ایمنی و حفاظت هم افزایی در موش ها با ایمن سازی همزمان با واکسن های DNA کد کننده پروتئین Spike و سایر پروتئین های ساختاری SARS-CoV-2

خلاصه:ظهور انواع جدیدی از سندرم حاد تنفسی شدید کروناویروس 2 (SARS CoV-2) باعث شیوع مجدد عفونت در سراسر جهان شده است. این گونه‌های بسیار جهش‌یافته، اثربخشی واکسن‌های بیماری کروناویروس فعلی 2019 (COVID-19) را کاهش می‌دهند، واکسن‌هایی که فقط برای هدف قرار دادن پروتئین اسپایک (S) ویروس اصلی طراحی شده‌اند. به جز S SARS-CoV-2، پتانسیل محافظت ایمنی سایر پروتئین‌های ساختاری (نوکلئوکپسید، N؛ پوشش، E؛ غشاء، M) به عنوان آنتی‌ژن‌های هدف واکسن هنوز مشخص نیست و ارزش بررسی دارد. در این مطالعه، واکسن‌های DNA مصنوعی کدکننده چهار پروتئین ساختاری SARS-CoV-2 (pS، pN، pE و pM) ساخته شدند و موش‌ها با سه دوز از طریق تزریق عضلانی و الکتروپوریشن ایمن شدند. قابل‌توجه، ایمن‌سازی همزمان با دو واکسن DNA که پروتئین‌های S و N را بیان می‌کردند، باعث ایجاد آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده بالاتری شد و در کاهش بار ویروسی SARS-CoV مؤثرتر از پروتئین S به تنهایی در موش‌ها بود. علاوه بر این، ایمن‌سازی مشترک pS با pN یا pE + pM باعث ایجاد ایمنی سلولی اختصاصی S بالاتر پس از سه ایمن‌سازی شد و باعث تغییرات هیستوپاتولوژیک خفیف‌تری نسبت به PS به تنهایی پس از چالش شد. نقش پروتئین‌های ساختاری حفاظت‌شده SARS-CoV{16}}، از جمله پروتئین‌های N/E/M، برای کاربردهای آن‌ها در طراحی واکسن، مانند واکسن‌های mRNA، باید بیشتر مورد بررسی قرار گیرد.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

کلمات کلیدی: کووید-19; SARS-CoV-2}}؛ ایمن سازی همزمان؛ واکسن DNA؛ پروتئین سنبله؛ پروتئین ساختاری

1. معرفی

سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) علت بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) است که باعث میلیون ها عفونت و مرگ در سراسر جهان شده است و سلامت انسان و اقتصاد جهانی را به خطر انداخته است. . اگرچه رویکردهای درمانی موثر هنوز در دسترس نیستند، اما به سرعت پیشرفت کرده اند، از جمله کاربرد سلول درمانی CAR-T و نانوتکنولوژی [1،2]. واکسیناسیون یک راه موثر برای کنترل همه گیری است و چندین واکسن برای استفاده توسط نهادهای نظارتی بهداشتی مختلف تایید شده است [3،4]. ژنوم کروناویروس چهار پروتئین ساختاری اصلی را کد می‌کند، یعنی پروتئین‌های اسپایک (S)، نوکلئوکپسید (N)، غشاء (M) و پروتئین‌های پوششی (E) که مسئول تجمع ویریون و سرکوب پاسخ ایمنی میزبان هستند [5]. ]. پروتئین S از 1273 باقی مانده اسید آمینه حاوی دو زیر واحد به نام های S1 و S2 تشکیل شده است. واسطه ورود ویروس است و یک هدف اصلی برای تولید واکسن‌های کروناویروس است [6-11]. با این حال، پروتئین SARS-CoV{17}} S دارای فرکانس جهش بالایی است. جای تعجب نیست که در SARS-CoV{19}}، یک ویروس RNA، جهش پیوسته و اجتناب ناپذیر است. از سپتامبر 2020، پنج نوع نگران کننده SARS-CoV{21}} (VOC) وجود داشته است، از جمله B.1.1.7 (بریتانیا، آلفا)، B.1.351 (آفریقای جنوبی، بتا)، P.1. (برزیل، گاما)، B.1.617.2 (هند، دلتا)، و B.1.1.529 (آفریقای جنوبی، Omicron) (Andreano and Rappuoli، 2021؛ Gupta، 2021). همه آنها چندین جهش در پروتئین سنبله دارند [12]. این گونه‌ها اثربخشی واکسن‌های فعلی کووید{38}} را که فقط برای هدف قرار دادن پروتئین اسپایک طراحی شده‌اند، تهدید می‌کنند.

پروتئین N SARS-CoV-2 از طریق یک دامنه اتصال RNA به طول {{2}-اسید آمینه در هسته آن‌ها به صورت «مهره روی رشته» به RNA ویروسی متصل می‌شود. این ویروس در بین کروناویروس‌ها به شدت حفظ می‌شود و دارای یک هویت توالی 90 درصدی با SARS-CoV است و همچنین تنها پروتئین ساختاری داخل ویریون است [13]. علاوه بر این، نقش مهمی در بسته بندی RNA ویروسی در کمپلکس ریبونوکلئو کپسید ایفا می کند و برای تکثیر RNA ویروسی، مونتاژ ویریون و آزادسازی از سلول های میزبان ضروری است [14]. بر اساس تشابه توالی بالای پروتئین N در کروناویروس‌ها، ممکن است به عنوان یک هدف واکسن محافظت متقابل پیشنهاد شود. قبلاً دریافتیم که ایمن‌سازی همزمان با دو واکسن DNA که پروتئین‌های E و M را بیان می‌کنند، محافظت نسبی در برابر SARS-CoV{13}} فراهم می‌کند و این روش باید در طول توسعه واکسن مورد توجه قرار گیرد [15]. بسته به سند چشم انداز سازمان جهانی بهداشت، معمولاً هفت استراتژی برای نامزدهای واکسن SARS-CoV{16}} وجود دارد که می توان آنها را به سه دسته تقسیم کرد: اول، واکسن های مبتنی بر پروتئین، از جمله واکسن های ویروس غیرفعال، واکسن های ویروس مانند. ذرات و واکسن های زیر واحد پروتئین؛ دوم، واکسن‌های مبتنی بر ژن، از جمله واکسن‌های حامل ویروس، واکسن‌های DNA، و واکسن‌های mRNA. سوم، ترکیبی از هر دو رویکرد مبتنی بر پروتئین و مبتنی بر ژن، مانند واکسن های ویروسی ضعیف شده زنده. فن‌آوری‌های DNA، به‌عنوان استراتژی‌های جدید واکسن مبتنی بر ژن، می‌توانند به سرعت چندین واکسن نامزد و استراتژی را در طول آزمایش‌های بالینی مقایسه کنند [16،17]. از نظر تئوری، تقریباً تمام پروتئین‌های ویروسی، ایمونوژن‌های بالقوه و اهداف واکسن هستند. با این حال، بر اساس دانش ما، ایمنی و پتانسیل محافظتی واکسن‌های DNA مصنوعی در رمزگذاری پروتئین‌های SARS-CoV-2 و سایر پروتئین‌های ساختاری هنوز به طور سیستماتیک گزارش نشده است. چهار واکسن DNA که پروتئین‌های SARS-CoV{30}، S، N، E و Ml را بیان می‌کنند از نظر ایمنی‌زایی و اثر محافظتی در موش‌ها برای بررسی اثرات ایمنی S در ترکیب با سایر پروتئین‌های ساختاری مورد ارزیابی قرار گرفتند.

2. مواد و روشها

2.1. سلول ها

سلول‌های Huh7.5 و سلول‌های 293T کلیه جنینی انسان در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در یک اتمسفر مرطوب با 5 درصد CO2 در طول مطالعه کشت داده شدند. سلول ها در محیط DMEM (HyClone، Logan، UT، USA)، تکمیل شده با 10٪ FBS (شرکت GEMINI، شانگهای، چین) و 1٪ پنی سیلین-استرپتومایسین (Gibco، نیویورک، نیویورک، ایالات متحده آمریکا) کشت داده شدند. همه رده های سلولی برای آلودگی مایکوپلاسما منفی تایید شد.

2.2. ساخت واکسن‌های DNA کدکننده SARS-CoV-2 S/N/E/M

ژن رمزکننده پروتئین SARS-CoV-2 S/N، حاوی یک توالی کوزاک N ترمینال (GCCCACC) و به دنبال آن یک کدون آغازین (ATG)، با استفاده از یک کدون بهینه شده برای پستانداران (شرکت GenScript، نانجینگ) سنتز شد. ، چین). سپس از طریق هضم EcoRI و XbaI در ناقل بیان pcDNA3.1 (+) کلون شد و pS/pN (واکسن‌های DNA) نامگذاری شد (شکل 1A). پروتئین pE/PM همانطور که قبلاً توضیح داده شد، ساخته و شناسایی شد [15]. واکسن ها با استفاده از کیت های Maxiprep بدون اندوتوکسین (Qiagen، Beijing، چین) تهیه شدند و توالی ها با استفاده از توالی یابی DNA Sanger تأیید شدند. بیان پروتئین S/N با استفاده از وسترن بلات و آنتی بادی های anti-S (Sino Biological، Beijing، چین)/anti-N رقیق شده در 1:1000 تأیید شد. این آزمایش ها همانطور که قبلاً توضیح داده شد [15،18] انجام شد.

شکل 1. طراحی و بیان ساختارهای واکسن پروتئین S/N مبتنی بر DNA نوترکیب SARS-CoV{3}}. (الف) نمودار شماتیک واکسن‌های مبتنی بر DNA نوترکیب که پروتئین‌های SARS-CoV-2 spike (PS)، نوکلئوکپسید (pN)، پوشش (pE) و/یا غشاء (PM) را کد می‌کنند. (B) بیان پروتئین هدف در واکسن‌های DNA از طریق آنالیز وسترن بلات سلول‌های 293T ترانسفکت شده با پلاسمیدهای pS/pN/pE/pM تایید شد.

2.3. ایمن سازی و چالش

موش های ماده BALB/c (Charles River Laboratories، فرانسه) در سن 6 هفتگی در موسسه ملی بهداشت حرفه ای و کنترل سم در محیطی با دمای 21 درجه سانتیگراد و رطوبت با چرخه نور/تاریکی 12 ساعت نگهداری شدند. در همین حال، غذا و آب به صورت آزاد ارائه شد و تمام آزمایش‌های حیوانی توسط کمیته اخلاقیات آزمایش‌های حیوانی مرکز کنترل و پیشگیری از بیماری‌های چین (CDC چین) تأیید شد. این تحقیق با مقررات اخلاقی مربوطه مطابقت داشت.

موش ها به طور تصادفی به پنج گروه تقسیم شدند و با pS/pN به تنهایی و یا با pS + pN یا pS + pE + PM در روزهای {4}}، 21 و 42 از طریق تزریق عضلانی به همراه الکتروپوریشن (35 میلی گرم در 50) واکسینه شدند. میلی لیتر) (شکل 2) [19،20]. به طور خلاصه، واکسن‌های DNA به عضله تیبیالیس قدامی (TA) تزریق شدند و با استفاده از یک الکترود آرایه‌ای دو سوزنی با فاصله 5 میلی‌متر (ECM830؛ BTX) با سوزن، فوراً با الکتریسیته پالس شدند. سرم های موش برای تجزیه و تحلیل پاسخ ایمنی هومورال جمع آوری شد و طحال موش برای اندازه گیری پاسخ ایمنی سلولی پردازش شد (شکل 2).

شکل 2. شماتیک چالش ایمن سازی و SARS-CoV-2. دوره زمانی واکسیناسیون، چالش برانگیز و نمونه گیری خون/بافت. موش های BALB/C به طور تصادفی به گروه هایی تقسیم شدند.

آزمایش‌های چالشی SARS-CoV{1}} همانطور که قبلاً توضیح داده شد [15،21] انجام شد. به طور خلاصه، موش ها بیهوش شدند و سپس با 2.5 × 108 PFU از Ad5-hACE2 در حجم کل 45 میکرولیتر به صورت داخل بینی انتقال داده شدند. پنج روز پس از ترانسدواکشن، موش‌ها بیهوش شدند و سپس با 105 × TCID50 SARS-CoV{15}} (Wuhan/IVDC HB{16}}/2019) در حجم کل 50 میکرولیتر سالین به صورت داخل بینی به چالش کشیده شدند. بافر تمام کار با SARS-CoV زنده-2 در مدل‌های موش در آزمایشگاه‌های ایمنی زیستی سطح 3 (ABSL{22}}) انجام شد.

2.4. سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم

سنجش‌های ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA) همانطور که قبلاً توضیح داده شد انجام شد [15]. به طور خلاصه، پروتئین های S (خری شده از Sino Biological)/N (هدیه ای از Song) رقیق شده در بافر کربنات (0.1 M، pH 9.6) روی صفحات {{6}چاهی EIA/RIA (Thermo) پوشانده شدند. Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) یک شب در 4◦C. پلیت ها با 200 میکرولیتر سرم 10 درصد بز در PBS در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت مسدود شدند و سپس پنج بار با PBST شسته شدند. سپس نمونه‌های سرمی رقیق‌شده در سرم 2 درصد بز در PBS اضافه و به مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند و سپس پنج بار شستشو با PBST انجام شد. IgG ضد موش بز با HRP کونژوگه (1:5000) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت اضافه شد. در مجموع 100 میکرولیتر از بستر TMB به هر چاهک اضافه شد و با 50 میکرولیتر 2M H2SO4 خاموش شد. جذب در طول موج 450 نانومتر با استفاده از SPECTR Ostar Nano (BIO-GENE، هنگ کنگ، چین) قرائت شد.

گیاه سیستانچ سیستم ایمنی را افزایش می دهد

برای مشاهده محصولات Cistanche Enhance Immunity اینجا را کلیک کنید

【بیشتر بخواهید】 ایمیل:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. آزمایش های عفونت و خنثی سازی شبه ویروس

سنجش خنثی سازی شبه ویروس همانطور که قبلا توضیح داده شد [21،22] انجام شد. پلاسمید بیان کننده پروتئین S ویروس اجدادی قبلا ساخته شده بود [22]. ژن پروتئین اسپایک نوع Omicron SARS-CoV{4} (GISAID: EPI_ISL_6590782.2) سنتز شد (هدیه ای از Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China) با استفاده از یک کدون بهینه شده برای پستانداران و شبیه سازی در وکتور pcDNA3.1، همانطور که قبلاً توضیح داده شد [22]. به طور خلاصه، پلاسمیدهایی که گزارشگر لوسیفراز را بیان می کنند و پلاسمیدهایی که پروتئین S را بیان می کنند با استفاده از معرف ترانسفکشن DNA HP GENE X-treme به سلول های HEK 293T ترانسفکت شدند. کشت سلولی 6 ساعت پس از ترانسفکشن تجدید شد و مایع رویی حاوی کاذب ویروس پس از 48 ساعت برداشت شد و در دمای 70- درجه سانتیگراد نگهداری شد. در روش خنثی سازی شبه ویروس، مخلوط مساوی سرم و ویروس در 37 حجم مایع رویی حاوی شبه ویروس انکوبه شد و سپس به سرم رقیق شده اضافه شد. ◦C به مدت 1 ساعت سپس محیط کشت سلولی Huh7.5 با 100 میکرولیتر از مخلوط سرم-ویروس جایگزین شد و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 12 ساعت انکوبه شد. سلول‌های کشت‌شده تنها با شبه ویروس‌های SARS-CoV{28}} به صورت موازی اجرا شدند. سپس محیط با DMEM (2% FBS) جایگزین شد و انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت انکوبه شد. سپس سیگنال لوسیفراز با استفاده از کیت لوسیفراز شب تاب Bright-Glo (Promega) اندازه گیری شد.

2.6. سنجش خنثی سازی SARS-CoV{3}

SARS-CoV-2 (Wuhan/IVDC-HB-02/2019) در این آزمایش استفاده شد. به طور خلاصه، سرم ها از رقت اولیه 1:10 دو بار رقیق شدند، با حجم مساوی (10-15 pfu/چاه) SARS-CoV زنده مخلوط شدند و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پس از آن آنها به سلول های Vero بذر اضافه شدند. پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 48 ساعت، یک اثر سیتوپاتیک (CPE) مشاهده شد و 100 میکرولیتر از مایع رویی کشت برای استخراج اسید نوکلئیک و PCR رونویسی معکوس فلورسانس بلادرنگ (RT-PCR) برداشت شد. دوز خنثی سازی میانه (ND50) با استفاده از روش رید-مونچ [15] محاسبه شد.

2.7. سنجش IFN-ELISpot

مخزن‌های پپتیدی که کل پروتئین S/N/E/M را به‌عنوان 15-مرهای متوالی بر روی 10 اسید آمینه پوشانده‌اند، توسط Scilight Biotechnology، LLC سنتز شدند. تقریباً 2.5 میلی گرم از هر پپتید خالص شده در استخر پپتید در هر ویال وجود داشت. آزمایش همانطور که قبلا توضیح داده شد انجام شد [18]. به طور خلاصه، صفحات چاهک (BD ELISPOT Set, USA) با Ab anti-IFN-capture پوشانده شدند و یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. پلیت ها پس از سه بار شستشو با محیط کشت کامل مسدود شدند. سلول‌های طحال پس از کشته شدن موش‌ها در روز 35 برداشت شدند و 120 سوسپانسیون تک سلولی تازه از هر گروه در 106×5 در هر چاهک کاشته شد و پپتیدها اضافه شدند. سپس پلیت ها در دمای 37 درجه سانتیگراد در 5% CO2 به مدت 22 ساعت انکوبه شدند و با استفاده از صفحه خوان ELISpot (Biosys, So. Pasadena, CA, USA) شناسایی شدند. واحد تشکیل نقطه (SFU) نشان دهنده IFN- ترشح کننده سلول T است.

2.8. ارزیابی حفاظت در موش‌ها چالش پس از SARS-CoV{4}}

آزمایش‌ها همانطور که قبلاً توضیح داده شد [15،21] انجام شد. به طور خلاصه، ریه ها پس از مرگ موش ها برداشت شدند. نیمی از بافت ها برای استخراج اسید نوکلئیک، RT-PCR فلورسانس بلادرنگ و TCID50 استفاده شد. نیمی دیگر برای ارزیابی پاتولوژیک به کالج دامپزشکی دانشگاه کشاورزی چین فرستاده شد.

2.9. تحلیل آماری

آزمون‌های t-paired، آزمون‌های ANOVA دو طرفه و آزمون مقایسه‌های چندگانه Dunnett با استفاده از GraphPad Prism 7 انجام شد.{3}} (GraphPad Software LLC). p-values ​​< 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد (* p < 0.05; ** p < 0.01; * ** p <0.001؛ **** p <0.0001).

3. نتایج

3.1. خصوصیات واکسن های DNA

سطح پروتئین E و M با استفاده از وسترن بلات شناسایی شد. ما بیان پروتئین های رمزگذاری شده S/N/E/M SARS-CoV{1}} را در سلول های HEK{2}T ترانسفکت شده با پلاسمیدهای pS/pN/pE/pM از طریق آنالیز وسترن بلات، با استفاده از ضد اندازه گیری کردیم. - آنتی بادی های S/anti-N و آنتی بادی ضد-6 x His، در لیزهای سلولی. باندها وزن مولکولی پیش بینی شده پروتئین های S (140-142 کیلو دالتون)، N (45 کیلو دالتون)، E (10 کیلو دالتون) و M (22-25 کیلو دالتون) را تقریب زدند (شکل 1B).

3.2. تولید قوی و پایدار Anti-S و/یا anti-N IgG ناشی از pS و/یا pN DNA

سرم واکسن ها از موش های BALB/c در 35، 56، 96 و 120 روز جمع آوری شد (شکل 2). سطوح Anti S/anti-N IgG با استفاده از روش الایزا شناسایی شد. بزرگی پاسخ IgG اختصاصی S یا N ناشی از pS یا pN در سرم به دنبال تقویت‌های اول و دوم افزایش یافت. تیتر ضد S و ضد N IgG در گروه pS + pN بالاتر از آنها در گروه های دیگر بود. با این حال، این تفاوت از نظر آماری معنی دار نبود (شکل 3A، B). هیچ پاسخ آنتی بادی اختصاصی پروتئین E/M قوی شناسایی نشد که با نتایج مطالعه قبلی (داده‌ها نشان داده نشده است) مطابقت دارد [15].

شکل 3. پاسخ سلول B به SARS-CoV{3}} در موش BALB/c. (الف) تیترهای نقطه پایانی اتصال IgG سرم برای پروتئین های SARS-CoV-2 S (A) و N (B). (ج) تیترهای خنثی سازی بر اساس سیستم ویروس کاذب SARS-CoV{7}} تعیین شد. (د) تیترهای خنثی سازی Anti-SARS-CoV{11}} با استفاده از ویروس SARS-CoV{13}} تعیین شد. (E) سنجش خنثی سازی بر اساس سیستم ویروسی کاذب SARS-CoV{15}} Omicron. نسبت های بازداری برای سرم ها از گروه های ساختگی (آبی)، pS (قرمز)، pS + pN (سبز)، pS + pE + pM (صورتی) و pN (نارنجی) نشان داده شده است. نوارهای خطا نشان دهنده SEM هستند، و مقادیر p با استفاده از ANOVA دو طرفه و تجزیه و تحلیل تعقیبی Sidak، که در آن * p < 0 محاسبه شد.05

3.3. سطوح بالای آنتی بادی خنثی کننده ناشی از ایمن سازی همزمان با واکسن های pS و pN

تیترهای خنثی کننده نمونه های سرمی رقیق شده با استفاده از ویروس SARS-CoV{1}} کاذب تعیین شد. بالاترین سطوح آنتی بادی های خنثی کننده (nAbs) در گروه pS + pN مشاهده شد، با تیترهای میانگین هندسی متقابل EC5{12}} به 2988 (در روز 35) و 3578 (در روز 56) (شکل 3C). نتایج مشابهی با استفاده از روش میکروخنثی‌سازی ویروس زنده (MN) مشاهده شد، که در آن سطوح nAbs در گروه pS + pN بالاتر از گروه S در روزهای 56 و 96 بود (p < 0.05؛ شکل؛ شکل 3 بعدی). علاوه بر این، سطوح nAbs در گروه pS + pN در روز 56 (تقویت دوم) به طور قابل توجهی بالاتر از سطح nAbs در روز 35 بود (05/0p<؛ شکل 3D).

فعالیت خنثی کننده هر رژیم واکسن علیه SARS-CoV-2 نوع Omicron بیشتر با استفاده از پلت فرم شبه و نمونه های سرم تعیین شد. مشخصات خنثی سازی در برابر ویروس Omicron در روزهای 35 و 56 مشابه با ویروس اجدادی بود (شکل 3E)، که نشان می دهد تیمار PS + pN دارای قدرت خنثی کننده متقاطع است.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

3.4. پاسخ سلول های T ناشی از واکسیناسیون DNA

همانطور که قبلاً توضیح داده شد، پاسخ سلول های T در برابر آنتی ژن های SARS-CoV{2}} S/N/E/M با استفاده از IFN-ELISpot برآورد شد، همانطور که قبلاً توضیح داده شد [15]. همانطور که انتظار می رفت، هر دو رژیم PS + pN و pS + pE + pM سطوح قابل توجهی بالاتری از سلول های IFN + T خاص برای پروتئین S را در روز 12 نسبت به روز 35 القا کردند (p < 0). 05؛ شکل 4A). علاوه بر این، تعداد سلول های IFN + T اختصاصی برای پروتئین N در روز 120 (تقویت دوم) به طور قابل توجهی بیشتر از روز 35 در گروه pS + pN بود (0.05 < p؛ شکل 4B). در نهایت، تعداد سلول های IFN + T اختصاصی برای پروتئین M در روز 120 (تقویت دوم) به طور قابل توجهی بیشتر از روز 35 در هر دو گروه بود (05/0p<؛ شکل 4D).

شکل 4. پاسخ سلول های T به پروتئین های ساختاری فردی SARS-CoV{2} در موش BALB/c. (الف) پاسخ‌های سلول‌های T با استفاده از IFN-ELISpot در سلول‌های طحال تحریک‌شده برای 20 ساعت با استخرهای پپتیدی همپوشانی که SARS-CoV{7}} S، (B) N، (C) E را در بر می‌گیرد، اندازه‌گیری شد. و (D) پروتئین های M. میله ها نشان دهنده میانگین ± SD هستند. تجزیه و تحلیل‌های آماری با استفاده از آنالیز واریانس دوطرفه و آزمون تعقیبی Sidak انجام شد که در آن * p < 0. 0.01 و **** p <0.0001.

3.5. حفاظت سینرژیستیک ناشی از ایمن سازی همزمان با pS/pN یا pS/pE/pM

سپس کارآیی محافظتی واکسن‌های DNA را با استفاده از موش‌های hACE2 ایمن‌سازی شده پس از چالش با ویروس اجدادی SARS-CoV{3}} ارزیابی کردیم. پس از این چالش، موش های گروه ساختگی کاهش وزن تدریجی را نشان دادند. در مقابل، موش‌های ایمن‌سازی شده با pS یا pS+ بلافاصله پس از عفونت، کاهش وزن خفیفی را نشان دادند و به دنبال آن بهبود یافتند (شکل 5A). هیچ ویروس زنده ای در موش های واکسینه شده با pS، pS + pN، یا pS + pE + pM شناسایی نشد. علاوه بر این، واکسیناسیون pS + pN به طور قابل توجهی تعداد کپی RNA ویروسی را در مقایسه با واکسیناسیون pS به تنهایی کاهش داد (p=0.0228؛ شکل 5B). علاوه بر این، هیستوپاتولوژی ریه نشان داد که موش‌ها در هر دو گروه ساختگی و pN لکه‌های کانونی التهاب، انواژیناسیون پلور، فروپاشی آلوئولی، سطوح بالای ارتشاح سلول‌های التهابی و مناطق خونریزی‌دهنده را نشان دادند. در مقایسه، موش‌های تحت درمان با pS + pN یا pS + pE + pM تغییرات هیستوپاتولوژیک خفیف‌تری و نمرات INHAND پایین‌تری پس از چالش نسبت به گروه دیگر نشان دادند (شکل 5C).

شکل 5. اثر حفاظتی ایمن سازی پس از چالش با ویروس زنده SARS-CoV-2. (الف) موش‌ها روزانه (میانگین ± خطای استاندارد میانگین (SEM)، n=4) به مدت سه روز پس از چالش وزن شدند. (ب) تیتر SARS-CoV{6}} عفونی در هموژنه‌های ریه در روز سوم پس از چالش، همانطور که از طریق آزمون TCID5{{{1{12}}}} و شماره کپی RNA تعیین شد. تفاوت‌های آماری معنی‌دار بین گروه‌ها با استفاده از ANOVA یک طرفه و به دنبال آن تصحیح مقایسه چندگانه Dunnett تعیین شد (* p < 0). **** p < 0.0001). (C) تجزیه و تحلیل هیستوپاتولوژیک ریه با استفاده از رنگ آمیزی H&E.

4. بحث

در این مطالعه، ایمن‌سازی همزمان با دو واکسن DNA که پروتئین‌های S و N را بیان می‌کنند، سطوح بالایی از nAbs را القا کرد و در کاهش بار ویروسی SARS-CoV-2 در موش‌ها بسیار مؤثر بود. واکسن‌های DNA که پروتئین S را بیان می‌کنند، سطوح ایمنی سلولی پروتئین S را پس از سه بار ایمن‌سازی افزایش دادند، زمانی که موش‌ها با پروتئین‌های N/E و M ایمن شدند و تغییرات هیستوپاتولوژیک پس از چالش را کاهش دادند. تا آنجا که ما می دانیم، این اولین گزارشی است که افزایش هم افزایی ایمنی و محافظت را در موش ها با استفاده از واکسن DNA کد کننده پروتئین S در هنگام ایمن سازی همزمان با واکسن های DNA که سایر پروتئین های ساختاری SARS-CoV را کد می کنند، آشکار می کند. }}.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

اپی توپ های سلول B ایمنی غالب در مناطق آنتی ژن N در چندین مطالعه مشاهده شده است. واکسن‌های مبتنی بر N معمولاً نمی‌توانند nAbs را القا کنند، احتمالاً به این دلیل که پروتئین N روی سطح ویروسی نمایش داده نمی‌شود. قابل‌توجه، ایمن‌سازی همزمان با پروتئین‌های S و N نسبت به سایر گروه‌ها سطوح بالاتری از nAbs را در برابر ویروس اجدادی و Omicron SARS-CoV-2 القا کرد. افزایش پاسخ‌های nAb با پاکسازی ویروسی بهتر و اثر محافظتی همراه است. نتایج ما نشان داد که درمان pS + pN نسبت به درمان pS به تنهایی در کاهش بار ویروسی SARS-CoV{7}} پس از چالش مؤثرتر بود. یک مطالعه قبلی گزارش داد که همسترهای ایمن‌سازی شده با واکسنی که پروتئین‌های M و N را بیان می‌کنند در برابر کاهش وزن شدید و آسیب‌شناسی ریه محافظت می‌شوند و به طور قابل‌توجهی تیترهای ویروسی را در اوروفارنکس و ریه‌ها پس از چالش SARS-CoV کاهش داده‌اند. که با نتایج ما مطابقت دارد [23]. متأسفانه، کاهش تیتر ویروس را نمی توان به طور خاص به پروتئین M یا N نسبت داد و سطوح nAb در این مطالعه ارزیابی نشد. یک مطالعه واکسن SARS-CoV{15}} mRNA گزارش داد که ایمن‌سازی مشترک S + N باعث افزایش پاسخ سلول‌های T اختصاصی S به CD{19}} و خنثی‌کننده فعالیت آنتی‌بادی می‌شود که محافظت بهتری در ریه‌ها در برابر دلتا ایجاد می‌کند. واریته در مقایسه با S به تنهایی که با نتایج این مطالعه مطابقت دارد [24]. مطالعه دیگری گزارش داد که پروتئین N ویروس گاستروانتریت قابل انتقال باعث سنتز آنتی بادی های خنثی کننده می شود که سلول های TGEV-IMMUNE خوک با ترکیبی از پروتئین های S و N در شرایط آزمایشگاهی تحریک می شوند و این اثر را می توان با پاسخ لنفوسیت T کمکی به آن توضیح داد. پروتئین N [25].

اپی توپ‌های سلول T CD{0}}/CD8+ در نواحی آنتی‌ژن N قبلاً شناسایی شده‌اند. چندین مطالعه گزارش کرده‌اند که واکسن‌های مبتنی بر پروتئین SARS-CoV-2 N به‌طور مؤثری پاسخ‌های ایمنی سلولی را القا می‌کنند. گروه S + N افزایش سطح ایمنی سلولی پروتئین S را پس از سه بار ایمن سازی نشان داد. یک مطالعه واکسن mRNA SARS-CoV{9}} گزارش داد که ترکیبی S + N در مقایسه با S به تنهایی، پاسخ سلول T CD{12}} S اختصاصی تقویت‌شده را القا می‌کند که با نتایج ما مطابقت دارد [24]. مطالعه دیگری گزارش داد که پاسخ سلول‌های T به آنتی‌ژن‌های S و N پس از واکسیناسیون اولیه hAd5 S + N با آنتی ژن دوگانه به تنهایی با پاسخ‌های بیماران مبتلا به SARS-CoV{20}} و در مدل‌های پیش‌بینی سیلیکونی سلول‌های T برابر است. اتصال اپی توپ HLA نشان داد که پاسخ سلول های T به واکسن hAd5 S + N کارایی خود را در برابر نوع B.1.351 حفظ خواهد کرد. علاوه بر این، پلاسمای بیمارانی که قبلاً آلوده به SARS-CoV{28}}آلوده شده بودند، میل اتصال بالاتری به سلول‌هایی که ساختار دوگانه S-Fusion + N-ETSD را بیان می‌کنند نسبت به hAd5 S-Fusion به تنهایی نشان داد، که بیشتر نشان می‌دهد که ایمنی‌زایی واکسن دو آنتی ژن S + N بهتر از واکسن تک آنتی ژن S است [26].

ویروس زنده در ریه‌ها شناسایی نشد، و کاهش وزن پس از چالش در گروه‌های pS، pS + pN، و pS + pE + pM کاهش یافت، در حالی که درمان pN به طور موثر تیتر ویروس را کاهش نداد. این یافته ها بر ضروری بودن و اثربخشی پروتئین S به عنوان یک هدف واکسن تاکید می کند. قابل ذکر است که ایمن سازی همزمان با pS و pN اثرات بهتری نسبت به pS یا pN بر پاکسازی ویروس داشت. گروه pS + pE + pM تغییرات هیستوپاتولوژیک کمتری را در ریه ها نشان داد که با نتایج مطالعه قبلی ما مطابقت دارد [15]. گروه S + N دارای کپی‌های RNA ویروسی کم در ریه، کاهش کاهش وزن و زمان بهبودی سریع پس از SARS-CoV{11}} در مقایسه با گروهی که تنها با S/N واکسینه شده بودند، داشتند که با نتایج این مطالعه با این حال، هیچ یک از گروه ها تیتر آنتی بادی خنثی کننده را شناسایی نکردند، که ممکن است با تفاوت در انواع واکسن و حیوانات آزمایشی توضیح داده شود [26]. یک مطالعه واکسن ناقل آدنوویروس SARS-CoV{14} گزارش داد که واکسن S تنها در صورت ایمن سازی همزمان با واکسن N از مغز حاد محافظت می کند [27]. مطالعه دیگری واکسن‌های Tri: ChAd، Bi: ChAd و Mono: ChAd را که به ترتیب پروتئین‌های S1/N/RdRp، N/RdRp و S1 را بیان می‌کنند، توسعه داد و آنها را در مدل حیوانی B.1.351 آزمایش کرد. آسیب شناسی گسترده گسترده در مونو: ChAdlungs مشاهده شد، در حالی که ریه های Bi: ChAd و Tri: ChAd تقریباً عاری از این آسیب شناسی ظاهر شدند [28].

علاوه بر این، حیوانات واکسینه نشده بارهای ویروسی ریه بالایی داشتند، در حالی که درمان Tri: ChAd به طور قابل توجهی بارهای ویروسی را 3.5 log کاهش داد. در مقایسه، هر دو واکسن Bi: ChAd و Mono: ChAd فقط بار ویروسی را به طور متوسط ​​کاهش دادند. این نتایج نشان می دهد که اثر محافظتی واکسن دو آنتی ژن S/N در برابر انواع ممکن است بهتر از واکسن تک آنتی ژن S باشد که با نتایج ما مطابقت دارد [28]. چند مطالعه گزارش کرده اند که موش های ایمن شده با پروتئین N پس از عفونت SARS-CoV دچار التهاب شدید ریه می شوند [29-31]. مطالعات قبلی همچنین گزارش کرده‌اند که ایمن‌سازی با واکسن ناقل آدنوویروس که پروتئین N ویروس هپاتیت موش را بیان می‌کند، از موش‌ها در برابر عفونت کشنده محافظت می‌کند، که نشان می‌دهد پروتئین N می‌تواند یک اثر محافظتی ایجاد کند [32]. علاوه بر این، گروهی که با واکسن CRT/N DNA ایمن شده بودند، تیتر ویروسی پس از چالش به طور قابل توجهی کاهش یافته بود، با یک ویروس واکسینیا که پروتئین SARS-CoV N را بیان می کرد [33].

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

یک مطالعه روی پروتئین S نشان داد که واکسن ترکیبی DNA/پروتئین باعث ایجاد ایمنی هومورال و سلولی بهتر از واکسن DNA/پروتئین به تنهایی می شود [8]. واکسن‌هایی که فقط پروتئین S را هدف قرار می‌دهند، در محافظت در برابر کووید خفیف تا متوسط-19 ناشی از انواع نوظهور، کارایی کمتری نشان داده‌اند. نقش پروتئین‌های ساختاری حفاظت‌شده SARS-CoV-2، از جمله پروتئین‌های N/E/M، در طراحی و کاربردهای واکسن شایسته توجه است، زیرا پاسخ‌های سلول T ناشی از واکسن در برابر اپی توپ‌های حفاظت‌شده معمولاً تحت تأثیر جهش‌ها قرار نمی‌گیرند. . یک مطالعه گزارش داد که بیماران بهبودیافته با SARS (n=23) هنوز دارای سلول‌های T حافظه طولانی‌مدت هستند که به پروتئین N SARS-CoV 17 سال پس از شیوع سال 2003 واکنش نشان می‌دهند، که واکنش متقابل قوی نسبت به SARS CoV نشان می‌دهد. {15}} پروتئین N، اعتبار بیشتر استفاده از پروتئین N را به عنوان یک هدف واکسن محافظ متقابل [34]. این مطالعه نشان داد که ایمن‌سازی مشترک pS/pN با پاسخ‌های nAb بالاتر، پاکسازی ویروسی بهتر، و پاسخ‌های ایمنی سلولی بهبود یافته مرتبط است و ممکن است پس از چالش SARS-CoV{20}} در مقایسه با pS به تنهایی، محافظت بهتری ارائه دهد. علاوه بر این، گونه‌های SARS-CoV{22}} بسیاری از گونه‌های جانوری را آلوده می‌کنند، و انتقال انسان به حیوان در برخی از حیوانات وحشی و حیوانات خانگی مشاهده شده است [7]. بنابراین، واکسن دامپزشکی SARS-CoV{27}} نیاز به توجه بیشتری دارد. علاوه بر این، فناوری نانو ممکن است ابزار قدرتمندی در بهینه‌سازی واکسن‌ها باشد و ارزش توجه بیشتری را دارد [2].

این مطالعه دارای چندین محدودیت است. اول، ما فقط استراتژی واکسن DNA را در موش‌های BALB/c مشاهده کردیم و مطالعات آینده باید اثرات ایمنی‌زایی این رژیم‌های واکسن را در سایر مدل‌های حیوانی ارزیابی کنند. دوم، تحقیقات بیشتری برای درک کامل مکانیسم‌های مولکولی نهفته در پاسخ‌های سلول‌های T اختصاصی nAb و S تقویت‌شده ناشی از ایمن‌سازی همزمان با استفاده از پروتئین‌های S و N و استفاده از این دانش برای بهینه‌سازی کووید مورد نیاز است{5}} طراحی واکسن در نهایت، عملکرد آنتی بادی های اختصاصی پروتئین N مستحق مطالعه بیشتر است.

cistanche tubulosa - بهبود سیستم ایمنی

در نتیجه، این مطالعه پتانسیل ایمنی ایمنی ایمن سازی همزمان با پروتئین های SARS-CoV{3}} S، N، E و M را ارزیابی کرد. چندین واکسن که فقط پروتئین S را هدف قرار می‌دهند، اثر محافظتی کمتری بر روی گونه‌های در حال ظهور دارند. نتایج ما پایه‌ای برای توسعه یک واکسن واکنش متقابل کووید-19 برای کنترل انواع کنونی و نوظهور SARS-CoV-2 و جلوگیری از همه‌گیری‌های بالقوه ویروس کرونا خواهد گذاشت.

منابع

1. زمیفسکایا، ای. ولیولینا، ا. گانیوا، آی. پتوخوف، آ. رضوانف، آ. Bulatov، E. کاربرد سلول درمانی CAR-T فراتر از انکولوژی: بیماری های خود ایمنی و عفونت های ویروسی. Biomedicines 2021، 9، 59. [CrossRef] [PubMed]

2. رشیدزاده، ح. دانافر، ح. رحیمی، ح. مظفری، ف. صالحیبار، م. رحمتی، م. رحاموز حقیقی، س. موسى زاده، ن. محمدی، ع. Ertas، YN; و همکاران نانوتکنولوژی در برابر کروناویروس جدید (سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2): تشخیص، درمان، درمان و چشم‌اندازهای آینده. Nanomedicine 2021، 16، 497-516. [CrossRef]

3. فونتانت، ا. Cauchemez، S. COVID{1}} مصونیت گله ای: ما کجا هستیم؟ نات. کشیش ایمونول. 2020، 20، 583-584. [CrossRef] [PubMed]

4. جیاناتان، م. افخمی، س. اسمیل، اف. میلر، ام اس; Lichty، BD; Xing، Z. ملاحظات ایمنی برای استراتژی‌های واکسن کووید-19. نات. کشیش ایمونول. 2020، 20، 615–632. [CrossRef] [PubMed]

5. واندلی، ا. مونتی، ام. میلانتی، ای. آرماوس، ا. روپرت، جی. زاکو، ای. بچارا، ای. دلی پونتی، ر. Tartaglia، GG تجزیه و تحلیل ساختاری ژنوم SARS-CoV{2}} و پیش‌بینی‌های متقابل انسان. Nucleic Acids Res. 2020، 48، 11270–11283. [CrossRef] [PubMed]

6. جکسون، سی بی; فرزان، م. چن، بی. Choe, H. مکانیسم‌های ورود SARS-CoV{2}} به سلول‌ها. نات. کشیش مول. سلول بیول. 2022، 23، 3-20. [CrossRef]

7. کنفورتی، ا. سانچز، ای. سالواتوری، ای. لیون، ال. Compagnone، M. پینتو، ای. پالمبو، اف. داکونتو، ای. موزی، ع. روسیلی، جی. و همکاران یک نامزد واکسن DNA خطی که دامنه اتصال گیرنده SARS-CoV{2}} را رمزگذاری می‌کند، پاسخ ایمنی قوی و آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده را در گربه‌های خانگی ایجاد می‌کند. مول. آنجا روش ها کلین. توسعه دهنده 2023. [CrossRef]

8. Borgoyakova، MB; کارپنکو، LI; مرکولیوا، IA; شچرباکوف، دی.ان. رودومتوف، AP; استاروستینا، EV; شانشین، دی وی; Isaeva، AA; Nesmeyanova، VS; Volkova، NV; و همکاران ایمنی زایی واکسن ترکیبی DNA/پروتئین در برابر کووید{1}}. گاو نر انقضا Biol. پزشکی 2023، 1-4. [CrossRef]

9. کو، ل. یی، ز. شن، ی. لین، ال. چن، اف. خو، ی. وو، زی. تانگ، اچ. ژانگ، ایکس. تیان، اف. و همکاران واکسن‌های RNA دایره‌ای علیه SARS-CoV-2 و انواع در حال ظهور. Cell 2022, 185, 1728-1744.e16. [CrossRef]

10. کوربت، KS; ادواردز، DK; Leist، SR; Abiona، OM; بوی اوغلو-بارنوم، اس. گیلسپی، RA; هیمانسو، اس. شفر، آ. Ziwawo، CT; دی پیازا، AT; و همکاران طراحی واکسن mRNA SARS-CoV{3}} با آمادگی پاتوژن نمونه اولیه فعال شده است. طبیعت 2020، 586، 567–571. [CrossRef]

11. تیان، ج. پاتل، ن. هاوپت، آر. ژو، اچ. وستون، اس. هاموند، اچ. لوگ، جی. پورنوف، ای. نورتون، جی. Guebre-Xabier، M. و همکاران ایمنی زایی NVX-CoV2373 برای واکسن گلیکوپروتئین اسپایک SARS-CoV-2 در بابون ها و محافظت در موش ها. نات. اشتراک. 2021, 12, 372. [CrossRef] [PubMed]

12. آندریانو، ای. پاسیلو، آی. پیچینی، جی. مانگانارو، ن. پیلری، پ. هیسنی، ط. لئوناردی، م. پانتانو، ای. ابینتو، وی. بنینکاسا، ال. و همکاران ایمنی ترکیبی سلول های B و آنتی بادی ها را در برابر انواع SARS-CoV-2 بهبود می بخشد. Nature 2021, 600, 530–535. [CrossRef]

13. نقوی، عترت; فاطمه، ک. محمد، ت. فاطمه، U. سینگ، آی کی. سینگ، آ. عاطف، SM; هاریپراساد، جی. حسن، جنرال موتورز; حسن، بینش MI درباره ژنوم، ساختار، تکامل، پاتوژنز و درمان‌های SARS-CoV{{2}: رویکرد ژنومیک ساختاری. بیوشیم. بیوفیز. اکتا مول. اساس. دیس 2020، 1866، 165878. [CrossRef] [PubMed]

14. عباسی، جی. واکسن DNA جدید کووید-19 هند برای نوجوانان و بزرگسالان اولین است. JAMA 2021, 326, 1365. [CrossRef] [PubMed]

15. چن، ج. دنگ، ی. هوانگ، بی. هان، دی. وانگ، دبلیو. هوانگ، ام. ژای، سی. ژائو، ز. یانگ، آر. ژائو، ی. و همکاران واکسن‌های DNA که پروتئین‌های پوششی و غشایی را بیان می‌کنند، محافظت نسبی در برابر SARS-CoV-2 در موش‌ها ارائه می‌کنند. جلو. ایمونول. 2022, 13, 827605. [CrossRef]

16. طبس، ص. کراینیاک، کالیفرنیا؛ پاتل، ا. مزلو، JN; مورو، نماینده مجلس؛ سیلوستر، ای جی; Knoblock، D.; گیلسپی، ای. آمانته، دی. راسین، تی. و همکاران واکسن Intradermal SynCon® Ebola GP DNA از نظر دما پایدار است و به طور ایمن مزایای ایمنی سلولی و هومورال را در داوطلبان سالم نشان می دهد. ج. عفونی کردن. دیس 2019، 220، 400–410. [CrossRef]

17. اسمیت، TRF; پاتل، ا. راموس، اس. الوود، دی. زو، ایکس. یان، جی. گری، EN; واکر، SN; شولتیس، ک. پوروار، م. و همکاران ایمنی زایی یک واکسن DNA کاندید کووید-19. نات. اشتراک. 2020، 11، 2601. [CrossRef]

18. ژائو، ز. دنگ، ی. نیو، پ. آهنگ، جی. وانگ، دبلیو. دو، ی. هوانگ، بی. وانگ، دبلیو. ژانگ، ال. ژائو، پی. و همکاران ایمن‌سازی همزمان با واکسن‌های CHIKV VLP و DNA باعث ایجاد یک پاسخ شوخ‌آمیز امیدوارکننده در موش‌ها می‌شود. جلو ایمونول. 2021, 12, 655743. [CrossRef]

19. گوان، ج. دنگ، ی. چن، اچ. یین، ایکس. یانگ، ی. Tan, W. پرایمینگ با دو واکسن DNA که پروتئین NS3 ویروس هپاتیت C را بیان می کند و سلول های دندریتیک را هدف قرار می دهد، پتانسیل محافظتی هترولوگ برتر را در موش ایجاد می کند. قوس. ویرول. 2015، 160، 2517-2524. [CrossRef]

20. چن، اچ. ون، بی. دنگ، ی. وانگ، دبلیو. یین، ایکس. گوان، جی. روآن، ال. Tan, W. اثر افزایش یافته ایمن سازی DNA به علاوه الکتروپوراسیون in vivo با ترکیبی از پلاسمیدهای هسته PreS1 و S-PreS1 ویروس هپاتیت B. کلین. واکسن ایمونول. 2011، 18، 1789-1795. [CrossRef]

21. یانگ، آر. دنگ، ی. هوانگ، بی. هوانگ، ال. لین، ا. لی، ی. وانگ، دبلیو. لیو، جی. لو، اس. ژان، ز. و همکاران یک واکسن mRNA کووید{2}} با ساختار پوسته هسته با الگوی توزیع زیستی مطلوب و ایمنی امیدوارکننده. انتقال سیگنال آنجا را هدف قرار دهید. 2021، 6، 213. [CrossRef] [PubMed]

22. یانگ، آر. هوانگ، بی. الف، ر. لی، دبلیو. وانگ، دبلیو. دنگ، ی. Tan, W. توسعه و اثربخشی شبه سیستم SARS-CoV-2 که با آزمایش بازده خنثی و مهار ورود در شرایط آزمایشگاهی تعیین شد. بیوساف. Health 2020, 2, 226-231. [CrossRef] [PubMed]

23. جیا، ق. Bielefeldt-Ohmann، H.; Maison، RM; Masleša-Gali´c، S. کوپر، SK; بوون، RA; هورویتز، MRA Replicating bacterium vectored واکسن بیان کننده SARS-CoV{4}} غشاء و پروتئین های نوکلئوکپسید در برابر بیماری شدید مانند COVID{5} در همستر محافظت می کند. NPJ Vaccines 2021, 6, 47. [CrossRef] [PubMed]

24. Hajnik, RL; پلانت، JA; لیانگ، ی. علامه، م.غ. تانگ، جی. ژونگ، سی. آدم، ا. چارتون، دی. رافائل، GH; لیو، ی. و همکاران واکسیناسیون ترکیبی mRNA محافظت در برابر واریانت دلتای SARS-CoV-2 را افزایش می‌دهد. bioRxiv 2021. [CrossRef]

25. Antón, IM; گونزالس، اس. Bullido، MJ; کورسین، ام. ریسکو، سی. لانگولد، جی پی؛ Enjuanes, L. همکاری بین پروتئین‌های ساختاری ویروس گاستروانتریت قابل انتقال (TGEV) در القای آزمایشگاهی آنتی‌بادی‌های اختصاصی ویروس. ویروس Res. 1996، 46، 111-124. [CrossRef]

26. Deschamboult, Y.; لینچ، جی. وارنر، بی. تیرنی، ک. هوین، دی. وندراملی، آر. خیاط، ن. فراست، ک. بوث، اس. ساجش، ب. و همکاران ایمن سازی منفرد با ویروس های واکسینیا نوترکیب ACAM2000 که نشان دهنده سنبله و پروتئین های نوکلئوکپسید هستند از همسترها در برابر بیماری بالینی ناشی از SARS-CoV{3} محافظت می کند. bioRxiv 2021. [CrossRef]

27. Penaloza-MacMaster، P. کلاس، جی. دانگی، تی. واکسن نوکلئوکپسید ریچنر، JM A SARS CoV{2}} در برابر انتشار ویروسی دیستال محافظت می کند. bioRxiv 2021.

28. افخمی، س. داگوستینو، MR; ژانگ، ا. استیسی، HD; مرزوک، ع. کانگ، ا. سینگ، آر. باوانانتاسیوام، ج. بله، جی. لو، ایکس. و همکاران تحویل مخاط تنفسی نسل بعدی واکسن کووید-19 محافظت قوی در برابر هر دو گونه‌های اجدادی و انواع مختلف SARS-CoV-2 ارائه می‌کند. Cell 2022, 185, 896-915.e19. [CrossRef]

29. ژنگ، ن. شیا، آر. یانگ، سی. یین، بی. لی، ی. دوان، سی. لیانگ، ال. گوا، اچ. Xie, Q. افزایش بیان پروتئین نوکلئوکپسید SARS-CoV در تنباکو و ایمنی زایی آن در موش. واکسن 2009، 27، 5001-5007. [CrossRef]

30. یاسویی، ف. کای، سی. کیتاباتکه، م. اینو، اس. یوندا، م. یوکوچی، اس. کاس، آر. سکیگوچی، اس. موریتا، ک. هیشیما، تی. و همکاران ایمن سازی قبلی با پروتئین نوکلئوکپسید ویروس مرتبط با سندرم حاد تنفسی (SARS) (SARS-CoV) باعث ذات الریه شدید در موش های آلوده به SARS-CoV می شود. J. Immunol. 2008، 181، 6337-6348. [CrossRef]

31. دمینگ، دی. شیهان، تی. هایسه، ام. یونت، بی. دیویس، ن. سیمز، آ. سوتر، م. هارکما، جی. ویتمور، ا. ترشی، ر. و همکاران اثربخشی واکسن در موش‌های مسن که با انواع اپیدمی و بیماری مشترک انسان و دام نوترکیب SARS-CoV به چالش کشیده شده‌اند. PLoS Med. 2006, 3, e525. [CrossRef] [PubMed]

32. Wesseling, JG; گودکه، جی. Schijns، VE; پریوک، ال. گراهام، اف. Horzinek، MC; Rottier، PJ موش میخچه ویروس هپاتیت و پروتئین های نوکلئوکپسید بیان شده توسط ناقل های آدنوویروس از موش ها در برابر عفونت کشنده محافظت می کند. جی ژنرال ویرول. 1993، 74، 2061-2069. [CrossRef] [PubMed]

33. کیم، TW; لی، جی اچ. آویزان، CF; پنگ، اس. رودن، آر. وانگ، ام سی؛ ویسیدی، آر. Tsai، YC; او، ال. چن، پی جی؛ و همکاران تولید و شناسایی واکسن‌های DNA که پروتئین نوکلئوکپسید سندرم حاد تنفسی شدید کرونا را هدف قرار می‌دهند. جی. ویرول. 2004، 78، 4638-4645. [CrossRef] [PubMed]

34. لی برت، ن. قهوهای مایل به زرد، AT; کوناسه گران، ک. تام، سی ال. حافظی، م. چیا، ا. Chng، MHY; لین، ام. تان، ن. لینستر، ام. و همکاران SARS-CoV-2-ایمنی سلول T خاص در موارد کووید-19 و SARS و کنترل های غیر آلوده. طبیعت 2020، 584، 457–462. [CrossRef]