afزبان
صفحه اصلی / دانش / محتوای

دانش

اثرات Naringenin بر پروفایل های MiRNA-mRNA در سلول های HepaRG

Mar 12, 2022

برای جزئیات بیشتر تماس بگیرید:tina.xiang@wecistanche.com

خلاصه: نارینگنین، طبیعیفلاونوئیدبه طور گسترده در مرکبات یافت می شود، گزارش شده است که دارای خواص آنتی اکسیدانی، ضد التهابی و محافظت از کبد به عنوان یک مکمل غذایی طبیعی است. با این حال، مکانیسم تنظیمی نارینژنین در کبد انسان نامشخص است. در مطالعه حاضر، توالی‌یابی RNA پیام‌رسان (mRNA-seq)، توالی‌یابی microRNA (miRNA-seq)، و qPCR بلادرنگ برای تشخیص تفاوت‌های بیانی بین سلول‌های HepaRG کنترل و تیمار شده با نارینژنین استفاده شد. ما 1037 mRNA با بیان متفاوت و 234 miRNA به دست آوردیم. با توجه به پیش‌بینی هدف و تجزیه و تحلیل یکپارچه‌سازی در سیلیکو، 20 جفت miRNA-mRNA بالقوه درگیر درکبدمتابولیسم این مطالعه اولین مطالعه‌ای است که چشم‌اندازی از تعاملات miRNA-mRNA در تنظیم نارینژنین از طریق تجزیه و تحلیل یکپارچه mRNA-seq و miRNA-seq در سلول‌های HepaRG ارائه می‌کند، که بیشتر ارزش غذایی نارینژنین را به عنوان یک افزودنی غذایی مشخص می‌کند.

کلید واژه ها: naringenin; mRNA-seq; miRNA-seq; سلول های HepaRG

4flavonoids anti-inflammatory

برای دریافت اطلاعات بیشتر محصول کلیک کنید

1. مقدمه

نارینگنینیک فلاونوئید طبیعی است که به وفور در مرکبات و سایر میوه های خوراکی مانند گریپ فروت، پرتقال، ترنج، گوجه فرنگی و انجیر یافت می شود [1]. پس از تجویز خوراکی، نارینژنین به طور گسترده در دستگاه گوارش و کبد توزیع می شود [2،3] و با فعالیت مهار رادیکال های آزاد به دلیل ساختار مولکولی خود، خاصیت آنتی اکسیدانی مستقیم از خود نشان می دهد و سیستم آنتی اکسیدانی درون زا را در کبد القا می کند [4]. شواهد رو به رشد از مطالعات in vitro و in vivo ظرفیت های محافظتی مختلف نارینگنین را شناسایی کرده است، مانندضد التهاب[5]، آنتی اکسیدان [6]، ضد فیبروز [Z]، و محافظ کبد 4،8| فعالیت ها. این ظرفیت‌ها نشان می‌دهد که نارینژنین غذایی می‌تواند برای پیشگیری از سندرم متابولیک و بیماری‌های بدخیم، از جمله هپاتیت برق‌آسا، چربی‌ها استفاده شود.بیماری کبدفیبروز و غیره 19،10]. با این حال، مطالعات دقیق کمی در مورد اثرات تنظیمی نارینژنین بر روی ژن های کلی کبد وجود دارد [4].

MicroRNA ها (miRNAs) کلاسی از مولکول های RNA غیر کدکننده و تک رشته ای با طول 18-26 نوکلئوتید کدگذاری شده توسط ژن های درون زا هستند که طیف وسیعی از عملکردهای تنظیمی بیولوژیکی را در فیلوژنی، تمایز، تکثیر و آپوپتوز نشان می دهند. [11]. miRNA، RNA های پیام رسان (mRNA) را با شناسایی توالی خاص متصل می کند، بیان ژن را در سطح پس از رونویسی از طریق تخریب mRNA های هدف به طور منفی تنظیم می کند [12]. تحت تحریک اگزوژن، بیان miRNA تغییر می کند و سپس بیان mRNA هدف تنظیم می شود. در نهایت، عملکردهای فیزیولوژیکی گسترده برای مقابله با چالش های ناشی از تحریک برون زا تغییر می کنند [13]. یک روش قابل اعتمادتر برای پیش‌بینی روابط هدف miRNA-mRNA، ادغام همزمان آنالیز mRNA-seq با تجزیه و تحلیل miRNA-seq با استفاده از یک زمینه پردازش خاص در سیلیکو است [14].

بنابراین، هدف ما بررسی اثرات نارینژنین بر ژن‌های جهانی و برجسته کردن مکانیسم تنظیمی احتمالی جفت‌های miRNA-mRNA در کبد بود. در مطالعه حاضر، تغییرات بیان mRNA و پروفایل های بیان miRNA در سلول های HepaRG با انجام mRNA-seq، miRNA-seq، آنالیزهای بیوانفورماتیک و qPCR بلادرنگ مورد بررسی قرار گرفت تا شواهدی برای پتانسیل نارینژنین به عنوان یک مکمل غذایی طبیعی ارائه شود.

flavonoids antioxidant

2. نتایج

2.1. تجزیه و تحلیل توالی رونوشت در پاسخ به نارینگنین

برای شناسایی تغییرات بیان mRNA ازسلول های HepaRGدر پاسخ به نارینگنین، هشت کتابخانه DNA(cDNA) مکمل در گروه کنترل (CK-1، CK-2، CK-3، و CK-4) و گروه آزمایش (T{4}}، T-2، T-3، و T-4) با RNA کل ساخته شدند و تحت توالی یابی Illumina HiSeq2500 قرار گرفتند (Genedenovo Biotechnology Co., Ltd, Guangzhou ، چین). مروری بر نتایج توالی یابی و مونتاژ برای گروه کنترل و گروه آزمایش در جدول 1 نشان داده شده است. تغییرات بیان ژن با مقایسه گروه های تیمار شده و کنترل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، گروه در معرض نارینگنین 1037 ژن بیان شده متفاوت (DEGs) را در مقایسه با گروه کنترل بیان کردند. یک نقشه حرارتی از 1037 درجه، تجزیه و تحلیل خوشه ای گروه کنترل و گروه نارینگنین را نشان داد (شکل 1b؛ 381 ژن تنظیم شده به بالا و 656 ژن پایین، جدول S1، مواد تکمیلی).

Summary of sequence data generated for HepaRG cells transcriptome and quality filtering.

با توجه به سیستم طبقه بندی ژن هستی شناسی (GO)، 1037 DEG به سه دسته عملکردی اصلی (فرایند بیولوژیکی، اجزای سلولی و عملکرد مولکولی) و 61 زیرمجموعه طبقه بندی شدند (شکل 2). در میان فرآیندهای بیولوژیکی، فرآیند سلولی (731) متداول‌ترین و پس از آن فرآیند تک ارگانیسم (672) و تنظیم بیولوژیکی (595) بود. در دسته اجزای سلولی، بخش قابل توجهی از خوشه ها به سلول (727)، بخش سلول (721) و اندامک (580) اختصاص یافت. ژن های دخیل در اتصال (666) و فعالیت کاتالیزوری (238) گروه به طور قابل توجهی در دسته عملکرد مولکولی نشان داده شدند.

Figure 1. Identification of differentially expressed messenger RNAs (mRNAs) in response to naringenin.(a)Volcano plot showed that all non-redundant unigenes were identified in the control group and the naringenin group. The 20,285gray dots represent non-significantly differentially expressed mRNAs, the 381 red dots represent significantly differentially up-regulated mRNAs, and the 656 blue dots represent significantly differentially down-regulated mRNAs; FC(fold change)= the naringenin group/the control group;FDR(false discovery rate), the expected percent of false predictions in the set of predictions;(b)heat map showing 1037 differentially expressed genes(DEGs), comparing the control group with the naringenin group. Each row represents one mRNA, and each column represents a sample. Red, upregulation;blue, downregulation; CK-1,CK-2, CK-3, and CK-4, the control group;T-1, T-2,T-3,and T-4, the naringenin group.

Gene Ontology (GO) terms categorization of 1037 DEGs. Number of genes: number of target genes in a term. Red, upregulation; green, downregulation; CK, the control group; T, the naringenin group

طبقه‌بندی کیوتو دایره‌المعارف ژن‌ها و ژنوم‌ها (KEGG) برای 1037 DEG یافت شد که بر اساس کوچک‌ترین مقدار Q و بزرگترین GeneNumber در حاشیه‌نویسی مسیر در بیست مسیر بیوشیمیایی برتر طبقه‌بندی شدند (شکل 3). تعداد ژن و نسبت ژن های مشروح پنج مسیر اصلی عبارتند از: لوپوس اریتماتوز سیستمیک (33.8.4 درصد)، اعتیاد به الکل (38.9.67 درصد)، تنظیم نادرست رونویسی در سرطان ها (22، 5.6 درصد)، مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt (34، 8.65 درصد) و آبشارهای مکمل و انعقادی (12، 3.05 درصد o). بیش از 10 ژن غنی شده در بین پنج مسیر وجود داشت. به طور کلی، تحت درمان با نارینژنین تأثیر قابل توجهی بر پروفایل بیان ژن جهانی سلول‌های HepaRG داشت. این نتایج نشان می‌دهد که ژن‌های درگیر در این مسیرها ممکن است نقش مهمی در تنظیم نارینگنین داشته باشند.

Top 20 pathways of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) terms for 1037 DEGs. GeneNumber: number of target genes in a pathway. RichFactor: ratio of number of target genes divided by number of all the genes in a term or pathway

2.2. تجزیه و تحلیل سطوح رونوشت miRNA در پاسخ به نارینگنین

در این مطالعه، ما با هدف تعیین اینکه آیانارینگنینقرار گرفتن در معرض سطح بیان miRNA ها در سلول های HepaRG را تغییر می دهد. پس از قرار گرفتن در معرض، ما RNA های کوچک را جمع آوری کردیم و فراوانی نسبی آنها را با استفاده از Illumina HiSeq2500 (شرکت بیوتکنولوژی Genenedenovo، با مسئولیت محدود، گوانگژو، چین) اندازه گیری کردیم. همانطور که در جدول 2 نشان داده شده است، به ترتیب پس از حذف آلاینده، خوانش تمیز هشت نمونه تولید شد. یک نمای کلی از خواندن برای توالی RNA کوچک از داده های خام به کیفیت بالا و با فیلتر کردن با کیفیت در جدول 2 ارائه شده است. ).

. Summary of sequence data generated for HepaRG cells' small RNA and quality filtering.

bution of the small RNA sequence. CK-1, CK-2, CK-3, and CK-4, the control group; T-1, T-2, T- 3, and T-4, the naringenin group. Figure 4. The length distribution of the small RNA sequence. CK-1, CK-2, CK-3, and CK-4, the control group; T-1, T-2, T-3, and T-4, the naringenin group.

همه RNA های کوچک در پایگاه داده GeneBank (نسخه 209.{3}}) و پایگاه داده Rfam (11.0) برای شناسایی و حذف RNA ریبوزومی (rRNA)، RNA شرطی کوچک (scRNA)، تراز شدند. هسته کوچک (snoRNA)، هسته کوچک (snRNA) و RNA انتقالی (tRNA). مطابق با ژنوم مرجع، این RNA های کوچک نگاشت شده به اگزون ها، اینترون ها و توالی های تکراری نیز حذف شدند. RNA های کوچک فیلتر شده در پایگاه داده miRBase (نسخه 21) برای شناسایی miRNA ها جستجو شدند. نقشه حرارتی 3373 miRNA تجزیه و تحلیل خوشه ای گروه کنترل و گروه نارینگنین را در شکل 5a نشان می دهد. پروفایل Illumina HiSeq2500 از 3373 miRNA تجزیه و تحلیل شده در مواجهه با نارینگنین در مقایسه با نمونه های شاهد نشان داد که در مجموع 234 miRNA متفاوت بیان شده (DEMs، 174 به بالا و 60 تنظیم شده پایین؛ جدول S2، مواد تکمیلی) در سلول های HepaRG قابل تشخیص هستند (شکل5G) .

re 5. Identification of differentially expressed microRNA (miRNAs) in response to naringenin. (a) Heat map of 3373 expressed miRNAs in response to naringenin. Each row represents one miRNA, and each column represents a sample. Red, upregulation; blue, downregulation; CK-1, CK-2, CK-3, and CK-4, the control group; T-1, T-2, T-3, and T-4, the naringenin group; (b) scatter plot showing 234 DEMs (174 up- and 60 down-regulated) comparing the control group with the naringenin group. Each dot represents one miRNA. Red, upregulation; green, downregulation; blue, non-significance. CK, the control group; T, the naringenin group. 2.3. Target Prediction and Integration Analysis of mRNA and miRNA Expression Profiles in Response to Naringenin Acting at the post-transcriptional level, miRNAs silence and/or down-regulate cellular mRNA gene expression by target RNA cleavage. To predict the target genes of 234 DEMs, we performed computational analyses using the RNAhybrid (v2.1.2) + svmlight (v6.01), Miranda (v3.3a), and TargetScan (Version: 7.0). The simultaneous profiling of 234 DEMs and 1037 DEGs levels in silico can identify the presumptive target mRNAs of miRNAs. We selected the intersection of DEGs and target genes of DEMs, and then performed bioinformatics analysis on these intersection genes. A total of 5607 negative miRNAmRNA pairs for naringenin treatment were obtained, with the involvement of 216 DEMs and 681 DEGs (Table S3, Supplementary Materials). In line with the GO classification sysFigure 5. Identification of differentially expressed microRNA (miRNAs) in response to naringenin. (a) Heat map of 3373 expressed miRNAs in response to naringenin. Each row represents one miRNA, and each column represents a sample. Red, upregulation; blue, downregulation; CK-1, CK-2, CK-3, and CK-4, the control group; T-1, T-2, T-3, and T-4, the naringenin group; (b) scatter plot showing 234 DEMs (174 up- and 60 down-regulated) comparing the control group with the naringenin group. Each dot represents one miRNA. Red, upregulation; green, downregulation; blue, non-significance. CK, the control group; T, the naringenin group.

2.3. پیش‌بینی هدف و تجزیه و تحلیل ادغام نمایه‌های بیان mRNA و miRNA در پاسخ به Naringenin

با عمل در سطح پس از رونویسی، miRNA ها بیان ژن mRNA سلولی را با برش RNA هدف خاموش و/یا تنظیم پایین می‌آورند. برای پیش‌بینی ژن‌های هدف 234 DEMs، ما آنالیزهای محاسباتی را با استفاده از RNAhybrid (v2.1.2) به همراه نورگیر (v6) انجام دادیم. .01)، Miranda (نسخه 3.3a)، و TargetScan (نسخه:7.0). پروفایل همزمان 234 DEM و سطوح 1037 DEG در سیلیکو می تواند mRNA های هدف فرضی miRNA ها را شناسایی کند. ما محل تلاقی DEG ها و ژن های هدف DEM را انتخاب کردیم و سپس آنالیز بیوانفورماتیکی را روی این ژن های تقاطع انجام دادیم. در مجموع 5607 جفت miRNA-mRNA منفی برای درمان نارینگنین، با دخالت 216 DEM و 681 درجه (جدول S3، مواد تکمیلی) به دست آمد. مطابق با سیستم طبقه بندی GO، 681 DEG در 58 زیرمجموعه طبقه بندی شدند (شکل 6). سه زیرمجموعه اول در سه دسته عملکردی اصلی در مقایسه با تحلیل توالی رونوشت تغییر نکرده بودند (شکل 2 و 6).

Gene Ontology terms categorization of 681 DEGs. Number of genes: number of target genes in a term. Red, upregulation; green, downregulation; CK, the control group; T, the naringenin group.

تجزیه و تحلیل غنی سازی مسیر برای 681 درجه از 5607 جفت miRNA-mRNA منفی، بیست مسیر برتر را با توجه به کوچکترین مقدار q و بزرگترین GeneNumber در حاشیه نویسی مسیر پس از قرار گرفتن در معرض نارینگنین (شکل 7): با مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt شناسایی کرد.965، درصد) هشتمین مسیر و دومین مسیر فراوان است.

Top 20 pathways of KEGG terms for 681 DEGs. GeneNumber: number of target genes in a pathway. RichFactor: ratio of number of target genes divided by number of all the genes in a term or pathway. 2.4. Real-Time qPCR Validation of Naringenin Regulation in Liver Metabolism and Potential Regulatory miRNA-mRNA Pairs According to global gene function annotations, literature review, and their potential relationship with naringenin-responsive miRNAs, 19 DEGs (ALOX15, CA9, TH, HKDC1, NDUFA4L2, RRM2, ACSL5, PLA2G4C, LIPT2, UGDH, FTCD, ABAT, AZIN2, HS6ST3, B4GALT6, GUSB, DCT, ALAS2, and MAT1A) were manually selected as representatives for their potential roles in liver metabolism. In addition, the PI3K–Akt signaling pathway had been significantly enriched (fourth in the KEGG of RNA-seq analysis, Figure 3; eighth in the KEGG of miRNA-RNA-seq analysis, Figure 7); therefore, 11 DEGs (PDGFRB, CSF1R, FGFR2, IL2RG, IL7R, ITGB4, GNG4, PCK1, CREB3L3, CREB3L1, and NFκB1) among the PI3K–Akt signaling pathway were screened out. We here described the interaction between the 30 DEGs and 11 human miRNAs (hsamiR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-6837-5p, hsamiR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-519a-3p, hsa-miR-7-5p, and hsa-miR- 200a-5p), including 20 negative miRNA–mRNA interactions (Figure 8). As shown in Figure 8, a single miRNA can regulate multiple target mRNAs and vice versa (e.g., ABAT, HS6ST3, B4GALT6, and DCT could possibly be simultaneously regulated by hsa-miR-429; HS6ST3 may be simultaneously regulated by hsa-miR-429, hsa-miR-100-3p, hsa-miR- 519a-3p, hsa-miR-676-3p, hsa-miR-7-5p, and hsa-miR-194-5p; some DEGs had no paired DEMs). The expression profiles of 19 DEGs related to liver metabolism and 11 DEGs among the PI3K–Akt signaling pathway were further validated using real-time qPCR (Figure 9a,b). The expression level of 11 human miRNAs (two up- and nine down-regulated) was further assessed for naringenin-induced changes by real-time qPCR consistent with sequencing results (Figure 9c). Although there were some quantitative differences Figure 7. Top 20 pathways of KEGG terms for 681 DEGs. GeneNumber: number of target genes in a pathway. RichFactor: ratio of number of target genes divided by number of all the genes in a term or pathway

2.4. اعتبارسنجی qPCR زمان واقعی تنظیم نارینگنین در متابولیسم کبد و جفت‌های تنظیم‌کننده بالقوه miRNA-mRNA

با توجه به حاشیه نویسی عملکرد ژن جهانی، بررسی ادبیات، و ارتباط بالقوه آنها با miRNA های پاسخگو به نارینگنین، 19 DEG (ALOX15، CA9، TH، HKDC1، NDUFA4L2، RRM2، ACSL5، PLA2G4C، LIPT2، UGDH، FTCDAZINSTAS2ABAT، ، B4GALT6، GUSB، DCT، ALAS2 و MAT1A) به صورت دستی به عنوان نمایندگان برای نقش بالقوه آنها در متابولیسم کبد انتخاب شدند. علاوه بر این، مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt به طور قابل توجهی غنی شده بود (چهارمین در KEGG تجزیه و تحلیل RNA-seq، شکل 3؛ هشتم در KEGG تجزیه و تحلیل miRNA-RNA-seq، شکل 7). بنابراین. 11 درجه (PDGFRB. CSF1R. FGFR2، IL2RG، IL7R، ITGB4، GNG4، PCK1، CREB3L3، CREB3L1، و NFkB1) در میان مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt غربال شد.

ما در اینجا تعامل بین 30 درجه و 11 miRNA انسانی (hsa-miR-1306-5p, hsa-miR-627-3p, hsa-miR-194-3p, hsa-miR{{9 را شرح دادیم. }}p، hsa-miR-6837-5p، hsa-miR-429، hsa-miR-100-3p، hsa-miR-194-5p، hsa-miR{19} }a-3p، hsa-miR-7-5p، و hsa-miR-200a-5p، از جمله 20 برهمکنش miRNA-mRNA منفی (شکل 9). همانطور که در شکل 9 نشان داده شده است، یک miRNA منفرد می تواند چندین mRNA هدف را تنظیم کند و بالعکس (به عنوان مثال، ABAT HS6ST3، B4GALT6، و DCT احتمالاً می توانند به طور همزمان توسط hsa-miR{35}} تنظیم شوند؛ HS6ST3 ممکن است به طور همزمان توسط RhsmiRh تنظیم شود. -429، hsa-miR-100-3p،hsa-miR-519a-3p، hsa-miR-676-3p، hsa-miR-7-5 p و hsa-miR{50}}p؛ برخی از DEG ها هیچ DEM جفتی نداشتند). نمایه های بیانی 19 DEG مربوط به متابولیسم کبد و 11 DEG در میان مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt با استفاده از qPCR بلادرنگ اعتبار بیشتر شد (شکل 9a,b). سطح بیان 11 miRNA انسانی (دو تا به بالا و نه تنظیم شده پایین) بیشتر برای تغییرات ناشی از نارینژنین توسط qPCR بلادرنگ مطابق با نتایج توالی یابی ارزیابی شد (شکل 9c). اگرچه برخی تفاوت‌های کمی بین دو پلتفرم تحلیلی وجود داشت، شباهت‌های بین داده‌های RNA-seq و PCR بلادرنگ نشان می‌دهد که داده‌های RNA-seq قابل تکرار و قابل اعتماد هستند.

Putative miRNA–mRNA negative correlation network in response to naringenin. Rectangular nodes, mRNAs; diamond nodes, miRNAs.

ure 9. Relative mRNA and miRNA expression of the control group and the naringenin group, in respect to RNA-seq and real-time qPCR. (a) The 19 genes involved in liver metabolism; (b) 11 genes involved in the PI3K–Akt signaling pathway; (c) 11 putative regulatory miRNAs. Y-axis represents log2 (FC); FC (fold change) = the naringenin group/the control group. The dashed line indicated fold change data of 2.0. Values are the mean ± SD (n = 4). 3. Discussion and Conclusions The findings discussed here reveal the first detailed information regarding parallel mRNA and miRNA expression changes in HepaRG cells in response to naringenin. We performed an integrative analysis of these data including 234 DEMs and 1037 DEGs induced by naringenin, which provide global insight into the miRNA–mRNA interactions of naringenin in the regulatory mechanism. According to the gene function annotations and literature review, 19 DEGs related to metabolism were screened out. In particular, the PI3K–Akt signaling pathway was significantly enriched both in analysis of transcriptome sequencing (the third-most abundant, and ranked fourth) and integration analysis of miRNA-mRNA expression profiles (the second-most abundant, and ranked eighth) in responses to naringenin. In addition, 11 DEGs in the PI3K–Akt signaling pathway were further validated using real-time qPCR analysis. In this work, we constructed a miRNAmRNA regulatory network according to the DEMs and DEGs datasets and miRNA-targeting information. Some studies have demonstrated that the miRNA–mRNA regulatory network responds to liver damage, including hepatocellular carcinoma and oxidative stress [15]. Although several miRNA-induced RNA activation phenomena were identified [16], under most circumstances, the negative correlation between miRNAs and their target mRNAs is often considered support for miRNA targeting [17]. Ultimately, 20 miRNAmRNA negative correlation pairs were identified with the involvement of liver metabolism and the PI3K–Akt signaling pathway. With regard to global genes, we addressed our particular research question using pathway analysis to highlight 19 DEGs related to the functional clusters: metabolism, including Lipid metabolism (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C, and B4GALT6), Energy metabolism (CA9 and NDUFA4L2), Metabolism of cofactors and vitamins (TH, LIPT2, and Figure 9. Relative mRNA and miRNA expression of the control group and the naringenin group, in respect to RNA-seq and real-time qPCR

ure 9. Relative mRNA and miRNA expression of the control group and the naringenin group, in respect to RNA-seq and real-time qPCR. (a) The 19 genes involved in liver metabolism; (b) 11 genes involved in the PI3K–Akt signaling pathway; (c) 11 putative regulatory miRNAs. Y-axis represents log2 (FC); FC (fold change) = the naringenin group/the control group. The dashed line indicated fold change data of 2.0. Values are the mean ± SD (n = 4). 3. Discussion and Conclusions The findings discussed here reveal the first detailed information regarding parallel mRNA and miRNA expression changes in HepaRG cells in response to naringenin. We performed an integrative analysis of these data including 234 DEMs and 1037 DEGs induced by naringenin, which provide global insight into the miRNA–mRNA interactions of naringenin in the regulatory mechanism. According to the gene function annotations and literature review, 19 DEGs related to metabolism were screened out. In particular, the PI3K–Akt signaling pathway was significantly enriched both in analysis of transcriptome sequencing (the third-most abundant, and ranked fourth) and integration analysis of miRNA-mRNA expression profiles (the second-most abundant, and ranked eighth) in responses to naringenin. In addition, 11 DEGs in the PI3K–Akt signaling pathway were further validated using real-time qPCR analysis. In this work, we constructed a miRNAmRNA regulatory network according to the DEMs and DEGs datasets and miRNA-targeting information. Some studies have demonstrated that the miRNA–mRNA regulatory network responds to liver damage, including hepatocellular carcinoma and oxidative stress [15]. Although several miRNA-induced RNA activation phenomena were identified [16], under most circumstances, the negative correlation between miRNAs and their target mRNAs is often considered support for miRNA targeting [17]. Ultimately, 20 miRNAmRNA negative correlation pairs were identified with the involvement of liver metabolism and the PI3K–Akt signaling pathway. With regard to global genes, we addressed our particular research question using pathway analysis to highlight 19 DEGs related to the functional clusters: metabolism, including Lipid metabolism (ALOX15, ACSL5, PLA2G4C, and B4GALT6), Energy metabolism (CA9 and NDUFA4L2), Metabolism of cofactors and vitamins (TH, LIPT2, and Figure 9. Relative mRNA and miRNA expression of the control group and the naringenin group, in respect to RNA-seq and real-time qPCR

5flavonoids anticancer

3. بحث و نتیجه گیری

یافته‌های مورد بحث در اینجا اولین اطلاعات دقیق را در مورد تغییرات بیان mRNA موازی و miRNA در سلول‌های HepaRG در پاسخ بهنارینگنین. ما یک تجزیه و تحلیل یکپارچه از این داده‌ها شامل 234 DEM و 1037 DEG القا شده توسط naringenin انجام دادیم که بینش جهانی را در مورد تعاملات miRNA-mRNA نارینگنین در مکانیسم تنظیمی ارائه می‌دهد. با توجه به حاشیه نویسی عملکرد ژن و بررسی ادبیات، 19 DEG مربوط به متابولیسم غربال شد. به طور خاص، مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt هم در تجزیه و تحلیل توالی رونوشت (سومین فراوان ترین و رتبه چهارم) و هم در تجزیه و تحلیل یکپارچه سازی پروفایل های بیان miRNA-mRNA (دومین فراوان ترین، و رتبه هشتم) غنی شد. در پاسخ به نارینگنین علاوه بر این، 11 درجه در مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt با استفاده از تجزیه و تحلیل qPCR بلادرنگ اعتبار بیشتر شد. در این کار، ما یک شبکه تنظیمی miRNA-mRNA را با توجه به مجموعه داده‌های DEMs و DEGs و اطلاعات هدف‌یابی miRNA ساختیم. برخی از مطالعات نشان داده اند که شبکه تنظیم کننده miRNA-mRNA به آن پاسخ می دهدآسیب کبدیاز جمله سرطان کبد و استرس اکسیداتیو [15]. اگرچه چندین پدیده فعال‌سازی RNA ناشی از miRNA شناسایی شد [16]، در بیشتر شرایط، همبستگی منفی بین miRNA ها و mRNA های هدف آنها اغلب پشتیبانی برای هدف‌گیری miRNA در نظر گرفته می‌شود [17]. در نهایت، 20 جفت همبستگی منفی miRNA-mRNA با دخالت متابولیسم کبد و مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt شناسایی شدند.

با توجه به ژن‌های جهانی، ما به سؤال تحقیقاتی خاص خود با استفاده از تجزیه و تحلیل مسیر پرداختیم تا 19 DEG مربوط به خوشه‌های عملکردی را برجسته کنیم: متابولیسم، از جمله متابولیسم لیپید (ALOX15، ACSL5، PLA2G4C، و B4GALT6)، متابولیسم انرژی (CA9 و NDUFA4L2) متابولیسم کوفاکتورها و ویتامین ها (TH، LIPT2 و FTCD)، متابولیسم اسیدهای آمینه (RRM2، AZIN2، DCT، ALAS2، و MAT1A)، بیوسنتز و متابولیسم گلیکان (HS6ST3 و GUSB) و متابولیسم کربوهیدرات ها» (HKDC1, PCK1, UGDH و ABAT) این 19 DEG غنی شده برای متابولیسم عمدتاً در حساسیت به انسولین، تجمع چربی، ذخیره گلیکوژن و مصرف انرژی نقش دارند. CA9 در موش‌های BALB/C [19]، بیماری کبد چرب غیرالکلی نازک (NAFLD) [20]، HKDC1 [21]، و تنظیم افزایشی UGDH [22] می‌تواند به طور قابل‌توجهی استرس اکسیداتیو، تجمع چربی و آسیب کبدی را کاهش دهد. نابودی NDUFA4L2 تجمع ROS را سرکوب کرد یون و آپوپتوز در سلول های کارسینوم کبدی (HCC) [23]. خاموش کردن RRM2 تکثیر سلولی NCI-H929 را مهار کرد [24] و بیان بیش از حد FTCD با ترویج آسیب DNA و القای آپوپتوز سلولی در سلول های HCC، تکثیر سلولی را سرکوب کرد [25]. فرسایش ACSL5 باعث بهبود حساسیت به انسولین، افزایش مصرف انرژی و تاخیر در جذب تری گلیسیرید در موش شد [26]. مکمل DCT استئاتوز و التهاب کبد مرتبط با سن را بهبود بخشید [27]. تشکیل قطرات لیپید بر اثر تحریک اسید چرب و ویروس هپاتیت C در سلول‌های نابودکننده PLA2G4C مختل شد [28]. تنظیم پایین LIPT2 سنتز اسیدهای چرب را مهار کرد [29]. افزایش تنظیم ABAT [30]، AZIN2 [31]، B4GALT6 [32]، HS6ST3 [33] و GUSB [34] می‌تواند باعث تجزیه اسید چرب و گلیکوژن شود. بیان بیش از حد ALAS2 می تواند ظرفیت خون ساز کبد را بهبود بخشد [35l، و MAT1A بیان شده در سلول های کبدی حالت تمایز این سلول ها را حفظ کرد [36]. مطابق با یافته های شرح داده شده در بالا، تنظیم این ژن های متابولیک در نتایج ما ممکن است برای بهبود متابولیسم در پاسخ به نارینگنین مطلوب باشد.

مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt ممکن است سرنخ هایی برای مکانیسم مولکولی درگیر در متابولیسم، التهاب و استرس اکسیداتیو [37] ارائه دهد که نقشی محوری در پاسخ به نارینگنین ایفا می کند. مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt دارای اثرات پایین دستی متنوعی بر متابولیسم سلولی از طریق تنظیم مستقیم ناقلان مواد مغذی و آنزیم های متابولیک یا کنترل عوامل رونویسی است که بیان اجزای کلیدی مسیرهای متابولیک را تنظیم می کند [38،39]، از جمله متابولیسم گلوکز، بیوسنتز. ماکرومولکول ها و حفظ تعادل ردوکس. گزارش شده است که خاموش کردن PDGFRB از فعال شدن و تکثیر سلول های ستاره ای کبدی و بهبود فیبروز کبدی جلوگیری می کند [40]. انتظار می رود که مهار مشترک CSF1R و FGFR2 با هدف قرار دادن فرار ایمنی و رگزایی در ریزمحیط تومور، اثرات ضد توموری را افزایش دهد [41]. از بین بردن ITGB4 باعث سرکوب گلیکولیز در فیبروبلاست های مرتبط با سرطان شد [42]. نابودی ژنتیکی PCK1 از افزایش ناشی از اسید چرب در شار اکسیداتیو، استرس اکسیداتیو و التهاب [43] جلوگیری کرد، که همچنین با مسیرهای سیگنالینگ تحت کنترل انسولین ارتباط داشت [44]. نشان داده شد که بیان بیش از حد CREB3L3 هسته ای باعث لیپولیز سیستمیک، کتوژنز کبدی و حساسیت به انسولین با افزایش مصرف انرژی می شود [45]. طبق گزارش ها، مهار CREB3L1 تهاجم و متاستاز سرطان را مسدود می کند [46]. NFkB یک تنظیم کننده کلیدی توسعه ایمنی، پاسخ های ایمنی، التهاب و سرطان است [47]. به خوبی ثابت شده است که سرکوب NFkB trans سیگنال های ضد التهابی را کاهش می دهد و التهاب را کاهش می دهد [48]. در مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt، نتایج ما نشان داد که نارینگنین به طور قابل‌توجهی بیان‌های mRNA PDGFRB، PCK1، CREB3L1، و NFkB1 را با miRNA‌های مرتبط (has-miR-1306-5p و hsa-miR{40}) کاهش داد. }p) به میزان قابل توجهی کاهش یافته است. بنابراین، داده‌های ما نشان می‌دهد که نارینژنین ممکن است از طریق مهار مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt، نقش مفیدی در متابولیسم ضد التهابی، ضد اکسیداتیو و بهبود دهنده داشته باشد.

این مطالعه اولین مطالعه ای بود که تجزیه و تحلیل mRNA-seq و miRNA-seq را در کبد در پاسخ به naringenin ادغام کرد و چشم اندازی از متابولیسم در تنظیم نارینگنین ارائه داد. از نظر متابولیسم و ​​مسیر سیگنالینگ PI3K-Akt، 11 جفت DEM، 30 درجه و 20 جفت miRNA-mRNA به تحقیقات بیشتری برای فعالیت های نارینگنین نیاز دارند. این تحقیق محدودیت هایی دارد. به عنوان مثال، اثرات وابسته به دوز و وابسته به زمان نارینژنین در تعاملات miRNA-mRNA هنوز نامشخص بود. اگرچه miRNA های داده شده که در سیلیکون تجزیه و تحلیل شده اند، ظرفیت های نظارتی را پیشنهاد می کنند، عملکرد آنها باید در یک زمینه خاص در یک سیستم زنده تأیید شود. به طور خلاصه، ما تحقیقات مقدماتی را در مورد تجزیه و تحلیل بیان mRNA و miRNA و پروفایل متابولیسم ارائه کردیم. مکانیسم تنظیمی جفت‌های miRNA-mRNA می‌تواند شواهد احتمالی اضافی برای توضیح ارزش غذایی نارینگنین باشد.

Effects on protection liver of cistanche

4. مواد و روش ها

4.1. مواد شیمیایی و معرف ها

رده سلولی HepaRG در اصل از Biopredic International (رن، فرانسه) خریداری شد. محیط RPMI-1640 و محلول پنی سیلین-استرپتومایسین-گلوتامین از Gibco (Gaithersburg، MD، ایالات متحده آمریکا) تهیه شد. سرم جنین گاوی (FBS) از Corning (اوکلند، نیوزیلند) خریداری شد. Naringenin و دی متیل سولفوکسید (DMSO) از Sigma-Aldrich (St.Louis، MO، USA) بودند. معرف TRIzolTM توسط Thermo Fisher (Carlsbad، CA، USA) عرضه شد. آب فوق خالص توسط یک سیستم تصفیه آب دانشگاهی Milli-O (میلیپور، بدفورد، MA، ایالات متحده آمریکا) تصفیه شد. همه معرف های دیگر محصولات تجاری با بالاترین درجه تحلیلی موجود بودند.

4.2. کشت سلول های HepaRG

سلول‌های HepaRG در 5×10*سلول بر سانتی‌متر در پلیت‌های شش چاهی کاشته شدند و در محیط کشت RPMI{4}} کشت داده شدند، با یا بدون 100 میکرومولار نارینژنین به مدت 48 ساعت کشت و با 10 درصد FBS و 1 درصد آنتی‌بیوتیک تکمیل شد. (100 واحد بر میلی لیتر پنی سیلین و 100 میکروگرم در میلی لیتر استرپتو-مایسین) در 37 درجه در انکوباتور CO 5 درصد مرطوب شده. CK-1، CK-2، CK-3 و CK-4 به گروه کنترل کنترل اشاره دارد. T{18}}، T{19}}، T{20}} و T{21}} به گروه درمان نارینگنین 100 میکرومولار اشاره دارد. اعداد 1، 2، 3 و 4 نمونه هایی از چهار آزمایش تکراری مستقل را نشان می دهند.

4.3. استخراج RNA کل

سلول های HepaRG دو بار با سالین بافر فسفات سرد (PBS) شسته شدند و طبق توصیه سازنده با معرف TRIZolTM برداشت شدند. اسپکتروفتومترهای Thermo Scientific NanoDropTM2000 c (Wilmington, DE, USA) برای اندازه گیری کیفیت و کمیت RNA هر نمونه طبق پروتکل سازنده استفاده شد.

4.4. توالی یابی RNA

mRNA توسط دانه های Oligo(dT) غنی شد، سپس mRNA غنی شده قطعه قطعه شد و با پرایمرهای تصادفی توسط کیت استخراج OiaOuick PCR (Qiagen، Venlo، هلند) به cDNA رونویسی معکوس شد. مولکول های RNA در محدوده اندازه 18-30 nt با الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید غنی شدند. آداپتورهای 3' و 5' اضافه شدند، سپس RNAهای غنی شده مطابق دستورالعمل سازنده (Qiagen، Venlo، هلند) توسط کیت استخراج QiaQuick PCR رونویسی معکوس شدند. محصولات بستن اندازه با الکتروفورز ژل آگارز انتخاب شدند. چهار نمونه در گروه نارینگنین و چهار نمونه در گروه کنترل وجود داشت. هر نمونه دو کتابخانه cDNA تولید کرد: یکی برای mRNA-seq و دیگری برای miRNA-seg. محصولات تقویت شده با PCR به ترتیب برای تولید 16 کتابخانه cDNA غنی شده و با استفاده از Ⅲlumina HiSeq2500 توسط Genedenovo Biotechnology Co (گوانگژو، چین) تعیین توالی شدند. داده‌های توالی‌یابی RNA و RNA کوچک در آرشیو خواندن توالی NCBI (شماره‌های دسترسی از SRR13675952 تا SRR13675963) ذخیره شدند.

4.5. qPCR زمان واقعی

رونویسی mRNA به cDNA با سیستم رونویسی معکوس GoScriptTM (Promega, Madison, WI, USA) از 3 ug کل RNA مطابق دستورالعمل سازنده انجام شد. برای تجزیه و تحلیل miRNA، سنتز cDNA با سنتز cDNA رشته اول miRNA (Tailing Reaction، Sangon Biotech، شانگهای، چین) از 2 ug از RNA کل انجام شد.

با GoTaq® qPCR Master Mix(Promega، Madison، WI، USA) در LightCycler 480 (روش، مانهایم، آلمان)، همانطور که توسط سازنده توصیه شده است. روش چرخه حرارتی با دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه شروع شد. به دنبال آن 45 چرخه دناتوراسیون برای 10 ثانیه در 95 درجه، اتصال پرایمر به مدت 20 ثانیه در 60 درجه و افزایش طول برای 20 ثانیه در 72 درجه انجام شد. این روش با تقویت نهایی در 95 درجه برای 5 ثانیه، 65 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، افزودن یک مرحله منحنی تفکیک و یک مرحله خنک کننده به پایان رسید. پرایمرها از Sangon Biotech (شانگهای، چین) خریداری شدند. توالی های جفت آغازگر مورد استفاده برای اعتبارسنجی امضا در جداول 3 و 4 توضیح داده شده است. مقادیر Ct با اشاره به -اکتین یا U6 محاسبه شد.

image

image

4.6. تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک و آمار

DEG ها و DEM ها با استفاده از یک بسته نرم افزاری مبتنی بر R شناسایی شدند. مقدار آستانه برای انتخاب DEG ها و DEM ها q-value (p-value تعدیل شده) کمتر یا مساوی با 0 بود.0تغییر 5 و برابری (FC) بزرگتر یا مساوی 2 یا کمتر از یا مساوی 0.5 است. طبقه بندی KEGG و GO شامل توابع مولکولی، فرآیندهای بیولوژیکی و اجزای سلولی برای تجزیه و تحلیل DEGs و DEMs استفاده شد.

نتایج سنجش بیولوژیکی در قالب میانگین ± انحراف معیار بر اساس چهار آزمایش مستقل در GraphPad Prism 8 ارائه شده است.

مواد تکمیلی: موارد زیر به صورت آنلاین در https://www.mdpi.com/1422-0 067/22/5/2292/s1 موجود است: جدول S1، شناسایی 1037 mRNA با بیان متفاوت در پاسخ به نارینگنین. جدول S2، شناسایی 234 miRNA با بیان متفاوت در پاسخ به نارینگنین. جدول S3، شناسایی 5607 جفت miRNA-mRNA منفی در پاسخ به نارینگنین، با دخالت 216 DEM و 681 درجه در مجموع

منابع

1. صالحی، ب. فوکو، PVT پتانسیل درمانی نارینگنین: مروری بر کارآزمایی‌های بالینی. Pharmaceuticals 2019, 12, 11. [CrossRef] [PubMed]

2. بای، ی. پنگ، دبلیو. یانگ، سی. زو، دبلیو. لیو، ام. وو، اچ. فن، ال. لی، پی. زنگ، ایکس. Su، W. فارماکوکینتیک و متابولیسم Naringin و متابولیت فعال Naringenin در موش‌ها، سگ‌ها، انسان‌ها و تفاوت‌های بین گونه‌ها. جلو. داروسازی 2020, 11, 364. [CrossRef]

3. جوشی، ر. کولکارنی، YA; Wairkar، S. فارماکوکینتیک، فارماکودینامیک و جنبه های فرمولاسیون Naringenin: به روز رسانی. زندگی علمی. 2018، 215، 43-56. [CrossRef]

4. هرناندز-آکوینو، ای. موریل، پی. اثرات مفید نارینژنین در بیماری های کبدی: مکانیسم های مولکولی. World J. Gastroenterol. 2018، 24، 1679–1707. [CrossRef]

5. وانگ، کیو. او، ی. در آغوش گرفتن.؛ ون، سی. یو، اس. چن، سی. خو، ال. زی، جی. دای، اچ. شیائو، اچ. و همکاران Naringenin با کاهش مسیر NLRP3/NF-kB در موش، بیماری کبد چرب غیر الکلی را کاهش می دهد. برادر J. Pharmacol. 2020، 177، 1806–1821. [CrossRef]

6. خان، تی. Ganaie, MA Naringenin با تنظیم توهین اکسیداتیو و التهابی در موش‌های صحرایی ویستار از سمیت ناشی از دوکسوروبیسین در بافت‌های کلیه جلوگیری می‌کند. قوس. فیزیول. بیوشیمی. 2020، 126، 300–307. [CrossRef]

7. وانگ، جی. دینگ، ی. Zhou، W. لیپوزوم های خود اصلاح شده با آلبومین برای درمان فیبروز کبدی از طریق مسیرهای وابسته به SPARC. بین المللی جی فارم. 2020, 574, 118940. [CrossRef]

8. کومتسی، ال. گواندر، ک. موفو ماتو، EP; هورشاند، آر. Owira، PMO با کاهش استرس اکسیداتیو، نارینجنین باعث کاهش افزایش قند خون ناشی از هیپرگلیسمی پروتئین مرتبط با فاکتور 2 اریتروئیدی کبدی می شود. جی فارم. داروسازی 2020، 72، 1394-1404. [CrossRef] [PubMed]

9. Rossino، MG; Casini، G. Nutraceuticals برای درمان رتینوپاتی دیابتی. Nutrients 2019, 11, 771. [CrossRef] [PubMed]

10. هرناندز-آکوینو، ای. Quezada-Ramírez، MA; سیلوا-الیوارس، آ. Casas-Grajales، S. راموس توار، ای. فلورس بلتران، RE; سگویا، جی. شیبایما، م. Muriel, P. Naringenin از طریق غیرفعال کردن سلول‌های ستاره‌ای کبدی و مسیرهای پروفیبروژنیک، پیشرفت فیفیبروز کبدی را کاهش می‌دهد. یورو J. Pharmacol. 2019، 865، 172730. [CrossRef] [PubMed]


شما نیز ممکن است دوست داشته باشید