تنظیم کننده اپی ژنتیک BRD4 در پاسخ التهابی ناشی از کادمیوم در کلیه موش صحرایی دخیل است

برای اطلاعات بیشتر:ali.ma@wecistanche.com

ژونگگو گونگ و همکاران

Cistanche tubulosa از بیماری کلیوی جلوگیری می کند، برای دریافت اینجا کلیک کنیدمحصولات و Cistanche DHT

چکیده

کادمیوم (Cd) به عنوان یک محرک التهابی بالقوه توصیف شده است، در حالی که شواهد فزاینده نشان می دهد که التهاب نامناسب یک عامل کمک کننده است.آسیب کلیه. از این رو، تحقیق در مورد پاسخ التهابی ناشی از کادمیوم برای روشن کردن مکانیسم کلیوی ناشی از کادمیوم اهمیت زیادی دارد. برومدامین حاوی 4(BRD4) یک تنظیم کننده مهم اپی ژنتیکی است که در ایجاد بسیاری از بیماری های التهابی دخیل است، اما نقش تنظیمی آن در ایجاد سی دیالتهابیپاسخ باید روشن شود در اینجا، ما دریافتیم که درمان با کادمیوم در موش‌های Sprague-Dawley (2 میلی‌گرم بر کیلوگرم وزن بدن، داخل صفاقی، 5 روز متوالی) و در موش صحراییسلول کلیهخط (NRK{0}}E، 0-10 میکرومولار، 12 ساعت) رونویسی سایتوکاین‌های التهابی را القا کرد، که می‌توان آن را با JQ1 (مهارکننده BRD4، 25 میلی‌گرم/کیلوگرم وزن بدن، داخل صفاقی) کاهش داد. 3 روز متوالی در داخل بدن؛ 0.5 میکرومولار، 12 ساعت در شرایط آزمایشگاهی) یا RNA مداخله گر کوچک BRD4 (siRNA، in vitro)، که نشان می دهد BRD4 در پاسخ التهابی ناشی از سی دی شرکت می کند. در مرحله بعد، مطالعه ما نقش BRD4 را در پاسخ التهابی ناشی از Cd روشن کرد. مهار BRD4 باعث کاهش جابجایی هسته‌ای NF-kB و فعال‌سازی Cd در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی شد. Cd سطح استیلاسیون RelA K310 را افزایش داد و اتصال BRD4 به NF-kB RelA استیله شده را در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی افزایش داد، که با مهار BRD4 لغو شد. به طور خلاصه، مطالعه ما نشان می دهد که BRD4 در رونویسی سیتوکین های التهابی ناشی از سی دی با واسطه فعال شدن مسیر سیگنالینگ NF-kB و افزایش اتصال خود به NF-kB RelA استیله در موش صحرایی نقش دارد.کلیه،بنابراین، BRD4 می تواند یک هدف درمانی بالقوه برای بیماری های کلیوی ناشی از Cd باشد.

کلید واژه ها: BRD4کادمیومالتهابی کلیهسیتوکین های NF-kB JQ1

1. مقدمه

کادمیوم (Cd) یک آلاینده فلز سنگین با سمیت بالا و نیمه عمر طولانی است. با توسعه تولید صنعتی، افزایش تهدید آلودگی کادمیوم برای امنیت محیطی و سلامت انسان باعث نگرانی شده است (وانگ و همکاران، 2020؛ هوریگوچی و اوگوما، 2016). پس از جذب توسط بدن، کادمیوم باعث آسیب چند اندام می شودکلیهاندام هدف اصلی است (فرناندو و همکاران، 2020؛ ژائو و همکاران، 2021). قبلاً، ما به طور سیستماتیک تأیید کردیم که مهار اتوفاژی، استرس اکسیداتیو و آپوپتوز به طور هم افزایی در سمیت کلیوی ناشی از Cd در موش‌ها نقش دارند (لیو و همکاران، 2017؛ وانگ و همکاران، 2017). التهاب یک پاسخ فیزیولوژیکی است که به عنوان یک واکنش دفاعی در برابر عفونت یا آسیب عمل می‌کند، اما پاسخ‌های التهابی کنترل‌نشده و نامناسب ناشی از کادمیوم می‌تواند باعث آسیب‌هایی مانند آسیب رساندن به بافت طبیعی اطرافیان و ترویج بیماری‌های خودایمنی شود (Hossein Khanazer et al., 2020; Zhang et al. al., 2020). پاسخ التهابی ناشی از کادمیوم باعث تشدید بیماری های قلبی عروقی و آسیب کبدی می شود که نشان می دهد التهاب ممکن است نقش مهمی در Cd با واسطه داشته باشد.کلیهفرآیندهای پاتولوژیک (فاگربرگ و همکاران، 2017؛ آلمیر و همکاران، 2019).

اپی ژنتیک به تغییرات ارثی در بیان ژن بر اساس تغییرات توالی غیر DNA اشاره دارد و برگشت پذیری این تغییرات، کشف اهداف درمانی جدید را امکان پذیر می کند (Vendetti and Rudin، 2013). خانواده برومودومین و دامنه خارج ترمینال (BET) شامل برومدامین حاوی 2 (BRD2)، BRD3، BRD4 و برومومین اختصاصی بیضه (BRDT) است که با دو برومومین مشخص می شود و به لیزین های استیله هیستون ها و غیر هیستون ها متصل می شوند. لوکرین و همکاران، 2014؛ چاترجی و بومن، 2018). پروتئین‌های BET به‌عنوان فعال‌کننده رونویسی بسیاری از ژن‌ها عمل می‌کنند، بنابراین چرخه سلولی، پاسخ التهابی، استرس اکسیداتیو و سایر فرآیندهای فیزیولوژیکی را در مدل‌های پاتولوژیک مختلف تنظیم می‌کنند (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 یک عضو کاملاً مطالعه شده از خانواده پروتئین BET است و تحقیقات انباشته آن را به عنوان یک هدف جدید اپی ژنتیکی در تنظیم انواع مختلف گزارش کرده است.بیماری های کلیویاز جمله نفریت مزمن، نفروپاتی دیابتی و آسیب تجربی کلیوی (Zeng and Zhou، 2002؛ Morgado-Pascual et al., 2019). تأیید شده است که BRD4 در فرآیند رونویسی وابسته به فاکتور هسته‌ای κB (NF-kB) برای تنظیم پاسخ‌های التهابی در بسیاری از بیماری‌ها شرکت می‌کند (Xu و Vakoc، 2014؛ سوارز-آلورز و همکاران، 2017). BRD4 را می توان توسط RelA استیله شده (زیر واحد NF-κB، یک ژن کد کننده پروتئین) در لیزین 310 (RelA-K310ac) از طریق برمودومین های آن به کار گرفت، بنابراین کیناز وابسته به سیکلین 9 (CDK9) را فعال می کند و فسفریله II را به پلیمراز ارتقا می دهد. رونویسی ژن های هدف NF-kB (حاجمیرزا و همکاران، 2018). مطالعات اخیر نشان می دهد که مهارکننده های BRD4 می توانند یک گزینه درمانی بالقوه برای بیماری های التهابی باشند. در مدل های آسیب نخاعی موش صحرایی، مهار BRD4 پاسخ التهابی را کاهش داد و باعث بهبود عملکرد میکروگلیا شد (Dey et al., 2019). همچنین، مهار BRD4 التهاب تجربی کلیه را در مدل‌های موشی انسداد یک طرفه حالب، GN پایه ضد غشایی و تزریق آنژیوتانسین II لغو کرد (Suarez-Alvarez et al., 2017).

با توجه به اثرات بالقوه پیش التهابی Cd و اثرات تنظیمی BRD4 بر التهاب، ما فرض کردیم که BRD4 در پاسخ التهابی ناشی از Cd نقش دارد. همانطور که انتظار می رفت، BRD4 فرآیند رونویسی سیتوکین های التهابی در مدل های کلیه موش صحرایی در معرض سی دی را واسطه می کند. مطالعه ما مکانیسم بالقوه‌ای را در پاسخ التهابی ناشی از کادمیوم نشان می‌دهد و بینش جدیدی در مورد درمان سمیت کلیوی ناشی از کادمیوم ارائه می‌کند.

2. مواد و روشها

2.1. مواد شیمیایی و آنتی بادی ها

کلرید کادمیوم (CdCl2، بی آب، 439800) از سیگما آلدریچ (Carlsbad، CA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شد. (به علاوه)-JQ1 (HY-13030) از MedChemExpress (Monmouth Junction، NJ، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. یک کیت استخراج پروتئین هسته ای از موسسه بیوتکنولوژی Beyotime (شانگهای، چین، P0027) خریداری شد. یک کیت لومینسانس شیمیایی کارآمد (ECL، 32209) و معرف سنجش پروتئین اسید بیسینکونیک (BCA، 23225) از Thermo Fisher Scientific (Madison، WI، ایالات متحده آمریکا) به دست آمد. آنتی بادی های اولیه علیه پروتئین های زیر استفاده شد: NF-kB p65 ({11}} AP)، IL{12}} ({13}}AP)، TNF- (17590-1-AP) از Proteintech Group (ووهان، چین)؛ -اکتین (3700 ثانیه)، هیستون H3 (His3، 4499)، Sirtuin 1 (Sirt1، 8469)، IgG خرگوش معمولی (IgG، 4394) از Cell Signaling Technology (دانورز، MA، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند. BRD4 (ab128874)، K (لیزین) استیل ترانسفراز 3 (KAT3B/Ep300، ab14984)، NF-kB RelA (استیل K310) (RelA-K310ac، ab19870)، Alexa Fluor® 488-Anti-rabbit73خرید شد از Abcam (کمبریج، انگلستان). آنتی بادی های دوم: IgG ضد موش بز (H به علاوه L) (115-035-003) و IgG ضد خرگوش بز (H به علاوه L) (111-035-003) از جکسون ایمونو ریسرچ (West Grove, PA, USA) خریداری شد. ).

2.2. حیوانات و آزمایشات

بیست و چهار موش Sprague-Dawley (نر، 6 هفته، 110-120 گرم) از شرکت پرورش حیوانات آزمایشی Pengyue (جینان، شاندونگ، چین) خریداری شدند. به موش‌ها اجازه دسترسی آزاد به غذا و آب در یک اتاق تحت کنترل محیطی داده شد (5 ± 24 درجه، چرخه نور/تاریکی 12 ساعت). رویه‌های آزمایشی برای آزمایش‌های حیوانی در دستورالعمل شورای جوامع اروپایی 2010/63/EU برای آزمایش‌های حیوانی قابل اجرا بودند و همه رویه‌ها توسط کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات دانشگاه یانگژو تأیید شدند. پس از یک هفته سازگاری، موش‌ها به طور تصادفی به چهار گروه تقسیم شدند: (1) گروه کنترل: حلال مربوطه (سالین فیزیولوژیکی یا محلول {{11}هیدروکسی پروپیل{12}}سیکلودکسترین) به صورت داخل صفاقی تزریق شد. (2) گروه Cd: CdCl2 (2 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن، محلول در سالین فیزیولوژیکی) به مدت 5 روز متوالی به صورت داخل صفاقی تزریق شد تا مدل مسمومیت با Cd ایجاد شود. (3) گروه Cd + JQ1: CdCl2 (2 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن) به مدت 5 روز متوالی به صورت داخل صفاقی برای ایجاد مدل مسمومیت با سی دی تزریق شد و JQ1 (25 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن، محلول در 2-هیدروکسی پروپیل{{{ 25}}محلول سیکلودکسترین) در روز 6-8 به صورت داخل صفاقی تزریق شد. (4) گروه JQ1: JQ1 (25 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن) به صورت داخل صفاقی در روزهای 6-8 تزریق شد. آمار محتوای کادمیوم در سرم و بافت کلیه موش در جدول S1 فهرست شده است که نشان دهنده ایجاد موفقیت آمیز مدل های موش در معرض سی دی است.

پس از 8 روز درمان، موش‌ها با دررفتگی دهانه رحم و تحت بیهوشی عمیق پس از 12 ساعت ناشتایی کشته شدند. بافت کلیه تشریح شد و 1 گرم بافت از هر کلیه به سرعت در دمای 80- درجه سانتیگراد برای وسترن بلات و تجزیه و تحلیل کمی PCR (qPCR) ذخیره شد. مقدار باقیمانده بافت به سرعت در 4 درصد پارافورمالدئید (PFA) برای رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی (IHC) تثبیت شد.

2.3. کشت و درمان سلولی

رده سلولی کلیه موش صحرایی (NRK{{0}}}E) از بانک سلولی شانگهای آکادمی علوم چین به دست آمد. S 00 U/mL) در شرایط مرطوب شده 5 درصد CO2 و 95 درصد هوا در دمای 37 درجه. CdCl2 (محلول در آب فوق خالص) و JQ1 (دی متیل سولفوکسید محلول) به طور جداگانه در دمای 4 درجه و 20- درجه نگهداری شدند و قبل از استفاده در محلول های کاری رقیق شدند. طرح آزمایشی به شرح زیر بود: (1) سلول ها با 0، 2.5، 5، 10 میکرومولار سی دی به مدت 12 ساعت، یا 5 میکرومولار سی دی برای 0، 6، 12، 24 ساعت برای انجام سنجش های بعدی تیمار شدند. (2) سلول ها با 5 میکرومولار کادمیوم و / یا 0.5 میکرومولار JQ1 به مدت 12 ساعت برای انجام سنجش های بعدی تحت درمان قرار گرفتند. (3) سلول ها با siBRD4 ترانسفکت شدند و/یا با 5 میکرومولار کادمیوم به مدت 12 ساعت دیگر برای انجام سنجش های بعدی تیمار شدند.

2.4. ترانسفکشن RNA تداخلی کوچک

ما RNA تداخلی کوچک 20 نانومولار BRD4 (siBRD4، Invitrogen، CA، USA) را به سلول‌های NRK{3}} توسط معرف ترانسفکشن Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Cat# 13778150) به مدت 24 ساعت طبق دستورالعمل‌های محصول انتقال دادیم. از siRNA های حسی زیر استفاده شد:

siBRD4، با دنباله هدف 5′-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3′؛

siCt (کنترل منفی siRNA)، با دنباله هدف 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

2.5. وسترن بلاتینگ

نمونه‌های بافت کلیه و سلول‌های NRK{0}E در بافر RIPA حاوی مهارکننده‌های پروتئاز لیز شدند تا پروتئین کل استخراج شود. پروتئین هسته ای از بافت ها و سلول های تازه از قبل تهیه شده و در دمای 80- درجه نگهداری می شود. نمونه‌های پروتئینی (20 تا 30 میکروگرم در هر نمونه) با الکتروفورز SDS-PAGE جدا شدند، سپس به غشاهای پلی‌وینیلیدین فلوراید (Millipore، ISEQ00010) منتقل شدند. غشاها با 5 درصد شیر بدون چربی به مدت 90 دقیقه مسدود شدند و 12 ساعت در 4 درجه با آنتی بادی های اولیه زیر انکوبه شدند: -اکتین (1:5000)، NF-κB p65 (1:1000)، IL{17}} ( 1:600)، TNF- (1:600)، BRD4 (1:1000)، Ep300 (1:1000)، Sirt1 (1:1000)، His3 (1:1000)، RelA-K310ac (1:1000). سپس غشاها با TBST شسته و با آنتی بادی های ثانویه مربوطه (1:10000) به مدت 90 دقیقه در دمای اتاق (RT) انکوبه شدند. غشاها با الکتروشیمیلومینسانس (ECL، ThermoFisher Scientific) انکوبه شدند و بر روی Chemidoc XRS (Bio-Rad، Marnes-La Coquette، فرانسه) تعیین شدند، و چگالی نوری با استفاده از ImageJ (NIH، Bethesda، MD، ایالات متحده آمریکا) آنالیز شد.

2.6. رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس (IF).

سلول‌های NRK{0}}E کاشته شده در یک 24-چاه چاه تا حدود 60 درصد تلاقی رشد کردند. سلول ها با 5 میکرومولار کادمیوم و/یا 0.5 میکرومولار JQ1 به مدت 12 ساعت تیمار شدند، سپس با PFA (4 درصد، 10 دقیقه)، نفوذپذیر با Triton X (0.1 درصد، 15 دقیقه)، مسدود شده با BSA ثابت شدند. (2 درصد، 90 دقیقه) در RT، و با آنتی بادی اولیه (NF-kB p65، رقت 1:50) یک شبه در 4 درجه انکوبه شد. پس از سه بار شستشو با PBS، سلول ها با آنتی بادی ثانویه (رقت 1:500) به مدت 90 دقیقه و با DAPI به مدت 5 دقیقه در RT انکوبه شدند، سپس سلول ها در زیر میکروسکوپ کانفوکال مشاهده شدند. انتقال هسته ای NF-kB در سه مطالعه مستقل مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

2.7. qPCR

کل RNA بافت کلیه و سلول های NRK{0}E با کیت RNAiso Plus (Takara Bio، Shiga، ژاپن) استخراج شد. 1 ug از RNA کل برای سنتز cDNA زنجیره 1 طبق دستورالعمل سازنده (روش، بازل، سوئیس) استفاده شد. 2 میکرولیتر DNA مکمل (cDNA) در هر چاه برای شناسایی سطوح mRNA نسبی با استفاده از سیستم LightCycler® 96 Real-Time PCR (روش) گرفته شد. سطوح mRNA نسبی را با توجه به معادله 2-△△CT محاسبه کنید. آغازگرها در جدول S2 فهرست شده اند. اکتین یک ژن مرجع موش بود.

2.8. رسوب ایمنی همزمان (Co-IP)

بافت‌های کلیه و سلول‌های NRK{0}E در بافر لیز سلولی تازه آماده شده (20 میلی‌مولار HEPES-KOH pH 7.5، 150 میلی‌مول در لیتر NaCl، 2 میلی‌مول در لیتر EDTA، 1 درصد تریتون ایکس{8} لیز شدند. }) حاوی PMSF. دانه های پروتئین G (100 میکرولیتر در هر نمونه، Bio-Rad، Hercules، CA، USA) با 2 میکروگرم BRD4، RelA-K310ac یا آنتی بادی IgG در هر نمونه مخلوط شدند و به مدت 10 دقیقه در RT چرخانده شدند. سپس، لیزات کل پروتئین با کمپلکس دانه‌ها-آنتی‌بادی یک شبه در دمای 4 درجه انکوبه شدند. پس از سه بار شستشو با بافر لیز سلولی، رسوبات ایمنی با بافر نمونه 1 × SDS PAGE برای پیکربندی نمونه ها مجدداً معلق شدند. پروتئین های هدف با استفاده از وسترن بلات با آنتی بادی های اولیه anti-BRD4 و anti-RelA K310ac شناسایی شدند.

2.9. تحلیل آماری

تمام داده ها از حداقل سه آزمایش مستقل به دست آمدند و به عنوان میانگین ± SEM بیان شدند، مگر اینکه غیر از این ذکر شود. گروه های آزمایشی با استفاده از آزمون t-test دانشجویی دو طرفه بدون جفت یا آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) با استفاده از SPSS 22 مقایسه شدند.{4}} (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). معناداری در p < 0.05="" تنظیم="">

3. نتایج

3.1. سی دی بیان سیتوکین های التهابی را در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی القا می کند

به عنوان یک آلاینده زیست محیطی، ثابت شده است که کادمیوم با تنظیم یک سری فرآیندهای بیولوژیکی باعث آسیب کلیه می شود (وانگ و همکاران، 2019c). در این مطالعه، تغییرات در سطوح رونویسی سیتوکین های التهابی پس از قرار گرفتن در معرض Cd مورد بررسی قرار گرفت تا بررسی شود که آیا التهاب در سمیت کلیوی ناشی از Cd دخالت دارد یا خیر. داده ها نشان داد که قرار گرفتن در معرض Cd به طور قابل توجهی باعث افزایش سطح پروتئین اینترلوکین (IL)-1 و فاکتور نکروز تومور (TNF) در سلول های NRK-52E (شکل 1A-B) و بافت کلیه موش صحرایی شد (شکل 1C) -د). در همین حال، همانطور که در شکل 1E-F نشان داده شده است، قرار گرفتن در معرض سی دی سطوح رونویسی سیتوکین های التهابی (IL{11}}، IL{12}}، TNF- و (پروتئین شیمی جذب کننده مونوسیت{14}}) MCP را افزایش داد. -1) in vivo و in vitro. این یافته‌ها نشان می‌دهد که Cd بیان سیتوکین‌های التهابی را در کلیه‌های موش‌های صحرایی القا می‌کند.

3.2. BRD4 در فرآیند رونویسی سیتوکین های التهابی ناشی از Cd شرکت می کند

BRD4 یک تنظیم کننده اپی ژنتیکی است که به تازگی توصیف شده است که به هیستون های استیله یا غیرهیستون برای تنظیم فرآیندهای التهابی در بسیاری از بیماری ها متصل می شود. در اینجا، از مهارکننده BRD4 JQ1 و BRD{4}}siRNA برای بررسی نقش BRD4 بر پاسخ التهابی ناشی از سی دی استفاده شد. داده ها نشان داد که سطوح IL{8}} و TNF- افزایش یافته با Cd با درمان JQ1 در شرایط in vivo و in vitro (شکل 2A-D) و توسط BRD4 knockdown در شرایط آزمایشگاهی کاهش یافت (شکل S1A-B). در همین حال، درمان JQ1 به طور قابل‌توجهی سطوح رونویسی تقویت‌شده با سی دی IL-1، IL{19}}، TNF- و MCP{21}} را در سلول‌های NRK-52E مهار کرد (شکل 2E) و بافت کلیه موش صحرایی (شکل 2F). همچنین، شکست BRD4 به طور قابل توجهی سطوح رونویسی سیتوکین های التهابی را در سلول های NRK{27} E کاهش داد (شکل S1C). در مجموع، این یافته ها نشان می دهد که BRD4 یک تنظیم کننده حیاتی پاسخ التهابی ناشی از سی دی در کلیه موش صحرایی است.

3.3. سطح بیان BRD4 پس از قرار گرفتن در معرض Cd بدون تغییر باقی می ماند

سپس، تغییرات در سطوح بیان BRD4 پس از قرار گرفتن در معرض Cd شناسایی شد. سلول‌های NRK{1}} با Cd تحت گرادیان غلظت تحت درمان قرار گرفتند و موش‌ها به مدت 5 روز با Cd به صورت داخل صفاقی تزریق شدند تا تأثیر Cd بر بیان BRD4 در کلیه در داخل بدن و در شرایط آزمایشگاهی مشخص شود. نتایج نشان داد که سطح پروتئین BRD4 در هر دو سلول NRK{6}}E در معرض Cd (شکل 3A-B) و بافت کلیه موش صحرایی (شکل 3C-D) بدون تغییر بود. همچنین، سطوح mRNA BRD4 پس از قرار گرفتن در معرض Cd بدون تغییر بود (شکل 3E-F). این نتایج نشان می دهد که BRD4 واکنش التهابی ناشی از سی دی را واسطه می کند به تغییرات در سطح بیان بستگی ندارد.

3.4. BRD4 انتقال هسته ای NF-kB با Cd را تنظیم می کند

نقش BRD4 در پاسخ التهابی ناشی از سی دی در مطالعه ما مورد بررسی قرار گرفت. تغییر مسیر سیگنالینگ NF-kB ارتباط نزدیکی با رونویسی سیتوکین های التهابی دارد (Chi et al., 2021). مطالعه ما نشان داد که BRD4 در انتقال هسته ای تنظیم شده با سی دی و فعال سازی NF-kB نقش دارد. ابتدا، محلی‌سازی درون سلولی NF-kB با رنگ‌آمیزی IF و رنگ‌آمیزی IHC تعیین شد. داده‌های شکل 4A و D نشان داد که JQ1 جابجایی هسته‌ای NF-kB با Cd را در سلول‌های NRK{12} E و بافت‌های کلیه موش مهار می‌کند. در همین حال، نتایج وسترن بلات نشان داد که JQ1 به طور قابل‌توجهی سطوح پروتئین هسته‌ای NF-kB با Cd را در داخل بدن (شکل 4B-C) و در شرایط آزمایشگاهی (شکل 4E-F) کاهش داد. به طور مشابه، ناک داون BRD4 همچنین به طور قابل توجهی انتقال هسته ای NF-kB با Cd را مهار کرد (شکل S2A) و سطوح پروتئین هسته ای NF-kB (شکل S2B-C) را در سلول های NRK{28}} کاهش داد. در مجموع، مهار BRD4 می‌تواند جابجایی هسته‌ای NF-kB ایجاد شده توسط Cd را کاهش دهد، که نشان می‌دهد BRD4 فعال شدن مسیر سیگنالینگ NF-kB در کلیه را پس از قرار گرفتن در معرض Cd واسطه می‌کند.

3.5. Cd باعث افزایش سطح استیلاسیون RelA K310 می شود

مطالعات تأیید کرده اند که BRD4 از طریق حوزه های برم خود به RelA K310 استیله متصل می شود تا رونویسی وابسته به NF-kB را تنظیم کند (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). بنابراین، سطح استیلاسیون RelA K310 و بیان دو آنزیم شناسایی شد. داده ها نشان داد که سطح پروتئین RelA-K310ac و استیلاز Ep300 به طور مداوم با افزایش غلظت Cd کاهش می یابد، در حالی که سطح پروتئین داستیلاز Sirt1 به تدریج در سلول های NRK{11}} E (شکل 5A-B) و بافت کلیه موش صحرایی افزایش می یابد (شکل . 5C-D). همچنین، سطوح mRNA Ep300 و Sirt1 روندهای یکسانی را نشان دادند (شکل 5E-F). این نتایج نشان می‌دهد که Cd سطح استیلاسیون RelA K310 را ارتقا می‌دهد، بنابراین BRD4 ممکن است در رونویسی سیتوکین‌های التهابی ناشی از سی دی در کلیه نقش داشته باشد.

3.6. سی دی اتصال BRD4 به RelA-K310ac را افزایش می دهد تا عملکرد رونویسی آن را افزایش دهد

اتصال به سایت های استیله سازی اساس تنظیم رونویسی BRD4 است (هوانگ و همکاران، 2009). برای بررسی اینکه آیا Cd با افزایش اتصال BRD4 به RelA-K310ac، عملکرد BRD4 را تنظیم می کند یا خیر، تعامل بین RelA-K310ac و BRD4 از طریق Co-IP شناسایی شد. داده‌های شکل 6A نشان داد که کادمیوم به طور قابل‌توجهی برهمکنش بین RelA-K310ac و BRD4 را در سلول‌های NRK{14}E افزایش می‌دهد، که با درمان JQ1 یا نابودی BRD4 کاهش می‌یابد. همچنین، همین روند در بافت کلیه موش صحرایی مشاهده شد (شکل 6B). این نتایج نشان می‌دهد که Cd اتصال BRD4 به RelA-K310ac را افزایش می‌دهد، که رونویسی وابسته به NF-kB را ترویج می‌کند و متعاقباً به پاسخ التهابی ناشی از Cd کمک می‌کند.

4. بحث

کادمیوم به دلیل سمیت بالای آن به عنوان یک محرک بالقوه التهاب گزارش شده است، در حالی که مکانیسم دقیق آن هنوز به طور کامل شناخته نشده است (عرب نوذری و همکاران، 2020؛ قوش، 2018). مطالعه ما تأیید کرد که Cd بیان سیتوکین های التهابی را در سلول های کلیوی موش صحرایی القا می کند و دریافت که BRD4، یک هدف اپی ژنتیکی که عملکردهای حیاتی در یک سری از فرآیندهای سلولی از جمله التهاب دارد، به پاسخ التهابی ناشی از سی دی کمک می کند. آزمایش‌های بیشتر نشان داد که BRD4 در فعال‌سازی مسیر سیگنالینگ NF-kB با Cd نقش دارد. همچنین، کادمیوم سطح استیلاسیون RelA K310 را افزایش داد، در نتیجه اتصال BRD4 به NF-kB RelA استیله شده را افزایش داد تا رونویسی سیتوکین های التهابی وابسته به NF-kB را تقویت کند.

التهاب یکی از مکانیسم‌های دفاعی طبیعی در برابر مواد شیمیایی برون‌زا است، در حالی که پاسخ التهابی کنترل نشده و نامناسب می‌تواند به بافت‌های طبیعی آسیب برساند و بیماری‌های خود ایمنی را القا کند (جیان و همکاران، 2018). نشانگرهای بیولوژیکی التهاب افزایش یافته با سی دی اغلب با بیماری های مختلف همراه بود. مطالعات نشان داده اند که التهاب ناشی از سی دی در آتروژنز نقش دارد (Tinkov et al., 2018). علاوه بر این، کادمیوم بیان سایتوکاین‌های التهابی را تقویت می‌کند که به آسیب بافت ریه و بیضه کمک می‌کند و باعث ایجاد سمیت کبدی می‌شود (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). این اثرات مضر با نتایج ما مطابقت دارد، که پاسخ التهابی در آسیب کلیه ناشی از سی دی دخیل است. تحقیقات روزافزونی بر مکانیسم‌های بروز التهاب ناشی از کادمیوم متمرکز شده‌اند. به عنوان یک عضو خانواده پروتئین BET که به خوبی مطالعه شده است، BRD4 نقش مهمی در بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی از جمله التهاب دارد. در اینجا، JQ1 (یک مهارکننده BRD4) و siRNA برای تنظیم‌زدایی فعالیت عملکردی BRD4 مورد استفاده قرار گرفت و دریافت که مهار BRD4 رونویسی سیتوکین‌های التهابی ناشی از Cd را در کلیه‌های موش کاهش می‌دهد، که نشان می‌دهد BRD4 در پاسخ التهابی ناشی از Cd شرکت می‌کند. . به طور کلی اعتقاد بر این است که اختلال در بیان BRD4 یک رویداد مهم در بروز پاسخ التهابی است. در آسیب نخاعی، هیپرتروفی قلبی پاتولوژیک و سایر بیماری های مرتبط با التهاب، بیان اختلال BRD4 به بیان سایتوکاین های التهابی کمک می کند (Zhu و همکاران، 2020؛ Marazzi و همکاران، 2018؛ رن و همکاران، 2019). با این حال، کادمیوم هیچ تاثیری بر سطوح بیان BRD4 در شرایط تجربی فعلی نداشت، که ما را به این موضوع سوق داد که آیا BRD4 پاسخ التهابی ناشی از Cd را از طریق مسیرهای دیگر واسطه می‌کند یا خیر.

NF-kB یک عامل تنظیم کننده مهم در فرآیندهای التهابی است و مسئول کنترل بیان بسیاری از واسطه های التهابی است (لارنس، 2009). مطالعات گزارش شده است که BRD4 در تنظیم مسیر سیگنالینگ NF-kB نقش دارد. هوانگ و همکاران (2017) پیشنهاد کرد که BRD4 فعال سازی NF-kB با واسطه IKK را از طریق مسیرهای p38 و JNK-MAPK تنظیم می کند. وانگ و همکاران (2019a) دریافت که ناک داون BRD4 یا درمان JQ1 مسیر سیگنالینگ NF-kB فعال شده با لیپوپلی ساکارید (LPS) را در میکروگلیا مسدود می کند. منگ و همکاران (2014) نشان داد که درمان JQ1 بیان سایتوکاین‌های التهابی را با مهار فعال‌سازی NF-kB در سلول‌های RAW 264.7 تحت درمان با LPS مسدود می‌کند. این گزارش‌ها نشان داد که BRD4 فعال‌سازی NF-kB را در بسیاری از مدل‌های التهاب واسطه می‌کند در حالی که مهار BRD4 یک رویکرد درمانی مؤثر برای ضد التهاب است. در مطالعه کنونی، مهار BRD4 انتقال هسته‌ای NF-kB را در بافت‌های کلیه موش صحرایی در معرض سی دی و سلول‌های NRK{27}E مسدود می‌کند، که نشان می‌دهد BRD4 مسیر سیگنالینگ NF-kB فعال شده با Cd را واسطه می‌کند.

به طور معمول، پس از اینکه NF-kB توسط محرک های مختلف فعال شد و به هسته منتقل شد، BRD4 به NF-kB RelA استیله شده در محل K310 متصل می شود که باعث افزایش ثبات و فعالیت رونویسی آن در هسته می شود (Hajmirza et al., 2018). بنابراین سطح استیلاسیون RelA K310 بر عملکرد تنظیمی BRD4 بر پاسخ التهابی تأثیر می گذارد. در نورون های هیپوکامپ، داستیلاز Sirt1 واسطه استیلاسیون RelA K310 برای تنظیم بیان BACE1 شد که به تولید آمیلوئید عصبی کمک کرد (Flores-Leon et al., 2019). در سلول‌های گلیوبلاستوما، استرس درمان فتودینامیک دی استیلاز Sirt1 را کاهش داد و استیلاز Ep300 را فعال کرد که باعث افزایش سطح RelA-K310ac شد و منجر به افزایش تولید اکسید نیتریک پرو بقا شد (Fahey et al., 2019). مطالعه ما نشان داد که Cd با افزایش بیان Ep300 و کاهش بیان Sirt1، سطح استیلاسیون RelA K310 را ارتقا می‌دهد، که نشان می‌دهد Cd با افزایش سطوح استیلاسیون RelA K310 بر عملکرد تنظیمی BRD4 تأثیر می‌گذارد.

قابل ذکر است، نتایج ما نشان داد که درمان JQ1 در کاهش پاسخ التهابی ناشی از Cd موثرتر از ناک داون BRD4 بود. JQ1 میل پیوندی بالایی با BRD4 دارد و می تواند تقریباً به طور کامل اتصال BRD4 به کروموزوم را مسدود کند، در حالی که siBRD4 تنها می تواند با بیان پروتئین BRD4 تداخل داشته باشد تا اتصال BRD4 به محل هدف را کاهش دهد، که نشان می دهد BRD4 واسطه پاسخ التهابی ناشی از Cd ممکن است به اتصال با NF-κB RelA استیله. مطالعات اخیر مکانیسم تنظیمی مشابهی را نشان داده‌اند: پس از جابه‌جایی و فعال‌سازی هسته‌ای NF-kB، BRD4 سپس با RelA استیله‌شده تعامل کرد تا فعال‌سازی رونویسی NF-kB را فعال کند (هوانگ و همکاران، 2009). RelA-BRD4 برای پروموتورهای هدف NF-kB در شرایط مختلف تحریک التهابی به کار گرفته شد، در حالی که درمان JQ1 با جلوگیری از اتصال BRD4 به NF-kB استیله شده RelA عمل کرد، بنابراین فعالیت رونویسی NF-kB را کاهش داد (Zou et al., 2014). نتایج ما نشان داد که مهار BRD4 تعامل تقویت‌شده با سی دی بین BRD4 و RelA-K310ac را در کلیه‌های موش بلوک می‌کند، و از نتایج فوق حمایت می‌کند که مهار BRD4 فعالیت رونویسی ناشی از Cd NF-kB را سرکوب می‌کند، و نشان می‌دهد که Cd باعث افزایش اتصال BRD4 acetylated به BRD4 می‌شود. NF-κB RelA برای افزایش رونویسی سیتوکین های التهابی.

به طور خلاصه، مطالعه ما مکانیسم‌های تنظیمی BRD4 را در پاسخ التهابی ناشی از Cd در کلیه‌های موش نشان داد: (1) BRD4 انتقال و فعال‌سازی هسته‌ای NF-kB ناشی از Cd را واسطه می‌کند. (2) Cd سطوح استیلاسیون RelA K310 را افزایش می دهد و اتصال BRD4 به NF-kB RelA استیله شده را افزایش می دهد، که رونویسی سیتوکین های التهابی وابسته به NF-kB را ترویج می کند. علاوه بر این، مهار BRD4 به طور قابل توجهی سطوح سیتوکین های التهابی با Cd را کاهش داد، که نشان می دهد BRD4 هدفمند این پتانسیل را دارد که به عنوان وسیله ای موثر برای درمان بیماری های التهابی از جمله نفریت ناشی از Cd توسعه یابد.

بیانیه مشارکت نویسنده CRediT

Zhongguo Gong: مفهوم سازی، روش شناسی، تجسم، تجزیه و تحلیل رسمی، اعتبارسنجی، بررسی، تجزیه و تحلیل رسمی، نظارت داده ها، نوشتن - پیش نویس اصلی. گنگ لیو: مفهوم سازی، روش شناسی، تجسم، نگهداری داده ها، نوشتن – پیش نویس اصلی، مدیریت پروژه، کسب بودجه. Wenjing Liu: نرم افزار، منابع، روش شناسی، تجزیه و تحلیل رسمی. هوی زو: مدیریت پروژه، نظارت. آهنگ Ruilong: نرم افزار، تحلیل رسمی، نظارت. Hongyan Zhao: نرم افزار، تحلیل رسمی، نظارت. یان یوان: نظارت. Jianhong Gu: نظارت. Jianchun Bian: جذب سرمایه، نظارت. Jiaqiao Zhu: نوشتن – بررسی و ویرایش، نظارت. Zongping Liu: نوشتن – بررسی و ویرایش، نظارت،

مدیریت پروژه، کسب منابع مالی، مفهوم سازی.

اعلامیه منافع رقابتی

نویسندگان اعلام می کنند که هیچ منافع مالی رقیب یا روابط شخصی شناخته شده ای ندارند که به نظر می رسد بر کار گزارش شده در این مقاله تأثیر بگذارد.

تصدیق

این کار توسط بنیاد ملی علوم طبیعی چین (شماره‌های 31872533، 31902329، 32072933)، برنامه تحقیقاتی و توسعه کلیدی ملی چین (شماره 2016YFD0501208) و پروژه توسعه برنامه‌های آکادمیک اولویت دار آموزش عالی جیانگ سو پشتیبانی شد. موسسه (PADP). نسخه خطی برای زبان انگلیسی، گرامر، علائم نگارشی، املا و سبک کلی مناسب توسط یک یا چند نفر از ویراستاران انگلیسی زبان بومی بسیار ماهر در ELIXIGEN ویرایش شده است.

منابع

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. ژل رویال سمیت کلیوی ناشی از کادمیوم را در موش های نر کاهش می دهد. علمی شماره 9 (1)، 5825.

عرب نوذری، م.، محمدی، ا.، شکرزاده، م.، آهنگر، ن.، امیری، اف. ایجاد آسیب اکسیداتیو میتوکندریایی، آپوپتوز، و مسیرهای NF-kB. محیط زیست علمی آلودگی. Res. بین المللی 27 (19)، 24048-24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. پودر دانه شنبلیله آسیب بیضه و سمیت کبدی ناشی از کادمیوم را در موشهای صحرایی نر کاهش می دهد. انقضا سموم پاتول. 66 (7)، 293-300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting در Nrf2: چگونه سیگنالینگ Nrf2 می تواند بر فعالیت های درمانی مهارکننده های پروتئین BET تأثیر بگذارد. Bioessays 40 (5)، 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. نقش سلنوپروتئین S در تشکیل تله نوتروفیل خارج سلولی وابسته به گونه های اکسیژن فعال ناشی از سلنیوم آرتریت کمبود ردوکس بیول. 44، 102003 دی، ا.، یانگ، دبلیو، گگون، ا.، نیشیاما، ا.، پان، آر.، یاگی، آر.، گرینبرگ، آ.، فینکلمن، اف. دی، فایفر، ک.، ژو، جی ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 رشد سلول های بنیادی خونساز را هدایت می کند و پاسخ های التهابی ماکروفاژها را تعدیل می کند. EMBO J. 38 (7)

فاگربرگ، بی.، متولد شد, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. قرار گرفتن در معرض کادمیوم با گیرنده فعال کننده پلاسمینوژن اوروکیناز محلول، یک نشانگر در گردش التهاب و بیماری قلبی عروقی آینده مرتبط است. محیط زیست Res. 152، 185-191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. رویدادهای سیگنالینگ بالادستی منجر به افزایش تولید اکسید نیتریک حامی بقا در سلول‌های گلیوبلاستوما با چالش فوتودینامیک می‌شود. رادیک آزاد. Biol. پزشکی 137، 37-45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. تنوع متابولیت ها و فلزات سنگین مختلف در Oryza sativa L. مربوط به بیماری مزمن کلیوی با علت ناشناخته در سریلانکا. Chemosphere 247, 125836.

Flores-Leon، M.، Perez-Dominguez، M.، Gonzalez-Barrios، R.، Arias، C.، 2019. کاهش NAD(+) ناشی از پالمتیک اسید با کاهش عملکرد SIRT1 و افزایش بیان BACE1 مرتبط است. در نورون های هیپوکامپ نوروشیمی. Res. 44 (7)، 1745-1754.

Ghosh، KNI، 2018. درمان با کادمیوم باعث ایجاد اکینوکوکوز، آسیب DNA، التهاب و آپوپتوز در بافت قلبی موش‌های صحرایی آلبینو ویستار می‌شود. محیط زیست سموم داروسازی 59، 43-52. التهاب و سرطان زیست پزشکی 6 (1)، 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. مواجهه حاد با کادمیوم باعث ایجاد نوتروفیلی طولانی مدت همراه با القای تاخیری فاکتور تحریک کننده کلونی گرانولوسیت در کبد موش می شود. قوس. سموم 90 (12)، 3005-3015.

حسین خناظر، ن.، عزیزی، غ.، اسلامی، س.، الحسن محمد، ح.، فیاض، ف.، حسین زاده، ر.، عثمان، ع.ب، کمالی، ع.، محمدی، ح.، جدیدی نیارق، ف.، دهقانی فرد، ا.، نوری سپهر، م.، 1399. اثرات مواجهه با کادمیوم در القای التهاب. ایمونوفارماکل. ایمونوتوکسیکول 42 (1)، 1-8.