اثربخشی آنتی اکسیدان های فرعی رژیم غذایی بر بیان ژن های CYP القایی و تغییرات بافتی در کبد و کلیه خوکچه های تغذیه شده با آفلاتوکسین B1 و اکراتوکسین A

edmund.chen@wecistanche.com

خلاصه:هدف از این مطالعه بررسی پتانسیل یک مخلوط محصول جانبی حاصل از صنعت روغن هسته انگور و خولان دریایی برای کاهش آسیب های مضر تولید شده توسط اکراتوکسین A و آفلاتوکسین B1 در کبد و کبد بود.کلیهسطح در خوک پس از از شیر گرفتن. چهل سر خوک دورگه TOPIGS{1}} پس از از شیر گرفتن به سه گروه آزمایشی (E1، E2، E3) و یک گروه کنترل (C) تقسیم شدند و به مدت 30 روز با جیره های آزمایشی تغذیه شدند. جیره پایه به عنوان شاهد و حاوی خوراک ترکیبی معمولی برای خوکچه های شروع کننده بدون مایکوتوکسین بود. گروه های آزمایشی به شرح زیر تغذیه شدند: E1 - رژیم غذایی پایه به اضافه مخلوط (1:1) از دو محصول جانبی (دانه انگور و کنجاله خولان دریایی). E2 - رژیم غذایی پایه که به طور تجربی با مایکوتوکسین ها (479ppb OTA و 62ppb AFB1) آلوده شده است. و E3 - رژیم غذایی پایه حاوی 5 درصد از مخلوط (1:1) دانه انگور و کنجاله خولان دریایی و آلوده به مخلوط OTA و AFB1. پس از 4 هفته، حیوانات ذبح شدند و نمونه‌های بافتی از کبد گرفته شد کلیه به منظور انجام بیان ژن و تجزیه و تحلیل بافت شناسی. تجزیه و تحلیل بیان ژن نشان داد که وقتی خوک‌های از شیر گرفته شده با رژیم غذایی آلوده تغذیه شدند، بیان اکثر ژن‌های تجزیه‌وتحلیل‌شده کاهش یافت. در میان خانواده CYP450، CYP1A2 ژنی بود که بیشترین کاهش تنظیم را داشت. با توجه به این نتایج، در کبد، ما دریافتیم که مایکوتوکسین ها باعث ایجاد تغییرات هیستومورفولوژیک در کبد وکلیهو بر سطح بیان CYP1A2، CYP2A19، CYP2E1 و CYP3A29 تأثیر داشت، اما ما تغییرات مهمی در سطح بیان ژن‌های CY4A24، MRP2 و GSTA1 تشخیص ندادیم.

کلمات کلیدی: خوکچه اثر آنتی اکسیدانی؛ افزودنی های خوراک؛ مایکوتوکسین ها؛ بیان ژن CYPs؛ کلیه؛ کلیه

مقدمه

مایکوتوکسین ها متابولیت های سمی ثانویه ای هستند که توسط گونه های خاصی از قارچ های رشته ای تولید می شوند. این ترکیبات با وزن مولکولی کم (تا 500 دا) می توانند انواع مواد خام را آلوده کرده و باعث افزایش خطر برای سلامت انسان و حیوان شوند [1]. تعداد مایکوتوکسین های مشخص شده و با اثرات شناخته شده نسبتاً کم است به دلیل وجود متابولیت های بسیار با پتانسیل سمی که توسط قارچ ها تولید می شوند [2-4]. آنها به پنج گروه، با ساختارهای شیمیایی خاص که اغلب در خوراک و غذا وجود دارند، طبقه بندی می شوند: تریکوتسن ها، زئارالنون، ​​اکراتوکسین ها، فومونیزین ها و آفلاتوکسین ها. قارچ های مولد مایکوتوکسین که در غذا و خوراک یافت می شوند به دو گروه تقسیم می شوند: قارچ هایی که قبل از برداشت غلات به آنها حمله می کنند، قارچ های مزرعه ای نامیده می شوند و قارچ هایی که تنها پس از برداشت رشد می کنند، به نام قارچ های انباری [5]. در سطح اروپا، مقررات و توصیه هایی در مورد حداکثر سطح پذیرفته شده برای شش نوع مایکوتوکسین که معمولاً در خوراک خوک ها یافت می شود وجود دارد: آفلاتوکسین ها، فومونیزین ها، اکراتوکسین ها، دئوکسی نیوالنول، توکسین T2 و زئارالنون [6-8]. در میان گونه‌های حیوانی مزرعه، خوک‌ها به دلیل قرار گرفتن در معرض علوفه‌های غلات به مایکوتوکسین‌ها بسیار حساس هستند [9]. متابولیسم خوکی در سم‌زدایی و دفع مایکوتوکسین‌ها مؤثر نیست، که خطر ابتلا به مایکوتوکسیکوز را افزایش می‌دهد. این حساسیت با سن، غلظت مایکوتوکسین ها در خوراک و مدت زمان قرار گرفتن در معرض نیز متفاوت است. کبد عضوی است که بیشتر تحت تأثیر مصرف این سموم قرار می گیرد [10]. علاوه بر این، این سموم نفوذپذیری سد اپیتلیال روده را در خوک و طیور افزایش می‌دهند که می‌تواند مستعد ابتلا به آنتریت نکروز [11] و کاهش ایمنی ذاتی باشد.

سیستانچ عملکرد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

آفلاتوکسین ها حاوی فراوان ترین مایکوتوکسین های موجود در مواد غذایی، دانه های روغنی، غلات، شیر، خاک، حیوانات و انسان هستند. همه انواع آفلاتوکسین‌ها از گونه‌های قارچی متعلق به جنس Aspergillus مشتق شده‌اند و جزو مضرترین مایکوتوکسین‌ها برای حیوانات و انسان به حساب می‌آیند [4، 1{14}} - 17]. همانطور که در بالا ذکر شد، در خوک‌های شیرده و خوک‌های در حال رشد، تکمیل و پرورش، اثرات بیولوژیکی اصلی آفلاتوکسین‌ها عبارتند از سرطان‌زایی، سرکوب سیستم ایمنی، جهش‌زایی، تراتوژنیسیته، کاهش راندمان تغذیه و افزایش وزن ضعیف، اختلال در کبد و تغییر پارامترهای بیوشیمیایی سرم، [1]. . اثرات شدید در خوکی می تواند منجر به هپاتیت حاد، خونریزی های سیستمیک، نفروز و مرگ شود [20] و همچنین کاهش مقاومت در برابر استرس [21]. برخی از نویسندگان همچنین نشان داده‌اند که خوکی‌هایی که با سطوح پایین آفلاتوکسین تغذیه می‌شوند، علائم ادم ریوی، کاهش مصرف خوراک و افزایش وزن بدن، و کاهش فعالیت‌های آنزیمی دخیل در دکربوکسیلاسیون اکسیداتیو، و همچنین پروتئین کل سرم، فشار خون و کاهش را نشان می‌دهند. تعداد کل لکوسیت ها [18، 22-24]. در این زمینه، طبق دستورالعمل کمیسیون اروپا 2003/100/EC، حداکثر میزان آفلاتوکسین B1 (AFB1) برای خوک ها 0.02 میلی گرم بر کیلوگرم تعیین شده است. اکراتوکسین ها متابولیت های ثانویه ای هستند که توسط گونه های قارچی متعلق به جنس Aspergillus و Penicillium تولید می شوند. نظرات متفاوتی در مورد مکانیسم های ژنوتوکسیک یا غیر سمی سمیت اکراتوکسین ها منتشر شده است [25، 26]. مطالعات in vitro و in vivo نشان داد که ترکیبات اضافی DNA مخصوص گوانین-OTA برای بیش از 16 روز درکلیهسطح، در حالی که در کبد و طحال، پس از 5 روز برداشته شدند [27]. به همین دلیل اثرات سمی و سرطان زا اصلی آنها در آن اعمال شدکلیه[28].

اکثر متابولیت های اکراتوکسین های فاز اول و دوم سم زدایی سمیت کمی دارند. در معده، بخشی از اکراتوکسین ها توسط آنزیم های پروتئولیتیک به اکراتوکسین هیدرولیز می شود. امکان دیگر برای هیدرولیز آنها باز شدن حلقه لاکتون در شرایط قلیایی روده است که در نتیجه ترکیبی با سمیت بالا ایجاد می شود. به دلیل اتصال قوی به آلبومین، حذف اکراتوکسین ها توسط فیلتراسیون گلومرولی ناچیز است و دفع عمدتاً از طریق ترشح لوله ای انجام می شود. تحلیل لوله ای تا حدی مسئول تجمع داخل سلولی اکراتوکسین ها در نظر گرفته می شود [29،30]. به طور کلی، در حیوانات مزرعه ای، اکراتوکسین ها پس از مصرف به سرعت از طریق دستگاه گوارش (معده و قسمت نزدیک ژژنوم) به صورت غیرفعال جذب می شوند، که به دلیل میل ترکیبی بالای اتصال اکراتوکسین ها به پروتئین های پلاسما، و به شکل غیریونیزه می شود. ، که ماندگاری آنها در بدن را توضیح می دهد. در سرم خوک، اکراتوکسین ها به طور خاص به پروتئین هایی با جرم مولکولی کمتر از 20 کیلو دالتون متصل می شوند و به آنها اجازه می دهند از غشای پایه گلومرولی عبور کرده و اثرات نفروتوکسیک را اعمال کنند. اوکراتوکسین ها نیز در کبد و ماهیچه ها تجمع می یابند. با این حال،کلیه هامحل اصلی ذخیره اکراتوکسین ها هستند، با بازجذب آنها در لوله های پروگزیمال و دیستال که به ماندگاری بدن و افزایش سمیت کلیوی کمک می کند [27،31]. از سوی دیگر، هنگامی که AFB1 در سطح روده جذب شد، به کبد می رسد و در آنجا توسط آنزیم های متابولیزه کننده فاز I توسط هیدروکسیلاسیون، هیدراتاسیون، دمتیلاسیون و اپوکسیداسیون تبدیل می شود. سه واکنش اول متابولیت‌های غیرسمی تولید می‌کنند، در حالی که واکنش چهارم، اپوکسید AFB1-8،9 تولید می‌کند که ترکیب‌های اضافی را با DNA در محل N7 گوانین تشکیل می‌دهد [32]. همچنین، AFB1 می تواند با گلوتاتیون احیا شده در واکنشی که توسط گلوتاتیون-S-ترانسفرازها [33] و اسید گلوکورونیک [34] کاتالیز می شود، کونژوگه شود. دفع AFB1 عمدتاً از طریق مسیرهای صفراوی و به دنبال آن مسیر ادراری رخ می دهد [35].

یکی از مشکلات اصلی در کنترل مایکوتوکسین ها این است که بیش از یک نوع مایکوتوکسین به طور همزمان در یک دسته علوفه یا غلات وجود دارد. بنابراین، تغذیه خوک‌ها و خوک‌ها با خوراک آلوده با چندین نوع مایکوتوکسین، حتی اگر در غلظت‌های حداقلی باشند، به دلیل اثر هم افزایی آنها می‌تواند پیامدهای منفی متعددی ایجاد کند [36-40]. در این زمینه، کاهش و از بین بردن اثرات منفی مایکوتوکسین های موجود در خوراک خوک می تواند هزینه تولید و ضرر در صنعت خوک را کاهش دهد. تا به امروز، استراتژی های متعددی برای جلوگیری، کاهش یا حتی حذف آلودگی مایکوتوکسین از خوراک دام با روش های سم زدایی بیولوژیکی، شیمیایی و فیزیکی ایجاد شده است. این روش‌ها امکان تخریب مایکوتوکسین‌ها و متابولیت‌های مربوط به آن‌ها را فراهم می‌کنند و ارزش غذایی غذا را بدون وارد کردن سایر مواد با پتانسیل سمی به سیستم‌های بیولوژیکی حفظ می‌کنند [6،14،41]. آلودگی بیولوژیکی مایکوتوکسین ها با استفاده از مهار رقابتی توسط سویه های قارچ دیگر یا افزودن ترکیبات آنتی اکسیدانی در خوراک دام به منظور کاهش اثرات سمی مایکوتوکسین ها و/یا مهار رشد گونه های قارچ تولید کننده مایکوتوکسین راه حل خوبی است. پرکاربردترین روش برای مقابله با تأثیر منفی مایکوتوکسین ها بر حیوانات مزرعه، افزودن «میکوتوکسین بایندر» یا «تغییرکننده مایکوتوکسین» است که آلومینوسیلیکات هایی با ساختار متخلخلی هستند که قادر به جذب و به دام انداختن مایکوتوکسین ها هستند [42-44]. آنها برای آفلاتوکسین ها بسیار موثر هستند و فعالیت محدودی در برابر سایر انواع مایکوتوکسین دارند. با این حال، غیر اختصاصی بودن، ویتامین ها و عناصر کمیاب را نیز متصل می کنند و کمبودهایی را ایجاد می کنند [45-47]. افزودن برخی از آنتی اکسیدان های گیاهی در خوراک می تواند راه حل بهتری برای کاهش اثرات مضر مایکوتوکسین ها بر سلامت حیوانات باشد [48].

آنزیم های سیتوکروم P450، عمدتاً در کبد، دستگاه روده وکلیه،نقش مهمی در تبدیل زیستی فاز I بیگانه‌بیوتیک‌ها، به‌ویژه آنهایی که به خانواده‌های 1 و 3 تعلق دارند، ایفا می‌کنند [49]. مایکوتوکسین‌ها می‌توانند سوبستراها، مهارکننده‌ها یا محرک‌های این آنزیم‌های متابولیزه باشند. تغییرات در فعالیت خاص و القاپذیری سیتوکروم P450 در نهایت تغییر نسبی در متابولیسم یک بیگانه‌بیوتیک را تعیین می‌کند. مایکوتوکسین‌ها ممکن است بیان ژن این پروتئین‌ها را تغییر دهند و منجر به تغییر جذب و تبدیل زیستی مواد مغذی و سایر داروهای سوبسترا از خوراک شوند. با توجه به این موضوع، هدف از مطالعه حاضر بررسی پتانسیل یک مخلوط محصول جانبی مشتق شده از صنعت روغن Vitis vinifera (دانه انگور) و Hippophae rhamnoides (خلان دریایی) برای کاهش آسیب مضر ناشی از حضور همزمان اکراتوکسین A (OTA) بود. و آفلاتوکسین B1 (AFB1) در خوراک در کبد وکلیهسطح در خوک پس از از شیر گرفتن.

نتایج

ترکیب رژیم غذاییترکیب شیمیایی کنجاله محصولات جانبی نشان داد که کنجاله خولان دریایی از نظر پروتئین (به علاوه 4/38 درصد)، چربی (به علاوه 6/66 درصد) و کربوهیدرات ها و خاکستر کمتر از کنجاله انگور است (جدول 1).

تجزیه و تحلیل شیمیایی همچنین مشخصات متفاوتی از این دو محصول جانبی در اسیدهای چرب، فلاونوئیدها، اسیدهای فنولیک و مواد معدنی را نشان داد. بنابراین، کنجاله خولان دریایی نسبت به کنجاله انگور حاوی اسیدهای چرب اشباع شده (پالمتیک و پالمیتولئیک)، اسیدهای امگا{0}} (سیس اولئیک اسید) و اسیدهای امگا-3 (-لینولنیک اسید) است. . در مقابل، کنجاله هسته انگور دارای محتوای اسیدهای امگا{3} (لینولئیک اسید) بسیار بالایی است (67.35 درصد در مقایسه با 18.59 درصد در کنجاله خولان دریایی) (جدول 2).

هر دو محصول فرعی حاوی فلاونوئیدها و اسیدهای فنولیک هستند، ترکیبات فعال زیستی که به دلیل خواص آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و تعدیل کننده سیستم ایمنی شناخته شده اند [50، 51]. بنابراین، غلظت کل پلی فنل ها در کنجاله انگور (133.84 میلی گرم GAE/L) 74.8 درصد بیشتر از خولان دریایی (76.57 میلی گرم GAE/L) بود. با توجه به کلاس های مختلف پلی فنل ها، کنجاله انگور حاوی غلظت بیشتری از کاتچین و اسید وانیلیک نسبت به خولان دریایی است، در حالی که خولان دریایی از نظر روتین، کوئرسیترین، لوتئولین، اسید p-کوماریک و اسید فرولیک غنی تر است (جدول 3). با توجه به ترکیبات معدنی، کنجاله خولان دریایی نسبت به کنجاله انگور حاوی مقادیر بیشتری پتاسیم، منیزیم، آهن، منگنز و روی است. در مقابل، کنجاله انگور دو برابر کنجاله خولان دریایی حاوی مس بود. نکته قابل توجه غلظت بالای آهن از کنجاله خولان دریایی است (جدول 4).

عملکرد حیوانات

قرار گرفتن خوکچه های گروه E2 با مخلوط اکراتوکسین به همراه آفلاتوکسین B1 هیچ اثر نامطلوبی بر وزن بدن، افزایش وزن و مصرف خوراک نداشت، زیرا این تفاوت ها در مقایسه با گروه شاهد معنی دار نبود. در مقابل، تجویز جیره حاوی مخلوط محصولات جانبی به تنهایی (E1) وزن بدن خوکچه های تغذیه شده با این جیره را در مقایسه با گروه شاهد (1.63 ± 32.14 در مقابل 1.31 ± 27.09) و گروه E2 که با افراد آلوده تغذیه شده بود، به طور قابل توجهی افزایش داد. رژیم غذایی (1.63 ± 32.14 در مقابل 1.07 ± 28.72). لازم به ذکر است که گروه خوکچه های دریافت کننده خوراک آلوده و مخلوط فرآورده های جانبی در مقایسه با گروه خوک های مسموم با مایکوتوکسین تمایل به افزایش وزن داشتند، اگرچه این تفاوت معنی دار نبود. تجزیه و تحلیل پارامترهای بیوشیمیایی، که وضعیت کلی سلامت حیوانات و عملکرد کبد را مشخص می کندکلیه هامقادیر نرمال ثبت شده برای گروه سنی و وزنی خوکچه های از شیر گرفته شده است. هیچ تفاوت معنی داری بین گروه ها برای اکثر آنها مشخص نشد (جدول 5). با این حال، مخلوط مایکوتوکسین باعث افزایش فعالیت ALP و گاما GT در مقایسه با شاهد و کاهش فعالیت در سطح کنترل در گروه E3 دریافت کننده مخلوط محصول جانبی شد.

بافت شناسی کبد و کلیهتجزیه و تحلیل میکروسکوپی نوری کبدهای گروه E2، تغذیه شده با رژیم غذایی پایه آلوده به مخلوط OTA و AFB1، مناطق کانونی نکروز، اتساع سینوسی و نفوذ پارانشیمی التهابی را نشان داد. نواحی پورتال انفیلتراسیون سلولی تک هسته ای و فیبروز اطراف پورتال را نشان داد. سپتوم فیبروتیک اطراف لوبولار فیبروتیک نیز مشاهده شد (شکل 1)

تجویز مایکوتوکسین باعث تغییرات ساختاری درکلیه هاکه هر دو قشر و مدولا را تحت تاثیر قرار می دهد. آتروفی تافت های گلومرولی و تغییر کپسول بومان مشاهده شد (شکل 2). توبول ها نکروز سلول های پوششی پوششی را نشان دادند که در بین آنها نفوذ سلول های التهابی وجود داشت. تجمعات کانونی سلول های التهابی در بین گلومرول ها و لوله ها در ارتباط با مناطق کانونی احتقان در رگ های خونی، به ویژه در ناحیه مدولاری مشاهده شد. ظاهرا، تکثیر کلاژن عمدتا در مناطق آسیب لوله مشاهده شد. علاوه بر این،کلیهبخش هایی از گروه های E3، گروهی که با رژیم غذایی پایه حاوی مخلوطی از دانه انگور و کنجاله خولان دریایی و آلوده به ترکیب OTA و AFB1 تغذیه شدند، تغییرات پاتومورفولوژیکی جزئی را نشان دادند، تقریباً مشابه گروه شاهد.

در کبد، بیان ژن برای CYP1A2 در مقایسه با گروه E1 به ترتیب 18 درصد برای E2 و 44 درصد برای E3 کاهش یافت. بیان ژن CYP2A19 در گروه های E1 و E2 اصلاح نشده بود، در حالی که در گروه E3 تقریباً 62 درصد کاهش یافت. افزایش قابل توجهی 29 درصدی در بیان ژن CYP2E1 در گروه E1 مشاهده شد که با رژیم غذایی پایه همراه با مخلوطی از دانه انگور و کنجاله خولان دریایی در مقایسه با گروه E2 تغذیه شدند. در مقابل، تجویز رژیم غذایی پایه غنی شده با مخلوطی از دانه انگور و کنجاله خولان دریایی (گروه E1) بیان ژن CYP3A29 را تا 24 درصد در مقایسه با سطح گروه E2 کاهش داد. تضاد دیگری در بیان ژن CYP4A24 مشاهده شد، با کاهش 33 درصدی برای گروه E1 و کاهش 24 درصدی برای گروه E3، و افزایش قابل توجه 41 درصدی در گروه E2 تغذیه شده با رژیم غذایی پایه همراه با مخلوط AFB1 و OTA، در مقایسه با سطح کنترل. در مورد MRP2، الگوی بیان ژن مشابه با ژن CYP4A24 بود، با کاهش ناچیز 35 درصدی برای گروه E1 و 24 درصد کاهش برای گروه E3، و افزایش قابل توجه 28 درصدی در گروه E2، در مقایسه با. به سطح کنترل به طور مشابه، بیان ژن CYP4A24، بیان ژن GSTA1 افزایش قابل توجهی 14 درصدی در گروه E2، افزایش 9 درصدی در گروه E1 و کاهش 30 درصدی برای گروه E3 نشان داد. بدیهی است که تجویز همزمان مخلوط دانه انگور و کنجاله خولان دریایی و OTA و AFB1 باعث کاهش بیان ژن های آنالیز شده در کبد نسبت به شاهد شد. با توجه به میزان بیان این ژن ها درکلیه ها،در مقایسه با نمونه های کبد، هیچ تغییر معنی داری از نظر آماری مشاهده نشد (شکل 4). با این حال، تغییرات در تنظیم سطح بیان ژن را می توان مشاهده کرد.

با تجزیه و تحلیل شکل 4، می توان متوجه شد که مخلوط دانه انگور و کنجاله خولان دریایی بیان ژن CYP1A2 را کاهش می دهد و بیان ژن CYP2A19، CYP2E1، CYP3A29 و CYP4A24 را به طور ناچیز تنظیم می کند و بیان ژن MRP2 را به طور غیر قابل توجهی تنظیم می کند و در آن بیان ژن GSTA1 باقی می ماند. . همچنین، حضور OTA و AFB1 در خوکچه‌ها بیان ژن CYP1A2 و CYP2A19 را به‌طور ناچیز تنظیم می‌کند، در حالی که MRP2 و GSTA1 اصلاح نشده بودند. تجویز همزمان مخلوط دانه انگور و کنجاله خولان دریایی و OTA و AFB1 بازگشت همه سطوح بیان ژنها را به سطوح کنترل تعیین کرد به استثنای GSTA1 که افزایش مهمی را در مقایسه با گروه E1 نشان داد.

بحث

مایکوتوکسین هایی مانند AFB1 و OTA سموم طبیعی هستند که انواع زیادی از محصولات گیاهی را آلوده می کنند. در نتیجه، AFB1، OTA و متابولیت های آنها در غذا و خوراک و همچنین در محصولات با منشاء حیوانی وجود دارند [52]. بیشتر مطالعات سم شناسی در مورد اثرات مایکوتوکسین ها، قرار گرفتن در معرض یک نوع مایکوتوکسین را بدون در نظر گرفتن ترکیب و تعامل بین آنها، به ترتیب، اثرات هم افزایی یا آنتاگونیستی که اغلب در طبیعت رخ می دهد، در نظر گرفته اند. داده‌های مربوط به اثرات سمی ترکیبات مایکوتوکسین محدود است، بنابراین خطرات قرار گرفتن در معرض چندین نوع سم هنوز ناشناخته است. وقوع مایکوتوکسین‌هایی مانند AFB1، DON، ZEA، OTA، FB1، و FB2 در غلات، محصولات غلات، و مواد غذایی مکمل و کامل برای خوک‌ها [16] به موقعیت جغرافیایی و تغییرات آب و هوایی مربوط می‌شود که خطر مرتبط را افزایش می‌دهد. با آلودگی مایکوتوکسین در طول ذخیره سازی و پردازش محصولات خوراک برای خوک [53]. آلودگی همزمان غلات و سایر مواد خام در زندگی واقعی بیشتر از آلودگی به مایکوتوکسین منفرد رخ می دهد [7]. برای مثال، وجود همزمان آفلاتوکسین B1 و اکراتوکسین A در مواد غذایی یا مواد غذایی مختلف، مانند گندم [54]، جو [55]، آرد غلات [56]، ادویه [57] و غیره یافت شده است. بین AFB1 و OTA در خوراک حدود 1 تا 6 یافت شد [37]. همچنین، محتوای خوراک جهانی در AFB1 و OTA به ترتیب بین عدم تعیین و 100 ppb و تعیین نشده و 211 ppb بود [58]. در این زمینه، به منظور تقلید از شرایط مزرعه، اثرات این مایکوتوکسین‌ها را با هم بررسی کردیم و اثربخشی ترکیب محصول جانبی را در مقابله با اثرات مایکوتوکسین‌ها ارزیابی کردیم. افزودنی های طبیعی (محصولات جانبی دانه انگور و خولان دریایی) بر اساس توانایی آنها در بهبود مایکوتوکسیکوز با مکمل های غذایی انتخاب شدند [59،60].

در مطالعه حاضر، قرار گرفتن خوک‌ها (گروه E2) با مخلوط مایکوتوکسین‌ها بر عملکرد حیوانات تأثیری نداشت (1.1 ± 27.83 در مقابل 27.{11}}9 ± 1.3 برای وزن بدن و 1.48 ± 0 .9 در مقابل 1.40 ± 0.8 برای مصرف خوراک) و پارامترهای بیوشیمیایی در مقایسه با شاهد. به طور مشابه، بلوغ و همکاران. [61] گزارش داد که خوکچه‌هایی که با تقریباً 0.4 میلی‌گرم بر کیلوگرم OTA در طول دوره شروع (0-28 روز) و رشد (29-49 روز) تغذیه می‌شوند، تغییرات قابل‌توجهی در صفات تولید و علائم بالینی سمیت در پرورش‌دهنده ثبت نکردند. فاز. در مقابل، کاهش قابل توجهی در افزایش وزن بدن در طول دوره شروع که حیوانات حساس تر بودند مشاهده شد. در این مطالعه، گنجاندن رژیم غذایی مخلوط محصول جانبی به تنهایی تأثیر قابل‌توجهی بر عملکرد حیوانات (گروه E1) داشت و تمایل به افزایش وزن خوک‌ها در زمانی که مخلوط با غذای آلوده همراه بود (گروه E3) بود.

از نقطه نظر سم شناسی، OTA توسط IARC (آژانس بین المللی تحقیقات سرطان) در همان گروه (2B) از مواد سرطان زا برای انسان طبقه بندی می شود که دارای سمیت مشابه با AFB1 است [62]. الگوهای توکسیکوکینتیک جذب، توزیع و حذف برای این مایکوتوکسین ها، در بیشتر موارد، کاملاً مشخص شده است. در مقابل، علی‌رغم پیشرفت‌های اخیر، دانش ما از مراحل تبدیل زیستی توکسیکوکینتیک با جزئیات مشخص نشده است. تعدادی از مطالعات نشان داده اند که AFB1 و OTA توسط میکروزوم های کبدی انسان، خوک و موش به چندین اپیمر متابولیزه می شوند [63]. تغییرات در فعالیت خاص و القاپذیری سیتوکروم P450 در نهایت تغییر نسبی در متابولیسم هر بیگانه‌بیوتیک را تعیین می‌کند.

مشخص شده است که قرار گرفتن در معرض AFB1 و OTA بیان ژن‌های CYP1A2، CYP2E1، CYP3A29 و MRP2 را در کبد خوک کاهش داده و منجر به تغییرات متعددی در بافت‌شناسی و فراساختار کبد، از جمله مناطق کانونی نکروز، گشاد شدن سینوس‌وئید و پران‌های التهابی می‌شود. انفیلتراسیون و فیبروز اطراف پورتال. با توجه به سطح بیان ژن ایزوفرم های CYP450 در خوک هاکلیه،هیچ داده ای در ادبیات علمی موجود نبود. ژن‌های CYP1A2، CYP2A19، CYP2E1، CYP3A29، CYP4A24، MRP2، و GSTA1 برای این مطالعه انتخاب شدند، زیرا پروتئین‌هایی با فعالیت آنزیمی یا عملکرد ناقل را کد می‌کنند که در فاز I و فاز II تبدیل زیستی و سم‌زدایی مجدد شکل الکتروفولیک‌ها فعال هستند. متابولیت ها [64]. با توجه به این نتایج، به نظر می رسد که تجویز محصول جانبی کاهش بیان ژن CYP1A2 و افزایش بیان ژن GSTA1 را تعیین کرد. نتایج مشابهی در سلول‌های سرطانی روده بزرگ انسانی HT{17} مشاهده شد که با عصاره سالیکورنیا فریتاژی که به‌خاطر فعالیت آنتی‌اکسیدانی و ضدالتهابی آن معروف است، تیمار شده‌اند. در این مورد، به دلیل محتوای آن در فنل‌های فعال زیستی، کاهش mRNA ژن CYP1A2 و تنظیم مثبت mRNA ژن GSTA1 رخ داد [65]. برخلاف نتایج ما، بیان mRNA و پروتئین CYP1A2 در کبد خوک‌های کاسنی تغذیه‌شده افزایش یافت [66]. این نتایج متفاوت احتمالاً به دلیل ترکیبات طبیعی مختلف موجود در کاسنی در مقایسه با محصولات جانبی مورد استفاده در مطالعه حاضر، عمدتاً اسیدهای کلروژنیک، کافئیک و p-کوماریک ایجاد شده است [67].

از سوی دیگر، OTA و AFB1 احتمالاً با گیرنده هیدروکربن آروماتیک تعامل کرده و آن را فعال کرده اند که منجر به جابجایی هسته ای آن می شود. پس از هترودایمریزاسیون، OTA و AFB1 احتمالاً با انتقال دهنده هسته ای گیرنده هیدروکربنی، هترودایمر، متصل به عناصر پاسخگو به بیگانه بیوتیک و ژن های ترانسفعال شده مانند CYP1A1، CYP1A2 و GST [68] برهم کنش دادند. این عنصر پاسخ‌دهنده به بیگانه‌بیوتیک بین ژن‌های CYP1A1 و CYP1A2 مشترک است [69]، و دو آنزیم که توسط آنها کدگذاری شده‌اند، ویژگی سوبسترای همپوشانی دارند [70]. در کبد خوک، فقط فعالیت CYP1A2 وجود دارد و مقدار نسبی کل CYP450 شناسایی شده آن 4 درصد است [71]. در کبد انسان، AFB1 و OTA القاء کننده CYP1A1، 1A2، 2B6، 2C9، 3A4 و 3A5 هستند [72]. AFB1، و همچنین قرار گرفتن در معرض OTA، اختلال عملکرد میتوکندری را ایجاد می‌کند که با افزایش تولید ROS مشخص می‌شود [14] که می‌تواند بیان TGF{37}} را افزایش دهد یا TGF نهفته را فعال کند [73]. با در نظر گرفتن شواهد قبلی مبنی بر اینکه TGF- 1 بیان CYP1 را در انسان و موش کاهش می‌دهد، این امکان وجود دارد که مکانیسم مشابه [74] در شرایط ما رخ داده باشد. اثرات مواجهه همزمان با هر دو مایکوتوکسین و محصولات جانبی دانه انگور و خولان دریایی احتمالاً هم افزایی بودند و بیان CYP1A2 در E3 در مقایسه با E1، E2 و گروه کنترل کمتر بود. CYP1A2 در سطوح پایین تری در بافت های خارج کبدی بیان می شود [75].

CISTANCHE نارسایی کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

اینکلیهناارگانتی است که حدود 25 درصد از عملکرد قلبی را دریافت می کند و باقی مانده متابولیک و بیگانه بیوتیک ها را از سیستم گردش خون تصفیه می کند. در طی این فرآیند تخلیه، مواد سمی در آن متمرکز می شوندکلیه[76]. در خوکککلیه ها، تنوع بیان ژن CYP1A2 با سطوح بیان در کبد برای E1 و E2 مشابه بود. جالب اینجاست که در گروه E3 بیان این ژن در سطح بالاتری نسبت به گروه کنترل بود. این احتمالاً به دلیل فعال شدن مسیر سیگنالینگ غیر متعارف برای رونویسی AhR درکلیهسلول ها [77]. در کبد خوک، مقادیر نسبی CYP2A19 و CYP2E1 به ترتیب 31 درصد 13 درصد از کل CYP450 را نشان می‌دهند [71]. ژن‌های CYP2A19 و CYP2E1 خوک مسئول تبدیل زیستی ترکیبات درون‌زا (اسکاتول، هورمون‌های جنسی) و همچنین ترکیبات اگزوژن (اجزای غذایی) هستند. هر دو نوع ترکیبات در کبد بسیار و کمتر در کبد بیان می شوندکلیهو بافت چربی رونویسی CYP2A19 توسط فاکتور رونویسی CAR کنترل می شود [78]. ارتولوگ انسانی آن، CYP2A6 توسط CAR، PXR، گیرنده گلوکوکورتیکوئیدی (GR)، گیرنده استروژن، HNF 4 و PGC -1 [79] کنترل می شود. همچنین، بیان سازنده کبدی CYP2A6 در موش توسط یک تعامل بین HNF 4، CCAAT-box/پروتئین اتصال دهنده تقویت کننده (C/EBP، C/EBP) و فاکتور رونویسی اکتامری کنترل می شود (اکتبر{13} }) [80]. پیش از این، یک همبستگی مثبت بین سطوح mRNA و پروتئین برای ژن CYP2A19 مشاهده شد [81]. برخلاف سایر ژن‌های CYP 450، CYP2A19 نقش کمتری در متابولیسم بیگانه‌بیوتیک‌ها ایفا می‌کند، اما در واکنش سلول‌ها به استرس، Nrf{21}} نقش دارد و در رونویسی CYP2A19 نیز نقش دارد [82]. ژن CYP2A19 احتمالاً در مقایسه با ژن CYP2A6 بسیار چندشکل است [83]، و یک تنوع گسترده بین فردی محصول آن ممکن است رخ دهد. مطالعات قبلی نشان داد که ارتولوگ‌های اردک P450 پستانداران CYP2A6 و CYP3A4 در فعال‌سازی زیستی AFB1 به شکل اپوکسید آن نقش دارند [84]. برخلاف این نتایج، در مطالعه حاضر، هیچ تغییر قابل توجهی در بیان ژن CYP2A19 در گروه E1 و E2 مشاهده نشد که احتمالاً به دلیل سطح بالای بیان این ژن در کبد خوک است. در حال حاضر، توضیح اینکه چرا قرار گرفتن همزمان هر دو مایکوتوکسین و مخلوط دانه انگور و کنجاله خولان دریایی باعث کاهش بیان CYP2A19 شد، دشوار است. با این حال، این کاهش بیان خطر تولید متابولیت های سمی را کاهش داد.

در خوککلیه،بیان CYP2A19 در مقایسه با آنچه در کبد یافت می شود کمتر است [79]. احتمالاً به دلیل این بیان کمتر، قرار گرفتن حیوانات در معرض مخلوطی از دانه انگور و کنجاله خولان دریایی باعث ایجاد اختلال در بیان ژن CYP2A19 ناشی از Nrf{3}} به دلیل محتوای لوتئولین [85] و اسید فرولیک [86] شد. . از سوی دیگر، شواهدی وجود دارد که نشان می‌دهد تنها دو عامل رونویسی، یعنی فاکتور رونویسی پروموتر بالادست اووالبومین جوجه (COUP-TF1) و فاکتور هسته‌ای کبدی (HNF{10}})، در تنظیم رونویسی CYP2E1 در خوک‌ها نقش دارند. [87]. CYP2E1، مانند سایر P450های متابولیزه کننده بیگانه بیگانه، عمدتاً در غشای شبکه آندوپلاسمی (ER) قرار دارد و می تواند تحت شرایط متابولیکی یا تغذیه ای مختلف القا شود. استرس ER می تواند توسط استرس متابولیک ایجاد شود، که ناشی از اضافه بار بیوسنتز پروتئین/لیپید است، و استرس اکسیداتیو، که می تواند مسیر سیگنالینگ هوموستاتیک پیچیده ای را که به صورت تکاملی حفظ شده است، به نام پاسخ پروتئین بازشده (UPR) تحریک کند [88].

این احتمال وجود دارد که سطح mRNA ژن CYP2E1 در گروه های E1 و کنترل تقریباً یکسان باشد به دلیل اثرات متضاد پالمیتیک اسید [89]، اسیدهای لینولئیک و لینولنیک [90] که این رونویسی ژن و اعمال وانیلی و وانیلی را افزایش می دهد. اسیدهای p-کوماریک که آن را کاهش دادند [65]. اخیراً ثابت شده است که خوراک حاوی OTA باعث تغییر میکروبیوتای روده در اردک ها شده و بر تنوع و ترکیب میکروبیوتای سکوم و همچنین سد روده تأثیر می گذارد. در نتیجه، لیپوپلی ساکاریدهای مشتق از باکتری گرم منفی وارد خون و کبد شدند و باعث التهاب کبد شدند [91]. در مورد آسیب کبدی با واسطه ایمنی، بیان CYP2E1 کاهش یافت [92]. این وضعیت ممکن است در گروه E2 رخ دهد. این احتمال وجود دارد که اثرات تجمعی دو مایکوتوکسین و محصولات جانبی رژیم غذایی باعث کاهش بیان CYP2E1 در کبد گروه E3 شود. درکلیه،اسیدهای چرب آزاد، مانند پالمیتات، اولئات و لینولئات، در نفرون ذخیره می شوند [93]، و این اسیدها احتمالا بیان ژن CYP2E1 را درکلیه هااز گروه E1 در مقایسه با سطح کنترل. طبق گفته Pfohl-Leszkowicz و Manderville [25]، OTA ترکیب اضافی را با DNA تشکیل می دهد و تولید می کند.کلیهسمیت ژنتیکی و سرطان زایی این احتمال وجود دارد که سطوح بالای OTA بیان ژن CYP2E1 را در بدن تحریک کندکلیه هااز گروه E2 در مقایسه با سطح کنترل. در گروه E3، به نظر می رسد که مصرف همزمان دو مایکوتوکسین و محصولات جانبی رژیمی دارای اثرات متضاد بوده و بیان ژن CYP2E1 به سطح کنترل باز می گردد. علاوه بر این، ارزیابی بافت شناسی برای گروه E3 نشان داد که مخلوط محصول جانبی حاصل از روغن هسته انگور و خولان دریایی آسیب مضر تولید شده توسط آفلاتوکسین B1 و اکراتوکسین A را در کبد و کبد کاهش می دهد.کلیهسطح در خوک پس از از شیر گرفتن. CYP2E1، مانند سایر P450های متابولیزه کننده زنوبیوتیک، عمدتاً در غشای ER قرار دارد و می تواند تحت شرایط مختلف متابولیک یا تغذیه ای القا شود [89]. تنظیم ژن CYP2E1 در گروه E1 احتمالاً به دلیل هیدروکسیل شدن ترکیبات مشتق شده از کومارین است که توسط آنزیم های CYP2A کاتالیز می شوند، که به عنوان شاخص های خاصی برای حضور آنزیم های CYP2 [94] با p-کوماریک در نظر گرفته می شوند. اسید موجود در محصولات جانبی دانه انگور و خولان دریایی.

در مورد خوک ها، اطلاعات کمی در مورد حضور آنزیم های CYP3As در خوک ها وجود داردبافت کلیه،و هیچ چیز در مورد القایی آنها شناخته نشده است [95]. چندین ژن در زیرخانواده CYP3A پستانداران شناسایی شده است (به عنوان مثال، پنج در موش و چهار در انسان)، اما بیان این ژن ها دربافت های کلیهضعیف مورد بررسی قرار گرفته است [96]. از نظر بیان ژن، Ayed-Boussema و همکاران. (2012) [63] و Gonzalez-Arias و همکاران. [97] افزایش سطح بیان را در تمام سیتوکروم‌های مورد سنجش (CYP3A4، 2B6، 3A5، و 2C9) در کشت اولیه سلول‌های کبدی انسانی توصیف کرد. مطالعات قبلی نتایج مختلفی را در مورد اثرات AFB1 و OTA در سلول‌های کبدی کشت اولیه انسانی گزارش کرده‌اند که در آن افزایش غلظت این مایکوتوکسین‌ها به وضوح سطوح mRNA CYP3A4 و CYP2B6 را به روشی وابسته به دوز القا می‌کرد [63]. در مقابل، مشخص شده است که در حضور OTA و AFB1 در کبد (شکل 3، گروه E2)، سطح بیان CYP3A29 در مقایسه با سطح کنترل کاهش می یابد، شاید به دلیل فعال شدن AhR [98]. این داده ها با داده های Zepnik و همکاران متفاوت است. [99]، که افزایش هیدرولیز OTA توسط آنزیم‌های میکروزومی از کبد موش را گزارش کرد، به‌ویژه برای P{28}}A1/2 و 3A4، نشان می‌دهد که این بیان ژن به شیوه‌ای وابسته به گونه تعدیل می‌شود. در برخی موارد، مهار آنزیم‌های P450 توسط پلی‌فنل‌ها ممکن است یک اثر شیمیایی پیشگیرانه به دلیل فعال شدن بالقوه مواد سرطان‌زا توسط آنزیم‌های P450 در طول فعالیت متابولیک طبیعی آنها داشته باشد. مهار آنزیم‌های فاز I متابولیزه‌کننده بیگانه‌بیوتیک می‌تواند یکی از اهداف اثرات شیمیایی پیشگیرانه پلی فنول‌های حلقوی طبیعی باشد. افزایش CYP4A24 مشاهده شده در کبد می تواند یک پاسخ فیزیولوژیکی در زمینه غیرمعمول تجمع چربی نابجا و عدم فعالیت CYP2E1 باشد، زیرا CYP2E1 و CYP4A سیتوکروم های میکروزومی کبدی القایی P{46} هستند که در هیدروکسیلاسیون چربی نقش دارند. اسیدها، و هر دو می توانند فرآیند تکثیر خودکار پراکسیداسیون لیپیدی را آغاز کنند. آنها ممکن است مکمل هم باشند و منجر به فعل و انفعالاتی در تنظیم آنزیم های فردی شوند [100]. بنابراین واضح است که پروتئین‌های CYP4A واسطه‌های کلیدی در پاسخ تطبیقی ​​به اختلال متابولیسم لیپید کبدی هستند [101]. کاهش سطح CYP4A24 درکلیهاحتمالاً منجر به اثرات سمی ایجاد شده در کبد به دلیل رژیم غذایی آلوده به مایکوتوکسین می شود، به این معنی که CYP4A24 استرس ER کبدی را تنظیم می کند [102،103].

سیستانچ درد کلیه/کلیه را بهبود می بخشد

در مطالعه حاضر، افزودن مخلوطی از محصولات جانبی دانه انگور و خولان دریایی باعث افزایش سطح بیان درکلیه،که انتظار می رود به نفع فرآیندهای حذف و حفظ تعادل مواد درون سلولی باشد [104]. علاوه بر این، OTA در روده جذب شد، جایی که پروتئین مقاومت چند دارویی 2 (ژن MRP2) نقش مهمی ایفا می‌کند و به عنوان یک ناقل خارجی بیگانه‌بیوتیک برای کاهش فراهمی زیستی خوراکی و بار سم به اندام‌ها و در نتیجه سمیت OTA عمل می‌کند. هنگامی که OTA به جریان خون می رسد، می تواند به اندام های دیگر مانند کبد برسد، و ناقل MRP2 دوباره یک ناقل فعال اصلی کلیدی است که در مزدوج آنیونی و اکستروژن بیگانه بیوتیک به فضای خارج سلولی که به تشکیل صفرا و حذف بعدی سم کمک می کند، نقش دارد. 97، 105]. همچنین، ناقل MRP2 در غشاهای آپیکال انتروسیت ها وجود دارد.کلیهتوبول های پروگزیمال و سایر سلول ها [105]. سمیت OTA به قسمت ایزوکومارین آن نسبت داده شده است، و به خوبی شناخته شده است که OTA توسط آنزیم های سیتوکروم P450 غیر فعال یا زیست فعال می شود [29]. پیش از این، حضور OTA در خوراک با ایجاد سمیت کلیوی مرتبط بود که در موش‌ها باکلیهآدنوم وکلیهتومورها [97]. در مطالعه حاضر، کاهش بیان MRP2 در کبد مشاهده شد که نشان دهنده اختلال در ترشح مایکوتوکسین ها در گروه E2 است.

در موش‌ها مشاهده شد که OTA 15 درصد کمتر در لوله‌های پروگزیمال ترشح می‌شود.کلیه،در حالی که انتقال لوله ای پروگزیمال اسیدهای آمینه مختل نشد [97، 106]. بنابراین، کاهش MRP2 در کبد یافت شده در این مطالعه می‌تواند مکانیسمی باشد که از طریق آن مایکوتوکسین‌ها به درصد بالایی از فراهمی زیستی در داخل بدن می‌رسند. به این ترتیب، قرار گرفتن در معرض AFB1 و OTA خوک ها بزرگ می شود و به سمیت کبدی کمک می کند. با در نظر گرفتن پتانسیل نفروتوکسیک OTA و AFB1، کاهش محصول ژن MRP2 نیز ممکن است تأثیر عمده ای بر توبول پروگزیمال داشته باشد که منجر به کاهش ظرفیت برای حذف OTA می شود [97]. با این حال، مطالعات بیشتری در مورد مکانیسم انتقال دهنده AFB1 و OTA برای حمایت از این فرضیه مورد نیاز است. در فاز دوم سم‌زدایی متابولیک، ترکیب اصلی بیگانه‌بیوتیک یا متابولیت‌های میانی اصلاح‌شده در فاز I به منظور دفع مناسب، کونژوگه می‌شوند. ترانسفرازهای گلوتاتیون S (GSTs) و UDP glycurosyltranferases (UGTs) به پردازش فاز II کمک می کنند [107].

در حضور مخلوطی از محصولات جانبی دانه انگور و کنجاله خولان دریایی در خوراک خوک ها، سطح بیان GSTA1 در کبد به طور قابل توجهی افزایش می یابد، احتمالاً توسط یک عنصر پاسخگو به آنتی اکسیدان (ARE) و عنصر پاسخگو به -NF (-NF-RE). به ترتیب، که در حضور آنتی اکسیدان های فنلی، ایزوفرم های GST را بدون نیاز به گیرنده های هیدروکربنی آریل (Ah) فعال می کنند [108]. با کمال تعجب، در مطالعه قدیری و همکاران. (2019) [109]، کاهش تنظیم mRNA با واسطه AFB1-GSTA1 در کبد گاو در حضور یک آنتی اکسیدان مشاهده شد. مطالعات قبلی [110] نشان داد که OTA و AFB1 برای همان آنزیم‌های CYP450 که مسیر فعال‌سازی زیستی AFB1 را نشان می‌دهند، با ترکیب‌های اضافی AFB{15}}DNA کمتری تولید می‌شوند، رقابت می‌کنند. با توجه به این رقابت، AFB1 احتمالاً می‌تواند با گلوتاتیون کاهش یافته در واکنشی که توسط آنزیم‌های GST کاتالیز می‌شود، ترکیب شود و ژن‌های کدکننده آن‌ها تنظیم مجدد شوند. AFB1 می تواند در انواع دیگر واکنش های فاز II، به عنوان مثال، گلوکورونیداسیون و سولفاته شدن نقش داشته باشد، در حالی که OTA عمدتاً با گلوتاتیون کاهش یافته کونژوگه می شود [72]. علاوه بر این، در پاسخ به تجویز همزمان در خوک‌ها، خوراک دو مایکوتوکسین (AFB1 و OTA) تولید بیومارکرهای استرس اکسیداتیو را افزایش داد. بنابراین، مکانیسم‌های دفاعی فعال شدند و سازگاری و بقا را در پاسخ به استرس اکسیداتیو ارتقا دادند [111]. برای مثال، ROS و اکسیدان‌ها می‌توانند رونویسی ایزوفرم‌های GST را از طریق ARE [108] فعال کنند، همانطور که هم در کبد و هم در کبد مشاهده شد.کلیه هااز طریق افزایش سطح بیان ژن GSTA1.

نتیجه گیری

داده های ما وجود تفاوت بین خوکچه ها را نشان دادکلیهو کبد با توجه به واکنش در برابر مایکوتوکسین ها و محصولات جانبی مورد استفاده در این مطالعه. به طور کلی، محصولات جانبی با عملکرد آنتی اکسیدانی بیان mRNA ژن CYPs تجزیه و تحلیل شده را در کبد کاهش داده و آنها را در کبد افزایش دادند.کلیه. همچنین، در هر دو اندام، قرار گرفتن همزمان خوک‌ها با OTA و AFB1 باعث افزایش یا کاهش بیان ژن وابسته به نوع ژن می‌شود. گنجاندن دانه انگور و کنجاله خولان دریایی در رژیم غذایی خوک‌های مسموم با OTA و AFB1- بیان ژن CYP P450 را کاهش داد، که نشان‌دهنده کاهش زیست فعال‌سازی این مایکوتوکسین‌ها است که احتمالاً منجر به کاهش سمیت در هر دو اندام می‌شود. مطالعات بافت شناسی نشان داده است. این یافته ها نشان می دهد که ضایعات کنجاله انگور و خولان دریایی منبعی امیدوارکننده در مقابله با اثر مضر اکراتوکسین A و آفلاتوکسین B1 هستند. اگرچه کار بیشتری برای کشف مکانیسم هایی لازم است که توسط آن محصولات جانبی دانه انگور و خولان دریایی بر تبدیل زیستی AFB1 و OTA و در نتیجه تولید متابولیت های سمی تأثیر می گذارند، به نظر می رسد اثرات محافظتی حداقل تا حدی با افزایش دفاع آنتی اکسیدانی در کبد انجام شود. وکلیهمرحله.

مواد و روش ها

طراحی تجربی و مجموعه نمونهچهل خوک دورگه TOPIGS-40 هیبریدی ( ♀ Large White × Hybrid (Large White × Pietrain) ×♂ Talent, عمدتا Duroc) پس از از شیر گرفتن با میانگین وزن بدن 9.11 ± 0.{16 }}3 کیلوگرم به سه گروه آزمایشی (E1، E2، E3) و یک گروه کنترل (C)، در قلم‌ها (دو تکرار پنج خوک در هر قلم در هر تیمار) و تغذیه با جیره‌های آزمایشی به مدت 3 تخصیص داده شد{19} } روزها. در طول آزمایش، خوراک و آب به صورت آزاد ارائه شد. جیره پایه به عنوان شاهد ارائه شد و حاوی خوراک ترکیبی معمولی برای خوکچه های شروع کننده بدون مایکوتوکسین بود (ذرت 68.46 درصد، کنجاله سویا 19 درصد، گلوتن ذرت 4 درصد، جایگزین شیر 5 درصد، L-lysine 0.3 درصد، DL-متیونین 0.1 درصد، سنگ آهک 1.57 درصد، مونوکلسیم فسفات 0.35 درصد، نمک 0.1 درصد، پیش مخلوط کولین 0.1 درصد، و 1 درصد پیش مخلوط ویتامین و مواد معدنی). گروه های آزمایشی به شرح زیر تغذیه شدند: E1 - جیره پایه به اضافه مخلوط (1:1) از دو محصول جانبی (دانه انگور و کنجاله خولان دریایی) در درصد 5 درصد با جایگزینی ذرت و کنجاله سویا. E2 - رژیم غذایی پایه که بطور مصنوعی با مایکوتوکسین ها آلوده شده است (مخلوطی از 62 ppb آفلاتوکسین B1- AFB1 و ppb 479 اکراتوکسین A-OTA). و E3 - رژیم غذایی پایه حاوی 5 درصد از مخلوط (1:1) دانه انگور و کنجاله خولان دریایی و آلوده به مخلوط AFB1 و OTA. مخلوط مایکوتوکسین های OTA و AFB1 با مهربانی توسط دکتر بودرا و دکتر مورگوی از INR A، مرکز کلرمونت فراند تهیه شد و با کشت آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس اکراسه روی گندم همانطور که قبلا توسط بودرا و همکارانش توضیح داده شد، تولید شد. [112]. مواد آلوده به‌دست‌آمده در جیره‌های گروه E2 و E3 گنجانده شد که منجر به غلظت نهایی 479 ppb OTA و 62 ppb AFB1 شد. حیوانات از تمام گروه های آزمایشی در هر روز از دوره آزمایشی (30 روز) به آب و غذای تیمار دسترسی آزاد داشتند. کنجاله هسته انگور و کنجاله خولان دریایی توسط دو آگهی تجاری محلی، SC OLEOMET-SRL و BIOCATINA، بخارست، رومانی ارائه شد. پس از 4 هفته، حیوانات با تایید کمیته اخلاقی موسسه ملی تحقیقاتی-توسعه ای تغذیه و زیست شناسی حیوانات، Balote s , ti، رومانی (کمیته اخلاقی شماره 118/02/12/2019) و مطابق با قانون رومانیایی 206/2004 و دستورالعمل شورای اتحادیه اروپا 98/58/EC برای جابجایی و حفاظت از حیواناتی که برای اهداف آزمایشی استفاده می شوند. در پایان دوره آزمایشی این مطالعه، پارامترهای تولیدی، وزن و مصرف خوراک اندازه‌گیری شد. کبد وکلیهنمونه ها از چهار حیوان در هر گروه جمع آوری شد و با محلول نمک سرد یخ پرفیوژن شد تا خون خارج شود. قطعات ~50 میلی گرم از لوب راست کبد وکلیهکورتکس (سه عدد از هر کدام) در معرف تثبیت RNAlater (Qiagen، Germantown، مریلند) جمع آوری شد و سپس تا مرحله جداسازی RNA در دمای ◦-80 نگهداری شد. به دلایل اخلاقی، حداکثر استفاده از هر حیوان، به حداقل رساندن تلفات حیوانات و تجزیه و تحلیل آماری، تعداد افراد تا حد امکان علمی کاهش یافت. علم خوب و طراحی آزمایشی خوب به کاهش تعداد حیوانات مورد استفاده در هر مطالعه تحقیقاتی کمک می کند و به دانشمندان امکان می دهد با استفاده از حداقل تعداد حیوانات مورد نیاز داده ها را جمع آوری کنند [113].

خصوصیات خوراکجیره های خوراک برای ترکیب شیمیایی پایه (ماده خشک، پروتئین خام، چربی خام، فیبر خام و خاکستر) بر اساس روش های سازمان استاندارد بین المللی (SR ISO 6496/2001، استاندارد شده بولتن (2010) تجزیه و تحلیل شدند. http://www. asro.ro (دسترسی در 13 فوریه 2021)). ترکیبات زیست فعال حاصل از محصولات جانبی وعده های غذایی، مانند پلی فنل ها، اسیدهای چرب غیراشباع چندگانه (PUFA) و مواد معدنی، با واکنش Folin-Ciocalteu، HPLC-UV-Vis و کروماتوگرافی گازی که توسط نویسندگان [113، 114] توصیف شده است، تعیین شدند. فعالیت آنتی اکسیدانی با روش DPPH همانطور که قبلا توسط نویسندگان [115] توضیح داده شد تعیین شد.

تجزیه و تحلیل بیومارکرهای پلاسمادر روز 30، نمونه خون به صورت آسپتیک از خوکچه های روزه گرفته شد. نشانگرهایی که عملکرد کبد (آسپارتات ترانس آمیناز-AST، آلانین ترانس آمیناز-ALT، گاما گلوتامیل ترانسفراز-GGT، پروتئین تام، آلکالین فسفاتاز-AKL) و کلیه ها (آلبومین، کراتینین) را منعکس می کنند، پس از سانتریفیوژ خون با استفاده از یک دستگاه شیمی بالینی تعیین شدند. آنالایزر Horiba Medical—ABX Pentra 400, (Irvine, CA, USA).

بررسی میکروسکوپ نوریکبد وکلیهبیوپسی ها در محلول فرمالدئید بافر فسفات 4 درصد تثبیت شدند، آبگیری شدند، شفاف شدند و در بلوک های پارافین قرار گرفتند. مقاطع 5 میکرومتری به ترتیب برای رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین و گوموری تری کروم (Leica Biosystems, 38016SS1, Nussloch, Germany) طبق پروتکل لایکا پردازش شدند. مقاطع میکروسکوپی با میکروسکوپ Olympus BX43 مجهز به دوربین دیجیتال Olympus XC30 تجزیه و تحلیل شد. تغییرات هیستوپاتولوژیک کبد وکلیهبر اساس شدت ضایعات به عنوان متعلق به درجه 1-4 طبقه بندی شدند، همانطور که قبلا توضیح داده شد [116]. برای کبد، درجه 1: جنبه طبیعی. درجه 2: سلول های کبدی طبیعی، سینوس های گشاد شده جزئی و احتقان. درجه 3: سلولهای کبدی واکوئله، سینوسوئیدهای گشاد شده و احتقان. تکثیر کلاژن متوسط؛ درجه 4: نکروز، ارتشاح التهابی، تکثیر کلاژن. برای کلیه، درجه 1: جنبه طبیعی. درجه 2: آسیب های جزئی لوله ای/گلومرولی، التهاب و تکثیر کلاژن. درجه 3: آسیب های خفیف لوله ای/گلومرولی، التهاب و تکثیر کلاژن. درجه 4: آسیب های لوله ای/گلومرولی مشخص، التهاب و تکثیر کلاژن. یک "مقدار ارزیابی میانگین" (MAV) به عنوان میانگین همه داده ها در هر گروه آزمایش محاسبه شد.

جداسازی RNAجداسازی RNA کل از 10 میلی گرم بافت با استفاده از کیت RNeasy Plus Universal Mini (Qiagen) طبق پروتکل سازنده انجام شد. علاوه بر این، شامل مرحله هضم DNase روی ستون بود. پس از جداسازی RNA، به منظور جلوگیری از تخریب ناشی از چرخه‌های انجماد و ذوب، مقدار کمی ساخته شد. غلظت و خلوص RNA کل با استفاده از اسپکتروفتومتر NanoDrop 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) تعیین شد.

شماره یکپارچگی RNA (RIN)مقادیر RIN نمونه‌های RNA با استفاده از Agilent RNA 6000 NanoKit (Agilent, Santa Clara, CA, USA) و Agilent 2100 Bioanalyzer با استفاده از پروتکل سازنده تعیین شد. نمونه هایی با مقادیر RIN کوچکتر از 8 در تجزیه و تحلیل بیشتر گنجانده نشدند و مراحل جداسازی تکرار شد.

رونویسی معکوسبرای سنتز cDNA، 1000 نانوگرم از RNA کل با استفاده از کیت سنتز cDNA iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) تحت رونویسی معکوس قرار گرفت. مخلوط واکنش 4 میکرولیتری و ترانس کریپتاز معکوس 1 میکرولیتری با نمونه‌های RNA 1 میکرولیتری مخلوط و با آب بدون RNase به حجم 20 میکرولیتر تکمیل شد. غلظت نهایی RNA 1000 نانوگرم در هر واکنش بود. این واکنش با استفاده از چرخه حرارتی Veriti 96- چاه (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) با برنامه زیر انجام شد: یک چرخه 25 درجه سانتیگراد برای 5 دقیقه، یک چرخه 42 درجه سانتیگراد برای 30 دقیقه و یک چرخه 85 ◦ C به مدت 5 دقیقه. غلظت و خلوص نمونه‌های cDNA با استفاده از اسپکتروفتومتر NanoDrop 8000 (Thermo Scientific) تعیین شد.

طراحی پرایمربه دلیل کمبود داده در مورد ژن‌های دخیل در سمیت کبدی در مواجهه با مایکوتوکسین خوک‌های از شیر گرفته شده، توالی‌های آغازگر (جدول 7) در سیلیکون با استفاده از Primer3Plus [59] طراحی و با برنامه BLAST [117] تأیید شدند. آنهایی که دارای بالاترین ویژگی برای توالی هدف بودند به منظور تقویت ژن‌های CYP1A2، CYP2A19، CYP2E1، CYP3A29، CYP4A24، MRP2، و GSTA1 و سه ژن مرجع کدکننده‌ای برای پروتئین اتصال جعبه TATA، پروتئین ریبوزومی بتا{L4 و پروتئین انتخاب شدند. {19}}میکروگلوبولین در Sus scrofa. دمای بازپخت پرایمرها با گرادیان دما PCR تعیین شد.

Real-Time PCRواکنش Real-Time PCR بر روی iCycler iQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) با استفاده از iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad) انجام شد. در یک 96-صفحه چاهی، 1 میکرولیتر از 1{{10}}0 نانوگرم بر میکرولیتر cDNA، 12.5 میکرولیتر iQ SYBR Green SuperMix (Bio-Rad)، 0.5 میکرولیتر پرایمر جلویی 20 pmol/μL، 0.5 میکرولیتر پرایمر معکوس 20 pmol/μL و 10.5 میکرولیتر آب MilliQ اضافه شد. حجم کل 25 میکرولیتر بود. برنامه تقویت شامل 1 سیکل 95 ◦ C به مدت 5 دقیقه، 45 سیکل 95 ◦ C برای 30 ثانیه، 55/56 ◦ C برای 30 ثانیه، 72 ◦ C برای 45 ثانیه، و 85 سیکل 55 ◦ C، با افزایش دمای نقطه تنظیم 0.5 ◦ C در هر چرخه برای 10 ثانیه. نمونه ها اجرا شدند و مقادیر چرخه های آستانه (Ct) ثبت شدند. منحنی های ذوب نیز انجام شد.

تحلیل داده هامقادیر Ct همانطور که در "راهنماهای MIQE: حداقل اطلاعات برای انتشار کمی آزمایش های PCR در زمان واقعی" [118] با استفاده از OpenOffice Calc مطابق روش 2- ∆∆ Ct توصیف شده توسط Livak و Schmittgen (2001) پردازش شد. ) [ 119 ]. ژن‌های مرجع (TBP، RPL4 و B2M) به منظور بیان پایدار در انواع بافت‌ها و تیمارهای مختلف بر روی نمونه‌های خوکی انتخاب شدند [120، 121]. مقدار بیان نسبی (2-Δ∆Ct) با نرمال سازی، کم کردن میانگین حسابی ژن های مرجع از هر ژن مورد نظر، به دست آمد. تکرارهای فنی قبل از تجزیه و تحلیل آماری میانگین گیری شدند. داده ها به عنوان مقادیر میانگین گروه ها (n=4) ± انحراف خطای استاندارد میانگین (STDEV) نشان داده شده است. تمام داده ها با استفاده از روش ANOVA یک طرفه که با نرم افزار GraphPad Prism 3.03 (نرم افزار GraphPad، La Jolla، CA، USA) انجام شد، مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. مقایسات پس‌هک بین همه گروه‌ها با استفاده از آزمون بونفرونی انجام شد. معنی‌داری آماری (p value) برای همه گروه‌ها در مقایسه با گروه کنترل (C) ارائه شد.