اثرات سفید کننده پوست اکتوئین از طریق سرکوب ملانوژنز تحریک شده با MSH و فعال شدن مسیرهای آنتی اکسیدانی Nrf2 در کراتینوسیت های تحت تابش UVA

تماس: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 ایمیل:audrey.hu@wecistanche.com

یو-چنگ هسو 1،2،3،4، ژوان زائو چن 1، یوگاندار وودیا گوریسانکار 1، هونگ رونگ ین 3،4،5،6، جینگ یوان چوانگ 7 و هسین لینگ یانگ 8،*

خلاصه:گونه های اکسیژن فعال (ROS) ناشی از اشعه ماوراء بنفش A (UVA) باعث تولید بیش از حد می شودملانوژنزدر سلول های پوست منجر به رنگدانه می شود. ما اثرات رنگدانه‌زدایی و ضد ملانوژنیک اکتوئین، یک اسمولیت طبیعی باکتریایی را در کراتینوسیت‌های انسانی تحت تابش UVA (HaCaT) نشان دادیم و مکانیسم‌های مولکولی زیربنایی مشخص شدند. سلول‌های HaCaT با غلظت‌های پایین اکتوئین ({3}}.5-1.5 میکرومولار) از قبل تیمار شدند و برای پارامترهای مختلف رنگدانه و ضد ملانوژن مورد سنجش قرار گرفتند. این پیش درمانی به طور قابل توجهی تولید ROS، تولید هورمون محرک ملانوسیت (-MSH) و بیان پروپیوملانوکورتین (POMC) را در سلول‌های HaCaT تحت تابش UVA کاهش داد. همچنین،آنتی اکسیدانهم اکسیژناز{0}} (HO{1}})، NAD(P)H دهیدروژناز [کینون 1] (NQO-1)، و زیرواحد کاتالیزوری -گلوتامات-سیستئین لیگاز (-GCLC) بیان شد از طریق جابجایی هسته‌ای فاکتور هسته‌ای اریترویید{7}}مربوط به فاکتور 2 (Nrf2) که شکست آن در واقع این اثر را مختل می‌کند و اهمیت مسیر Nrf2 را نشان می‌دهد. اکتوئین فعال سازی Nrf2 از طریق مسیرهای p38، پروتئین کیناز B (همچنین به عنوان AKT)، پروتئین کیناز C (PKC) و کازئین کیناز II پروتئین کیناز (CKII) واسطه بود. محیط تهویه‌شده به‌دست‌آمده از سلول‌های HaCaT پیش تیمار شده با اکتوئین و تابش اشعه UVA، تنظیم را کاهش داد.تیروزیناز، پروتئین مربوط به تیروزیناز-1 و -2 (TRP-1/-2)، پروتئین کیناز AMP حلقوی (c-AMP)، پروتئین اتصال به عنصر c-AMPresponse (CREB) ، و بیان فاکتور رونویسی مرتبط با میکروفتالمیا (MITF) که منجر به ملانوم B16F1{18}} می شود که سنتز ملانین را مهار می کند. جالب توجه است، این اثر ضد ملانوژنی در سلول‌های B16F10 تحریک‌شده با MSH تنها در غلظت‌های 50 تا 400 میکرومولار اکتوئین قابل مشاهده بود، که نشان‌دهنده نقش کلیدی پوست کراتینوسیتسین درمان‌شده با اکتوئین (0.5-1 میکرومولار) است.سفید کردناثرات ما به این نتیجه رسیدیم که اکتوئین می‌تواند به‌عنوان یک عامل آرایشی طبیعی موضعی مؤثر با اثر ضد رنگدانه و ضد ملانوژن استفاده شود.

کلید واژه ها:اکتوئین؛ کراتینوسیت ها؛ملانوژنز; تیروزیناز; -MSH Nrf2

سیستانچ اثر آنتی اکسیدانی دارد.

1. مقدمه

قرار گرفتن پوست انسان در معرض اشعه UVA باعث تولید ROS و همچنین تولید بیش از حد ملانین در سلول های پوست می شود. تولید کنترل نشده ROS می تواند منجر به شرایط ملانوما نیز شود. اکثر عوامل سفید کننده پوست هدف قرار داده و سعی در به حداقل رساندن آن دارندملانوژنزفرآیند از طریق مهار -MSH وتیروزینازتولیدات [1]. اکثر کرم‌های روشن‌کننده رنگ پوست از هیدروکینون [2] یا هیدروکورتیزون [3] تشکیل شده‌اند که به کاهش تشکیل ملانین معروف هستند و با عوارض جانبی شدید نیز همراه هستند. به عنوان مثال، آکنه، پوسته پوسته شدن و خارش پوست، تغییر رنگ آبی و سیاه پوست، اکرونوز، سوزش و سوزش پوست و حتی التهاب. با این حال، پوستسفید کردنعواملی از منابع طبیعی، به عنوان مثال، اسید کوجیک (مشتق قارچی که از گونه‌های پنی سیلیوم و آسپرژیلوس به دست می‌آید) نیز گزارش شده است که باعث ایجاد درماتیت تماسی در افراد دارای پوست حساس می‌شود. در این افراد، بیش از 1 درصد اسید کوجیک می‌تواند عوارض جانبی با حساسیت شدید ایجاد کند [4،5]. بنابراین، تنها چند پوست به طور طبیعی مشتق شده استسفید کردنمحصولات (اولئوزین، عصاره شیرین بیان، اسید اسکوربیک، پروتئین سویا، N-استیل گلوکزامین و غیره) در حال حاضر در صنعت آرایشی و بهداشتی مورد استفاده قرار می گیرند [6]. با این حال، محصولات مراقبت از پوست که عمدتاً خواص رنگ‌زدایی را هدف قرار می‌دهند، گاهی اوقات نتوانسته‌اند بر روی مقابله با اثرات مضر ناشی از تولید ROS ناشی از اشعه UVA تمرکز کنند.ملانوژنزدر سلول های پوست

اکتوئین یک "اکسترمولیت طبیعی" است که از چندین گونه از میکروارگانیسم ها در شرایط استرس زا تولید می شود [7،8]. این ترکیب ابتدا از گونه‌های باکتری Ectothiorhodospira که در صحرای مصر زندگی می‌کنند، جدا شد. آبشار ژن‌های اپرون ect (ectA، ectB، ectC، یا ectD) در تولید این ترکیب نقش دارند. اکتوئین از نظر شیمیایی به‌عنوان 1،4،5،{5}}تتراهیدرو{6}}متیل-4-پیریمیدین کربوکسیلیک اسید [9] مشخص می‌شود. به عنوان یک چسبنده رطوبت، اکتوئین کمک می کند، بازسازی غشای سلولی پوست [10]، محافظت در برابر آسیب و آلودگی UV [11،12]، مرطوب کننده پوست [13]، به تاخیر انداختن پیری زودرس پوست [14] و غیره. نشان داده شده است که اکتوئین در درمان درماتیت آتوپیک [15]، آلزایمر [16] و همچنین مهار تکثیر HIV [17]، رادیو و شیمی درمانی [18] و سیروز کبدی برای نقش های محافظ پوست مفید است. 19]. تصور می شود که اکتوئین خاصیت بی رنگ کنندگی و سفید کنندگی پوست خود را بدون ایجاد عوارض جانبی نامطلوب نشان می دهد [20]. در مقابل، مکانیسم‌های مولکولی استخراج شده توسط اکتوئین شناخته شده نیستند. بنابراین، هدف از این مطالعه تعیین مکانیسم‌های رنگ‌دانه‌سازی و ضد ملانوژنیک ناشی از اکتوئین است که در کراتینوسیت‌های انسانی تحت تابش UVA (HaCaT) به‌عنوان سیستم مدل سلولی ایجاد می‌شود. اثر ترشحات ناشی از اکتوئین عوامل محافظ پوست از سلول‌های HaCaT به محیط کشت (محیط شرطی‌شده) نیز با استفاده از یک خط سلولی ملانوما معمولی (B16F10) آزمایش شد.

2. مواد و روشها

2.1. معرف ها و آنتی بادی ها

اکتوئین (شماره محصول: 81619، خلوص بیشتر یا مساوی 95 درصد) از Sigma-Aldrich (Taufkichen، آلمان) خریداری شد. سرم جنین گاوی (FBS)، پنی سیلین/استرپتومایسین، Eagle'smedium اصلاح شده Dulbecco (DMEM) و ال-گلوتامین از Invitrogen/Gibco BRL (Carlsbad، CA، USA) خریداری شدند. l-DOPA، ملانین، 3-4،5-دی متیل-2-ایل-2،5-دی فنیل تترازولیوم بروماید (MTT) و -MSH از شرکت سیگما شیمیایی تهیه شده است. (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا). N-استیل سیستئین (NAC) و 20،{13}}دی کلروفلورسئین-دی استات (DCFH{15}}DA) از سیگما آلدریچ (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا) تهیه شد. تمام مهارکننده‌های دارویی مورد نیاز برای JNK (SP600125)، ERK1/2 (PD98059)، p38 (SB203580)، PKC (GF109203X)، و CKII از Calbiochem (La Jolla، CA، USA) به‌دست آمدند. از Sigma-Aldrich (سنت لوئیس، MO، ایالات متحده آمریکا). تمام آنتی بادی ها برای POMC، CREB، -اکتین،تیروزیناز، Nrf2، p-CREB، NQO-1، PKC، پروتئین مرتبط با ECH مانند کلچ-1 (Keap-1)، andTRP-1، TRP-2 از شرکت بیوتکنولوژی سانتا کروز (هایدلبرگ، آلمان) به دست آمد. آنتی بادی‌های ضد -GCLC و HO{10}} از Gene Tex Inc. (سان آنتونیو، تگزاس، ایالات متحده آمریکا) تهیه شد. ما آنتی‌بادی‌هایی علیه پروتئین کیناز c-AMP و CKII از Abcam (کمبریج، MA، ایالات متحده آمریکا) به دست آوردیم. هیستون ها، MITF، p-p38، p38، p-AKT، و AKT از فناوری سیگنال سلولی (بورلی، MA، ایالات متحده آمریکا) به دست آمدند. معرف های تشخیص نورتابی شیمیایی پیشرفته (ECL) از Millipore، (Billerica، MA، USA) به دست آمد. تمام معرف های دیگر (در درجه HPLC) یا از Sigma-Aldrich یا Merck & Co., Inc خریداری شده اند. (دارمشتات، آلمان).

2.2. کشت سلولی

ما سلول‌های کراتینوسیت پوست انسان HaCaT و ملانوم موشی B16F10 را از هر دو سرویس خط سلولی (CLS، Eppelheim، آلمان) و مجموعه فرهنگ نوع آمریکایی (ATCC، VA، ایالات متحده آمریکا) به‌دست آوردیم. سلول ها در DMEM حاوی 10 درصد FBS فعال شده با حرارت، 1 درصد استرپتومایسین/پنی سیلین و 2 میلی مولار ال-گلوتامین در یک انکوباتور مرطوب شده با 5 درصد CO2 در دمای 37 درجه سانتیگراد کشت داده شدند.

2.3. درمان سلولی و اشعه UVA

قبل از تابش اشعه UVA، سلول ها با اکتوئین (0.5-1.5 میکرومولار به مدت 24 ساعت) یا وسیله نقلیه (PBS) پیش تیمار شدند. پس از انکوباسیون، سلول‌های شسته شده با PBS با استفاده از UV CROSS-LINKER CL{13}} (UVItec, Cambridge, lmax, 365nm, λmax, 365nm, lmax,365nm) در معرض 3 J/cm2 تابش UVA قرار گرفتند. انگلستان) [21].

2.4. سنجش ROS داخل سلولی

سلول های HaCaT با تراکم 1.5 × 105 در یک محفظه آزمایشگاهی چاه حاوی DMEM حاوی 10 درصد FBS کاشته شدند و تا 80 درصد تلاقی رشد کردند. این سلول‌ها ابتدا با 1.5 میکرومولار اکتوئین تیمار شدند و سپس در معرض 3 J/cm2 تابش UVA برای مدت زمان مقرر قرار گرفتند. سلول‌ها با PBS شسته شدند و از روش DCFH{10}}DA برای تعیین تولید ROS داخل سلولی استفاده شد. با استفاده از نرم افزار راه حل نرم افزار Olympus برای هر شرایط [21].

2.5. کمی سازی ملانین

در یک صفحه چاه، سلول‌های ملانوم B16F10 موش با تراکم 2.5 × 105 سلول در چاه کاشته شدند. آنها با 100، 200 و 400 میکرومولار اکتوئین به مدت 2 ساعت در غیاب یا حضور -MSH پیش تیمار شدند. (1 میکرومولار). پروتکل مورد استفاده برای تعیین کمیت ملانین از روشی که قبلا توضیح داده شده بود پیروی می کرد [21]. ما محتوای ملانین را با میکروپلیت خوان ELISA با طول موج جذب 470 نانومتر اندازه‌گیری کردیم.

سیستانچ ملانین را مهار می کند.

2.7. وسترن بلات

سلول های HaCaT (1 × 106 سلول / ظرف 10 سانتی متر) یا B16F10 (1 × 106 سلول / ظرف 10 سانتی متر) از قبل با غلظت های مختلف اکتوئین (0.5، 1 و 1.5 میکرومولار) یا -MSH (1) تیمار شدند. میکرومولار) به دنبال تابش در صورت عدم حضور یا حضور UVA برای مدت زمان تعیین شده. سلول‌های شسته‌شده PBS جمع‌آوری شدند، محتوای پروتئین (هسته‌ای و سیتوزولی) پس از تیمار جدا شد. سپس سلول‌ها تحت روش وسترن بلات قرار گرفتند که قبلاً برای تعیین بیان پروتئین‌های مختلف هسته‌ای و سیتوزولی استفاده می‌شد [21].

2.8. استخراج RNA و RT-PCR

سلول های HaCaT پیش تیمار شده با اکتوئین (1.5 میکرومولار، 24 ساعت) برای جداسازی RNA کل از این سلول ها در معرض معرف TRIZol (Invitrogen، Carlsbad) قرار گرفتند. 1 میکروگرم از RNA کل و معرف های ارائه شده توسط کیت تک مرحله ای RT-PCR پلاتین Taq SuperScript-III (Invitrogen، Carlsbad) در آزمایش PCR با ابزار Bio-Rad iCycler PCR (Bio-Rad، Hercules، CA، ایالات متحده). آغازگرهای رو به جلو و معکوس مورد استفاده برای Nrf2 عبارت بودند از: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30، R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. آغازگرهای رو به جلو و معکوس برای GAPDH استفاده شده عبارت بودند از: F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30، R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. در پایان آزمایش، محصول PCR با استفاده از ژل آگارز 1 درصد آنالیز شد. سپس با رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید مشاهده شد. به عنوان یک کنترل داخلی، از GAPDH [22] استفاده کردیم.

2.9. سنجش ایمونوفلورسانس

سلول‌های HaCaT با تراکم 1 × 104 سلول در چاهک در مکمل DMEM با 10 درصد FBS در یک محفظه آزمایشگاهی چاهک (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) کشت داده شدند. ما سلول ها را با 1.5 میکرومولار اکتوئین برای مدت زمان مشخص شده و به دنبال آن تابش در غیاب یا حضور UVA پیش تیمار کردیم. سلول ها تحت یک سنجش ایمونوفلورسانس قرار گرفتند که از روشی استفاده می کند که قبلا توضیح داده شد [21].

2.10. تحلیل آماری

ما از میانگین ± انحراف معیار (میانگین ± انحراف معیار) برای تمام نتایج مورد استفاده در این مطالعه استفاده کردیم. همه داده‌ها با تحلیل واریانس (ANOVA) و سپس آزمون دانت برای مقایسه‌های زوجی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند و به صورت میانگین ± انحراف معیار از سه ارائه شدند. یا آزمایش های مستقل بیشتری. اهمیت آماری در * p < 0="" تنظیم="" شد.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" در="" مقایسه="" با="" سلولهای="" کنترل="" درمان="" نشده،="" و="" #="" p=""><0.05; ##="" p="">< 0.01;="" ###="" p=""><0.001 در="" مقایسه="" با="" سلول‌های="" hacat="" در="" معرض="" uva="" یا="" سلول‌های="" b16f10="" تحت="" درمان="" با="">

3. نتایج

3.1. اکتوئین تولید ROS ناشی از UVA را در سلول‌های HaCaT مهار کرد

ابتدا، ما اثرات سیتوتوکسیک اکتوئین (شکل 1A) را بر روی سلول‌های HaCaT تحت تابش UVA آزمایش کردیم. داده‌های MTT ما نشان داد که در مقایسه با سلول‌های کنترل درمان‌نشده، اکتوئین پیش تیمار شده (0.5-1.5 میکرومولار) و سلول های HaCaT در معرض 3 J/cm2 UVA قادر به نشان دادن کاهش قابل توجهی در قابلیت زنده ماندن سلولی نبودند (شکل 1B). علاوه بر این، پیش تیمار اکتوئین، مرگ سلولی ناشی از UVA (3 J/cm2) را به روشی وابسته به دوز کاهش داد (شکل 1B). علاوه بر داده‌های فلورسانس ما، که نشان می‌دهد، در مقایسه با سلول‌های کنترل، 3 J/cm2 تابش UVA و تیمارهای اکتوئین به تنهایی (1.5 میکرومولار) به طور قابل‌توجهی سطوح ROS را تا 5- و 2-برابر تنظیم می‌کنند، به ترتیب. با این حال، در مورد Ectoinepretreatment، سطوح ROS به طور قابل توجهی کاهش یافت و ما می توانیم استنباط کنیم که اکتوئین دارای یکآنتی اکسیداناثر در برابر اشعه UVA این همچنین سطوح پایه ROS را در سلول های HaCaT القا می کند (شکل 1C، D).

3.2. اکتوئین سرکوب بیان POMC و -MSH در سلول های HaCaT تابش شده با UVA

کراتینوسیت های در معرض اشعه UVA برای POMC با واسطه ROS-p53 و همچنین یک هورمون پپتیدی کوچک -MSH که از POMC مشتق شده است تحریک شدند [23]. بنابراین، ما الگوهای عدم بیان تغییرات -MSH، POMC، و سایر پروتئین‌های مرتبط را در سلول‌های HaCaT پیش تیمار شده با اکتوئین تعیین کردیم و سپس آنها را در معرض UVA (3 J/cm2) قرار دادیم. داده‌های وسترن بلات نشان داد که تنظیم دخیل در UVA ناشی از عبارات -MSH و POMC با پیش‌درمان اکتوئین کاهش یافت. در حالی که درمان اکتوینی بدون تابش اشعه UVA به طور کامل بیان -MSH و POMC سلول های HaCaT تابیده نشده را مهار کرده است (شکل 2A). بعداً، ما تأثیر «محیط تهویه‌شده» (صفحه 10 میلی‌لیتر در 100 میلی‌متر)، به‌دست‌آمده از سلول‌های HaCaT پیش تیمار شده با اکتوئین و تابش اشعه UVA را بر رویملانوژنزسلول های ملانوما B16F10. شکل 2B این محیط شرطی شده را نشان می دهد که پایین تنظیم شده استتیروزینازسطوح TRP-1، TRP-2، پروتئین کیناز c-AMP، p-CREB، CREB و MITF در سلول های B16F10.

3.3. اکتوئین بیان ملانین و تیروزیناز را در سلول های B16F10 تحریک شده با MSH کاهش داد.

سلول های ملانوما B16F10 ابتدا در معرض غلظت های بالاتر اکتوئین قرار گرفتند و اثر سمیت سلولی با استفاده از روش MTT تعیین شد. شکل 3A نشان می دهد که اکتوئین تاثیر قابل توجهی بر زنده ماندن سلول های B16F10 در غلظت های بالاتر (100-400 میکرومولار برای 72 ساعت) ندارد. با این حال، زنده ماندن سلولی در 24 و 48 ساعت درمان با اکتوئین تأثیری نداشت (داده‌ها نشان داده نشده است). بنابراین، از این غلظت‌ها برای تعیین اثر اکتوئین بر تحریک -MSH استفاده شدملانوژنزدر سلول های B16F10 داده های کمی سازی ملانین نشان داد که در مقایسه با سلول های کنترل، تیمار با -MSH (1 میکرومولار) به تنهایی به طور قابل توجهی سطح ملانین را بیش از 25 درصد افزایش داد. با این حال، در مقایسه با تیمار -MSH به تنهایی، سلول‌هایی که در معرض افزایش غلظت اکتوئین (100-400 میکرومولار در 72 ساعت) وابسته به دوز قرار گرفتند و به طور قابل‌توجهی درصد محتوای ملانین را با حداکثر کاهش تنها 85 درصد (یا 15- درصد نسبت به تیمار نشده) کاهش دادند. شاهد) در 400 میکرومولار پیش تیمار اکتوئین مشاهده شد (شکل 3B). علاوه بر این، داده‌های وسترن بلات ما نیز نشان داد که -MSH تحریک می‌شودتیروزینازبیان (24 ساعت) و p-CREB (2 ساعت) به طور قابل توجهی با افزایش غلظت پیش تیمارهای اکتوئین در این سلول های ملانوما کاهش یافت (شکل 3C).

3.4. اکتوئین بیان پروتئین‌های HO-1، NQO-1 و -GCLC را در سلول‌های HaCaT افزایش داد.

برای تعیین اثر زمان بر انتقال هسته ای Nrf2 با واسطه اکتوئین و متعاقب آن بیان پایین دست پروتئین های HO{1}}، NQO{2}} و -GCLC، سلول های HaCaT در معرض 1.5 میکرومولار اکتوئین قرار گرفتند و پروتئین های سلولی برداشت شدند. 0.5، 1، 2، 4، 8 یا 12 ساعت پس از درمان اکتوینی. داده‌های وسترن بلات نشان داد که به جز پروتئین -GCLC، 1.5 میکرومولار اکتوئین باعث حداکثر بیان پروتئین‌های HO{16}}، Nrf2 و NQO{18}} در نقطه زمانی 4 ساعت شد. -GCLC در یک نقطه زمانی 8 ساعت نشان داده شد (شکل 5A). داده‌های به‌دست‌آمده از منحنی زمان ما را به آزمایش تأثیر غلظت اکتوئین بر بیان سوق می‌دهدآنتی اکسیدانپروتئین در یک نقطه زمانی 4 ساعت شکل 5B نشان می دهد که هر سه پروتئین آنتی اکسیدانی حداکثر بیان را در غلظت 1.5 میکرومولار اکتوئین از خود نشان دادند. بعداً، اثرات پیش تیمار اکتوئین بر بیان نسبت Nrf2 و Keap{6}} در سلول های HaCaT تحت تابش UVA مورد آزمایش قرار گرفت. تجزیه و تحلیل داده های غربی نشان داد که پیش تیمار با 1.5 میکرومولار اکتوئین افزایش نسبت Nrf2/Keap{12}} را در سلول های HaCaT تحت تابش UVA نشان داد (شکل 5C). ما همچنین داده های سازگار با افزایش بیان NQO را مشاهده کردیم. پروتئین‌های -1، HO-1 و -GCLC در سلول‌های HaCaT پیش تیمار شده با اکتوئین که با 3 J/cm2 UVA تابش شده‌اند (شکل 5D). این داده ها نشان می دهد که پیش تیمار اکتوئین نقش محافظتی در سلول های HaCaT تابش شده با UVA ایفا می کند.

3.5. مسیرهای سیگنال دهی مختلف در فعال سازی Nrf2 در سلول های HaCaT تیمار شده با اکتوئین درگیر شدند

ما مسیرهای سیگنال دهی درگیر در جابجایی هسته ای Nrf2 با واسطه اکتوئین را تعیین کردیم. سلول‌های HaCaT با مهارکننده‌های دارویی مسیرهای سیگنال‌دهی PI3K/AKT، ERK، p38، JNK، PKC، ROS و CKII از قبل تحت درمان قرار گرفتند و به دنبال آن 1.5 میکرومولار اکتوئین انجام شد. داده های وسترن بلات هسته ای Nrf2 نشان داد که مسیرهای MAPK، PI3K/AKT، PKC و CKII p38 در این مکانیسم دخیل هستند (شکل 6A). از اطلاعات به‌دست‌آمده، ما همچنین تأثیر پیش‌تیمار اکتوئین را بر نقش این مسیرها در بیان پروتئین‌های آنتی‌اکسیدانی تعیین کردیم. شکل 6B نشان می دهد که مهار دارویی مسیرهای MAPK، p38، PI3K/AKT، CKII، و PKC بیان NQO{16}}، HO{17}} و -GCLC را کاهش داد.آنتی اکسیدانپروتئین ها در سلول های HaCaT علاوه بر این، زمان صرف شده برای فسفوریلاسیون AKT، p38، و بیان PKC و CKII در مواجهه با اکتوئین نشان می دهد که به جز p-AKT، فسفوریلاسیون p38 و بیان PKC و CKII در اواخر انجام شد. فقط نقاط زمانی (پس از 30 دقیقه) (شکل 6C). در مورد AKT، فسفوریلاسیون از نقطه زمانی 15 دقیقه مشاهده شد که در 30 دقیقه به اوج خود رسیده است (شکل 6C). در مورد AKT، فسفوریلاسیون از نقطه زمانی 15 دقیقه مشاهده شد که در 30 دقیقه به اوج خود رسیده است (شکل 6C). این نتایج تجمعی نشان می دهد که مسیرهای سیگنال دهی p38، AKT، PKC و CKII، آنتی اکسیدان ها را با واسطه اکتوئین انتقال هسته ای فعال می کنند. Nrf2 منجر به بیان پروتئین های آنتی اکسیدانی می شود.

3.6. اثر ضد ملانوژنیک واسطه اکتوئین به دلیل از بین رفتن Nrf2 سرکوب شد

نقش Nrf2 در ضد اکتوئین واسطهملانوژنزبا خاموش کردن Nrf2 در سلول‌های HaCaT تعیین شد. داده‌های وسترن بلات نشان داد که سلول‌های شکست Nrf2 در معرض 1.5 میکرومولار اکتوئین حداقل بیان NQO-1، HO{5}} و -GCLC را نشان دادند.آنتی اکسیدانپروتئین ها (شکل 7A). بعداً، ما تأثیر ناک‌داون Nrf2 را بر بیان سطوح -MSH در سلول‌های HaCaT تحت تابش UVA (3 J/cm2) آزمایش کردیم. نتایج وسترن بلات نشان داد که برای کنترل سلول‌های ترانسفکت‌شده siRNA، تابش UVA در تنظیم مثبت سطح بیان MSH در سلول‌هایی که در معرض اکتوئین قرار نگرفته بودند، معنی‌دار بود (شکل 7B). با این حال، 1.5 میکرومولار اکتوئین این اثر را سرکوب کرده است. برای مورد دیگر، سلول های ترانسفکت شده با siNrf2 کاهش در سطح -MSH را در سلول های تیمار نشده و تیمار شده نشان دادند (شکل 7B). مشابه داده‌های -MSH، داده‌های فلورسانس ما همچنین نشان داد که تابش‌های UVA به طور قابل‌توجهی تولید ROS را در سلول‌های siRNA کنترل نشده تیمار نشده با اکتوئین تنظیم می‌کنند (شکل 7C، D). با این حال، این اثر زمانی که سلول‌ها در معرض 1.5 میکرومولار اکتوئین قرار گرفتند، به‌طور قابل‌توجهی سرکوب شد. از سوی دیگر، سلول های HaCaT ترانسفکت شده با Nrf2 و تابش اشعه UVA، تقریباً 8-برابر افزایش سطح ROS در مقایسه با سلول های ترانسفکت شده Nrf2 که با UVA تابش نشده بودند اما در معرض تیمار اکتوئین قرار داشتند، نشان دادند (شکل 7C، D). همه این داده‌ها نشان‌دهنده نقش محافظتی با واسطه اکتوئین است که Nrf2 در به حداقل رساندن تولید ملانین در سلول‌های HaCaT تحت تابش UVA بازی می‌کند. . همه این داده ها نقش محافظتی با واسطه اکتوئین را توسط Nrf2 در به حداقل رساندن تولید ملانین در سلول های HaCaT تحت تابش UVA نشان می دهد.

مزیت سیستانچ: سفید کردن پوست

4. بحث

پوست های مختلف -سفید کردنعوامل در صنعت آرایشی و بهداشتی استفاده می شوند. بسیاری از این عوامل منشا شیمیایی دارند و از محدودیت های ایجاد عوارض جانبی مختلف از جمله سرطان رنج می برند [24-26]. بنابراین، شناسایی عوامل ایمن و طبیعی سفیدکننده پوست نشان دهنده نیاز روز است. اکتوئین (شکل 1A) به عنوان یک ماده فعال در کرم صورت و سایر عوامل آرایشی استفاده می شود. این به عنوان یک عامل مرطوب کننده پوست عمل می کند و همچنین پیری زودرس پوست را به تاخیر می اندازد [27]. تقریباً تمام عوامل شناخته شده سفید کننده پوست، کاهش تنظیم پوست را هدف قرار می دهندتیروزینازفعالیت آنزیمی در سلول های تحت تابش اشعه ماوراء بنفش که باعث کاهش آن می شودملانوژنزدر سلول های پوست.Yao et al. را نشان دادسفید کردنویژگی‌های اکتوئین بیوسنتز شده و بیانگر این است که این ماده سفیدکننده است. در مطالعه خود، آن ها غلظت بالای (5{2}}0 میکرومولار) اکتوئین را برای اثر سفید کنندگی آن بر روی رده های سلولی ملانوم موش (B16F0) و ملانوم انسانی (A2058) آزمایش کردند و به این نتیجه رسیدند که اکتوئین یک ماده بی خطر است. عامل بالقوه برای کاربردهای زیبایی و بالینی [20]. با این حال، در این مطالعه، ما بیشتر اثرات مفید غلظت‌های پایین اکتوئین (0.5-1.5 میکرومولار) را بر روی سلول‌های HaCaT تحت تابش UVA آزمایش کردیم و مکانیسم‌های مولکولی زیربنایی رمزگشایی شدند. در مطالعه ما، نشان داده شد که اکتوئین، از طریق مسیر Nrf2/ARE، نه تنها بیان ژن آنتی اکسیدانی را القا کرده است، بلکه سطوح -MSH را در سلول های HaCaT تحت تابش اشعه UVA از طریق سرکوب POMC کاهش داده است. کاهش سطح -MSH با کاهش فعالیت آنزیم تیروزیناز که منجر به کاهش تولید ملانین می‌شود، مرتبط بود. از دانش ما، این اولین گزارشی است که توسط مکانیسم استخراج شده توسط اکتوئین در سلول های HaCaT تابش شده با UVA اثبات شده است. این مطالعه مکانیسم‌های مولکولی نشان‌داده‌شده توسط اکتوئین را در سلول‌های HaCaT در سیستم مدل سلولی مشخص کرد.

ابتدا غلظت‌های زیر کشنده اکتوئین و همچنین تأثیر تابش UVA بر زنده‌مانی سلول‌های HaCaT را تعیین کردیم. داده‌های MTT ما نشان داد که غلظت‌های پایین اکتوئین (0.5-1.5 میکرومولار) تأثیر قابل‌توجهی بر زنده‌مانی سلول‌های HaCaT ندارد (شکل 1B). پیش تیمار اکتوئین قابلیت زنده ماندن 3 J/cm2 سلول HaCaT تابش شده با UVA را افزایش داد (شکل 1B). بر اساس این مشاهدات، آزمایشات بعدی را با استفاده از 1.5 میکرومولار پیش تیمار اکتوئین و تابش UVA در دوزهای 3 J/cm2 ادامه دادیم.

تولید ROS ناشی از اشعه UVA در کراتینوسیت های پوست یک واقعیت شناخته شده است [28]. بنابراین، ما همچنین برای هر گونه اثرات مفید از پیش تیمار اکتوئین در تولید ROS ناشی از اشعه UVA در سلول‌های HaCaT آزمایش کردیم. داده‌های شدت فلورسانس DCF ما نشان داد که پیش تیمار با 1.5 میکرومولار اکتوئین به‌طور قابل‌توجهی باعث کاهش قابل توجهی در اینکراتینوسیت‌های تولید ROS ناشی از اشعه UVA شد. همچنین مشاهده شد که 1.5 میکرومولار اکتوئین می‌تواند باعث افزایش سطح پایه در سطوح theROS در سلول‌های HaCaT شود که از نظر آماری معنی‌دار بود (شکل 1D، E).

روسو و همکاران گزارش شده است که POMC توسط کراتینوسیت ها و ملانوسیت های اپیدرمی انسان ترشح می شود و باعث تحریکملانوژنز[29]. با در نظر گرفتن این موضوع، ما نیز تأثیر تابش اشعه UVA و پیش تیمارهای اکتوئین را بر روی پروتئین های مرتبط با ملانوژنز در سلول هایHaCaT آزمایش کردیم. داده‌های وسترن بلات ما نشان داد که کاهش وابسته به دوز بیان پروتئین‌های -MSH و POMC در سلول‌های HaCaT تابش‌شده با UVA ناشی از پیش تیمار با اکتوئین است.ملانوژنزپروتئین های مرتبط قابل ذکر است، تقریباً تمام پروتئین های آزمایش شده (تیروزیناز، TRP{0}}، TRP-2، پروتئین‌کیناز c-AMP، CREB، و MITF) با افزایش غلظت Ectoinepre-treatment در سلول‌های HaCaT تحت تابش اشعه UVA کاهش عبارات را نشان دادند (شکل 2A، B). این داده ها نشان دهنده این واقعیت است که Ectoine دارای خواص ضد ملانوژنی در سلول های HaCaT تابش شده با UVA است.

اثر ضد ملانوژنیک اکتوئین بیشتر در سلول‌های B16F10، یک رده سلولی ملانوم شناخته شده مورد استفاده درملانوژنزمطالعات [30]. یکی از مشاهدات قابل توجه در مطالعه ما این بود که بر خلاف سلول‌های HaCaT، غلظت بالای اکتوئین (100-400 میکرومولار) برای سرکوب سنتز ملانین در سلول‌های B16F10 تحریک‌شده با -MSH ضروری بود (شکل 3B). داده‌های وسترن بلات ما نشان داد که اکتوئین به‌طور وابسته به دوز بیان آن را کاهش می‌دهدتیروزینازو پروتئین های p-CREB در سلول های B16F10 تحریک شده با -MSH که منجر به اثر فوق الذکر می شود (شکل 3C). بنابراین، همچنین آزمایش شد که آیا این غلظت‌های بالای اکتوئین می‌تواند بر زنده‌مانی سلول‌های B16F10 تأثیر بگذارد یا خیر. نتایج MTT ما نشان داد که غلظت های بالای اکتوئین (100-400 میکرومولار) هیچ تاثیری بر زنده ماندن سلول های B16F10 ندارد (شکل 3A). این نتایج نشان می‌دهد که کراتینوسیت‌ها نقش کلیدی در ضد اکتوئین با واسطه دارند.ملانوژنزو اثرات رنگدانه.

نقش فاکتور رونویسی Nrf2 در متابولیسم سلول های پوست به خوبی ثبت شده است [31]. بنابراین، ما مکانیسم‌های بازی‌شده توسط مسیر Nrf2/Keap{3}} را در اثرات واسطه‌شده اکتوئین در کراتینوسیت‌ها آزمایش کردیم. شکل 4A نشان می دهد که اکتوئین وابسته به دوز و به طور قابل توجهی نسبت Nrf2/Keap{7}} را با حداکثر اثر در غلظت 1.5 میکرومولار اکتوئین افزایش داد. همچنین مشاهده شد که 1.5 میکرومولار اکتوئین از جابجایی هسته ای پروتئین Nrf2 با حداکثر بیان Nrf2 از بخش پروتئین هسته ای که در نقطه زمانی 2 ساعت مشاهده شده است (شکل 4B) ترجیح داده است. (شکل 4D).

در ملانوسیت ها و کراتینوسیت های انسانی، Marrot و همکاران. و دیگران اهمیت مسیر دفاعی Nrf2 را در پاسخ های استرس اکسیداتیو نوری توضیح داده اند [32]. ما نیز اثر بیان پروتئین آنتی اکسیدانی Ectoinemediated در سلول های HaCaT را مطالعه کردیم. داده‌های منحنی زمان ما نشان داد که بیان هر سه پروتئین آنتی‌اکسیدان (HO{4}}، NQO{5}}، -GCLC) و Nrf2 به‌صورت دو فازی با افزایش زمان بیان می‌شوند. 8}}.5-12 ساعت) با یک اثر قابل مشاهده در نقطه زمانی 4 ساعت ذکر شد (شکل 5A). از این، منحنی غلظتی که اثر غلظت اکتوئین را بر روی اندازه گیری می کندآنتی اکسیدانبیان پروتئین نیز در یک نقطه زمانی 4 ساعت تعیین شد. شکل 5B نشان می دهد که در مقایسه با سلول های تیمار نشده، تیمار اکتوئین به طور وابسته به دوز بیان پروتئین های HO-1، NQO-1، -GCLC را افزایش داده است. ما همچنین میزان غلظت اکتوئین را در سلول‌های HaCaT که در معرض اشعه UVA قرار داشتند، اندازه‌گیری کردیم. داده‌های وسترن بلات نشان داد که اکتوئین به‌طور وابسته به دوز بیان پروتئین‌های آنتی‌اکسیدانی را با یک تنظیم چشمگیر در نسبت Nrf2/Keap{9}} نیز افزایش می‌دهد (شکل 5C، D). این نتایج نشان داد که پیش تیمار Ectoine (1.5 میکرومولار، 4 ساعت) اثر بالقوه ای برای القای بیان پروتئین آنتی اکسیدانی در سلول های HaCaT دارد که می تواند اثرات مضر ناشی از قرار گرفتن در معرض UVA را خنثی کند.

سیستانچ آنتی اکسیدانی

5. نتیجه گیری ها

از داده‌های بالا، ما به این نتیجه رسیدیم که غلظت‌های پایین اکتوئین ({0}}.5-1.5 میکرومولار) می‌تواند از طریق سرکوب POMC و تولید ملانین -MSH را کاهش دهد.تیروزینازمسیر سلول های HaCaT تحت تابش اشعه UVA، نشان دهنده ضد آن است.ملانوژنزاثر. علاوه بر این، اکتوئین همچنین در سرکوب تولید ROS داخل سلولی در سلول‌های HaCaT نقش داشت. برخلاف سلول‌های HaCaT، غلظت‌های بالای اکتوئین (50 تا 400 میکرومولار) می‌تواند اثر مشابهی را در ملانومسل‌های B16F10 نشان دهد که نشان‌دهنده این واقعیت است که کراتینوسیت‌ها می‌توانند نقش کلیدی در ضد اکتوئین با واسطه داشته باشند.ملانوژنزو پوست -سفید کردناثرات در سلول های پوست مهمتر از همه، اکتوئین از طریق فعال کردن مسیر Nrf2، که باعث بیانآنتی اکسیدانپروتئین‌های HO-1، NQO-1 و -GCLC. نشان داده شد که AKT اولین مسیر سیگنال دهی است که فعال سازی Nrf2 و به دنبال آن مسیرهای دیگر (p38، PKC و CKII) را آغاز می کند. در نهایت، خاموش کردن Nrf2 به طور مستقیم شواهدی را ارائه داد که Nrf2 نقش کلیدی در تنظیم ROS داخل سلولی و همچنین تولید -MSH ایفا می‌کند. ما به این نتیجه رسیدیم که مکانیسم اصلی سفیدکننده اکتوئین باید با مهار مسیر ROS-p53/POMC{10}}MSH در سلول‌های HaCaT تحت تابش اشعه UVA توجیه شود. بنابراین، اکتوئین یا مشتقات آن می‌تواند یک ماده فعال در مرطوب‌کننده‌ها و لوسیون‌ها باشد. که به عنوان پوست بالقوه و طبیعی استفاده می شودسفید کردننمایندگان در صنعت آرایشی و بهداشتی

مکمل آنتی اکسیدانی سیستانچ