وضعیت فعلی محافظت عصبی در بیماری مادرزادی قلب قسمت 2

سپس تصاویر میکروسکوپی با استفاده از نرم افزار ImageJ (موسسه ملی بهداشت، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا) تحت محاسبه تصویر قرار گرفتند. سیگنال Hsp60 در "x" ضرب شد.

Hsp60 یک مولکول پروتئینی مهم است که نقش بیولوژیکی مهمی در بدن انسان دارد. تحقیقات در سال های اخیر نشان داده است که وجود Hsp60 ارتباط نزدیکی با حافظه انسان دارد.

Hsp60 یک پروتئین چپرون مولکولی است که عمدتاً در تاخوردگی، باز شدن، تثبیت و تجزیه پروتئین نقش دارد. این فرآیندها برای متابولیسم طبیعی و عملکرد سلولی بدن انسان بسیار مهم هستند. در عین حال، Hsp60 همچنین دارای اثرات آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و تعدیل کننده سیستم ایمنی است و نقش زیادی در حفظ سلامت انسان و تعادل سیستم ایمنی دارد.

تحقیقات نشان داده است که Hsp60 نقش مهمی در تشکیل و نگهداری حافظه دارد. سلول های مغز در طول فرآیند یادگیری و حافظه، تعداد زیادی مولکول Hsp60 تولید می کنند. این مولکول‌ها می‌توانند از سلول‌ها در برابر تداخل و آسیب محیط خارجی محافظت کنند تا از پیشرفت آرام یادگیری و حافظه اطمینان حاصل کنند. علاوه بر این، Hsp60 می‌تواند با تغییر در انتقال سیگنال سلول‌های مغزی و رشد نورون‌ها بر تفکر و رفتار انسان تأثیر بگذارد و تأثیر مثبتی بر شناخت و مقاومت در برابر استرس دارد.

اگرچه نقش Hsp60 اثرات مثبتی را بر بدن انسان نشان داده است، اما مردم همچنین باید بدانند که هم افراط و هم کمبود Hsp60 ممکن است اثرات منفی بر سلامت انسان داشته باشد. بنابراین، ما باید به طور فعال مکانیسم Hsp60 را در شرایط مختلف فیزیولوژیکی و پاتولوژیک بدن انسان بررسی و مطالعه کنیم تا جایگاه و نقش Hsp60 در سلامت انسان را بهتر درک کنیم. مشاهده می شود که ما نیاز به بهبود حافظه داریم و سیستانش دسرتیکولا می تواند حافظه را به میزان قابل توجهی بهبود بخشد، زیرا گیاه سیستانچ دسرتیکولا دارای اثرات آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و ضد پیری است که می تواند به کاهش اکسیداسیون و واکنش های التهابی در مغز کمک کند و در نتیجه از مغز محافظت کند. سلامت سیستم عصبی علاوه بر این، Cistanche deserticola همچنین می‌تواند رشد و ترمیم سلول‌های عصبی را افزایش داده و در نتیجه اتصال و عملکرد شبکه‌های عصبی را افزایش دهد. این اثرات می تواند به بهبود حافظه، توانایی یادگیری و سرعت تفکر کمک کند و همچنین ممکن است از ایجاد اختلالات شناختی و بیماری های عصبی جلوگیری کند.

برای بهبود حافظه کوتاه مدت، روی دانستن کلیک کنید

مقدار "x" به شرح زیر تعیین شد: کم کردن سیگنال Hsp60 تا شده "x" از سیگنال DNA میتوکندری در گروه کنترل، مقدار DNA میتوکندری را کمتر یا مساوی صفر کرد. سیگنال هیستون H2B در "y" ضرب شد.

مقدار "y" به شرح زیر تعیین شد: کم کردن سیگنال هیستون-H2B تا شده "y" از سیگنال هسته ای-DNA در گروه کنترل، مقدار DNA- هسته ای را کمتر از یک برابر صفر کرد. اگر سیگنال پس زمینه از ضرب زیاد شود، کنتراست تصویر ضرب شده را می توان برای شرایط یکسان در همه نمونه ها تنظیم کرد.

تصویر رنگ‌آمیزی dsDNA، منهای تصویر تنظیم‌شده Hsp6 ضرب شده و هیستون H2B، برای تجزیه و تحلیل بعدی استفاده شد. با استفاده از تابع "Adjust-Threshold"، این تصاویر باینریزه شدند. ما نقطه‌های dsDNA را در اندازه‌های 2 تا 20 میکرومتر مربع (دایره‌ای 0.1-1.0) انتخاب کردیم و با استفاده از تابع "تجزیه و تحلیل - تجزیه و تحلیل ذرات" شمارش شدند.

2.3. میکروسکوپ الکترونی

یک روز قبل از ترانسفکشن، سلول‌های HeLa با تراکم 600 سلول در میکرولیتر کاشته شدند. بیان ژن‌های مورد علاقه در سلول‌های HeLa با استفاده از Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) در معرف ترانسفکشن Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) خاموش شد. دستورالعمل سازنده (با غلظت نهایی RNA 10 نانومولار).

چهار روز پس از حذف siRNA، سلول‌ها تحت تثبیت قرار گرفتند. نمونه‌های کشت سلولی با 2% PFA و 2% گلوتارآلدئید در 0.1 مولار فسفاتبافر، pH 7.4، در دمای 37 درجه سانتیگراد تثبیت شدند، سپس در 4 قرار گرفتند. ◦ یخچال به مدت 30 دقیقه. نمونه ها در گلوتارآلدئید 2 درصد در بافر فسفات 1/1 مولار یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد تثبیت شدند. نمونه ها سه بار با بافر فسفات 1.1 مولار به مدت 30 دقیقه شسته و پس از تثبیت با 2 درصد اسمیم متتروکسید در بافر فسفات 0.1 مولار در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت.

نمونه‌ها محلول‌های اتانول تصفیه‌شده آب‌گیری شدند، به رزین (Quetol{0}}، Nisshin EM Co.، توکیو، ژاپن) منتقل شدند و در دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت پلیمریزه شدند. رزین های پلیمریزه شده با یک چاقوی الماسی با استفاده از اولترامیکروتوم (Ultracut UCT، Leica Microsystems، Wetzlar، آلمان) به مقاطع بسیار نازک 70- نانومتری بریده شدند و سپس بر روی شبکه های مسی سوار شدند.

مقاطع با اورانیل استات 2 درصد در RT به مدت 15 دقیقه رنگ آمیزی شدند و با آب مقطر شسته شدند و سپس با محلول رنگ آمیزی سرب (سیگما آلدریچ، توکیو، ژاپن) در RT به مدت 3 دقیقه رنگ آمیزی ثانویه انجام شد.

شبکه‌ها در زیر میکروسکوپ الکترونی عبوری مشاهده شدند (JEM{0}}Plus, JEOL Ltd.، توکیو، ژاپن) با ولتاژ شتاب 80 کیلو ولت (مغز گورخرماهی) یا 100 کیلو ولت (سلول)، و تصاویر با استفاده از دوربین دستگاه شارژ (CCD) (EM{4}}RUBY2, JEOL Ltd.) ضبط شد. .

2.4. میکروسکوپ ایمونوالکترونی

نمونه های روی دیسک های طلا در پروپان مایع در دمای -175 درجه سانتیگراد منجمد شدند. پس از انجماد این نمونه ها، آنها را با 1% اسید تانیک در اتانول و 2% آب مقطر در دمای 80- درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت جایگزین انجماد کردند.

سپس نمونه‌ها به مدت 4 ساعت در دمای 20- درجه سانتیگراد و سپس انکوباسیون در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت نگهداری شدند. سپس نمونه ها در اتانول بی آب 3 بار به مدت 30 دقیقه آبگیری شدند. هر بار، و به دنبال آن با یک مخلوط 50:50 از رزین اتانولند (LR سفید: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) در دمای 4◦C به مدت 1 ساعت نفوذ کنید. نمونه ها به رزین 100% تازه منتقل و در دمای 4 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انکوبه شدند و این عمل سه بار تکرار شد.

نمونه ها به رزین 100% تازه منتقل و در 50 ◦CO/N پلیمریزه شدند. رزین های پلیمریزه شده با برش فوق العاده نازک در 90 نانومتر با چاقوی الماسی با استفاده از اولترامیکروتوم (Ultracut UCT؛ Leica) برش داده شدند و مقاطع بر روی شبکه های نیکل قرار گرفتند. شبکه‌ها با آنتی‌بادی ضد dsDNA (35I9 DNA) (1/800، Abcam، Cat# ab27156، RRID: AB{10}}) در 1٪ BSA/PBS در 4 ◦CO/N انکوبه شدند، و به دنبال آن سه شستشو با 1% BSA/PBS به مدت 1 دقیقه.

آنها متعاقباً با این آنتی بادی ثانویه کونژوگه با ذرات طلای {{0}} نانومتری (پلی کلونالانتی بادی IgG ضد موش بز) به مدت 2 ساعت در RT انکوبه شدند. پس از شستشو با PBS، شبکه ها در بافر 2% گلوتارآلدئیدین 0.1 مولار کاکودیلات قرار داده شدند.

سپس توری ها خشک شده و با اورانیل استات 2 درصد به مدت 15 دقیقه و با محلول لکه ای سرب (سیگما آلدریچ) در دمای RT به مدت 3 دقیقه رنگ آمیزی شدند. شبکه ها از طریق میکروسکوپ الکترونی عبوری (JEM{4}}) مشاهده شدند پلاس؛ JEOLLtd.) در ولتاژ شتاب 100 کیلوولت. تصاویر دیجیتال با دوربین CCD (EM-14830RUBY2، JEOL Ltd.) به دست آمد.

3. نتایج

3.1. کاهش TFAM یا GBA باعث افزایش DNA میتوکندری نابجا می شود

ابتدا، نمونه‌ای از تشخیص DNA سیتوپلاسمی مشتق از میتوکندری در سلول‌های HeLa را نشان دادیم که در آن پروتئین TFAM توسط siRNA شکسته شد (شکل 1A). .

گزارش شده است که پلی مورفیسم توالی در این ژن با بیماری پارکینسون مرتبط است [21،22]. پس از 3 روز از حذف پروتئین TFAM، تعداد زیادی از نقاط DNA دو رشته ای در سیتوپلاسم سلول های HeLa شناسایی شد.

هیستون ها نشانگرهای مثبت برای DNA با منشاء هسته ای در سیتوپلاسم، و نشانگرهای منفی برای DNA میتوکندری و DNA با منشاء میتوکندری در سیتوپلاسم هستند [23]. این نقاط با هیستون ها محلی سازی نمی شوند، که نشان می دهد DNA مشتق از هسته نیستند. علاوه بر این، برخی از این نقاط سیتوپلاسمی و نابجا DNA با Hsp60، نشانگر ماتریکس میتوکندری، هم‌زمان محلی‌سازی نشدند، که نشان می‌دهد آنها خارج از میتوکندری هستند (شکل 1B، C).

میکروسکوپ الکترونی همچنین نشان داد که DNA نابجا از میتوکندری نشت کرده است (شکل 2A, B). به طور خلاصه، افزایش DNA‌های نابجا در سیتوپلاسم با کاهش TFAM به دلیل نشت DNA میتوکندری از میتوکندری بود. (شکل 1A).

GBA ژن مسبب بیماری گوچر است، اما جهش هتروزیگوت GBA نیز یک عامل خطر برای بیماری پارکینسون است [24]. بسیاری از نقاط DNA دو رشته‌ای در سیتوپلاسم سلول‌های HeLa پس از 3 روز کاهش پروتئین GBA شناسایی شدند. برخی از نقاط DNA با هیستون ها محلی سازی شدند که نشان می دهد DNA مشتق شده از هسته هستند.

سایر نقاط DNA با هیستون‌ها هم‌زمان موضعی نشدند، که نشان می‌دهد آنها DNA مشتق شده از هسته نیستند، بلکه DNA مشتق شده از میتوکندری هستند (شکل 1D). به طور خلاصه، افزایش نقاط DNA نابجا در سیتوپلاسم با ناک داون GBA حداقل تا حدی به دلیل نشت DNA میتوکندری از میتوکندری بود.

For more information:1950477648nn@gmail.com