مطالعه در مورد تأثیر Acteoside (یک ماده فعال در Cistanche Deserticola) بر NAFLD با القای اتوفاژی

چکیده:

 

هدف:به منظور کشف عملکرد اتوفاژی از ماده فعال Acteoside (ACT) در Cistanche Deserticola و تأثیر آن بر بیماری کبد چرب غیر الکلی (NAFLD).

روشبرای گرفتن اکیناکوزید و به عنوان اشیاء تحقیقاتی عمل می کند ، 1 {15}} {17}} μmol/L عمل و اکیناکووزید (ECH) با مهار کننده مهار کننده اتوفاژی-لیزوزوم A1 برای درمان مداخله ترکیب شدند. از سیستم ایمنی بدن پروتئین برای تشخیص سطح بیان نسبی پروتئین نشانگر اتوفاژی پروتئین مرتبط با پروتئین 1 زنجیره سبک 3 (LC {5}} II) استفاده شد. سلولهای HEPG2 با غلظت های مختلف ACT در شرایط آزمایشگاهی مداخله شدند و زنده ماندن سلول با استفاده از روش نمک تترازولیوم تشخیص داده شد. در مداخله آزمایشگاهی سلولهای HepG2 با غلظت های مختلف ACT همراه با Balofloxacin A1 ، و تشخیص LC {9}} II بیان پروتئین با استفاده از پروتئین با استفاده از فناوری ایمنی بدن. از یک مدل NAFLD ساخته شده در شرایط آزمایشگاهی با مداخله دارو برای لکه دار کردن قطرات لیپید با استفاده از روش رنگ آمیزی روغن قرمز O و تشخیص سطح تری گلیسیرید داخل سلولی استفاده شد. بومی سازی پروتئین LC3 و قطرات لیپید را از طریق فناوری ایمونوفلورسانس مشاهده کنید. قانون نتایج می تواند به طور قابل توجهی اتوفاژی را در سلولهای HEPG2 القا کند ، و سطح بیان پروتئین LC {12} II II به طور قابل توجهی در مقایسه با گروه کنترل افزایش می یابد (با عمل به تنهایی) (1.36 0. 11 ، {21}. 28 {{{{{{{32 به ترتیب) ، با اهمیت آماری (P0.05). 50 میکرومول در لیتر به طور قابل توجهی اتوفاژی را در سلولهای HepG2 القا کرد ، و سطح بیان پروتئین LC {25} II به طور قابل توجهی افزایش یافت (به ترتیب 0.53 ± 1.83 ، 0.35 0.35 0.35). سطح TG سلولهای HEPG2 در گروه مداخله ACT (68/111111 19.11) به طور قابل توجهی پایین تر از آن در NAFLD در گروه مدل آزمایشگاهی آزمایشگاهی (90 ± 34.15) بود و تفاوت ها از نظر آماری معنی دار بود (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

کلمات کلیدی:بیماری کبد چرب غیر الکلی ؛کوارتری;عیار؛ اتوفاژی

 

TCM Herb Cistanche برای درمان بیماری کبد چرب غیر الکلی (NAFLD)

برای کسب جزئیات بیشتر روی عکس کلیک کنید

 

در چند دهه گذشته چرب غیر الکلیبیماری کبد(NAFLD) رایج ترین شده استبیماری مزمن کبد، با شیوع جهانی تقریباً 25 ٪ از جمعیت بزرگسالان ، و در نظر گرفته می شود که از نزدیک با سندرم متابولیک مرتبط است [1]. اگرچه احتمال عوارض مربوط به کبد در بیماران NAFLD کمتر از 10 ٪ است ، NAFLD یک عامل خطر برای بیماری های مرتبط با کبد مانند سیروز و سرطان کبد اولیه است ، که بار اقتصادی بزرگی را به بیماران تحمیل می کند [5 {5 {}]. با وجود توجه روزافزون به NAFLD ، NAFLD به عنوان یک بیماری مزمن مهم توجه کافی را به خود جلب نکرده است. بنابراین ، درک عمیق بیشتر از پاتوژنز NAFLD و جستجوی استراتژی های درمانی مؤثر به مشکلات فوری تبدیل شده است (7 {7}}].

مطالعات اخیر نشان داده است که اتوفاژی سلولی نقش مهمی در فیزیولوژی کبد و آسیب شناسی ایفا می کند [8]. اختلال عملکرد اتوفاژی یا اختلال در تنظیم با انواع بیماری های کبدی مانندبیماری کبد مربوط به الکل[9] ، NAFLD [10] ، استئاتهپاتیت غیر الکلی [11] و سرطان سلولهای کبدی [12]. خصوصیات پاتولوژیک NAFLD رسوب بیش از حد تری گلیسیریدها (TG) و سایر قطرات لیپید خنثی (LD) در سلولهای کبدی تحت تحریک غیر الکلی است. برای کبد ، دو مسیر اصلی تنظیم کاتابولیسم این LD ها لیپولیز و اتوفاژی هستند.
مسیر لیپولیز توسط لیپازهای خنثی سیتوپلاسمی مانند لیپاز حساس به هورمون و لیپاز TG چربی تنظیم می شود. در مسیر لیپوتوفاژی مربوطه ، LD ها ممکن است با جذب مستقیم پروتئین های مربوط به اتوفاژی برای تشکیل اتوفاگوزوم ها انتخاب شوند ، و سپس LDS محصور شده توسط اتوفاگوزوم ها بیشتر به لیزوزوم تحویل داده می شوند و توسط لیپاز اسید در لیزوزوم ها تجزیه می شوند. بنابراین ، فعال کردن لیپوتوفاژی در سلولهای کبدی به یک استراتژی مؤثر برای پیشگیری و درمان NAFLD تبدیل شده است.
Cistanche Deserticola یک داروی گیاهی گرانبهای چینی است که در فرمول های سنتی طب چینی به طور گسترده در عمل بالینی مورد استفاده قرار گرفته است. در عین حال ، مدتهاست که از آن به عنوان یک مکمل غذایی بهداشتی استفاده می شود. Cistanche Deserticola شامل انواع مختلفی از مواد فعال زیستی است که مهمترین آنها Cistanche Deserticola Phenylethanol Glycosides است. به عنوان نمایندگان گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید ، اکیناکووزید (ECH) و Verbascoside (ACT) گزارش شده است که بسیاری از فعالیت های مهم بیولوژیکی مانند آنتی اکسیدان ، محافظت کننده عصبی ، سیستم ایمنی بدن و کبد دارند [13]. از نظر محافظت از کبد ، مطالعات نشان داده اند که ECH می تواند با کاهش واسطه های التهابی ، مهار تغییر فاکتور رشد و کاهش سطح بیان ژنهای مرتبط با فیبروز کبد ، از کبد محافظت کند. ACT اثر محافظتی قابل توجهی در آسیب کبد شیمیایی و ناشی از مواد مخدر مانند الکل ، تتراکلرید کربن و لیپوپلی ساکارید دارد. قانون استرس اکسیداتیو ناشی از مواد شیمیایی سمی را کاهش می دهد ، اکسیژن واکنشی انباشته شده در کبد را از بین می برد و غلظت مالوندالدئید را کاهش می دهد. در عین حال ، فعالیت سوپراکسید دیسموتاز کبد را به طور قابل توجهی افزایش می دهد و میزان گلوتاتیون را کاهش می دهد و آسیب هیستوپاتولوژیک کبد و آپوپتوز را به میزان قابل توجهی بهبود می بخشد. با این حال ، هیچ گزارش ادبیات مربوطه در مورد اینکه آیا گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید از Cistanche Deserticola در روند اتوفاژی در اعمال محافظت از کبد نقش دارند ، وجود ندارد. بر این اساس ، این مطالعه از روشهای زیست شناسی سلولی معمولی و یک مدل سلول آزمایشگاهی برای بررسی اولیه اثر ناشی از اتوفاژی از گلیکوزیدهای Cistanche Deserticola فنیل اتانوئید استفاده کرده و عملکردهای دارویی احتمالی آن را با هدف فراهم کردن مبنای علمی برای توسعه داروهای آینده مورد بررسی قرار داده است.

 

1 ماده و روش

1.1 مواد

1.1.1 موضوعات تحقیقاتی ECH و ACT به عنوان موضوعات تحقیق استفاده شد.

1.1.2 مواد سلولهای Hepg2 از Wuhan Punosai Life Science Co. ، Ltd. ، Ech (شماره دسته ای: B21209) و ACT (شماره دسته ای: B20715 ، خلوص HPLC بیشتر از 98 ٪) خریداری شد ، از شرکت بیولوژیک Shanghai Yuanyee ، DMEM FEPPHTERD1 (BATCH GLUCOSES MEDIM) خریداری شد. از شرکت Hyclone ، USA ، سرم گاو جنین خریداری شد (شماره دسته ای: {9}} A) از شرکت BI خریداری شد ، اسرائیل ، پنی سیلین/استرپتومایسین (شماره دسته ای: SV30010.01) از شرکت Hyclone ، USA ، MTT ، MTT (شماره جمع: M8180) پودر خریداری شد (شماره دسته ای: BC0625) کیت تشخیص از شرکت Solebao ، پکن ، چین ، روغن قرمز O (شماره شماره: O {14}} G) ، دی متیل سولفوکسید (شماره تعداد: BCBZ1685) از سیگما-آلدریچ ، USA خریداری شد. مهار کننده اتوفاژی-لیزوزوم Bafilomycin A1 (BAFA1 ، تعداد تعداد زیادی: TLRL-BAF1) از Invitrogen ، USA خریداری شد. فعال کننده اتوفاژی راپامایسین (شماره تعداد زیادی: S17098) از شرکت بیوتکنولوژی شانگهای یوانی ، آموزشی ویبولیتین ، چین خریداری شد. پروتئین مرتبط با میکروتوبول 1 زنجیره سبک 3 (LC3 ، تعداد زیادی: L7543 ، گونه ها: خرگوش ، نسبت رقیق: 1: {29}}) و -actin (تعداد زیادی: Zrb1312 ، گونه ها: نسبت رقیق ، 1: {33} 33}}}) آنتی بادی های Sigma خریداری شدند. آنتی بادی ثانویه با برچسب پراکسیداز باکتری (شماره تعداد: {36}} ، گونه ها: ضد خرگوش بز ، نسبت رقیق شدن: {{39}) از Biotech جنوبی خریداری شد ، شرکت USA ، Fluorescent با عنوان آنتی بادی ثانویه 110: 43328 ، WAVELLENG: 43328 ، WAVELLENG. از شرکت Sigma-Aldrich ، ایالات متحده و BODIPY 493/501 (شماره تعداد زیادی: D3922) از شرکت Invitrogen ، USA خریداری شد.

 

1.2 روش

1.2.1 کشت سلولی

سلولهای HEPG2 در محیط گلوکز بالا گلوکز اصلاح شده Dulbecco حاوی 10 ٪ سرم گاوی جنین ، 100 پنی سیلین U/میلی لیتر و 100 ug/ml استرپتومایسین در 37 درجه انکوباتور دی اکسید کربن کشت داده شدند. هنگامی که تلاقی سلول به 85 ٪ رسید ، خرده فرهنگ ، آبکاری ، مداخله و سایر عملیات انجام شد.

 

1.2.2 تشخیص سیستم ایمنی بدن پروتئین

1.2.2.1 عمل و درمان ECH

LC 3- redate سطح بیان پروتئین در سلولهای HepG2 BAFA1 ، به عنوان یک مهار کننده پمپ پروتون ، می تواند باعث شود پروتئین LC {3}} در مقادیر زیادی در سلول ها جمع شود ، در نتیجه توانایی القاء اتوفاژی را تقویت می کند. بنابراین ، استفاده ترکیبی از BAFA1 می تواند به عنوان یک سیستم نظارت اتوفاژی برای ارزیابی توانایی القاء اتوفاژی استفاده شود. سلولهای HEPG2 در مرحله رشد لگاریتمی برای کشت یک شبه به ظروف کشت سلول 3.5 سانتی متر منتقل شدند. 100 میکرومول در لیتر ACT ، ECH و BAFA1 برای مداخله به مدت 12 ساعت استفاده شد. سلولها با محلول بافر فسفات از پیش خنک شده (PBS) شسته شدند و بلافاصله در بافر لیز پروتئین RIPA به مدت 10 دقیقه لیز شدند. مایع رویی سانتریفیوژ شد و غلظت پروتئین کل با استفاده از کیت سنجش غلظت پروتئین اسید بیسینکونیک تعیین شد. پس از اندازه گیری با بافر سدیم دودسیل سولفات ، نمونه در 95 درجه به مدت 10 دقیقه گرم شد تا پروتئین را دفع کند. سپس 30 میکرولیتر از نمونه با میکروپیپت گرفته شد و بر روی ژل پلی آکریل آمید الکتروفورز شد.
پس از الکتروفورز ، پروتئین از ژل به یک غشای نیتروسلولوز منتقل شد ، با شیر 1 {2}}} در طول شب مسدود شد ، با یک آنتی بادی اولیه خاص در دمای اتاق به مدت 1 ساعت انکوبه شد ، با بافر فسفات حاوی 0.5 ٪ تریتون شسته شد و با یک آنتی بادی ثانویه خاص در دمای اتاق به مدت 1 H انکوبه شد. از روش ECL برای توسعه رنگ استفاده شد. آنها به عنوان گروه کنترل خالی ، گروه راپامایسین ، گروه ECH ، گروه ACT ، گروه راپامایسین+BAFA1 ، گروه ECH+BAFA1 و گروه ACT+BAFA1 قرار گرفتند.

 

1.2.2.2 غلظت های مختلف ACT در سطح بیان LC {4}} ⅱ پروتئین در سلولهای HEPG2 مداخله کرد

سلولهای HEPG2 فاز رشد لگاریتمی برای کشت شبانه به کشت سلولهای 3.5 سانتی متر منتقل شدند و عملکرد 25 ، 50 و 100 میکرومول در لیتر همراه با BAFA1 برای درمان مداخله به مدت 12 ساعت استفاده شد و پروتئین LC {8}}} توسط پروتئین توسط پروتئین ایمونولوتینگ تشخیص داده شد. گروه کنترل (گروه CON ، کنترل خالی) ، گروه گرسنگی (گروه STA ، سلولهای HEPG2 درمان گرسنگی) ، 25 ، 50 و 100 میکرومول در لیتر گروه ACT و BAFA1 همراه با گروه ACT 25 ، 50 و 100 میکرومول در لیتر.

1.2.3 روش MTT برای تشخیص میزان بقای سلولهای HEPG2 تحت درمان با غلظت های مختلف ACT برای 24 و 48 ساعت
سلولهای HEPG2 در مرحله رشد لگاریتمی در صفحه چاه {1}} با چگالی تلقیح متوسط ​​تلقیح شدند و به مدت 12 ساعت در یک دستگاه جوجه کشی کشت شدند. عمل 2 {10} ، 40 ، 60 ، 80 و 100 میکرومول در لیتر به مدت 24 و 48 ساعت اضافه شد. محلول MTT 0.5 میلی گرم در میلی لیتر در یک محیط تاریک اضافه شد و در انکوباتور انکوبه شد. پس از 4 ساعت ، مایع رویی دور ریخته شد ، 100 میکرولیتر از دی متیل سولفوکسید به هر چاه اضافه شد ، و سلول ها در یک شاکر دمای ثابت در 37 درجه به مدت 10 دقیقه تکان خوردند. مقدار چگالی نوری (OD) در طول موج 490 نانومتر توسط یک نشانگر آنزیم تشخیص داده شد و میزان بقای سلول محاسبه شد.

 

1.2.4 در شرایط آزمایشگاهی مدل سلول NAFLD

وزن مشخصی از اسید پالمیتیک (PA) در یک حجم مشخص ایزوپروپانول برای تهیه یک محلول 100 میلی مول در لیتر PA PA ، وزن شد و به طور کامل حل شد ، که سپس برای استفاده بعدی در یک یخچال درجه {1}} ذخیره شد. محلول سهام PA با استفاده از محیط کشت کامل به 100 میکرومول در لیتر رقیق شد و 1 ٪ آلبومین سرم بدون اسید چرب اضافه شد. سلول ها در 37 درجه به مدت 3 ساعت انکوبه شدند تا محلول القایی تهیه شود. سلولهای HEPG2 در مرحله رشد لگاریتمی به یک ظرف کشت سلول 3.5 سانتی متر در یک چگالی مناسب برای کشت یک شبه منتقل شدند و سپس از محلول القایی تهیه شده برای مداخله استفاده شد.

 

1.2.5 مداخله ACT NAFLD در شرایط آزمایشگاهی مدل TG تشخیص و رنگ آمیزی روغن قرمز O

 

1.2.5.1 تشخیص TG

سلولهای HEPG2 در مرحله رشد لگاریتمی به یک ظرف کشت سلول 3.5 سانتی متر برای کشت طبق گروه کنترل خالی ، گروه مدل و گروه مداخله ACT منتقل شدند. گروه مدل با 100 میکرومول در لیتر القایی PA القا شد ، و گروه مداخله ACT با محلول القایی 100 میکرومول در لیتر PA القا شد و 50 میکرومول در لیتر ACT در همان زمان اضافه شد. زمان مداخله 24 ساعت بود. محیط کشت قدیمی را به آرامی بردارید ، به آرامی سطح سلول را با PBS از پیش خنک شده یک بار بشویید ، 100 میکرولیتر در روز از محلول لیز Ripa از قبل خنک شده اضافه کنید ، به طور کامل روی یخ به مدت 15 دقیقه ، سانتریفیوژ در 4 درجه و {12} r/min به مدت 10 دقیقه ، جمع آوری فوق العاده ، 10 میکرولندی را برای تشخیص آنزیمیک از نظر انسداد enzymatic از TG استفاده کنید. دستورالعمل های کیت TG ، و در آخر سطح TG در هر میلی گرم پروتئین را اصلاح کنید.

1.2.5.2 رنگ آمیزی قرمز O

سلولهای HEPG2 در مرحله رشد لگاریتمی به یک ظرف کشت 3.5 سانتی متر پوشیده از یک پوشش استریل برای کشت یک شبه منتقل شدند. 100 میکرومول در لیتر Pa باعث ایجاد قطرات لیپید شد. در همان زمان ، 50 میکرومول در لیتر قانون برای مداخله به مدت 24 ساعت اضافه شد.
The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed with 4% formaldehyde at room temperature for 10 min, washed the cell surface with PBS, added the prepared Oil Red O staining working solution, stained at room temperature in the dark for 15 min, aspirated the Oil Red O staining solution, washed the excess staining solution with double distilled water, rinsed with 60% isopropanol, washed with double distilled water, and sealed, and در زیر میکروسکوپ عکاسی شده است.

 

1.2.6 مشاهده ایمونوفلورسانس اتوفاگوزومها و قطرات لیپیدی پس از درمان ACT

سلولهای HEPG2 در مرحله رشد لگاریتمی به یک ظرف کشت 3.5 سانتی متر پوشیده از یک پوشش استریل برای کشت یک شبه منتقل شدند. 1 {10}} 0 μMol/L PA برای القاء تشکیل قطرات لیپید در سلول ها استفاده شد. در همان زمان ، ACT برای مداخله به مدت 24 ساعت اضافه شد. اسلایدهای سلولی جمع آوری شدند ، 3 بار با PBS از قبل خنک شده ، در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه با 4 ٪ فرمالدئید ، در دمای اتاق به مدت 15 دقیقه با یک بافر نفوذپذیری ، حاوی 0.1 ٪ ساپونین ، که در دمای اتاق به مدت 1 ساعت با سرم بز مسدود شده است ، در دمای اتاق 3 ساعته در دمای اتاق با آنتی در دمای اتاق به مدت 1 ساعت با LC {14 {14 {{14} 14 یک آنتی بادی ثانویه با برچسب فلورسنت خاص ، در دمای اتاق انکوبه شده و به مدت 1 ساعت از نور دور است. پس از انکوباسیون آنتی بادی ، اسلایدها 3 بار با PBS شسته شدند ، با پیش بینی پروب لیپید 493/503 در دمای اتاق به مدت 10 دقیقه ، شسته شده با PBS ، و با محیط آب بندی ضد دم ، در تاریکی مشاهده شد و با یک میکروسکوپ لیزر مشاهده شد و ضبط شد. گروه کنترل خالی ، گروه درمانی راپامایسین و گروه مداخله ACT تنظیم شد.

 

1.3 تجزیه و تحلیل آماری

SPSS25. از نرم افزار آماری {1}} برای تجزیه و تحلیل داده ها استفاده شد. داده های کمی به عنوان X ± S بیان شد. تجزیه و تحلیل یک طرفه از واریانس و آزمون LSD-T استفاده شد. پ<0.05 was considered statistically significant.