کلاس 1، و بیشتر آنتی‌بادی‌های کلاس 2، از جمله LY-CoV555 و REGN10933 همپوشانی داشتند، اما نه با آنتی بادی های کلاس 3 و کلاس 4 (شکل 3A). S{24}} دارای همپوشانی قابل توجهی در ناحیه اتصال با کلاس 1 CC12.3، چندین آنتی بادی کلاس 4، از جمله CR3022، و سایر آنتی بادی های طبقه بندی نشده بود، در حالی که دارای همپوشانی جزئی با چند کلاس 2 و یک آنتی بادی منفرد کلاس 3 بود (شکل 3A). به طور مشابه، یک آزمون BLI رقابتی نشان داد که S{33}} و S{34}} شدیداً با یکدیگر برای اتصال به اسپایک WT-6P رقابت می‌کنند، در حالی که S{36}} این کار را نکرد (شکل تکمیلی 3). به طور کلی، این داده ها نشان می دهد که S{38}} و S{39}} اپی توپ های مشابهی را که از S{40}} متمایز هستند، تشخیص می دهند.

شکل 3. مکانیسم خنثی سازی گسترده S{1}}

آنتی بادی S{0}} توسط IGHV3-66 کدگذاری شد و دارای ناحیه 3 تعیین کننده مکملی کوتاه (CDR-H3) بود. قابل توجه، mAbهایی که RBS را در حالت اتصال 1 (یعنی RBS-A یا مکان کلاس 1) متصل می کنند، که با CC12.1، CC12.3، B38، و C105 مشخص می شوند (13، 18، 23، 29، 38، 39)، تمایل به استفاده از IGHV{20}} یا 3-66 دارند و به جهش های VOC حساس هستند (40). با این حال، ناحیه CDR-H3 S{25}} بسیار متمایز از سایر آنتی‌بادی‌های این کلاس است که به‌طور بالقوه فعالیت گسترده‌تر آن را به حساب می‌آورد. برای درک مبانی ساختاری خنثی سازی گسترده توسط S{26}} در این اپی توپ، ساختار میکروسکوپ کریو الکترونی (کرایو-EM) (شکل 3B) از IgG S{30}} را در کمپلکس با اسپایک WT حل کردیم. {31}}P-Mut7، یک نسخه از سنبله WT{34}}P دارای پیوند دی سولفیدی بین پروتومر در C705 و C883، با وضوح جهانی تقریباً 3.3 Å (شکل تکمیلی 4E). با استفاده از روش‌های گسترش تقارن، طبقه‌بندی متمرکز و پالایش، به وضوح محلی در رابط RBD-Fv تقریباً 4 A دست یافتیم (شکل تکمیلی 4E و جدول تکمیلی 8). ساختار بلوری S{44}} Fab با وضوح 3.1 Å تعیین شد و برای ساخت مدل اتمی در رابط RBD-Fv استفاده شد. ساختارهای ما تأیید می‌کنند که S{48}} اپی توپ RBS-A (یا کلاس 1) را در ساختار RBD-up (شکل 3B و شکل تکمیلی 4E) متصل می‌کند، مشابه سایر IGHV3-53/{55} } آنتی بادی ها (شکل 3C). انسداد استریک محل اتصال آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 (ACE2) توسط S{60}} قدرت خنثی‌سازی بالای آن را در برابر SARS-CoV-2 توضیح می‌دهد. موتیف 32NY33 و موتیف 53SGGS56 (23) در S{68}} CDR-H1 و -H2 با RBD تقریباً مانند CC12.3 تعامل دارند (شکل تکمیلی 4، B و C). با این حال، در مقایسه با VH 98DF99 در CC12.3، VH 98DY99 در S{82}} CDR-H3 برهمکنش‌های گسترده‌تری، از جمله برهمکنش‌های آبگریز و قطبی، با RBD ایجاد می‌کند، که ممکن است خنثی‌سازی گسترده در برابر VOCها را به همراه داشته باشد (شکل جداول 3 بعدی و تکمیلی 6 و 7). دی گلایسین VH 100GG101 در S{90}} CDR-H3 همچنین ممکن است اتصال گسترده‌تری را در مقایسه با VH Y100 در CC12.3 تسهیل کند، احتمالاً به دلیل انعطاف‌پذیری در باقی‌مانده‌های گلیسین که منجر به ترکیب متفاوت نوک CDR می‌شود. -حلقه H3 و تغییر نسبی باقیمانده ها در 98DY99.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

اگرچه VOC های Omicron دارای جهش های گسترده در RBD هستند، بیشتر این باقیمانده ها با S{0}} برهمکنش ندارند، زیرا اتصال هنوز مشاهده می شود (شکل تکمیلی 4A). از مدل WT{2}}P-Mut{4}} Fab S728-1157 ما، Y505 تا VL Q31 و E484 تا VH Y99 پیوندهای هیدروژنی ایجاد می‌کنند (شکل تکمیلی 4D و جدول تکمیلی 6 ) که پتانسیل ایجاد اختلال در جهش Omicron Y505H و E484A را دارند. با این حال، یک جهش Y505H همچنان اجازه پیوند هیدروژنی با VL Q31 را می دهد و یک جهش E484A زنجیره جانبی آبگریز دیگری را در نزدیکی باقی مانده های آبگریز VL Y99، F456 و Y489 اضافه می کند. این تماس‌ها ممکن است تا حدی مکانیسمی را توضیح دهند که S{20}} را قادر می‌سازد تا فعالیت خنثی‌کننده را، هرچند کاهش یافته، در برابر آنتی‌ژن BA.1 سنبله حفظ کند (شکل 1G و شکل 2B). آنتی ژن BA.1، به نوبه خود، احتمالاً مربوط به جهش های Omicron است که چشم انداز ساختاری پروتئین سنبله را تغییر می دهد (34). با این حال، چندین باقیمانده جهش یافته جسمی، به عنوان مثال، VH L27، L28، R31، F58، و VL V28 و Q31، در S{32}} در تعامل با SARS-CoV-2 RBD درگیر هستند (شکل تکمیلی 1 و جدول تکمیلی 7)، که همچنین ممکن است به واکنش پذیری گسترده آن در مقایسه با CC12.3 کمک کند. به طور کلی، مطالعات ساختاری ما اساس خنثی‌سازی گسترده S{39}} را نشان داد که می‌تواند اکثر جهش‌ها را در VOCs SARS-CoV{41}} در خود جای دهد.

شکل 4. اثر حفاظتی bnAbs در برابر عفونت SARS-CoV-2 در همستر.

S728-1157 تکثیر SARS-CoV-2 BA.1 Omicron، Delta و WT SARS-CoV-2 را در همسترهای سوریه کاهش می‌دهد. برای ارزیابی اثر حفاظتی mAb های خنثی کننده گسترده خود، از یک مدل عفونت همستر سوری طلایی استفاده کردیم که به طور گسترده برای SARS-CoV استفاده شده است-2. همسترها 5 میلی‌گرم بر کیلوگرم از mAbs آزمایشی ما یا یک کنترل ایزوتیپ که آنتی ژن نامربوط (گلیکوپروتئین ابولا ویروس) را هدف قرار می‌دهد، از طریق تزریق داخل صفاقی 1 روز پس از آلودگی با ویروس‌های SARS CoV{10}} دریافت کردند. بافت ریه و بینی 4 روز پس از عفونت جمع آوری شد (شکل 4A). تجویز درمانی S{13}} منجر به کاهش تیترهای WT، BA.1 Omicron، و انواع دلتا در شاخک‌های بینی و ریه‌های همسترهای آلوده شد (شکل 4، B-D). جالب توجه است که اثر S{16}} در ریه‌ها چشمگیر بود و بارهای ویروسی WT و BA.1 Omicron را تقریباً 104PFU کاهش می‌داد و تیترهای ویروسی نوع BA.1 Omicron به طور کامل لغو شد (شکل 4C). برخلاف خنثی‌سازی آزمایشگاهی (شکل 1G)، S{22}} تکثیر ویروسی BA.1 Omicron را در شاخک‌های ریه و بینی کاهش نداد، که نشان‌دهنده قطع ارتباط بین خنثی‌سازی in vitro و حفاظت در شرایط in vivo برای این کلون است (شکل 4E) . در مقایسه، تجویز S{25}} منجر به کاهش قابل توجهی در تیترهای ویروسی ریه به دنبال چالش WT و BA.1 شد (شکل 4، F، و G). این داده‌ها تاکید می‌کنند که برای تعریف دقیق mAbs محافظ گسترده، ارزیابی کارایی حفاظت به موازات فعالیت خنثی‌سازی مورد نیاز است. با حرکت رو به جلو، جالب است که بررسی کنیم تا چه حد ظرفیت حفاظتی S{28}} وابسته به Fc است. به طور کلی، S{30}} یک mAb امیدوارکننده با کارایی خنثی سازی گسترده در برابر انواع SARS CoV{31}} را نشان می دهد که قادر به کاهش چشمگیر تکرار WT، Delta و BA.1 در داخل بدن هستند.

عفونت SARS-CoV-2 به ندرت باعث ایجاد mAbهای خنثی کننده متقاطع S728-1157 می شود. با توجه به خنثی‌سازی متقاطع و پتانسیل پیشگیری از S{5}}، ما به دنبال ارزیابی این بودیم که آیا آنتی‌بادی‌های مشابه S728-1157 معمولاً در بین پاسخ‌های پلی کلونال در بیماران SARS-CoV-2 القا می‌شوند یا خیر. برای ارزیابی این، ما ELISA های رقابتی را با استفاده از سرم نقاهت انجام دادیم تا تیترهای آنتی بادی ضد RBD را شناسایی کنیم که می تواند برای اتصال با S{11}} رقابت کند (شکل 5A). آزمودنی ها بر اساس میزان پاسخ های آنتی بادی، همانطور که قبلاً تعریف شد، به 3 گروه تقسیم شدند (15، 16). اگرچه پاسخ دهندگان بالا و متوسط ​​دارای تیترهای بالاتری از آنتی بادی های سرمی رقابتی S{16}} در مقایسه با پاسخ دهندگان کم بودند (شکل 5B)، این تیترها در همه گروه ها بسیار پایین بود، که نشان می دهد به دست آوردن سطوح بالای S{{{ 18}}-آنتی بادی های مشابه در سرم پلی کلونال به دنبال عفونت WT SARS-CoV{20}}. ما علاوه بر S{21}}، رقابت سرم نقاهت را با سایر mAbs از جمله S{22}}، S{23}}، LY-CoV555، REGN10933، CR3022 و CC12.3 آزمایش کردیم. مشابه S{30}}، ما تیترهای نسبتاً پایینی از آنتی بادی‌های رقابتی با S{31}}، S{32}}، LY-CoV555، REGN10933 و CC12.3 را در سرم پلی کلونال اکثر بیماران نقاهت مشاهده کردیم. افراد (شکل 5، C-F و H). با این وجود، پاسخ‌دهنده‌های بالا تمایل به داشتن تیترهای قابل‌توجهی بالاتری نسبت به mAb‌های خنثی‌کننده نسبت به پاسخ‌دهنده‌های پایین داشتند (شکل 5، B-F و H). در مقابل، آنتی‌بادی‌هایی که محل اپی‌توپ CR3022 را هدف قرار می‌دهند، در افراد در حال نقاهت بارزتر بودند، که نشان‌دهنده غنی‌سازی آنتی‌بادی‌های کلاس 4 RBD در سرم پلی کلونال است (شکل 5G). قابل‌توجه، تفاوت معنی‌داری در تیترهای CR3022 در 3 گروه پاسخ‌دهنده وجود نداشت، که نشان می‌دهد آنتی‌بادی‌های سایت CR به طور مداوم در طول عفونت WT SARS-CoV{47} در اکثر افراد القا می‌شوند. جالب توجه است، در مقایسه با CC12.3، S{50}} در سطوح 4-برابر کمتر در سرم پاسخ دهندگان بالا تشخیص داده شد. بنابراین، علی‌رغم اینکه آنتی‌بادی‌های کلاس 1 اغلب توسط عفونت طبیعی و واکسیناسیون القا می‌شوند (14، 20، 28، 29، 41-43)، داده‌های ما نشان می‌دهد که آنتی‌بادی‌های مشابه S728-1157 که زیرمجموعه‌ای از این کلاس را نشان می‌دهند، نسبتاً نادر هستند.

علاوه بر این، ما تفاوت در واکنش پذیری به 2P در مقابل سنبله تثبیت شده با 6P را در سرم های کوهورت دوران نقاهت خود بررسی کردیم (شکل 5، I-K). ما متوجه شدیم که هر 3 گروه پاسخ دهنده، آنتی بادی های واکنشی ضد سنبله را علیه اسپایک WT تثبیت شده با 6P به میزان بیشتری نسبت به سنبله WT تثبیت شده با 2P، با ضریب 6 تا 11 برابری نصب کردند (شکل 5J)، که نشان می دهد اپی توپ های آنتی ژنی اصلی بهتر نشان داده شده و یا بر روی آنتی ژن 6P تثبیت شده تثبیت شدند. با استفاده از نمونه‌های مشابه، پاسخ‌دهندگان با شدت بالا و متوسط ​​نیز تیتر کمتری از آنتی‌بادی‌های ضد سنبله علیه BA داشتند.1-2P نسبت به BA.{18}}P، 4 تا 5 برابر (شکل 5K). نکته قابل توجه، پاسخ‌دهنده‌های پایین در مقایسه با اسپایک WT-2P و 6P (-2P و 6P ({25}}برابر کاهش) تغییر برابری کمتری در واکنش‌پذیری اتصال در برابر سنبله BA داشتند. {28}}کاهش برابری) (شکل 5، J و K)، نشان می‌دهد که آنتی‌بادی سرم علیه اپی توپ‌های واکنش‌دهنده BA.1 Omicron ممکن است در افراد دارای پاسخ کم محدودتر باشد. به طور کلی، این داده ها نشان می دهد که اتصال پلی کلونال بهبود یافته ناشی از عفونت طبیعی به سنبله تثبیت شده با 6P، هر دو برای ویروس های WT و Omicron وجود دارد.

آنتی بادی های مشابه S728-1157 به طور مطلوب در زمینه ایمنی هیبریدی القا می شوند. عفونت اولیه SARS-CoV-2 بدون واکسیناسیون در شرایط جهانی کنونی نادر شده است، و چندین مطالعه گزارش کرده‌اند که ایمنی SARS-CoV-2 بین افراد دارای سابقه واکسیناسیون/عفونت خاص متفاوت است. در نتیجه، ما بعداً به دنبال بررسی این بودیم که کدام مواجهه‌های رایج، به غیر از عفونت WT با SARS-CoV{7}} به تنهایی، می‌تواند به طور موثر آنتی‌بادی‌های مشابه S728-1157 را در پلاسما از واکسن‌های مبتنی بر mRNA تک ظرفیتی با و بدون قبلی القا کند. عفونت ما نمونه زیستی لازم را از گروه مطالعاتی حفاظت مرتبط با ایمنی سریع در برابر SARS-CoV{12}} (PARIS) به‌دست آوردیم، که از ابتدای همه‌گیری به‌طور طولی کارکنان مراقبت‌های بهداشتی را دنبال کرده است (44). ما نمونه‌های پلاسما را از شرکت‌کنندگان مطالعه کاملاً ایمن‌شده (2× واکسینه) با و بدون عفونت و همچنین از شرکت‌کنندگان تقویت‌شده (3× واکسینه) با و بدون عفونت انتخاب کردیم. علاوه بر این، نمونه‌هایی را از شرکت‌کنندگان مطالعه که واکسن mRNA دو ظرفیتی (WA1/2020 اجدادی به اضافه Omicron BA.5) دریافت کرده بودند را نیز وارد کردیم (شکل 6A و جدول تکمیلی 2). عفونت‌های جدید در شرکت‌کنندگانی که واکسن‌های تقویت‌کننده دریافت کرده بودند در زمانی رخ داد که دودمان Omicron همه دودمان دیگر SARS-CoV{22}} را در منطقه شهری نیویورک جابجا کرده بودند. ما دریافتیم که افراد دو واکسینه شده کمترین تیتر آنتی‌بادی‌های سرمی رقابتی S{24}} را در بین 5 گروه از نمونه‌های آزمایش شده داشتند (شکل 6B). به طور قابل توجهی، این سطوح مشابه سطح مشاهده شده برای گروهی که در دوران نقاهت واکسینه نشده بودند (همه پاسخ دهندگان؛ شکل 5B) بود. در مقایسه، افراد با سابقه عفونت طبیعی، از جمله افراد در حال نقاهت با 2 دوز از 3 واکسن، و افرادی که عفونت اولیه را تجربه کرده بودند و یک تقویت کننده دو ظرفیتی دریافت کرده بودند، در مقایسه با افراد غیر عفونی، به طور قابل‌توجهی سطوح بالاتری از تحریک S{31} را نشان دادند. اما افراد واکسینه شده (شکل 6B). اگرچه گروه دوز آلوده نشده 3- تنها افزایش غیر قابل توجهی را در مقایسه با 2-گروه دوز نشان داد، تجزیه جفتی بر اساس نوع واکسن نشان داد که دوزهای سوم همولوگ BNT162b2 و mRNA{37}} به طور قابل توجهی S{{ 38}} مانند خنثی کردن تیتر آنتی بادی به ترتیب 2.72 × و 2.85 × (شکل 6، C و D). لازم به ذکر است، در میان شرکت‌کنندگانی که 3 کل تماس با سنبله به هر وسیله‌ای داشتند، تیتر آنتی‌بادی‌های مشابه S{45} در واکسن‌های دوبار نقاهت‌شده در مقایسه با واکسن‌های سه‌گانه بدون عفونت، 3 × بیشتر بود، که نشان می‌دهد SARS-CoV{{{ 51}} عفونت به طور مطلوب تری این کلونوتیپ را القا می کند. در میان گروه‌های ایمنی هیبریدی، ما متوجه شدیم که اکثر افراد تقویت‌شده با پیشرفت‌هایی که دوز واکسن تقویت‌کننده دو ظرفیتی دریافت کرده‌اند، در مقایسه با گروه‌های واکسینه شده قبل از دوران نقاهت، فقط تیتر آنتی‌بادی S{52}} کمی بالاتر داشتند، که نشان می‌دهد S{53 تیتر }} به احتمال زیاد پس از 3 قرار گرفتن در معرض به یک فلات نزدیک می شد. همچنین تیتر آنتی‌بادی‌های پلی کلونال را که علاوه بر S{58}} با CC12.3 و CR3022 رقابت می‌کردند، بررسی کردیم. همه افراد تیتر نسبتاً بالایی از آنتی‌بادی‌های CC12 را نشان دادند.3- و CR3022-، مستقل از تعداد و نوع مواجهه‌ها (شکل تکمیلی 5)، برخلاف آنچه که برای S{63}} مشاهده کردیم. مانند آنتی بادی ها به طور کلی، این داده‌ها نشان می‌دهند که عفونت SARS-CoV-2 و واکسیناسیون mRNA هر دو در القای آنتی‌بادی مشابه S{66} نقش دارند و عفونت نقش غالب‌تری را در افراد واکسینه شده بازی می‌کند.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

در نهایت، در مقایسه پاسخ‌ها در برابر اسپایک تثبیت‌شده با 2P- در مقابل 6P در گروه واکسیناسیون mRNA، متوجه شدیم که اکثر گروه‌ها سطوح مشابهی از آنتی‌بادی‌ها را علیه هر دو سازه استخراج می‌کنند. استثنا در این مورد، گروه غیر آلوده واکسینه شده سه گانه بود که نسبت به سنبله تثبیت شده با 6P واکنش آماری بالاتر، اگرچه فقط اندکی افزایش یافته بود، نسبت به 2P نشان دادند (شکل 6E). این داده‌ها نشان می‌دهند که بر خلاف عفونت طبیعی (شکل 5، J، و K)، واکسیناسیون به تنهایی یک پاسخ پلی کلونال ایجاد می‌کند که بیشتر به اپی توپ‌های موجود در ساختار P، مطابق با اسپایک، محدود می‌شود. }} فرمولاسیون واکسن های فعلی. در نهایت، این یافته‌ها از این ایده حمایت می‌کنند که تثبیت 6P واکسن‌های آینده SARS-CoV{16}} می‌تواند از مزایای عمده در القای کلونوتیپ‌های آنتی‌بادی محافظی مانند S{17}} باشد.

شکل 5. رقابت آنتی بادی سرم دوران نقاهت با mAbهای واکنشی RBD خنثی کننده گسترده و مقایسه پاسخ آنتی بادی سرم در برابر اسپایک های تثبیت شده با 6P- در مقابل 2P

شکل 6. رقابت آنتی بادی سرم واکسینه شده با mRNA با mAbهای فعال RBD خنثی کننده S{2} و مقایسه پاسخ آنتی بادی سرم در برابر اسپایک های تثبیت شده با 6P- در مقابل 2P.

بحث

در این مطالعه، ما یک bnAb قوی جدا شده از یک سلول B حافظه فردی را شناسایی می‌کنیم که در طول موج اولیه همه‌گیری COVID-19 از عفونت SARS-CoV{1}} بهبود یافته بود. این bnAb، S{3}}، واکنش‌پذیری اتصال قابل‌توجهی را حفظ کرد و فعالیت خنثی‌کننده ثابتی در برابر همه SARS-CoV-2 VOC آزمایش‌شده، از جمله Omicron BA.1، BA.2، BA.2.75، BL.1 داشت. BA.2.75+R346T)، BA.4، BA.5، و XBB، و توانست به طور قابل ملاحظه ای تیترهای ویروسی عفونی را به دنبال عفونت Delta و BA.1 در همستر کاهش دهد.

ما دریافتیم که سرم نقاهت از گروه ما حاوی غلظت‌های پایینی از آنتی‌بادی‌هایی است که با S{0}} (یک آنتی‌بادی کلاس 1/ RBS-A) و اپی توپ کلاس 2 بادی‌آب‌ها رقابت می‌کنند. این نشان می‌دهد که S{4}} تا حدودی از سایر آنتی‌بادی‌هایی که اپی توپ‌های کلاس 1 را هدف می‌گیرند منحصربه‌فرد است و به ندرت در مجموعه سلول‌های B حافظه خاص RBD القا می‌شود. در عوض، به نظر می‌رسد که گروه عفونت طبیعی ما آنتی‌بادی‌هایی را القا می‌کند که اپی توپ CR3022 (کلاس 4) را هدف قرار می‌دهند. آنتی بادی های با این ویژگی اغلب واکنش متقاطع هستند اما خنثی کننده کمتری نسبت به آنتی بادی های هدف گیری RBS هستند (14، 17). این داده ها مکمل یافته های قبلی ما هستند که نشان می دهد فراوانی آنتی بادی های کلاس 3/S309 در سرم های دوران نقاهت ممکن است به فعالیت خنثی کننده علیه انواع آلفا و گاما کمک کند، در حالی که فقدان آنتی بادی های کلاس 2 ممکن است باعث کاهش قابلیت خنثی سازی در برابر دلتا شود (15). . با وجود این، وسعت فعالیت بیشتر این آنتی‌بادی‌های هدف‌دار RBS (RBS-A/کلاس 1، RBS-B، C/کلاس 2، و RBS-D، S309/کلاس 3) در برابر انواع Omicron بسیار محدود گزارش شده است. (11، 40، 45).

چالش کلیدی حرکت رو به جلو، تعیین چگونگی بهبود برانگیختن آنتی‌بادی‌های واکنش متقاطع گسترده به اپی توپ‌های حفاظت‌شده RBS است. در این رابطه، ما در اینجا مشاهده کردیم که افراد با ایمنی ترکیبی، تیترهای بیشتری از آنتی‌بادی‌های مشابه S{0}} نسبت به افراد واکسینه شده بدون عفونت قبلی داشتند. نکته مهم این است که این پدیده حتی زمانی که تعداد مواجهه‌ها برای آن کنترل می‌شد (یعنی در واکسن‌های دوگانه دوران نقاهت در مقابل واکسن‌های سه‌گانه غیر عفونی) مورد توجه قرار گرفت، که نشان می‌دهد برخی از عناصر ایمنی مرتبط با عفونت (یا فرمول واکسنی که می‌تواند این نوع ایمنی را تقلید کند) برای برانگیختن این کلونوتیپ مهم است. این با شواهد تجربی مستند می‌کند که افراد دارای ایمنی ترکیبی دارای پروفایل‌های واکنش‌پذیری آنتی‌بادی گسترده‌تر در مقایسه با افرادی هستند که فقط پاسخ‌های ایمنی ناشی از واکسیناسیون یا عفونت اولیه دارند (9).

ساختارهای اینجا نشان می‌دهند که S728-1157 اپی توپ RBS-A/کلاس 1 را در RBD با ترکیب بالا متصل می‌کند. به نظر می رسد که این اپی توپ در سنبله های تثبیت شده با 6P، که گزارش شده است 2 RBD را در بالادست نشان می دهد، در مقایسه با سنبله های 2P، که تنها 1 (30، 33، 46، 47) را نشان می دهد، و آنتی بادی های ما به آنها ارائه می کنند، راحت تر قابل دسترسی است. خاص برای سنبله تا ترکیب، اتصال بهبود یافته را نشان می دهد. S{14}} پس از عفونت طبیعی جدا شد. در چنین زمینه‌هایی، احتمال القای کلون‌های مشابه S{15}} با توجه به اینکه RBD باید بتواند یک ترکیب بالا را اتخاذ کند، حتی به‌طور موقت، به ACE2 متصل می‌شود، و در نتیجه این اپی توپ را آشکار می‌کند، احتمالاً بیشتر است. برخلاف اکثر آنتی‌بادی‌های IGHV3-53/3-66 RBS-A/کلاس 1، S{21}} می‌تواند جهش‌های کلیدی در جهش‌های VOC را با استفاده از برهمکنش‌های گسترده بین CDR-H3 و RBD در خود جای دهد (29, 48-50). S{27}} همچنین از یک زنجیره سبک متفاوت (IGLV3-9) در مقایسه با سایر آنتی بادی‌های کمتر گسترده مانند CC12.3 (IGKV3-20) استفاده می‌کند که ممکن است بر تعاملات اتصال کلی تأثیر بگذارد. با این حال، تجزیه و تحلیل ما نشان می دهد که پیوند هیدروژنی کمتری بین زنجیره سبک S{32}} و RBD در مقایسه با CC12.3 وجود دارد (جدول تکمیلی 7). اگرچه بسیاری از باقیمانده های تماس CDR-H3 که برای واکنش متقابل VOC در این تعامل حیاتی هستند، رمزگذاری شده توسط ژرملاین هستند و توسط جهش های سوماتیک معرفی نمی شوند، چندین باقیمانده جهش یافته سوماتیک در مناطق چارچوب یا CDR-H1، CDR-H2، و CDR-L1 هستند. درگیر در تعامل با SARS-CoV-2 RBD. از یک طرف، این نشان می‌دهد که سلول‌های B حافظه که آنتی‌بادی‌های کلاس IGHV3-53/66 را کد می‌کنند، می‌توانند با بلوغ میل ترکیبی، درجه مشابهی از واکنش متقابل را به دست آورند. از سوی دیگر، این همچنین نشان دهنده امکان طراحی ایمونوژن های هدفمند ژرمنی است که S{52}}مانند سلول های B ساده را هدف قرار می دهند. اگرچه طراحی واکسن‌هایی که می‌توانند به طور خاص آنتی‌بادی‌های مشابه S{53}} را با CDR-H3s انتخابی که قادر به غلبه بر جهش‌های VOC هستند، چالش‌برانگیز باشد، مشوق است که محدودیت ژن IGHV در سایر SARS-CoV قوی مشاهده شود. {58}} مطالعات mAbs خنثی کننده (13، 15، 20-27). روش دیگر، این ممکن است از طریق ایمن سازی مکرر با ایمونوژن های RBD بهینه شده نیز امکان پذیر باشد، همانطور که قبلا برای سایر پاتوژن ها گزارش شده است (51-55).

اگرچه جهش های زیادی در سایت آنتی ژنی کلاس 1 RBS-A/ مشاهده شده است (18)، با توجه به اپی توپ S{3}}، 13 مورد از 15 کل باقیمانده تماس RBD و 2 از 3 CDR-H{{9} }بقایای تماس RBD محدود در Omicron و تمام VOCهای دیگر حفظ می شوند. این نشان می‌دهد که ناحیه RBD که در آن اپی‌توپ S{10}} یافت می‌شود ممکن است دارای باقیمانده‌هایی باشد که برای عملکرد دینامیکی و تناسب ویروسی آن حیاتی است و بنابراین نسبت به باقی‌مانده‌های محل RBS-A/ کلاس 1 نسبت به جهش‌ها و رانش آنتی‌ژنی کمتری تحمل می‌کند. در این صورت، تمایل به از بین رفتن این اپی توپ خاص با تکامل انواع ویروسی باید کاهش یابد، و خصوصیات S{13}} و آنتی‌بادی‌ها و اپی توپ‌های مشابه برای واکسن‌های مقاوم به انواع یا توسعه درمانی mAb مهم شود. به طور خلاصه، مطالعه ما bnAbs را شناسایی می‌کند که ممکن است طراحی ایمونوژن را برای نسل بعدی واکسن‌های ضد ویروس کرونا نشان دهد یا به‌عنوان داروهای درمانی mAb که در برابر تکامل SARS CoV{17} مقاوم هستند، عمل کنند. به طور خاص، از نظر ترکیب قدرت و وسعت، به نظر می رسد S{18}} بهترین آنتی بادی در کلاس است که تا به امروز جدا شده است. با توجه به اینکه این آنتی بادی به راحتی با تثبیت 6P متصل می شود، پیش بینی می شود که ترجیحاً توسط پروتئین های نوترکیب سنبله تثبیت شده با 6P یا ویروس کامل القا شود، که نشان می دهد اصلاح هگزاپرولین می تواند به سازه های واکسن آینده برای محافظت بهینه در برابر SARS-CoV آینده کمک کند. انواع -2 و آربوویروس‌های دیگر.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

مواد و روش ها

جداسازی آنتی بادی مونوکلونال PBMC ها از فیلترهای کاهش لک جداسازی شدند و همانطور که قبلا توضیح داده شد منجمد شدند (24). سلول های B از PBMC ها از طریق FACS غنی شدند. سلول ها با CD19، CD3، و پروب های آنتی ژن کونژوگه به ​​الیگو فلوروفور رنگ آمیزی شدند. سلول های مورد نظر به عنوان CD3-CD{5}} Antigen+ شناسایی شدند. همانطور که قبلاً توضیح داده شد، همه mAbs از سلول‌های طبقه‌بندی شده با طعمه آنتی‌ژنی با برچسب الیگو تولید شدند که از طریق RNA-Seq تک سلولی شناسایی شدند (15، 24). داده‌های تک سلولی B تولید شده در این مطالعه به ژن بیان Omnibus: GSE171703 و GSM5231088-GSM5231123 سپرده شده‌اند.

سلول های B اختصاصی آنتی ژن برای تولید mAbs بر اساس شدت آنتی ژن-کاوشگر که توسط JMP Pro 15 تجزیه و تحلیل شد انتخاب شدند. ژن های زنجیره سنگین و سبک آنتی بادی توسط فناوری های DNA یکپارچه (IDT) سنتز شدند و در IgG1 انسانی و زنجیره سبک κ یا λ انسانی کلون شدند. بردارهای بیانی توسط مجموعه گیبسون، همانطور که قبلاً توضیح داده شد (56). زنجیره‌های سنگین و سبک بادی‌آب متناظر به‌طور موقت به سلول‌های HEK293T (ATCC) انتقال داده شدند. پس از ترانسفکشن به مدت 18 ساعت، سلول های ترانسفکت شده با مایع رویی محیط هیبریدوم بدون پروتئین (PFHM-II، Gibco) تکمیل شدند. مایع رویی حاوی mAb ترشح شده در روز 4 برداشت شد و با استفاده از دانه های پروتئین A-agarose (Thermo Fisher Scientific) همانطور که قبلاً توضیح داده شد (56) خالص شد. دنباله‌ای از زنجیره‌های سنگین و سبک از آنتی‌بادی‌های به خوبی مشخص‌شده از بانک داده‌های پروتئین (PDB)، LY-CoV555 (PDB ID: 7KMG)، CR3{99}}22 (PDB ID: 6W7Y) و REGN1 مشتق شدند. 125}}933 (PDB ID: 6XDG) و همانطور که در بالا توضیح داده شد سنتز شدند. CC12.3 mAb (PDB ID: 6XC4) توسط Meng Yuan در موسسه تحقیقاتی Scripps (سان دیگو، کالیفرنیا، ایالات متحده آمریکا) ارائه شد. بیان پروتئین نوترکیب سنبله سنبله تمام قد (FL) نوترکیب D614G SARS-CoV{28}}، BA.2-6P، BA.4/5-6P، BQ.1-6P، BQ. یک Y505A و Y505F)، ترکیبی جهش یافته RBD (K417N/E484K/L452R/NN501Y)، SARS-CoV{57}} RBD، و MERS-CoV RBD در داخل تولید شدند. به طور خلاصه، آنتی ژن های نوترکیب با استفاده از سلول های Expi293F (Thermo Fisher Scientific) بیان شدند. ژن مورد نظر در یک وکتور بیانی پستانداران (AbVec اصلاح شده داخلی) کلون شد و با استفاده از کیت ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific) طبق پروتکل سازنده ترانسفکت شد. مایع رویی در روز 4 پس از ترانسفکشن برداشت شد و با Ni-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) آگارز (Qiagen) انکوبه شد. تصفیه با استفاده از یک ستون جریان گرانشی انجام شد و با بافر حاوی ایمیدازول همانطور که قبلا توضیح داده شد شسته شد (57، 58). محلول شستشو بافر شده و با استفاده از واحد گریز از مرکز Amicon (Millipor) با PBS مبادله شد. سنبله‌های نوترکیب FL با جهش‌های 2P در واریانت‌های B.1.1.7 آلفا، B.1.351 بتا، P.1 گاما، B.1.617.2 دلتا، BA.1، BA.2 و BA.4 Omicron تثبیت شدند و تولید شده در آزمایشگاه ساتر در موسسه تحقیقات کودکان سیاتل. K417V، N439K، و E484K RBD و نوترکیب FL spike WT-2P و 6P در آزمایشگاه کرامر در دانشکده پزشکی Icahn در کوه سینا تولید شدند. SARS-CoV{88}}P-Mut7 و spike BA.{91}}P همانطور که در مطالعه قبلی توضیح داده شد، طراحی و تولید شدند (59). توالی پروتئین و منابع برای هر آنتی ژن در جدول تکمیلی 4 فهرست شده است. ELISA. پروتئین‌های نوترکیب SARS-CoV{95} spike/RBD روی صفحات میکروتیتر با اتصال به پروتئین بالا (Costar) با غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر در PBS با 50 میکرولیتر در چاه پوشانده شدند و یک شب در دمای 4 درجه نگهداری شدند. صفحات با PBS حاوی 0.05% Tween 20 (PBS-T) شسته و با 150 میکرولیتر PBS حاوی 20% FBS به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه مسدود شدند. آنتی‌بادی‌های مونوکلونال با شروع از 10 میکروگرم در میلی‌لیتر در PBS به‌طور متوالی 3-برابر رقیق شدند و در چاهک‌ها به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه انکوبه شدند. سپس بشقاب ها شسته و با آنتی بادی ضد IgG بز کونژوگه با HRP (Jackson ImmunoResearch; 109- 035-098)، 1:1،000 به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند. پس از شستشو، 100 میکرولیتر از سوبسترای Super AquaBlue ELISA (eBioscience) به هر چاهک اضافه شد. میزان جذب در طول موج 405 نانومتر بر روی دستگاه اسپکتروفتومتر میکروپلیتی (Bio-Rad) اندازه گیری شد. سنجش‌ها با استفاده از آنتی‌بادی کنترل S{122} (15)، با ویژگی‌های اتصال شناخته شده در هر صفحه، استاندارد شدند و صفحات تا زمانی که جذب کنترل به OD 3.0 رسید، توسعه یافتند. همه mAbs در دو نسخه مورد آزمایش قرار گرفتند و هر آزمایش دو بار انجام شد.

سرم الایزا. پلیت‌های میکروتیتر با اتصال به پروتئین بالا با آنتی‌ژن‌های نوترکیب SARS-CoV{1} در غلظت 2 میکروگرم بر میلی‌لیتر در PBS در دمای 4 درجه یک شبه پوشانده شدند. بشقاب ها با PBS 0 شسته شدند.05% Tween و مسدود شده با 200 μL PBS 0.1% Tween + 3% شیر خشک بدون چربی به مدت 1 ساعت در دمای اتاق (RT). نمونه های پلاسما قبل از انجام آزمایش سرولوژی به مدت 1 ساعت در دمای 56 درجه غیرفعال شدند. پلاسما به صورت متوالی 2-برابر در PBS 0.1% Tween + 1% پودر شیر بدون چربی رقیق شد. پلیت ها با رقت های سرمی به مدت 2 ساعت در RT انکوبه شدند. آنتی بادی ثانویه ضد Ig انسانی بز کنژوگه شده با HRP رقیق شده در 1:3،{23}} با PBS 0.1% توئین + 1% پودر شیر بدون چربی برای تشخیص اتصال آنتی بادی ها استفاده شد. پس از 1 ساعت انکوباسیون، پلیت ها با 100 میکرولیتر محلول SigmaFast OPD (Sigma-Aldrich) به مدت 10 دقیقه تولید شدند. سپس، 50 میکرولیتر 3M HCl برای توقف واکنش توسعه استفاده شد. میزان جذب در طول موج 490 نانومتر بر روی دستگاه اسپکتروفتومتر میکروپلیتی (Bio-Rad) اندازه گیری شد. تیترهای نقطه پایانی از منحنی استاندارد 4PL سیگموئیدی (که در آن x غلظت ورود به سیستم است) برای هر نمونه برون یابی شد. حد تشخیص (LOD) به عنوان میانگین + 3 SD سیگنال OD ثبت شده با استفاده از پلاسما از افراد قبل از SARS-CoV{39}} تعریف می‌شود. تمامی محاسبات در نرم افزار GraphPad Prism (نسخه 9.0) انجام شد.

مسابقه الایزا برای تعیین طبقه‌بندی اپی‌توپ هدف بادی‌آب‌های واکنش‌دهنده RBD، ELISA رقابتی با استفاده از سایر پادتن‌ها با ویژگی‌های اتصال اپی توپ شناخته‌شده به عنوان پادتن‌های رقیب انجام شد. mAbs رقیب با استفاده از EZ-Link sulfo-NHS-biotin (Thermo Fisher Scientific) به مدت 2 ساعت در RT بیوتینیله شدند. بیوتین اضافی بادی‌آب‌های بیوتینیله شده با ستون‌های نمک‌زدایی با وزن مولکولی 7K (MWCO) Zeba حذف شد (Thermo Fisher Scientific). پلیت ها با 2 ug/mL آنتی ژن RBD در یک شب در دمای 4 درجه پوشانده شدند. صفحات با PBS–20% FBS به مدت 2 ساعت در RT مسدود شدند و 2-رقت برابری mAbs یک کلاس یا سرم نامشخص اضافه شد، با شروع از 20 ug/mL از mAbs و رقت 1:10 سرم. پس از انکوباسیون آنتی بادی به مدت 2 ساعت در RT، mAb رقیب بیوتینیله شده با غلظت دو برابر ثابت تفکیک آن (KD) اضافه شد و به مدت 2 ساعت دیگر در RT همراه با mAb یا سرمی که قبلاً اضافه شده بود انکوبه شد. صفحات شسته و با 100 میکرولیتر استرپتاویدین کونژوگه با HRP (Southern Biotech) در رقت 1:1{21}} به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند. صفحات با بستر Super AquaBlue ELISA (eBioscience) توسعه داده شدند. برای عادی سازی سنجش ها، mAb بیوتینیله رقیب بدون هیچ گونه mAb یا سرم رقیب به عنوان شاهد به چاه اضافه شد. داده ها زمانی ثبت شد که جذب چاه کنترل به OD 1.0-1.5 رسید. سپس درصد رقابت بین mAbs با تقسیم OD مشاهده شده نمونه بر OD بدست آمده توسط کنترل مثبت، کم کردن این مقدار از 1 و ضرب در 100 محاسبه شد. مقادیر غلظت بازداری درصد (IC50) با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism (نسخه 9.0). داده‌ها به Log1P تبدیل شدند و به نموداری نشان‌دهنده رقت سرم متقابل IC50 رقت سرم رسم شدند که می‌تواند 50 درصد رقابت با mAb رقیب مورد علاقه را به دست آورد. همه mAbs در دو نسخه آزمایش شدند، هر آزمایش 2 بار به طور مستقل انجام شد و مقادیر از 2 آزمایش مستقل به طور میانگین محاسبه شد.

سنجش پلاک سنجش پلاک با ویروس‌های گونه SARS-CoV{1}} روی سلول‌های Vero E6/TMPRSS2 (مجموعه منابع زیستی تحقیقاتی ژاپنی (JCRB)) انجام شد (جدول تکمیلی 5). قبل از اینکه تریپسینیزه شوند و با تراکم 3 × 104 سلول در چاهک در 96- پلیت های چاهک کاشته شوند، سلول ها برای دستیابی به 9{23}} درصد تلاقی کشت داده شدند. در روز بعد، 102 PFU از نوع SARS-CoV{11}} با 2-mAbs رقیق‌شده برابر به مدت ۱ ساعت انکوبه شدند. مخلوط آنتی بادی و ویروس با سلول های Vero E6/TMPRSS2 به مدت 3 روز در دمای 37 درجه انکوبه شد. صفحات با متانول 20 درصد تثبیت و سپس با محلول کریستال ویولت رنگ آمیزی شدند. غلظت کامل بازدارندگی (IC99) با استفاده از log (مهارکننده) در مقابل پاسخ نرمال شده (شیب متغیر)، که در GraphPad Prism (نسخه 9.0) انجام شد، محاسبه شد. همه mAbs در دو نسخه مورد آزمایش قرار گرفتند و هر آزمایش دو بار انجام شد. تست خنثی سازی کاهش تمرکز تست‌های خنثی‌سازی کاهش تمرکز (FRNTs)برای تعیین فعالیت‌های خنثی‌سازی به عنوان یک پلت فرم اضافی به غیر از سنجش پلاک استفاده شد. رقت های سریالی سرم با غلظت نهایی 1:20 با 103 واحد کانونی ویروس در هر چاه مخلوط شده و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شدند. یک نمونه سرم تلفیقی پیش از همه‌گیری به عنوان شاهد استفاده شد. مخلوط آنتی‌بادی-ویروس روی سلول‌های Vero E6/TMPRSS2 (JCRB) در صفحات چاهک تلقیح شد و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه شد. حجم مساوی محلول متیل سلولز به هر چاهک اضافه شد. سلول ها به مدت 16 ساعت در دمای 37 درجه انکوبه و سپس با فرمالین تثبیت شدند. پس از حذف فرمالین، سلول‌ها با یک mAb موش در برابر نوکلئوپروتئین SARS-CoV{39}}/2 [کلون 1C7C7 (سیگما-آلدریچ)] رنگ‌آمیزی شدند و سپس یک ایمونوگلوبولین ضد موش بز با برچسب HRP (Sigma-) آلدریچ؛ A8924). سلول های آلوده با سوبسترای TrueBlue (SeraCare Life Sciences) رنگ آمیزی شدند و سپس با آب مقطر شسته شدند. پس از خشک شدن، اعداد فوکوس با استفاده از ImmunoSpot S6 Analyzer، نرم افزار ImmunoCapture و نرم افزار BioSpot (تکنولوژی سلولی) اندازه گیری شدند. IC50 با استفاده از رگرسیون غیرخطی شیب متغیر (4 پارامتر) در GraphPad Prism (نسخه 9.0) از مقدار درونیابی شده از ورود به سیستم (بازدارنده) در مقابل پاسخ نرمال شده محاسبه شد.

منابع

1. Hou YJ، و همکاران. نوع SARS-CoV-2 D614G تکثیر کارآمد ex vivo و انتقال in vivo را نشان می‌دهد. علوم پایه. 2020؛ 370 (6523): 1464-1468.

2. Garcia-Beltran WF، و همکاران. چندین گونه SARS CoV{2}} از خنثی شدن توسط ایمنی هومورال ناشی از واکسن می‌گریزند. سلول. 2021؛ 184 (9): 2523.

3. Wall EC، و همکاران. خنثی کردن فعالیت آنتی بادی علیه SARS-CoV-2 VOCs B.1.617.2 و B.1.351 با واکسیناسیون BNT162b2. لانست. 2021؛ 397 (10292): 2331-2333.

4. Edara VV، و همکاران. عفونت و پاسخ های آنتی بادی خنثی کننده ناشی از واکسن به انواع SARS-CoV-2 B.1.617. N Engl J Med. 2021؛ 385 (7): 664-666.

5. ژو دی و همکاران. شواهدی مبنی بر فرار SARS-CoV-2 نوع B.1.351 از سرم های طبیعی و ناشی از واکسن. سلول. 2021؛ 184 (9): 2348-2361.

6. Weisblum Y و همکاران. فرار از آنتی بادی های خنثی کننده توسط انواع پروتئین SARS-CoV-2. الیف 2020؛ 9: e61312.

7. Graham F. گزارش روزانه: نوع ویروس کرونا Omicron دانشمندان را در حالت آماده باش قرار می دهد. طبیعت. 2021؛.

8. کریم SSA، کریم QA. نوع Omicron SARS-CoV-2: فصل جدیدی در همه‌گیری COVID-19. لانست. 2021؛ 398 (10317): 2126-2128.

9. Carreño JM، و همکاران. فعالیت سرم نقاهت و واکسن علیه SARS-CoV-2 Omicron. طبیعت. 2021؛ 602 (7898): 682-688.

10. وانگ کیو و همکاران. ویژگی‌های هشداردهنده فرار از آنتی‌بادی‌های در حال افزایش SARS-CoV-2 BQ و XBB. سلول. 2022؛ 186 (2): 279-286.

11. VanBlargan LA، et al. یک ویروس SARS-CoV{2}} عفونی B.1.1.529 Omicron از خنثی شدن توسط آنتی بادی های مونوکلونال درمانی می گریزد. نات مد. 2022؛ 28 (3): 490-495.

12. تاکاشیتا ای، و همکاران. اثر بخشی آنتی بادی ها و داروهای ضد ویروسی در برابر کووید-19 نوع Omicron. N Engl J Med. 2022؛ 386 (10): 995-998.

13. یوان ام، و همکاران. شناسایی دامنه اتصال گیرنده SARS-CoV{2}} با خنثی کردن آنتی بادی ها. Biochem Biophys Res Commun. 2021؛ 538: 192-203.

14. بارنز CO، و همکاران. ساختارهای آنتی بادی خنثی کننده SARS-CoV{2} استراتژی های درمانی را ارائه می دهد. طبیعت. 2020؛ 588 (7839): 682-687.

15. Changrob S, et al. خنثی سازی متقاطع انواع نگران کننده SARS-CoV{3}} توسط آنتی بادی هایی که اپی توپ های متمایز را روی سنبله هدف قرار می دهند. امبیو 2021؛ 12 (6): e0297521.

16. Guthmiller JJ و همکاران. شدت عفونت SARS-CoV{2}} با ایمنی هومورال برتر در برابر سنبله مرتبط است. امبیو 2021؛ 12 (1): e02940-20.

17. گرینی ای جی و همکاران. نقشه برداری جهش به SARS-CoV-2 RBD که از اتصال توسط کلاس های مختلف آنتی بادی ها فرار می کند. Nat Commun. 2021؛ 12 (1): 4196.

18. لیو اچ، ویلسون IA. اپی توپ های خنثی کننده محافظ در SARS-CoV-2. Immunol Rev. 2022؛ 310 (1): 76-92.

19. Jette CA، و همکاران. واکنش متقاطع گسترده در بین آربوویروس‌ها که توسط زیرمجموعه‌ای از آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده مشتق شده از کووید-19 نشان داده می‌شود. Cell Rep. 2021; 36 (13): 109760.

20. Brouwer PJM، و همکاران. آنتی بادی های خنثی کننده قوی از بیماران کووید{1}} اهداف آسیب پذیری متعددی را مشخص می کند. علوم پایه. 2020؛ 369 (6504): 643-650.

21. پینتو دی و همکاران. خنثی سازی متقاطع SARS CoV-2 توسط یک آنتی بادی مونوکلونال SARS-CoV انسانی. طبیعت. 2020؛ 583 (7815): 290-295.

22. Robbiani DF، و همکاران. پاسخ های آنتی بادی همگرا به SARS-CoV-2 در افراد در حال نقاهت. طبیعت. 2020؛ 584 (7821): 437-442.

23. یوان ام، و همکاران. اساس ساختاری پاسخ آنتی بادی مشترک به SARS-CoV{2}}. علوم پایه. 2020؛ 369 (6507): 1119–1123.

24. دوگان اچ ال، و همکاران. پروفیل غلبه ایمنی سلول B پس از عفونت SARS-CoV{2}} تکامل آنتی بادی را به اهداف ویروسی غیرخنثی کننده نشان می دهد. مصونیت. 2021؛ 54 (6): 1290-1303.

25. راجرز تی اف، و همکاران. جداسازی پادتن‌های خنثی‌کننده قوی SARS CoV{1} و محافظت از بیماری در مدل حیوانی کوچک. علوم پایه. 2020؛ 369 (6506): 956-963.

26. اشمیتز ای جی، و همکاران. یک آنتی بادی عمومی ناشی از واکسن در برابر SARS-CoV-2 و انواع در حال ظهور محافظت می کند. مصونیت. 2021؛ 54 (9): 2159-2166.e6.

27. شی آر، و همکاران. یک آنتی بادی خنثی کننده انسانی محل اتصال گیرنده SARS-CoV را هدف قرار می دهد-2. طبیعت. 2020؛ 584 (7819): 120-124.

28. Cao Y و همکاران. آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده قوی علیه SARS-CoV-2 که با توالی‌یابی تک‌سلولی با کارایی بالا سلول‌های B بیماران در حال نقاهت شناسایی شدند. سلول. 2020؛ 182 (1): 73-84.

29. بارنز CO، و همکاران. ساختار آنتی بادی های انسانی متصل به سنبله SARS-CoV{2}} اپی توپ های مشترک و ویژگی های عود کننده آنتی بادی ها را نشان می دهد. سلول. 2020؛ 182 (4): 828-842.

30. Corbett KS، و همکاران. طراحی واکسن mRNA SARS-CoV{2}} با آمادگی پاتوژن نمونه اولیه فعال شده است. طبیعت. 2020؛ 586 (7830): 567-571.

31. امانت ف، و همکاران. معرفی دو پرولین و حذف محل برش پلی پایه منجر به کارایی بالاتر واکسن SARS-CoV{3}} مبتنی بر سنبله نوترکیب در مدل موش شد. mBio. 2021؛ 12 (2): e02648-20.

32. سان دبلیو و همکاران. یک ویروس بیماری نیوکاسل که یک پروتئین سنبله تثبیت شده SARS-CoV-2 را بیان می کند، پاسخ های ایمنی محافظتی را القا می کند. Nat Commun. 2021؛ 12 (1): 6197.

33. Hsieh CL, et al. طراحی مبتنی بر ساختار میخ های SARS-CoV-2 تثبیت شده با پیش تزریق. علوم پایه. 2020؛ 369 (6510): 1501-1505.

34. Gobeil SM, et al. تنوع ساختاری SARS-CoV-2 سنبله Omicron. سلول مول. 2022؛ 82 (11): 2050-2068.

35. یوان ام، و همکاران. یک اپی توپ رمزی بسیار حفاظت شده در حوزه های اتصال گیرنده SARS-CoV-2 و SARS-CoV. علوم پایه. 2020؛ 368 (6491): 630-633.

36. Starr TN و همکاران. نقشه کامل جهش‌های SARS-CoV-2 RBD که از آنتی‌بادی مونوکلونال LY-CoV555 و کوکتل آن با LY-CoV016 فرار می‌کنند. Cell Rep Med. 2021؛ 2 (4): 100255.

37. Baum A, et al. آنتی بادی‌های REGN-COV2 از عفونت SARS-CoV{4} در ماکاک‌ها و همسترهای رزوس پیشگیری و درمان می‌کنند. علوم پایه. 2020؛ 370 (6520): 1110–1115.

38. Wu NC، و همکاران. یک حالت اتصال جایگزین آنتی‌بادی‌های IGHV3-53 به دامنه اتصال گیرنده SARS-CoV-2. Cell Rep. 2020; 33(3):108274.

39. Wu Y و همکاران. یک جفت غیررقیب از آنتی بادی‌های خنثی‌کننده انسانی، اتصال ویروس کووید-19 به گیرنده ACE2 را مسدود می‌کنند. علوم پایه. 2020؛ 368 (6496): 1274-1278.

40. یوان ام، و همکاران. پیامدهای ساختاری و عملکردی رانش آنتی ژنی در انواع اخیر SARS-CoV-2. علوم پایه. 2021؛ 373 (6556): 818-823.

41. یان کیو و همکاران. آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده هدف‌دار RBD رمزگذاری‌شده با IGHV3-53-معمولاً در فهرست آنتی‌بادی‌های بیماران COVID-19 وجود دارند. میکروب های ظهور می کنند. 2021؛ 10 (1): 1097-1111.

42. ژانگ کیو و همکاران. آنتی بادی های عمومی قوی و محافظ IGHV3- 53/{{3-66 و جهش مشترک فرار آنها در سنبله SARS-CoV-2. Nat Commun. 2021؛ 12 (1): 4210.

43. وانگ زی و همکاران. آنتی بادی های ایجاد شده توسط واکسن mRNA برای SARS-CoV-2 و انواع در گردش. طبیعت. 2021؛ 592 (7855): 616-622.

44. سیمون وی، و همکاران. پاریس و اسپارتا: پیدا کردن پاشنه آشیل SARS-CoV-2. mSphere. 2022؛ 7 (3): e0017922.

45. Starr TN و همکاران. SARS-CoV-2 آنتی‌بادی‌های RBD که وسعت و مقاومت در برابر فرار را به حداکثر می‌رسانند. طبیعت. 2021؛ 597 (7874): 97-102.

46. ​​Walls AC، et al. ساختار، عملکرد و آنتی ژنی گلیکوپروتئین سنبله SARS-CoV-2. سلول. 2020؛ 181 (2): 281-292.

47. هندرسون آر، و همکاران. کنترل ترکیب گلیکوپروتئین اسپایک SARS-CoV-2. Nat Struct Mol Biol. 2020؛ 27 (10): 925-933.

48. Shrestha LB، و همکاران. آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده گسترده در برابر انواع جدید SARS-CoV-2. جلو ایمونول. 2021؛ 12:752003.

49. گرینی ای جی، و همکاران. آنتی‌بادی‌هایی که توسط واکسیناسیون mRNA{1}} ایجاد می‌شوند نسبت به آنتی‌بادی‌های ناشی از عفونت SARS-CoV{3}، به‌طور گسترده‌تری به دامنه اتصال گیرنده متصل می‌شوند. Sci Transl Med. 2021; 13 (600):eabi9915.

50. Reincke SM, et al. SARS-CoV-2 عفونت نوع بتا آنتی‌بادی‌های قوی خاص و واکنش متقابل را ایجاد می‌کند. علوم پایه. 2022؛ 375 (6582): 782-787.

51. Wrammert J, et al. آنتی‌بادی‌های واکنش متقاطع گسترده بر پاسخ سلول‌های B انسانی در برابر عفونت ویروس آنفلوانزای همه‌گیر H1N1 در سال 2009 غالب هستند. J Exp Med. 2011؛ ​​208 (1): 181-193.

52. Guthmiller JJ و همکاران. اولین قرار گرفتن در معرض ویروس همه گیر H1N1 آنتی بادی های خنثی کننده گسترده ای که اپی توپ های سر هماگلوتینین را هدف قرار می دهند. Sci Transl Med. 2021; 13(596):eabg4535.

53. باجیک جی، و همکاران. مهندسی آنتی ژن آنفلوانزا بر پاسخ های ایمنی به یک اپی توپ ویروسی تحت سلطه اما به طور گسترده محافظت می کند. میکروب میزبان سلولی 2019؛ 25 (6): 827-835.

54. Nachbagauer R, et al. یک رویکرد واکسن جهانی ویروس آنفولانزا مبتنی بر هماگلوتینین کایمریک، ایمنی گسترده و طولانی‌مدتی را در یک کارآزمایی فاز I تصادفی‌شده و کنترل‌شده با دارونما ایجاد می‌کند. نات مد. 2021؛ 27 (1): 106-114.

55. آنجلتی دی، و همکاران. غلبه بر ایمنی برای هدف قرار دادن اپی توپ‌های خنثی‌کننده تحت سلطه. Proc Natl Acad Sci US A. 2019؛ 116(27):13474–13479.

56. Guthmiller JJ و همکاران. یک روش کارآمد برای تولید آنتی بادی های مونوکلونال از سلول های B انسانی. روش‌ها Mol Biol. 2019؛ 1904: 109-145.

57. امانت ف، و همکاران. یک سنجش سرولوژیکی برای تشخیص تبدیل سرمی SARS-CoV-2 در انسان. نات مد. 2020؛ 26 (7): 1033-1036.

58. Stadlbauer D, et al. تبدیل سروی SARS-CoV-2 در انسان: یک پروتکل دقیق برای سنجش سرولوژیکی، تولید آنتی ژن و تنظیم آزمایش. Curr Protoc Microbiol. 2020؛ 57 (1): e100.

59. تورس جی ال، و همکاران. بینش‌های ساختاری یک آنتی‌بادی مونوکلونال انسانی SARS-CoV{3}} خنثی‌کننده بسیار قوی. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119(20):e2120976119.

60. سولووی سی، و همکاران. میکروسکوپ مولکولی خودکار: سیستم جدید لژینون J Struct Biol. 2005؛ 151 (1): 41-60.

61. Lander GC، و همکاران. Appion: خط لوله یکپارچه مبتنی بر پایگاه داده برای تسهیل پردازش تصویر EM. J Struct Biol. 2009؛ 166 (1): 95-102.

62. Voss NR، و همکاران. DoG Picker و TiltPicker: ابزارهای نرم افزاری برای تسهیل انتخاب ذرات در میکروسکوپ الکترونی تک ذره. J Struct Biol. 2009؛ 166 (2): 205-213.

63. پترسن EF، و همکاران. UCSF Chimera{1}}یک سیستم تجسم برای تحقیق و تحلیل اکتشافی. J Comput Chem. 2004؛ 25 (13): 1605-1612.

64. Punjani A, et al. پالایش غیر یکنواخت: منظم سازی تطبیقی ​​بازسازی تک ذره کریو-EM را بهبود می بخشد. روش‌های Nat 2020؛ 17 (12): 1214-1221.

65. Zhang K. Gctf: تعیین و تصحیح CTF در زمان واقعی. J Struct Biol. 2016؛ 193 (1): 1-12.

66. Zivanov J, et al. ابزارهای جدید برای تعیین ساختار خودکار cryo-EM با وضوح بالا در RELION-3. الیف 2018؛ 7: e42166.

67. Casanal A, et al. پیشرفت‌های کنونی در کوت برای ساخت مدل ماکرومولکولی انجماد میکروسکوپی الکترونی و داده‌های کریستالوگرافی. پروتئین Sci. 2020؛ 29 (4): 1069-1078.

68. فرنز بی، و همکاران. رفع خودکار خطاها در ساختارهای گلیکوپروتئین با روزتا. ساختار. 2019؛ 27 (1): 134-139.

69. Klaholz BP. استخراج و پالایش مدل‌های اتمی در کریستالوگرافی و کرایو-EM: جدیدترین ابزار Phenix برای تسهیل تجزیه و تحلیل ساختار. Acta Crystalogr D Struct Biol. 2019؛ 75 (pt 10): 878-881.

70. پترسن EF، و همکاران. UCSF ChimeraX: تجسم ساختار برای محققان، مربیان و توسعه دهندگان. پروتئین Sci. 2021؛ 30 (1): 70-82.

71. Otwinowski Z، Minor W. پردازش داده های پراش اشعه ایکس جمع آوری شده در حالت نوسان. روش ها آنزیمول. 1997؛ 276:307-326.

72. مک کوی ای جی، و همکاران. نرم افزار کریستالوگرافی فازر. J Appl Crystalogr. 2007؛ 40 (pt 4): 658-674.

73. کیانگ ام، و همکاران. آنتی بادی های خنثی کننده SARS CoV-2 از یک کتابخانه آنتی بادی انسانی که دهه ها پیش ساخته شده بود، انتخاب شدند. Adv Sci (Weinh). 2022؛ 9 (1): e2102181.

74. Emsley P, Cowtan K. Coot: ابزارهای مدل سازی برای گرافیک مولکولی. Acta Crystalogr D Biol Crystallogr. 2004؛ 60 (pt 12 pt 1): 2126-2132.

75. آدامز پی دی و همکاران. PHENIX: یک سیستم جامع مبتنی بر پایتون برای حل ساختار ماکرومولکولی. Acta Crystalogr D Biol Crystallogr. 2010؛ 66 (pt 2): 213-221.

76. Montiel-Garcia D و همکاران. Epitope-Analyzer: یک ابزار وب مبتنی بر ساختار برای تجزیه و تحلیل اپی توپ های خنثی کننده گسترده. J Struct Biol. 2022؛ 214 (1): 107839.