ابسترعمل کنید

زمینهمطالعات فزاینده ای اثر درمانی اگزوزوم های مشتق از سلول های بنیادی مزانشیمی (MSC) را گزارش کرده اند که توسط آن پروتئین و miRNA مشخص می شود. با این حال، پروفایل های پروتئومیکس و miRNA اگزوزوم های مشتق شده از سلول های بنیادی جنینی انسان (hESCs) و سلول های بنیادی پرتوان القایی انسان (hiPSCs) نامشخص است.

گلیکوزید سیستانچ همچنین می تواند فعالیت SOD را در بافت های قلب و کبد افزایش دهد و به طور قابل توجهی محتوای لیپوفوسین و MDA را در هر بافت کاهش دهد و به طور موثر رادیکال های مختلف اکسیژن فعال (OH-، H2O2 و غیره) را از بین ببرد و از آسیب DNA ناشی از آن محافظت کند. توسط رادیکال های OH گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید سیستانچ دارای توانایی مهار قوی رادیکال های آزاد، توانایی کاهش بالاتری نسبت به ویتامین C، بهبود فعالیت SOD در سوسپانسیون اسپرم، کاهش محتوای MDA و اثر محافظتی خاصی بر عملکرد غشای اسپرم هستند. پلی ساکاریدهای سیستانچ می توانند فعالیت SOD و GSH-Px را در گلبول های قرمز و بافت ریه موش های آزمایشگاهی مسن ناشی از D-گالاکتوز افزایش دهند و همچنین محتوای MDA و کلاژن را در ریه و پلاسما کاهش دهند و محتوای الاستین را افزایش دهند. اثر پاک کنندگی خوب بر روی DPPH، طولانی شدن زمان هیپوکسی در موش های پیر، بهبود فعالیت SOD در سرم، و به تاخیر انداختن انحطاط فیزیولوژیکی ریه در موش های آزمایشگاهی پیر. و این پتانسیل را دارد که دارویی برای پیشگیری و درمان بیماری های پیری پوست باشد. در عین حال، اکیناکوزید موجود در سیستانچ توانایی قابل توجهی در از بین بردن رادیکال های آزاد DPPH دارد و می تواند گونه های فعال اکسیژن را از بین ببرد، از تخریب کلاژن ناشی از رادیکال های آزاد جلوگیری کند و همچنین اثر ترمیم خوبی بر آسیب آنیون رادیکال آزاد تیمین دارد.

روی ضد پیری پودر سیستانچ فله کلیک کنید

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

مواد و روش ها: در این مطالعه، ما اگزوزوم‌ها را از hESCs، hiPSCs و سلول‌های بنیادی مزانشیمی بند ناف انسانی (hUC-MSCs) از طریق اولتراسانتریفیوژ کلاسیک و فیلتر 0.{2} میکرومتر و به دنبال آن شناسایی محافظه‌کارانه جدا کردیم. برچسب زدن برچسب توده پشت سر هم و کمیت پپتید نسبی بدون برچسب با هم پروتئومیک آنها را تعریف کردند. توالی یابی با توان بالا برای تعیین پروفایل های miRNA انجام شد. سپس، ما یک تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک برای شناسایی فرآیندهای بیولوژیکی غالب و مسیرهای تعدیل شده توسط محموله های اگزوزوم انجام دادیم. در نهایت، وسترن بلات و RT-qPCR برای شناسایی بارهای واقعی پروتئین ها و miRNA ها در سه نوع اگزوزوم انجام شد.

نتایج: بر اساس مطالعه ما، محموله های سه نوع اگزوزوم به فرآیندهای بیولوژیکی پیچیده کمک می کند. در مقایسه، اگزوزوم‌های hESC (hESC-Exos) در تنظیم رشد، متابولیسم و ​​ضد پیری برتر بودند و اگزوزوم‌های hiPSC (hiPSC-Exos) عملکردهای بیولوژیکی مشابهی با hESC-Exos داشتند، در حالی که اگزوزوم‌های hUC-MSCs (hUC-MSC-Exos) بیشتر به تنظیم ایمنی کمک کرد.

نتیجه گیری: داده های ارائه شده در مطالعه ما به تعریف مناظر پروتئین و miRNA سه اگزوزوم، پیش بینی عملکردهای بیولوژیکی آنها از طریق تحلیل سیستماتیک و جامع شبکه در سطح سیستم کمک می کند و کاربردهای بالقوه مربوطه را در زمینه های مختلف برای بهینه سازی انتخاب اگزوزوم در پیش بالینی و بالینی آشکار می کند. آزمایش های.

کلید واژه ها: سلول های بنیادی جنینی انسان، سلول های بنیادی پرتوان القا شده توسط انسان، سلول های بنیادی مزانشیمی بند ناف انسان، اگزوزوم ها، پروتئومیکس، miRNA

معرفی

وزیکول‌های خارج سلولی (EVs) وزیکول‌های کوچکی هستند که به طور فعال توسط سلول‌ها ترشح می‌شوند و عمدتاً حاوی اگزوزوم‌ها، میکرووزیکول‌ها (MVs) و اجسام آپوپتوز هستند [40، 56، 57]. آنها به طور گسترده در مایعات بدن مانند بزاق، شیر مادر، خون، مایع مغزی نخاعی، صفرا و ادرار توزیع می شوند [57]. در میان آنها، اگزوزوم ها دارای دو لایه لیپیدی با قطر 40-200 نانومتر، چگالی شناور 1.13-1.18 گرم در میلی لیتر در گرادیان ساکارز، و ظاهری فنجانی در زیر میکروسکوپ الکترونی هستند [21، 53]. ترکیبات فعال زیستی مختلف، از جمله پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک و لیپیدها، عملکرد ارتباط بین سلولی اگزوزوم ها را بین سلول ها فراهم می کنند [16، 17]. دولایه لیپیدی یک سد ظریف است که از محتویات اگزوزوم ها در برابر دژنراسیون آنزیمی مایع بدن محافظت می کند [49]. اگزوزوم های پایدار می توانند فرآیندهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیک پیچیده را از طریق فعالیت پاراکرین، از جمله رشد اندام و تولید مثل، ارائه آنتی ژن، ارتباطات عصبی، پاسخ ایمنی، تنظیم پیری و تکثیر سلولی واسطه کنند [57، 62].

تشکیل و آزادسازی اگزوزوم یک فرآیند کاملاً تنظیم‌شده است و مرتب‌سازی محتویات محصور شده در اگزوزوم با بسیج پروتئین‌های مختلف صورت می‌گیرد [22، 47]. پروتئین های متعدد برای تشکیل اگزوزوم، که شامل مجموعه مرتب سازی اندوزومی مورد نیاز برای حمل و نقل (ESCRT)، تتراسپانین ها (CD9، CD63 و CD81)، ژن مرتبط با آپوپتوز 2-پروتئین متقابل X (Alix) و حساسیت تومور است، بسیار مهم هستند. ژن 101 (TSG101) [38، 55]. قاچاق درون سلولی اگزوزوم ها توسط فعالیت جمعی یک سری پروتئین، از جمله سوئیچ مولکولی RAB GTPases و پروتئین های اسکلت سلولی، مانند اکتین و توبولین انجام می شود [24]. متعاقباً، ترشح اگزوزوم توسط کمپلکس SNARE و خانواده سیناپتوتاگمین تکمیل می شود [22]. تحقیقات مشخص کرده اند که جوانه زدن و ریزش اگزوزوم ها به فعالیت کلسیم و جذب ESCRT بستگی دارد [15]. به عنوان یک پیام رسان، آزادسازی اگزوزوم در واکنش به فیزیولوژی سلولی و تغییرات پاتولوژیک، مانند فعال شدن، تغییر pH، هیپوکسی، آسیب تشعشع یا استرس سلولی در تداخل سلولی نقش دارد [61].

برای کشف اجزای اگزوزوم ها و عملکردهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیک احتمالی آنها، اغلب از تکنیک های پروتئومی، ترانسکریپتومی و دیگر برای مطالعه RNA ها و پروتئین های اگزوزوم گونه ها، بافت ها و سلول های مختلف استفاده می شود [44]. تجزیه و تحلیل پروتئومیک اگزوزوم معمولاً شامل سه مرحله است: جداسازی، خالص‌سازی و مشخصه‌یابی اگزوزوم‌ها، شناسایی اجزای پروتئین با استفاده از طیف‌سنجی جرمی و تجزیه و تحلیل داده‌های خام [14]. حالت سلولی به طور قابل توجهی بر ترکیب پروتئین و فراوانی اگزوزوم ها تأثیر می گذارد. در حال حاضر، تکنیک‌های کمی پروتئومیک برای تجزیه و تحلیل خصوصیات و فراوانی پروتئین برای روشن کردن مکانیسم تولید اگزوزوم و عمیق‌تر کردن درک ما از نقش‌های فیزیولوژیکی و پاتولوژیک اگزوزوم‌ها در سلول‌ها استفاده می‌شود [39]. در میان آن‌ها، فناوری‌های پروتئومیک کمی مبتنی بر طیف‌سنجی جرمی به طور گسترده استفاده می‌شوند، که عمدتاً شامل روش‌های بدون برچسب و نشان‌دار ایزوتوپ پایدار می‌شود [13، 42]. miRNA ها مولکول های زیست فعال کوچکی هستند که ارتباط نزدیکی با فعالیت های مختلف زندگی دارند. تکنیک توالی یابی با توان عملیاتی بالا با حساسیت و دقت بالا مشخص می شود و کاربرد گسترده ای در توالی یابی miRNA (18-30 nt) دارد [6]. با توجه به توسعه فناوری فعلی، هیچ مانعی برای تشریح پروفایل های پروتئین و miRNA اگزوزوم ها وجود ندارد.

hESCها و hiPSCها پتانسیل تمایز بالایی دارند [36]. با این حال، کاربرد مستقیم آنها در درمان به دلیل خطر بدخیمی و مسائل اخلاقی محدود است [31]. در مقابل، سلول های بنیادی مزانشیمی (MSCs) کاربرد وسیع تری برای مداخله در چندین بیماری در محیط های بالینی دارند [8]. با این حال، استفاده مستقیم از آنها هنوز با چندین محدودیت، از جمله نرخ بقای کم، رد ایمنی، و مسائل ایمنی مواجه است [8، 43]. در حال حاضر توجه زیادی به اگزوزوم ها به دلیل امنیت زیستی، پایداری، غیر آنئوپلوئیدی و ایمنی زایی پایین آنها شده است [51]. مطالعات قبلی مقایسه اجزای سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق شده از بافت های مختلف و اگزوزوم های آنها حاوی پروفایل های پروتئومی و miRNA را مستند کرده اند [59]. گونگ و همکاران همچنین شبکه تنظیمی وزیکول‌های خارج سلولی hESC (EVs) را از نظر پروتئوم، اما فقط در مسیرهای مرتبط با پیری بدون تمرکز بر روی دیگران به تصویر می‌کشد [19]. کوستا و همکاران اطلس پروتئومی EV hiPSCs مشتق شده از فیبروبلاست های پوست ختنه گاه انسان (HFFs) را بافتند [45]. اگرچه این مطالعات تا حدی اجزای پروتئین EVs را گزارش کرده‌اند، اما آنها صرفاً بر روی اگزوزوم‌ها تمرکز نکرده‌اند و آنالیز پروتئومی جامع آنها به وضوح بیان نشده است. به طور خاص، پروفایل های miRNA هنوز توصیف نشده اند. برای پرداختن به این موضوع، اگزوزوم‌های جدا شده از hESCs، hiPSCs و hUC-MSCs در مطالعه حاضر برای بررسی بیشتر با هدف قرار دادن پروفایل‌های پروتئوم و miRNA انتخاب شدند تا بینش‌های جدیدی برای تحقیقات و کاربردهای بالینی خود به دست آورند.

مواد و روش ها

تهیه و شناسایی اگزوزوم ها

hESCها و hiPSCها در محیط ncTarget (شماره گربه RP{20}}1020؛ Nuwacell. Ltd، چین) کشت شدند، در حالی که نسل سوم hUC-MSCها در محیط hMSC ماموریتی بدون سرم (گروه شماره. RP02010؛ Nuwacell. Ltd، چین). سپس، 350 میلی لیتر از مایع رویی سلول ها در فاز رشد لگاریتمی (~80 درصد تلاقی) برای خالص سازی اگزوزوم جمع آوری شد. اگزوزوم ها با یک سری سانتریفیوژ و اولتراسانتریفیوژ شناسایی شده استخراج شدند، همانطور که قبلاً توضیح داده شد [34، 52]. به طور خلاصه، محیط های شرطی شده (CM) جمع آوری شد و تحت سانتریفیوژ گرادیان (300×g برای 10 دقیقه، 2000×g برای 15 دقیقه، 10، 000×g برای 30 دقیقه) قرار گرفتند تا جدا شوند. بقایای سلولی. اگزوزوم ها از رویی جمع آوری شده در 100، 000×g به مدت 70 دقیقه با استفاده از روتور Ti45 (بکمن کولتر، ایالات متحده آمریکا) پلت شدند. سپس با استفاده از فیلتر غشایی 0.{21}}میکرو متری MF-Millipore™ (سیگما، ایالات متحده آمریکا) در PBS برای فیلتراسیون بعدی معلق شدند. فیلتر به مدت 70 دقیقه تحت اولتراسانتریفیوژ در 100000×g قرار گرفت. گلوله اگزوزوم نهایی برای تجزیه و تحلیل بعدی در PBS معلق شد. یک سیستم پراکندگی نور پویا (DLS) (Wyatt Technology، ایالات متحده آمریکا) برای اندازه گیری غلظت و اندازه اگزوزوم های جدا شده استفاده شد.

میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM)

اسکن TEM برای توصیف مورفولوژی اگزوزوم های جدا شده، همانطور که قبلا توضیح داده شد، انجام شد. اگزوزوم های معلق مجدد (1 میکروگرم در 10 میکرولیتر PBS) روی یک شبکه مسی پوشش داده شده با کربن ({3}} مش) کاشته شدند و اجازه داده شد به مدت 2 دقیقه روی آن جذب شوند و سپس دو بار شستشو با آب تقطیر شده دو بار انجام شد. سپس شبکه ها با 8 میکرولیتر محلول اورانیل استات 2 درصد به مدت 1 دقیقه به صورت منفی رنگ آمیزی شدند. پس از خشک شدن طبیعی، نمونه ها با استفاده از سیستم Tecnai Spirit (Thermo Fisher، ایالات متحده آمریکا) در ولتاژ 120 کیلوولت مورد بررسی قرار گرفتند.

پراکندگی دینامیک نور

توزیع اندازه اگزوزوم ها از طریق تجزیه و تحلیل ردیابی نانوذرات با استفاده از یک پراکنده نور پویا (Wyatt Technology، ایالات متحده آمریکا) طبق دستورالعمل های سازنده ({0}}DPN)، همانطور که قبلاً گزارش شد، توصیف شد[23]. به طور خلاصه، پلت اگزوزوم در 100 میکرولیتر PBS معلق شد. ده، 50 میکرولیتر از اگزوزوم های فوق به 1450 میکرولیتر PBS اضافه شد و به مدت 30 ثانیه گرداب شد. اگزوزوم ها (1.5 میلی لیتر) برای تعادل در دمای 25 درجه به مدت 30 ثانیه به یک کووت یکبار مصرف منتقل شدند. مقدار ضریب شکست پراکنده 1.37 بود، و هر دو میانگین Z و polydispersity (PDI) اندازه ذرات اگزوزوم را تعیین کردند. اندازه گیری های مستقل از درخت برای هر نمونه انجام شد.

برچسب زدن برچسب جرم پشت سر هم (TMT) و تجزیه و تحلیل کمی پپتید نسبی بدون برچسب (LFQ)

Total protein was extracted from exosomes, and the concentration was quantified using the Bradford method.  The samples were separated by 12.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).  The protein suspensions were digested with trypsin (cat.   no. 9002-07-7; Sigma, USA) in 40 μL of tetraethylammonium bromide (TEAB) buffer for 12  h at 37  °C and then labeled with TMTsixplex™ isobaric label reagent set (cat. no. 90061; Thermo Fisher, USA). TMT-labeled peptides were fractionated by reversed-phase chromatography using an Agilent 1260 Infinity II HPLC system  (Agilent Technology, USA). LC-MSC/MS analysis was performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. (Hangzhou,  China). Briefly, the analysis was completed using the combination of a Q Exactive Plus mass spectrometer and Easy nLC (Thermo Fisher, USA). Survey scans were acquired at a resolution of 70,000 at m/z 200. MS/MS   spectra were captured by the MASCOT engine using the built-in software Proteome Discoverer 2.4. Label-free relative peptide quantification analysis was also performed by LC-Bio Technology Co., Ltd. as previously reported  [27]. Briefly, the digested proteins of exosomes were separated by HPLC and detected by mass spectrometry.  Raw files from technical and biological replicates were filtered, de novo sequenced, and assigned with protein ID   using PEAKS 8.0 by searching against the human SwissProt database. Tree-independent exosome samples were subjected to TMT or label-free assay. The final protein profiles of exosomes were determined by overlapping the data of TMT (mascot score>60, abundance>100 و P<0.05) and label-free (at least two tests results>0 و P<0.05).

Differentially expressed proteins (DEPs) were considered valid after the data were normalized by protein loading and differential p-value false discovery rates (FDR) corrected [30]. In particular, the proteins with log2|fold change|>1 (|log2FC|>1) و همچنین اهمیت آماری (P<0.05), were classified as enriched in exosomes.

تجزیه و تحلیل پروفایل miRNA

RNA کل از اگزوزوم های جدا شده با استفاده از کیت جداسازی miRNA میروانا (شماره گربه AM1560؛ ترمو فیشر، ایالات متحده آمریکا) استخراج شد. نمونه های RNA تحت بازرسی کیفیت برای سنجش ریزآرایه miRNA انجام شده توسط LC-Bio Technology Co., Ltd. تجزیه و تحلیل داده های خام همانطور که قبلا گزارش شده بود انجام شد [9]. miRNAهای بیان شده متفاوت به عنوان miRNAهای کاندید در مقدار p انتخاب شدند<0.05 and |log2FC|>2. Data were omitted if they corresponded to questionable miRNAs, according to previous reports or in-house validated miRNAs [12]. The miRNA target genes were determined by the overlap of prediction of Targetscan and miRanda databases under the restriction of threshold value>90 (Targetscan) و حداکثر انرژی آزاد<−10 (miRanda).

تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک

داده‌های خام با استفاده از بسته نرم‌افزار Maxquant (نسخه 1.6.{2}}) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و داده‌های Swiss-Prot{4}}به‌عنوان مرجع (20600 پروتئین) تنظیم شدند (شناسه پروتئوم: UP000005640) . پروتئین های شناسایی شده بر اساس اصطلاحات KOBAS [60] به هستی شناسی ژن (GO) و دایره المعارف ژن ها و ژنوم های کیوتو (KEGG) نگاشت شدند تا خواص بیولوژیکی و عملکردی آنها تعیین شود. نرم افزار Cytoscape و بسته igraph در نرم افزار R (نسخه 3.6.1) برای ترسیم شبکه در هم تنیده پروتئین های اگزوزوم یا miRNA ها بین مسیرهای سیگنالینگ استفاده شد.

تحلیل آماری

همه آزمایشات در سه تکرار انجام شد. تکرارپذیری کمی پروتئین ها و miRNA ها از طریق تجزیه و تحلیل مؤلفه های اصلی (PCA)، انحراف استاندارد نسبی و ضریب همبستگی پیرسون افزایش یافت. نتایج با استفاده از آزمون t غیر جفتی استودیو مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. داده ها به عنوان میانگین خطای استاندارد میانگین (SEM) بیان می شوند. مقادیر P در *P از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد<0.05, **P<0.01, and ***P<0.001.

نتایج

جداسازی و شناسایی اگزوزوم ها

کشت و شناسایی سه سلول بنیادی پرتوان انسانی در فایل اضافی 1 توضیح داده شد. اگزوزوم ها از محیط های شرطی شده سه نوع سلول بنیادی جدا شدند (پرونده اضافی 1: شکل S1) و بر اساس مورفولوژی، اندازه ذرات، غلظت، شناسایی شدند. و نشانگرهای سطح [19]. TEM نشان داد که این اگزوزوم ها مورفولوژی فنجانی شکل دارند (شکل 1A)، و DLS نشان داد که توزیع اندازه آنها در 50-200 نانومتر است (شکل 1B). وسترن بلات نشان داد که اگزوزوم های جدا شده نشانگرهای مثبت CD63، TSG101 و HSP70 را دارند اما نشانگر منفی کالکسین را ندارند (شکل 1C). هر hESC بازده اگزوزومی مشابه هیPSCها داشت و هر دو بالاتر از hUC-MSCها بودند (شکل 1D). نتایج این نشان می دهد که اگزوزوم های نماینده بدون تفاوت در شکل دستگیر شدند. با این حال، تفاوت‌هایی بین غلظت اگزوزوم‌های جدا شده از سه نوع سلول بنیادی مشاهده شد.

بیوانفورماتیک پروتئین های مشترک و با بارگذاری بالا

The SDS-PAGE and quantitative analyses revealed that while the protein concentrations of hESC-Exos and hiPSC-Exos were not different, they were both higher than those of hUC-MSC-Exos (Additional file 1: Fig.  S2A and B). The PCA plot indicated that exosomes had good uniformity within each group (Additional file 1:  Fig. S2C). The peptide fragments digested via enzymatic hydrolysis passed the quality inspection (Additional file 1: Fig. S2D–G) and then were subjected to the next bioinformatics analysis. Moreover, the proteins of three exosomes were mainly located in the extracellular region,   followed by the cytoplasm (Additional file 1: Fig. S2H).  To describe the protein profiles of the three types of exosomes, we integrated the TMT (Additional file 2) and label-free data (Additional file 3) under the conditions of mascot score>60 and abundance>100 (TMT assay)   and abundance of at least two repetitions>0 (آزمون بدون برچسب). در نهایت، به ترتیب 554، 437 و 911 دانه برای آنالیز پروفایل های پروتئینی hESC-Exos، hiPSC-Exos و hUC-MSC-Exos انتخاب شدند (فایل اضافی 1: شکل S3A). سپس این کاندیداها برای انتخاب پروتئین های مشترک تحت آزمایش نمودار ون قرار گرفتند (فایل اضافی 1: شکل S3B). تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک نشان داد که 303 پروتئین مشترک بر تنظیم در این مسیرهای سیگنالینگ از جمله تنظیم اسکلت سلولی اکتین، چسبندگی کانونی، PI3K-AKT، متابولیسم کربن و غیره غالب هستند (فایل اضافی 1: شکل S3C). تجزیه و تحلیل GO همچنین نشان داد که پروتئین های مشترک در اگزوزوم خارج سلولی، غشاء، اتصال پروتئین و ناحیه خارج سلولی غنی شده بودند (پرونده اضافی 1: شکل S3D).

Furthermore, the top-loaded proteins were selected from the candidates with high FDR confidence (TMT   assay) and abundance of each repetition>0 (آزمون بدون برچسب) (شکل 2A). بر اساس این نتایج، 163، 187 و 451 پروتئین به ترتیب در hESC-Exos، hiPSC-Exos، و hUC-MSC-Exos غربالگری شدند (پرونده اضافی 1: شکل S3E). سپس منحنی فراوانی بیان سه نوع اگزوزوم را توصیف کردیم و ده نماد ژنی برتر پروتئین های بارگذاری شده در اگزوزوم ها را شناسایی کردیم (شکل 2B). Thپروتئین‌های با بارگذاری بالا بر اساس الگوریتم KOBAS تحت بیوانفورماتیک قرار گرفتند. پروتئوم های سه نوع اگزوزوم همگی در یک شبکه تنظیمی مسیر سیگنالینگ پیچیده درگیر بودند و سپس 20 مسیر برتر بر اساس مقدار -log10 (P-value) مرتب شدند (شکل 2C-E). همه پروتئوم ها در تعامل گیرنده ماتریکس خارج سلولی (ECM) و مسیرهای سیگنالینگ PI3K-AKT غنی شدند. تجزیه و تحلیل برهمکنش پروتئین-پروتئین (PPI) نشان داد که پروتئین های با بارگذاری بالا در هر دو hESC-Exos و hiPSC-Exos بودند.در چرخه سلولی و مسیر متابولیک غنی شده است، در حالی که پروتئین های بارگذاری شده از بالا در hUC-MSC-Exos در مسیرهای مربوط به تنظیم ایمنی غنی شده بودند (شکل 2F-H).

مقایسه دوتایی پروتئومیکس اگزوزوم

برای ارزیابی تفاوت بین هر دو پروتئوم اگزوزوم، ما یک نمودار ون ساختیم تا خوشه‌های ژنی منحصربه‌فرد و همپوشانی کدکننده پروتئین را شناسایی کنیم. سپس ژن‌های کدکننده پروتئین مشترک تحت آنالیز نقشه آتشفشانی و حرارتی و GSEA قرار گرفتند و پروتئین‌های بیان شده متفاوت در P فیلتر شدند.<0.05 and  |log2FC|≥1. Comparison of hESC-Exos and hiPSC-Exos  (Additional file 1: Fig. S4A) revealed that their unique clusters were both enriched in ECM-receptor interaction and complement and coagulation cascades (Additional file 1: Fig. S4B and C) while overlapping clusters participated in multiple signaling pathways, including metabolic, cell cycle, and Hippo pathways (Fig. 3A). Significant differentially expressed protein-coding genes are presented in the volcano plot (Fig. 3 B). Heatmap analysis revealed that Cluster 1 proteins related to developmental biology, TGF-β signaling, and pluripotency regulation were enriched in hESC-Exos. Proteins in Cluster 2,   which were mainly enriched in hiPSC-Exos, were related to taurine and hypotaurine metabolism, RNA transport,   thiamine metabolism, and folate biosynthesis (Fig. 3 C).  GSEA further emphasized the more important role of hESC-Exos in developmental biology and cell cycle compared to hiPSC-Exos (Additional file 1: Fig. S5).

مقایسه بین hESC-Exos و hUC-MSC- 1: شکل S4 D) نشان داد که خوشه های ژن کد کننده پروتئین منحصر به فرد hESC-Exos عمدتاً در EGFR، TGF-، چرخه سلولی، تنظیم پرتوانی و Wnt دخیل بودند. سیگنالینگ (پرونده اضافی 1: شکل S4E). در مقابل، خوشه های منحصر به فرد hUC-MSC-Exos در بسیاری از مسیرهای سیگنالینگ مرتبط با تنظیم ایمنی مانند سیستم کمپلمان، تنظیم التهاب و عفونت میکروبی غنی شدند (فایل اضافی 1: شکل S4F). خوشه های همپوشانی در تعامل گیرنده ECM، آبشارهای مکمل و انعقاد و سیگنال دهی PI3K-AKT بسیار غنی شده بودند (شکل 3D). نمودار آتشفشان تفاوت بین hESC-Exos و hUC-MSC-Exos را نشان می دهد (شکل 3E). پروتئین‌های تنظیم‌شده در hUC-MSC-Exos (خوشه 1) عمدتاً در پاسخ مکمل، فعالیت سلول‌های کشنده طبیعی و سیگنال‌دهی Rap1 و PPAR نقش داشتند. در مقابل، پروتئین‌های تنظیم‌شده hESC-Exos عمدتاً در سیگنال‌دهی PI3K-AKT، MAPK و AMPK دخیل بودند (شکل 3F). GSEA توانایی تنظیمی بالاتر hiPSC-Exos را در پرتوانی (پرونده اضافی 1: شکل S6A و D) و hESC-Exos در تنظیم ایمنی، از جمله سمیت سلولی با واسطه سلول‌های کشنده طبیعی (پرونده اضافی 1: شکل S6B و E) تأیید کرد. و تنظیم COVID{37}}SARS-CoV2 (پرونده اضافی 1: شکل S6C و F).

مقایسه hiPSC-Exos و hUC-MSC-Exos (فایل اضافی 1: شکل S4G) نشان داد که مجموعه ژن منحصربفرد کدکننده پروتئین hiPSCExos به طور قابل توجهی با متابولیسم انتهای غیرهمولوگ، TGF- و ویتامین B6 مرتبط است (اضافی) فایل 1: شکل S4H)، در حالی که فایل hUC-MSC-Exos عمدتاً در مسیرهای مربوط به تنظیم ایمنی درگیر بود (پرونده اضافی 1: شکل S4I). پروتئین های همپوشانی آنها همچنین در تنظیم فعل و انفعالات گیرنده ECM، آبشارهای مکمل و انعقاد، و سیگنال دهی PI3K-AKT (شکل 3G) شرکت داشتند. نمودار آتشفشان پروتئین های متفاوت بیان شده را نشان می دهد (شکل 3H). پروتئین های خوشه 1 در نقشه حرارتی نشان داد که hUCMSC-Exos عمدتاً پاسخ ایمنی و مسیر سیگنالینگ AMPK را تنظیم می کند در حالی که hiPSC-Exos عمدتاً چرخه سلولی و مسیرهای سیگنالینگ انسولین، Hippo و mTOR را تنظیم می کند (شکل 3 I). GSEA بیشتر از نقش غالب hiPSC-Exos در تنظیم فرآیندهای توسعه (پرونده اضافی 1: شکل S7A و D) و حفظ پرتوانی (فایل اضافی 1: شکل S7B و E) پشتیبانی کرد، در حالی که hUC-MSC-Exos بیشتر در فرآیند تنظیم ایمنی نقش دارد (پرونده اضافی 1: شکل S7C و F).

بیوانفورماتیک پروتئوم های همپوشانی

در مرحله بعد، پروتئوم های مشترک سه نوع اگزوزوم را بررسی کردیم. در مجموع، 309 ژن کد کننده پروتئین (شکل 4A) تحت آنالیزهای GO و KEGG قرار گرفتند. نتایج نشان داد که مجموعه‌های ژن کدکننده پروتئین مشترک در بین سه نوع اگزوزوم عمدتاً در فعالیت‌های خارج سلولی و فرآیندهای بیولوژیکی از جمله فرآیندهای متابولیک پروتئین سلولی، اتصال گیرنده سیگنالینگ، اتصال ATP، اتصال NAD، بهبود زخم و فرآیندهای متابولیک لیپید نقش دارند. 4B). آنها همچنین در ساخت شبکه های نظارتی پیچیده مسیرهای سیگنالینگ مانند PI3K-AKT، گلیکولیز/گلوکونئوژنز، کرگدن، اکسی توسین، HIF{7}}، چرخه سلولی و مسیرهای AMPK مشارکت داشتند (شکل 4C). روابط نظارتی پیچیده ای بین این مسیرهای سیگنالینگ پروتئومی و متعارف وجود دارد (شکل 4D). نمودار حباب نشان دهنده فراوانی متفاوت هر خوشه پروتئین در مسیر سیگنال دهی متعارف است. در حالی که hESC-Exos و hiPSC-Exos ممکن است توانایی های تنظیمی قوی تری نسبت به hUC-MSC-Exos از نظر چرخه سلولی و مسیرهای سیگنال دهی AMPK داشته باشند، hUC-MSC-Exos ممکن است اثرات نظارتی برجسته ای بر مسیرهای سیگنال دهی VEGF و NF-kB داشته باشد (A فایل 1: شکل S8).

تجزیه و تحلیل نقشه حرارتی بیشتر تفاوت‌ها را در بیان پروتئین‌های مشترک نشان داد (شکل 4E). در خوشه A، پروتئین های درگیر در مسیرهای سیگنالینگ گیرنده PI3K-AKT، Hippo، VEGF و سلول B در hUC-MSCExos و hESC-Exos غنی شدند. پروتئین‌های خوشه B عمدتاً در تنظیم سیگنال‌دهی PPAR، متابولیسم کلسترول و تولید IgA شرکت داشتند و در hESC-Exos تخلیه شدند. hUC-MSC-Exos عمدتاً حاوی پروتئین های Cluster C بود که پاسخ کمپلمان، عفونت میکروبی، سیگنال دهی HIF{9}}، سیگنال دهی MAPK، مسیرهای متابولیک و مسیر NF-kB را تنظیم می کرد. پروتئین های Cluster d که در hiPSC-Exos غنی شده بودند، در تنظیم سیگنال دهی Ras، فسفوریلاسیون اکسیداتیو و سیگنال دهی mTOR شرکت داشتند. پروتئین‌های Cluster e هم در hiPSC-Exos و هم در hESC-Exos نسبت به hUC-MSCExos فراوان‌تر بودند و در فرآیندهای متابولیکی متعددی مانند چرخه سیترات، چرخه سلولی، سیگنال‌دهی انسولین، متابولیسم اسیدهای چرب و سیگنال‌دهی AMPK نقش داشتند. . پروتئین‌های Cluster f در تنظیم بازجذب کلسیم، گلیکولیز/گلوکونئوژنز، سیگنال‌دهی آدرنرژیک و متابولیسم پیرووات شرکت داشتند و در هر دو hUC-MSCExos و hiPSC-Exos تخلیه شدند. پروتئین ها در خوشه های مختلف در فایل اضافی 4 فهرست شده اند.

پروفایل های miRNA از سه نوع اگزوزوم

برای بررسی پروفایل های miRNA سه نوع اگزوزوم، RNA کل از اگزوزوم ها جدا شد تا انتهای 5' و 3' برای رونویسی معکوس بعدی جفت شود. cDNA به دست آمده برای ساخت کتابخانه و آزمایش گسترده استفاده شد. عدد یکپارچگی RNA (RIN) در hESC-Exos، hiPSC-Exos، و hUC-MSC-Exos به ترتیب 2.7، 2.6 و 2.6 بود (پرونده اضافی 1: شکل S9A). تعیین غلظت RNA نشان داد که hESC-Exos بر بار RNA غالب است و به دنبال آن hiPSC-Exos و hUC-MSCExos قرار دارند (پرونده اضافی 1: شکل S9B). ضریب همبستگی پیرسون (پرونده اضافی 1: شکل S9C) و PCA (پرونده اضافی 1: شکل S9D) برای ارزیابی کمی تکرارپذیری miRNA ها استفاده شد. از نقشه های حرارتی برای نشان دادن miRNA های متفاوت بیان شده در سه نوع اگزوزوم (فایل اضافی 1: شکل S9E) و تعداد miRNA های بیان شده متفاوت در P استفاده شد.<0.05 or 0.01,   was evaluated between each two exosome types (Additional file 1: Fig. S9F). Based on the sequencing results, the top 20 miRNAs in each of the three exosome types were identified (Fig. 5 A–C). In hESC-Exos, has-miR-302 dominated the read counts and comprised has-miR-302b-3p,   has-miR-302a-5p, and has-miR-302d-3p (Fig.  5A). The three miRNAs with the highest read counts were has-miR- 372-3p, has-miR-371a, and has-miR-302a in hiPSC-Exos and has-miR-21-5p (Fig.  5B), has-miR-146a-5p, and hasmiR-320a-3p in hUC-MSC-Exos (Fig. 5C).

برای بررسی miRNA های درگیر در فرآیندهای بیولوژیکی، miRNA های بالایی در P فیلتر شدند<0.05 and read count>1000 برای پیش بینی بیشتر ژن هدف. سپس ژن های غنی شده تحت آنالیزهای GO و KEGG قرار گرفتند. نتایج نشان داد که miRNA های hESC-Exos به طور قابل توجهی بر فرآیندهای زیر تأثیر می گذارد: Rap1، PI3K-AKT، کلسیم، Hippo، cAMP، ErbB، Foxo، چرخه سلولی، مسیر سیگنالینگ AMPK و غیره (تجزیه و تحلیل KEGG) (شکل 5D)، و چرخه سلولی، توسعه ارگانیسم های متعدد، انتقال سیگنال درون سلولی، تمایز سلولی، پیری، سیگنال دهی Wnt و متابولیسم اسیدهای چرب. (فرآیند بیولوژیکی) (شکل 5G). غنی سازی ژن هدف miRNA های hiPSC-Exos نشان داد که فرآیندهای زیر به طور قابل توجهی تنظیم می شوند: PI3K-AKT، Rap1، Ras، کلسیم، Hippo، cAMP، و مسیر سیگنالینگ cGMP-PKG و غیره (تجزیه و تحلیل KEGG)، و چرخه سلولی، رشد ارگانیسم های متعدد، فسفوریلاسیون، تمایز سلولی، مهاجرت سلولی و پاسخ به هیپوکسی. (فرایند بیولوژیکی) (شکل 5H). در شبکه تنظیمی miRNA های hUC-MSC-Exos، محتمل ترین فرآیندهای بیولوژیکی عبارت بودند از: Rap1، Ras، PI3K-AKT، کلسیم، cAMP، Hippo، چرخه سلولی، JAK-STAT و مسیر سیگنالینگ HIF{19}} . (تجزیه و تحلیل KEGG) (شکل 5F)، و فسفوریلاسیون، انتقال سیگنال درون سلولی، اتصال ATP، تقسیم سلولی، متابولیسم لیپید، تحریک همزمان سلول T، بهبود زخم، اتصال NF-kB و پاسخ التهابی. (فرایند بیولوژیکی) (شکل 5 I). شبکه پنج miRNA برتر و مسیرهای تنظیمی آنها نیز به تصویر کشیده شد (فایل اضافی 1: شکل S10).

【برای اطلاعات بیشتر:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】