خصوصیات ساختاری پلی ساکارید Cistanche Deserticola و اثر محافظتی آن بر روی HK {1} آسیب سلول ناشی از گلوکز بالا

1.2.5.8 تشخیص پتانسیل غشای میتوکندری

سلولهای Hk -2 در صفحات {1}}}} intulection تلقیح شدند و کشت داده شدند. پس از تحریک مربوطه ، محیط کشت در صفحات 6-} آسپیراسیون شد و یک گروه کنترل مثبت مثبت (POS) تحت "1.2.5.6" به گروه اضافه شد. یک بار با PBS بشویید ، 1 میلی لیتر محیط کشت سلول را اضافه کنید و 1 میلی لیتر JC {9}}} محلول کاری رنگ آمیزی کاملاً مخلوط شد و به مدت 20 دقیقه در یک انکوباتور کشت سلولی در تاریکی قرار گرفت. سلولها دو بار با بافر رنگ آمیزی JC {11}} شسته شدند و تصاویر با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس جمع آوری شدند.

 

 

 

 

مزایای Cistanche

 

1.2.5.9 HOECHST33258 روش تشخیص آپوپتوز سلول

اسلایدهای سلولی در صفحات 6-} قرار داده شدند ، و سلولهای HK {1}} در مرحله رشد لگاریتمی در صفحات {2}}} با چگالی سلول 1 × 105 سلول/چاه کاشته شدند. پس از مداخله دارویی مربوطه ، از کیت رنگ آمیزی Hoechst33258 برای رنگ آمیزی استفاده شد. آپوپتوز سلولی تشخیص داده شد و تصاویر با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس جمع آوری شد.

 

1.2.5.10 وسترن بلات برای تشخیص

بیان پروتئین های مربوط به مسیر سیگنالینگ TLR4/NF-κB با گروه بندی و درمان سلول ها با توجه به روش تحت "1.2.5.6" مورد بررسی قرار گرفت. پس از آن ، پروتئین کل در سلول ها با توجه به دستورالعمل کیت استخراج پروتئین استخراج شد. اندازه گیری پروتئین با استفاده از روش کمیت پروتئین اسید Bicinchoninic (BCA) انجام شد ، و پروتئین دناتوره شد و در یخچال درجه 6 {6} ذخیره شد.
10 ٪ سدیم دودسیل سولفات پلی آکریل آمید ژل الکتروفورز (SDS-PAGE) ، انتقال غشای پلی وینیلیدن فلوراید (PVDF) ، غشای را در Tween tween {3}} بافر قرار دهید
سلولها در یک سالن بافر تریس با محفظه Tween {0}} (TBST) انکوبه شدند و در دمای اتاق مسدود شدند. آنتی بادی های اولیه به TLR4 ، NF-κB P65 ، P-NF-κB P65 و -actin استفاده شدبافت کلیه را تشخیص دهید(آنتی بادی ها با نسبت حجم 1: 2000 به محلول TBST رقیق شدند) در 4 درجه یک شبه. ستایش
این غشای با آنتی بادی ثانویه (آنتی بادی و محلول TBST با نسبت حجم 1: 2000 رقیق شد) رقیق شد و به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انکوبه شد. پس از شستشوی غشای 3 بار با TBST ، معرف Luminescent ECL برای تشخیص اضافه شد و بیان پروتئین با تصویربرداری ژل تشخیص داده شد. از نرم افزار Image J برای تجزیه و تحلیل مقدار پروتئین خاکستری پروتئین ، با -actin به عنوان مرجع داخلی استفاده شد.

1.3 پردازش داده

SPSS 23. {1}}} و GraphPad Prism 6.01 برای تجزیه و تحلیل داده ها استفاده شد. از آزمون Shapiro-Wilk برای آزمایش نرمال بودن داده های نمونه استفاده شد و از آزمون قهوه ای-فوریت یا بارتلت برای آزمایش همگن بودن واریانس داده های نمونه استفاده شد. داده های اندازه گیری با توزیع طبیعی و همگن بودن واریانس به عنوان میانگین انحراف استاندارد بیان شد. (x ± S) توضیحات را نشان می دهد ، از ANOVA یک طرفه برای آزمایش استفاده شد ، و از روش Dunnett برای مقایسه زوج در صورت معنی داری استفاده شد.
برای مقایسه زوج های بعد از تعقیب واریانس های نابرابر ، از روش T3 Dunnett استفاده شد ، با p <{1}}. {3}} 5 نشان دهنده تفاوت آماری معنی دار است ، و P <0.01 نشان دهنده تفاوت معنی داری بین دو گروه است.

2 نتیجه و تجزیه و تحلیل

2.1 تعیین کل قند ، اسید اوررونیک و پروتئین CDP

معادله رگرسیون خطی محتوای پلی ساکارید: Y=5. 7628x - 0. 0004 ، r {4}} 999. این آزمایش نشان داد که بین 7 تا 70 میکروگرم بر میلی لیتر ، بین غلظت گلوکز استاندارد (X) و مقدار جذب (Y) رابطه خطی خوبی وجود دارد. درصد محاسبه شده از محتوای پلی ساکارید در نمونه: 81.02 ٪ است.
معادله رگرسیون خطی اسید اوریک استاندارد: y=1. 1571x + 0. 0015 ، r {{4}. 9968. این آزمایش نشان داد که بین 20 تا 100 میکروگرم بر میلی لیتر ، بین غلظت استاندارد اسید ارورونیک (X) و مقدار جذب (Y) رابطه خطی خوبی وجود دارد. میزان اسید اوررونیک در نمونه: 4.43 ٪ است.
معادله رگرسیون خطی پروتئین استاندارد عبارت است از: y=1. 2671x + 0. 2145 ، r=0. 9969. این آزمایش نشان داد که بین 20 تا 1 {9}} میکروگرم در میلی لیتر ، بین غلظت پروتئین استاندارد (X) و مقدار جذب (y) رابطه خطی خوبی وجود دارد. محتوای پروتئین موجود در نمونه: 4.00 ٪.

 

2.2 توزیع وزن مولکولی CDP

وزن مولکولی CDPS با استفاده از کروماتوگرافی نفوذ ژل با کارایی بالا تشخیص داده شد. با RT به عنوان (x) و LGMP به عنوان (y) ، معادله منحنی کالیبراسیون LGMP-RT به صورت محاسبه شد: y {{1}. 1951x {3}}. 661 ، r² {5 {5}. 9956 ؛ RT (x) است ، LGMW (y) است ، معادله منحنی کالیبراسیون LGMW-RT: y=-0. 1973x {10}}. 738 ، r² {12}. 9956 ؛ RT (x) است ، lgmn (y) است ، منحنی کالیبراسیون lgmn-rt معادله است: y {{15}. 1964x {{17}. 7 ، r²=0. 9955 ؛ بر اساس منحنی استاندارد ، فرمول محاسبه برای محاسبه وزن مولکولی هر نمونه بدست می آید. طیف وزن مولکولی نمونه به شرح زیر است ، و نتایج محاسبه در جدول 2 نشان داده شده است. نتایج نشان داد که CDP ها دارای قله های شستشوی متعدد هستند ، و وزن مولکولی پلی ساکاریدها به طور عمده بین 3 و 8 کیلو دالتون توزیع می شود ، که یک هتروپولیزاکارید وزن مولکولی ناهمگن کوچک بود. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است.

 

 

2.3 CDPS ترکیب مونوساکارید

CDP ها با استفاده از کروماتوگرافی یونی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند ، و کروماتوگرام در شکل 2 نشان داده شده است. نتایج نشان داد که در مقایسه با زمان احتباس 16 استاندارد مونوساکارید ، 5 مونوساکارید در CDPS تشخیص داده شد. با مقایسه طیف ها با استانداردهای مونوساکارید ، CDP ها عمدتاً از گلوکز ، گالاکتوز ، رامنوز ، مانوز و ساکارز تشکیل شده بودند. ، Arabinose. نسبت مولی 0. 734 0 5: 0. 0 5381: 0. 0502: 0.0255: 0.0178. از نسبت مولی ، می توان دریافت که CDP ها عمدتا از گلوکز ، گالاکتوز و رامنوز تشکیل شده اند. در میان آنها ، گلوکز 73.405 ٪ ، گالاکتوز 5.381 ٪ و Rhamnose 5.02 ٪ را تشکیل می دهد.

 

توجه: Man.Mannose ، GLC N.Glucosamine Hydrochloride ، Rha.rhamnose ، Glc-ua.Glucuronic Acid ، Gal-ua.galacturonic acid ، gal n.galactosamine هیدروکلراید ، glc.glucose ، gal.galactose ، xyl.xylose ، ara. ARABINOSE ، FUC.FUCOSE.

2.4 تجزیه و تحلیل مادون قرمز CDPS فوریه

قله نزدیک 3246 سانتی متر {1}} در اثر لرزش کشش OH از گروه هیدروکسیل ، قله جذب در نزدیکی 2900 سانتی متر -1 اوج ارتعاش کشش ch 3 و قله جذب در 1594 سانتی متر {9} action in vivity is in vibration in vibration in vibration intriction {{peak} in vibration intriction {10}} in vibration} in vibration. 1374.31 cm -1: این اوج جذب ممکن است مربوط به لرزش تغییر شکل پیوندهای CH باشد ، به خصوص در گروه های متیل (-CH3) یا متیلن (-H {18}). اوج جذب در 1018.38 سانتی متر {21} ممکن است مربوط به ارتعاش کششی پیوند CO باشد ، که معمولاً در پیوندهای اتر یا پیوندهای استر پلی ساکاریدها یافت می شود. سه قله جذب ضعیف در محدوده {23}} cm {24}} وجود حضور پیرانوز در CDP ها را نشان می دهد. قله های جذب در 870 و 930 سانتی متر {27}} نشان می دهد که اوراق قرضه گلیکوزیدی نوع ممکن است در CDP ها وجود داشته باشد. شکل 3 را ببینید.

 

2.5 اثرات سمی CDP ها بر روی سلولهای HK {2 {2

در مقایسه با CON ، در 24 ساعت پس از تجویز ، زنده ماندن سلول پس از رسیدن غلظت CDPS به 1000 UG در میلی لیتر کاهش یافت (P<0.05); at 48 h after administration, the cell viability decreased when the CDPs concentration reached 800 μg/mL and did not exceed 80 %; after 1000 µg/mL, the cell viability began to decline significantly (P<0.05); this may be related to the imbalance of cell osmotic pressure and cell membrane damage caused by the high concentration of polysaccharides. There was no significant difference in cell viability when compared with the concentrations of 25, 50, 100, 200, and 400 µg/mL, so the concentrations of CDPs of 100, 200, and 400 µg/mL when cell viability did not decrease significantly were selected as the drug intervention concentrations. See Table 3.

 

3 بحث و نتیجه گیری

پلی ساکاریدهاپلیمرهای با وزن مولکولی بالا متشکل از بیش از 10 مونوساکارید هستند. گزارش شده است که پلی ساکاریدها دارنداثرات ایمنی ، آنتی اکسیدان ، ضد التهابی و هیپوگلیسمی[15] به عنوان یکی از مواد اصلی دارویی فعال در Cistanche Deserticola ، CDP ها دارای ارزش دارویی قابل توجهی هستند. این مطالعه به طور مقدماتی ساختار CDPS را مشخص می کند و نشان می دهد که آنها می توانند آسیب سلول های HK {1}} ناشی از محیط قند بالا را بهبود بخشند.

 

ساختار پیچیده پلی ساکاریدها با فعالیت بیولوژیکی آنها ارتباط نزدیکی دارد ، که در میان آنها نوع و نسبت مونوساکاریدها ، توده مولکولی نسبی پلی ساکاریدها و نوع پیوندهای گلیکوزیدی عوامل مؤثر بر آنها هستند [16]. توده مولکولی نسبی متوسط ​​به پلی ساکاریدها به سایت های فعال تر می دهد و ممکن است فعالیت بیولوژیکی قوی تری داشته باشد.
با این حال ، وزن مولکولی بزرگ باعث افزایش مقاومت به ترانسمیبران ، مانع جذب پلی ساکارید و تأثیرگذاری بر فعالیت می شود. در مقابل ، پلی ساکاریدهای با وزن مولکولی کوچک ممکن است قادر به ایجاد ساختارهای فعال مؤثر نباشند و در نتیجه باعث کاهش فعالیت شود [17]. هنگام بررسی فعالیت بیولوژیکی پلی ساکاریدها ، لازم است که به طور جامع ترکیب مونوساکارید ، توده مولکولی نسبی و نوع پیوند گلیکوزیدی را در نظر بگیرید [18]. در این مطالعه ، کروماتوگرافی یونی مشخص کرد که CDP ها عمدتاً از گلوکز ، گالاکتوز و رامنوز تشکیل شده اند ، که مطابق با گزارش Xu و همکاران است. [19] وزن مولکولی متوسط ​​وزن CDP ها که توسط کروماتوگرافی ژل مایع با کارایی بالا اندازه گیری می شد به ترتیب 3444 ، 4198 و 8031 ​​کیلو دالتون بود. وزن مولکولی سه پلی ساکارید Cistanche از چهار ماده دارویی از نوع Cistanche اندازه گیری شده توسط یانگ و همکاران. [20] مشابه بود. CDP ها ممکن است حاوی پیوندهای گلیکوزیدی نوع باشند و ممکن است حاوی گلوکز یا -mannose باشد. پلی ساکاریدهای تشکیل شده از گلوکز یا -mannose توسط گیرنده های Toll -مانند 4 (TLR4) یا TLR2 به راحتی شناخته می شوند [21].
DN یکی از جدی ترین عوارض ریز عروقی دیابت است و پاتوژنز آن از نزدیک با استرس اکسیداتیو ، اختلال عملکرد میتوکندری و آپوپتوز سلولی ارتباط نزدیکی دارد [22]. این مطالعه با تنظیم مسیر سیگنالینگ TLR4/NF-κB و مکانیسم مولکولی آن ، اثر محافظتی CDP ها بر سلولهای HK {{2} ناشی از گلوکز را بررسی کرده است.

در شرایط گلوکز بالا ، سلولهای HK {0}} استرس اکسیداتیو قابل توجهی دارند [23]. مطالعات نشان داده اند که سطح قند بالا به طور قابل توجهی تولید ROS داخل سلولی را افزایش می دهد. این مقدار بیش از حد ROS می تواند به طور مستقیم به لیپیدهای غشای سلولی آسیب برساند و منجر به افزایش محتوای محصول پراکسیداسیون لیپید MDA شود [24]. در عین حال ، فعالیت SOD و GSH-PX ، سیستم های دفاعی مهم آنتی اکسیدانی ، به طور قابل توجهی کاهش یافته است ، نشان می دهد که ظرفیت آنتی اکسیدانی سلول ها به شدت آسیب دیده است [25]. این عدم تعادل در سیستم اکسیداسیون و آنتی اکسیداسیون بیشتر بیان و فعال سازی TLR4 را تقویت می کند [26]. مطالعات قبلی نشان داده اند که ROS بیش از حد می تواند توسط TLR4 به عنوان الگوهای مولکولی مرتبط با خطر (DAMP) شناخته شود و یک حلقه بازخورد مثبت تشکیل می دهد [27]. در این مطالعه ، پیش درمانی CDPS به طور قابل توجهی سطح ROS ، افزایش فعالیت SOD و GSH-PX را کاهش داده و محتوای MDA را کاهش می دهد. این اثر جامع آنتی اکسیدانی نشان می دهد که CDP ها ممکن است پاسخ های استرس اکسیداتیو را از طریق چندین هدف تنظیم کنند.
در مسیر سیگنالینگ TLR4/NF-κB ، فعال شده TLR4 با جذب پروتئین های آداپتور پایین دست ، فعال سازی مجتمع IKK را تقویت می کند ، که به نوبه خود منجر به فسفوریلاسیون و تخریب IκB می شود [28]. مطالعه حاضر مشاهده کرد که گلوکز بالا به طور قابل توجهی سطح فسفوریلاسیون IκB را افزایش داده و منجر به انتقال NF-κB P65 از سیتوپلاسم به هسته می شود. مطالعات نشان داده اند که انتقال هسته ای P65 نه تنها استرس اکسیداتیو را تشدید می کند بلکه بر عملکرد میتوکندری نیز تأثیر می گذارد [29].
با توجه به رنگ آمیزی JC {{0} مشاهده شد که درمان با گلوکز بالا باعث کاهش قابل توجهی در پتانسیل غشای میتوکندری شده است ، نشان می دهد تغییر از فلورسانس قرمز به فلورسانس سبز ، نشان می دهد که شیب پروتون بین غشاهای داخلی و بیرونی میتوکندری مختل شده است. اختلال عملکرد میتوکندری بیشتر تولید ROS را تشدید می کند و یک چرخه شرور را تشکیل می دهد [30]. پیش درمانی CDPS می تواند پایداری پتانسیل غشای میتوکندری را حفظ کند ، و این اثر محافظتی ممکن است با مهار بیان TLR4 و فعال سازی NF-κB حاصل شود.
اختلال عملکرد میتوکندری و استرس اکسیداتیو مداوم در نهایت منجر به آپوپتوز سلول می شود [31]. رنگ آمیزی هوچست نشان داد که هسته های سلول در گروه درمانی گلوکز بالا تغییرات مورفولوژیکی آپوپتوز معمولی مانند تراکم ، تراکم و تکه تکه شدن را نشان می دهد [32]. این تغییرات نزدیک به مسیر آپوپتوز ذاتی میتوکندری با واسطه میتوکندری مرتبط است: از دست دادن پتانسیل غشای میتوکندری منجر به آزاد شدن سیتوکروم C ، فعال سازی آبشار کاسپاز و در نهایت آپوپتوز سلول می شود [33]. مورفولوژی هسته ای سلول ها در گروه پیش تصفیه CDPS اساساً طبیعی بود و رنگ آمیزی یکنواخت بود ، نشان می دهد که CDP ها با حفظ عملکرد میتوکندری و مهار استرس اکسیداتیو از آپوپتوز سلول جلوگیری می کنند.
به طور خلاصه ، این مطالعه به طور سیستماتیک شاخص های استرس اکسیداتیو (ROS ، MDA ، SOD ، GSH-PX) ، عملکرد میتوکندری (JC {1}}) و آپوپتوز سلولی (Hoechst) ، همراه با TLR4/NF-κB سیگنالینگ مسیر سیگنالینگ مولکول های مولکول های CDPS را نشان می دهد.
اول ، با بهبود ظرفیت آنتی اکسیدانی سلول ها ، کاهش سطح ROS و کاهش فعال سازی TLR4. ثانیا ، با مهار بیان TLR4 و فسفوریلاسیون IκB ، مسدود کردن انتقال هسته ای NF-κB. سرانجام ، با بهبود عملکرد میتوکندری ، مهار آپوپتوز سلول. مرگ ، بدین ترتیب نقش محافظتی در برابر DN بازی می کند. این اثر هم افزایی چند هدف باعث می شود CDP ها چشم انداز کاربرد خوبی را در درمان DN نشان دهند. در مطالعات بعدی ، ساختار پلی ساکارید با پراش اشعه ایکس ، طیف سنجی رزونانس مغناطیسی هسته ای و طیف سنجی کروماتوگرافی گازی بیشتر تعیین می شود. علاوه بر این ، میانگین نتایج وزن مولکولی نشان می دهد که CDP ها پلی ساکاریدهای ناهمگن هستند. در مرحله بعد ، پلی ساکاریدهای همگن را جدا و تصفیه خواهیم کرد ، ساختار پلی ساکارید و فعالیت بیولوژیکی را تشخیص می دهیم و رابطه ساختار و فعالیت را روشن می کنیم.