اثر درمانی سیستانوزید A بر متابولیسم استخوان موش های تخمدان برداشته شده

1. مقدمه

پوکی استخوان، یک "قاتل خاموش" اسکلتی سیستمیک، به یک خطر بزرگ برای سلامتی تبدیل شده است که در سال های اخیر بیش از 2000 میلیون نفر را در سراسر جهان مبتلا کرده است. این بیماری با تراکم توده استخوانی کم (BMD) و تخریب ریزمعماری مشخص می شود که از تحلیل بیش از حد استخوان بیش از تشکیل استخوان ناشی می شود و در نهایت منجر به شکستگی پوکی استخوان می شود. امروزه، شناسایی عواملی برای جلوگیری از تمایز و جذب استئوکلاستیک، راهبرد متداول و موفقی برای توسعه داروهای درمانی برای پوکی استخوان است و در واقع عوامل مصنوعی بسیاری از جمله استرادیول والرات و آلندرونات سدیم وجود دارند که می توانندپیشگیری و درمان پوکی استخوان. با این حال، داروهای مربوط به این بیماری ها از ایده آل فاصله زیادی دارند. برخی از این داروها می توانند خطر ابتلا به سرطان آندومتر و سینه را افزایش دهند و همچنین دارای درجاتی از عوارض جانبی مانند هیپرکلسمی، هیپرکلسیوری و غیره هستند که کاربردهای بالینی آنها را محدود می کند. بنابراین، برای بیش از یک هزار سال، داروهای سنتی چینی (TCM)، به ویژه TCM خوراکی با ترکیبات و فراکسیون های زیست فعال جدا شده، به طور گسترده ای به طور ایمن و موثر در کشورهای آسیایی برای پیشگیری و درمان بیماری های مختلف از جمله پوکی استخوان استفاده می شود.

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای درمان و پیشگیری از بیماری پوکی استخوان PHGS75% ECH 30% ACT 12%

پوکی استخوان به عنوان افزایش جذب استخوان به دلیل افزایش استئوکلاستوژنز مشخص می‌شود و این فرآیند شامل تعهد مونوسیت‌های خونساز به پیش سازهای استئوکلاست است که ترکیب می‌شوند تا استئوکلاست‌های چند هسته‌ای را تشکیل دهند که مکان‌های استخوانی در حال بازسازی را هدف قرار می‌دهند [4]. فعال کننده گیرنده برای لیگاند فاکتور هسته ای-κB (RANKL)، یک عامل کلیدی که از استئوبلاست ها ترشح می شود، تمایز مونوسیت ها را به استئوکلاست ها تحریک می کند [8،9]. برهمکنش RANKL با RANK گیرنده اش منجر به آبشاری از رویدادهای درون سلولی، از جمله NF-κB، PI3K/Akt، و کیناز وابسته به کلسیم/کالمودولین با به کارگیری فاکتور مرتبط با گیرنده پروتئین سیگنال آداپتور TNF (TRAF6) می شود. در نتیجه، چندین ژن نشانگر مرتبط با استئوکلاست، از جمله TRAP، کاتپسین K و DPD، تنظیم می شوند و روند تحلیل استخوان تسریع می شود.

گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید توسط سینامیک اسید و نیمه های هیدروکسیل فنیل اتیل مشخص می شوند که از طریق یک پیوند گلیکوزیدی به گلوکوپیرانوز (آپیوز، گالاکتوز، رامنوز، زایلوز و غیره) متصل می شوند که به طور گسترده در گیاهان دارویی توزیع می شوند [10]. سیستانوزید A (Cis A) یک فعال استگلیکوزید فنیل اتانوئیددر Cistanche deserticola YC Ma. با توجه به سابقه داروسازی چینی، C. deserticola به طور سنتی برای درمان کمبود کلیه یین، ضعف عضلانی، ناتوانی کمر و غیره استفاده می شد و گلیکوزیدهای فنیل اتانوئید اصلی ترین ترکیبات زیست فعال در این گیاه هستند [11]. بر اساس تئوری "کلیه" TCM، کلیه می تواند بر سیستم استخوانی حکومت کند، به این معنی که رشد و عملکرد استخوان ها به جوهر کلیه بستگی دارد، و این جوهر کلیه می تواند به مغز استخوان تبدیل شود تا استخوان ها را تغذیه کند. باعث رشد و ترمیم اسکلت و تقویت اسکلت می شود [12]. از آنجایی که C. deserticola می تواند کلیه ها را تقویت کند، ما فرض کردیم که Cis A می تواند از پوکی استخوان جلوگیری کرده و آن را درمان کند. بنابراین مطالعه حاضر برای اعتبارسنجی پتانسیل طراحی شده استسیس A در پیشگیری از پوکی استخوانبا استفاده از مدل موش‌های تخمدان‌برداری شده و نشانگرهای تشکیل و جذب استخوان و همچنین مکانیسم‌های بالقوه مرتبط برای تخمین زیست فعالی ضد پوکی استخوان این عامل تعیین شد.

2. نتایج و بحث

2.1. نتایج

2.1.1. اثرات Cis A بر تست خمش سه نقطه ای استخوان

برای تجزیه و تحلیل اینکه آیا درمان با Cis ​​A باعث قوی‌تر شدن استخوان می‌شود، استخوان ران را تحت آزمایش خمش سه نقطه قرار دادیم. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، حداکثر بار اعمال شده هنگام شکستن استخوان 21.5٪ و 22.{5}}٪ بیشتر در حیوانات تحت درمان با 20 mg/kg و 80 mg/kg بود. کیلوگرم Cis A، به ترتیب، در مقایسه با حیوانات در گروه تخمدان برداشته شده (OVX) (p < 0.05). در همین حال، درمان با Cis ​​A نیز سفتی استخوان را افزایش داد. همه موش‌های تیمار شده با Cis ​​A به ترتیب سفتی افزایش قابل توجهی با داده‌های 121.{27}} ± 12.1 (p <0.05)، 124.1 ± 16.2 (p <0.05) و 127.7 ± 9.6 (p <0.01) نشان دادند. در مقایسه با 10.7 ± 102.2 موش OVX. نتایج نشان می دهد که افزایش استحکام استخوان در موش های OVX تحت درمان با Cis ​​A به دلیل افزایش مقدار استخوان و افزایش کیفیت استخوان است.

2.1.2. اثرات Cis A بر ریزمعماری استخوان

ریزمعماری استخوان ترابکولار سه بعدی موش‌ها که توسط میکرو CT اندازه‌گیری شده است (شکل 2 و جدول 1) به طور مستقیم نشان می‌دهد که موش‌های گروه OVX کاهش قابل‌توجهی در ناحیه ترابکولار و تعداد ترابکولار در مقایسه با گروه شم داشتند، که نشان می‌دهد که تخمدان برداشتن می تواند کاهش قابل توجهی در تراکم توده استخوانی (BMD، -46٪)، محتوای مواد معدنی استخوان (BMC، -66٪)، محتوای مواد معدنی بافت (TMC، -85٪)، کسر حجمی استخوان (BVF، -82٪)، تعداد ترابکولار (Tb. N، 76-%) و افزایش جداسازی ترابکولار (Tb. Sp، +80%) بدون هیچ گونه تغییری در تراکم معدنی کل بافت (TMD) و ضخامت ترابکولار (Tb. Th) پس از عملیات 12 هفته با این حال، موش‌های OVX تحت درمان با Cis ​​A منجر به افزایش وابسته به دوز BMD ({12}}%~57%)، BMC (+65%~73%)، TMC (+83%~) شدند. 90%)، BVF ({18}}%~88%)، کاهش بیشتر سل. Sp (-79٪ ~ 88٪) و افزایش بیشتر سل. N (+73%~82%) در مقایسه با گروه OVX. به نظر می‌رسید که TMD تحت تأثیر اوارکتومی قرار نگیرد، اما با درمان با استرادیول والرات (EV) به طور قابل‌توجهی افزایش یافت.

2.1.3. اثرات Cis A بر هر دو نشانگر تشکیل استخوان و جذب

اثرات Cis A بر مارکرهای تحلیل استخوان، از جمله TRAP، DPD، شاخص تشکیل استخوان کاتپسین K ALP، و پروتئین گلا استخوان (BGP)، در شکل 3 نشان داده شده است. پس از 12 هفته از عمل جراحی تخمدان، فعالیت های TRAP، DPD و کاتپسین K در گروه OVX به طور قابل توجهی افزایش یافت، به ویژه DPD، که نزدیک به 55.6٪ افزایش یافت. TRAP و کاتپسین K به ترتیب 43.5٪ و 38.1٪ در مقایسه با گروه شم افزایش یافتند. Cis A که به مدت 12 هفته به صورت خوراکی تجویز شد، پتانسیل قابل توجهی در جلوگیری از همه نشانگرهای تحلیل استخوان ذکر شده در بالا نشان داد، به ویژه دوز بالا (8{13}} میلی گرم بر کیلوگرم) که تأثیر قابل توجهی در سرکوب فعالیت های DPD نشان می دهد. در مقایسه با گروه OVX (شکل 3). اگرچه روند افزایشی فعالیت های ALP و BGP در گروه OVX نشان داده شد، هیچ تغییر آماری معنی داری مشاهده نشد. با این حال، بهبود قابل توجهی در فعالیت ALP در گروه‌های تحت درمان با A کم و بالا در مقایسه با گروه شم مشاهده شد (01/0p<).

توبولوزای طبیعی سیستانچ برای پیشگیری از پوکی استخوان 75% ECH 30% ACT 12%

2.1.4. اثرات Cis A بر سطوح بیان پروتئین TRAF6، NF-kB PI3K، Akt، OPG و RANKL

تجزیه و تحلیل وسترن بلات نشان داد که در مقایسه با گروه شم، سطوح پروتئین TRAF6، NF-kB، و RANKL در گروه OVX به طور قابل توجهی افزایش یافته است (p < 0.05)، در حالی که OPG، PI3K و Akt به طور قابل توجهی کاهش یافتند (شکل 4). Cis A (2{13}} میلی‌گرم/کیلوگرم یا ۸۰ میلی‌گرم/کیلوگرم) بیان TRAF6 را به‌طور قابل‌توجهی کاهش داد (۰۵/۰p<)، به دنبال آن بیان RANKL کاهش یافت و OPG افزایش یافت، که به این معنی است که نسبت OPG/RANKL افزایش یافته است. در نتیجه، آبشارهای سیگنال دهی NF-kB کاهش یافتند و PI3K / Akt با درمان Cis A تنظیم مثبت شدند (05/0p <).

2.2. بحث

با توجه به محدودیت‌های گزینه‌های درمانی فعلی برای بیماری پوکی استخوان، نیاز به جایگزین‌هایی از غذا یا گیاهان دارویی خوراکی طبیعی وجود دارد. به عنوان بخشی از تلاش مداوم ما برای کشف عوامل موثر ضد پوکی استخوان از TCM، مجموعه‌ای از عصاره‌ها، فراکسیون‌ها و ترکیباتی را یافتیم که دارای اثر ضد پوکی استخوان هستند [13،14]. Cistanche deserticola یک TCM کلاسیک مهم است که دارای مشخصات ایمنی مطلوب [15] و عملکردهای دارویی گسترده ای برای درمان کمبود کلیه و غیره است [16]. با توجه به تئوری TCM، TCM که دارای اثر تقویت کننده کلیه است معمولابرای درمان پوکی استخوان استفاده می شود; گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی ترکیبات فعال زیستی اصلی در این گیاه هستند، بنابراین به این معنی است کهگلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدیموجود در C. deserticola ممکن است دارای خاصیت ضد پوکی استخوان باشد. ثابت شد که عصاره C. deserticola می تواند به طور قابل توجهی از کاهش BMD جلوگیری کند و از بدتر شدن ریزمعماری ترابکولار ناشی از OVX جلوگیری کند [17]. در آزمایش آزمایشگاهی، همچنین به طور قابل توجهی ALP، پروتئین مورفوژنتیک استخوان و mRNA استئوپونتین و همچنین معدنی شدن استخوان استئوبلاست های کشت داده شده را افزایش داد [18]. اکیناکوزید، یک جزء فعال زیستی اصلی در C. deserticola که به طور رسمی در داروسازی چینی ثبت شده است [11]، فعالیت ضد پوکی استخوان را با دوز بالای 30 تا 270 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن در روز نشان داد [19]، و نتایج بیشتر در شرایط آزمایشگاهی نشان داد که آن را نشان می دهد. می‌تواند با افزایش جیره OPG/RANKL در سلول‌های MC3T{8}}E1 Subclone 14، بازسازی استخوان را تقویت کند [20]. Cis A یکی از گلیکوزیدهای فنیل اتانول جدا شده از C. deserticola بود و چندین گزارش نشان داد که این ترکیب دارای فعالیت آنتی اکسیدانی [21] و خواص ضد التهابی است [22،23]. مقاله‌ای که اخیراً منتشر شده است کشف کرد که Cis A فعالیت‌های محافظتی بر روی CCl4 و سمیت کبدی ناشی از الکل در موش‌ها نشان می‌دهد، و همچنین یک خاصیت محافظتی بر روی آسیب ناشی از اتانول در سلول‌های کبدی کشت اولیه موش در شرایط آزمایشگاهی نشان داد [24]. در مطالعه حاضر، نتایج نشان داد که Cis A دارای فعالیت ضد پوکی استخوان در دوز پایین (20 تا 80 میلی‌گرم به ازای هر کیلوگرم وزن بدن در روز) با استفاده از مدل موش‌های تخمدان‌برداری شده بود، و این زیست‌فعالی با کاهش سطح TRAF6، سرکوب شد. بیان RANKL و NF-kB و تحریک OPG، PI3K و Akt، که به این معنی است که اثر درمانی Cis A در موش‌های OVX از طریق مکانیسم غیرفعال‌سازی NF-kappaB با واسطه TRAF و فعال‌سازی PI3K/Akt بود.

به خوبی شناخته شده است که اوارکتومی می تواند باعث پوکی استخوان با کاهش آشکار BMD، استحکام بیومکانیکی، کیفیت استخوان و ریزمعماری استخوان ترابکولار شود و تغییرات فوق تا حدی به دلیل کمبود استروژن است [25]. در حال حاضر، در آزمایش in vivo حاضر، مطالعه ما نشان می‌دهد که پوکی استخوان ناشی از تخمدان منجر به کاهش قابل توجهی در استحکام بیومکانیکی و پارامترهای ساختاری ترابکولار، از جمله BMD، BMC، TMC و Tb می‌شود. N و افزایش Tb. Sp; و درمان Cis A به طور قابل توجهی خواص مکانیکی استخوان از جمله حداکثر بار و سفتی را بهبود بخشید، BMD را افزایش داد و بسیاری از پارامترهای ساختاری ریزمعماری ترابکولار استخوان را در مقایسه با موش‌های گروه OVX بهبود بخشید، که نشان می‌دهد Cis A در بهبود کیفیت استخوان موثر است. و ریزمعماری ترابکولار در موش های OVX

علاوه بر BMD کل، آزمون خمش سه نقطه ای و اندازه گیری ریزمعماری استخوان ترابکولار می تواند به طور مستقیم پوکی استخوان را تشخیص دهد، نشانگرهای تشکیل استخوان، از جمله ALP و BGP، و شاخص تحلیل استخوان، از جمله TRAP، DPD، و کاتپسین K نیز برای تشخیص استفاده شد. در مطالعه ما، فعالیت ALP در موش های گروه OVX روند افزایشی غیر قابل توجهی را نشان داد که نشان دهنده افزایش نرخ گردش استخوان [26،27] در پوکی استخوان پس از یائسگی بود. دوز بالا (80 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن در روز) و دوز پایین (20 میلی گرم بر کیلوگرم وزن بدن در روز) تیمارهای Cis A افزایش قابل توجهی در فعالیت ALP در مقایسه با گروه شم نشان داد، در حالی که به نظر می رسید فعالیت BGP تحت تأثیر قرار نگرفت. تخمدان در تمام گروه های تحت درمان TRAP، DPD و کاتپسین K به طور قابل توجهی در گروه OVX افزایش یافتند و تجویز Cis A به طور قابل توجهی هر سه نشانگر تحلیل استخوان را کاهش داد. داده‌های بالا حاکی از آن است که Cis A دارای فعالیت ضد پوکی استخوان بالقوه است، و این اثر با تنظیم متابولیسم استخوان، از جمله سرکوب تحلیل استخوان و افزایش تشکیل استخوان، اعمال می‌شود.

هماهنگی بین استئوبلاست و استئوکلاست یک عامل حیاتی در حفظ یکپارچگی اسکلتی است. استئوکلاست‌ها که TRAP را بیان می‌کنند، از طریق تشکیل نواحی مهر و موم متصل به اکتین به سطح استخوان می‌چسبند، که در آن آنزیم‌های پروتئولیتیک مانند کاتپسین K آزاد می‌شوند و منجر به تشکیل حفره‌های جذب می‌شوند. تعدیل استئوکلاستوژنز توسط سلول های نابالغ دودمان استئوبلاستی توسط RANKL و OPG [28] انجام می شود. OPG یک گیرنده فریب است که از فعال سازی RANKL در استئوکلاستوژنز جلوگیری می کند و در نتیجه تحلیل استخوان را کاهش می دهد. RANKL که سیگنال مهمی به اجداد استئوکلاست‌ها می‌دهد، یک مولکول متصل به غشاء از خانواده لیگاند فاکتور نکروز تومور است که تشکیل استئوکلاست‌ها را ترویج می‌کند. اعتقاد بر این است که نسبت بیان OPG/RANKL یک پارامتر کلیدی در فعالیت استئوکلاستوژنیک است و آبشارهای سیگنالینگ فعال شده توسط RANKL شامل مسیرهای NF-kB و PI3K می‌شوند [29]. اهمیت مسیر NF-kB برای استئوکلاستوژنز با این واقعیت نشان داده می شود که حذف NF-kB در موش منجر به عدم وجود استئوکلاست های بالغ می شود [30]. TRAF6 به عنوان یک هدف امیدوارکننده برای داروهای جدید ضد پوکی استخوان ثابت شد. موش‌های دارای کمبود TRAF که دارای استئوکلاستوژنز معیوب و استئوپتروز شدید بودند، اهمیت TRAF6 را در متابولیسم استخوان نشان دادند. شواهد در حال ظهور به یک عملکرد نظارتی حیاتی برای TRAF6 در آبشارهای سیگنالینگ با واسطه RANKL/RANK اشاره می‌کنند [4،31]. داده‌های مطالعه حاضر نشان داد که درمان Cis A روی موش‌های OVX منجر به کاهش سطح بیان پروتئین TRAF6، کاهش RANKL و افزایش بیان OPG شد و در نتیجه از فعال‌سازی RANKL پایین‌دست NF-kB و فعال کردن مسیرهای سیگنال PI3K/Akt جلوگیری کرد. نشان می‌دهد که Cis A تمایز استئوکلاست‌ها را توسط TRAF{20}}غیرفعال‌سازی NF-kappaB و فعال‌سازی PI3K/Akt مهار می‌کند و نسبت OPG/RANKL را افزایش می‌دهد، متعاقباً استئوکلاستوژنز را مهار می‌کند و باعث تشکیل استخوان می‌شود.

TUBULOSA CISTANCHE NATURAL FORفعالیت ضد پوکی استخوانPHGS75% ECH 30% ACT 12%

3. مواد و روش ها

3.1. مواد گیاهی، آماده سازی و تعیین

ساقه های گیاه سیستانش دسرتیکولاYC Ma، شناسایی شده توسط پروفسور Xue-yan Fu از گروه داروسازی، دانشگاه پزشکی Ningxia، در 2 سپتامبر 015 در شهرستان Yongning، استان Ningxia، چین جمع آوری شد. یک نمونه کوپن (#20150901) در هرباریوم بخش داروسازی نگهداری شد. در مجموع 30.0 کیلوگرم از ساقه خشک شده در هوای C. deserticola با 70 درصد اتانول (180 لیتر، 3×2 ساعت) 3 بار با رفلاکس استخراج شد. فیلترها ترکیب شدند و تحت یک ستون رزین ماکرو متخلخل (AB-8) با یک سیستم حلال گرادیان مرحله‌ای با افزایش اتانول در آب (0٪، 20٪ و 60٪، هر 60 لیتر) قرار گرفتند تا سه بخش به دست آید، سپس 60 درصد از بخش بیشتر توسط سپادکس LH{18}} (شرکت فارماسیا بیوتکنولوژی، اوپسالا، سوئد) و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا نیمه آماده‌سازی (Agilent 1100، Agilent Technologies، Waldbronn، آلمان) خالص شد تا زرد کم رنگ به دست آید. سیستانوزید A 4.5 گرم (Cis A؛ عملکرد 0.015٪ بود). ساختار عمدتاً با تجزیه و تحلیل داده‌های NMR (Bruker Avance، 400 مگاهرتز، آلمان) و طیف‌های MS (Agilent 6540، Agilent Technologies) که با داده‌های گزارش‌شده مطابقت داشتند، روشن شد [19]. خلوص آن با روش نرمال سازی ناحیه HPLC تعیین شد (شکل 5). در آزمایشات حیوانی، بر اساس آزمایش اولیه ما، دوز Cis A 20-80 میلی گرم بر کیلوگرم در روز بود.

3.2. مواد شیمیایی و حلال ها

موارد زیر مورد استفاده قرار گرفت: کیت استخراج پروتئین کل و کیت های کوانتیزاسیون پروتئین BCA (Ken Gen Biotech. Co. Ltd, Nanjing, China)، آنتی بادی های اولیه TRAF6، NF-kB، PI3K، Akt، RANKL، OPG، -اکتین و توبولین ( فناوری سیگنال‌دهی سلولی، بورلی، MA، ایالات متحده آمریکا)، آنتی‌بادی‌های ثانویه از بز کونژوگه با پراکسیداز ترب کوهی IgG ضد خرگوش (ZSGB-BIO، پکن، چین)، استرادیول والرات (1 میلی‌گرم، دلفارم لیل SAS، پاریس، فرانسه)، گلا استخوان کیت های الایزا پروتئین و دئوکسی پیریدینولین (شرکت مهندسی بیولوژیکی Xinyu، شانگهای، چین) و کیت کاتپسین K ELISA (Biovision، Mountain View، CA، USA) را پیوند می دهد. تمام مواد شیمیایی و عوامل بیوشیمیایی دیگر مورد استفاده، معرف های درجه تحلیلی AR بودند.

3.3. آزمایش های حیوانی

60 موش ماده نژاد کونمینگ، 8 هفته‌ای با وزن بدن 26. 1.62 ±0 از دانشگاه پزشکی نینگشیا خریداری شدند و 10 موش با رژیم غذایی آزمایشگاهی استاندارد در یک قفس نگهداری شدند. و آب لوله کشی تحت شرایط کنترل شده با هوا (24.{9}} ± 0.5 ◦C، رطوبت 45%–50% و چرخه روشنایی نور تا تاریکی 12 ساعت/12 ساعت). پس از سازگاری به مدت 1 هفته، عمل جراحی در شرایط آسپتیک انجام شد و همه موش ها با کلرال هیدرات (100 میلی گرم بر کیلوگرم، داخل صفاقی) بیهوش شدند. موش هایی که بدون برداشتن تخمدان تحت عمل جراحی قرار گرفتند، گروه شم بودند (n=10). بقیه به عنوان گروه OVX (n=50) تحت اوارکتومی دوطرفه قرار گرفتند. آزمایشات حیوانی فوق طبق راهنمای مراقبت و استفاده از حیوانات آزمایشگاهی انجام شد و توسط کمیته اخلاق زیستی دانشگاه پزشکی نینگشیا تأیید شد.

پس از یک دوره بهبودی هفته‌ای {{0}، 50 موش OVX فوق به‌طور تصادفی و به طور مساوی به 5 گروه تقسیم شدند. با 20، 40 و 80 میلی گرم بر کیلوگرم در روز Cis A به عنوان گروه های با دوز کم، متوسط ​​و بالا، به ترتیب. با وسیله نقلیه (0.5٪ کربوکسی متیل سلولز () -Na) به عنوان گروه مدل (OVX). همه موش‌ها با حجم مساوی 1 میلی‌لیتر/100 گرم وزن بدن، EV یا Cis ​​A به صورت خوراکی تجویز شدند که از هفته دوم پس از عمل شروع شد و به مدت 12 هفته ادامه داشت. وزن بدن هر دو هفته اندازه گیری شد و دوز بر این اساس تنظیم شد. پس از آخرین تجویز خوراکی، نمونه‌های خون از شریان فمورال موش‌های بی‌هوش خارج شد، اجازه لخته شدن داده شد و در 3000 × گرم به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد تا سرم تهیه شود. استخوان ران و استخوان درشت نی سمت راست تشریح شد. همه نمونه ها در دمای 80- درجه سانتیگراد برای ارزیابی بیشتر ریزمعماری استخوان و پارامترهای بیوشیمیایی سرم مرتبط با پوکی استخوان ذخیره شدند.

3.4. تست خمش سه نقطه

ویژگی بیومکانیکی استخوان ران راست موش با استفاده از آرایش خمشی سه نقطه ای تعیین شد. جیگ خمشی دارای یک تکیه گاه V شکل برای محکم کردن انتهای دیستال و پروگزیمال استخوان ران در طول آزمایش است. استخوان ران به صورت افقی و سمت قدامی به سمت بالا قرار می گیرد و بار به سمت پایین در مرکز میانی استخوان ران اعمال می شود. فاصله بین تکیه گاه ها 8 میلی متر بود. استخوان‌ها با سرعت جابجایی ثابت 0.02 میلی‌متر بر ثانیه تا زمان شکست با استفاده از دستگاه تست BOSE (3220) بارگذاری شدند (شرکت بوز، گروه سیستم‌های Endura TEC، Minnetonka، MN، ایالات متحده). منحنی‌های بار-جابجایی به‌دست آمدند و برای محاسبه خواص ساختاری و مصالح از جمله حداکثر بار، بار اوج، مدول الاستیک، مقاومت خمشی و غیره استفاده شدند.

3.5. تجزیه و تحلیل توموگرافی کامپیوتری میکرو

استخوان ران راست همه موش‌ها از بافت‌های نرم چسبنده پاکسازی شد و ریزمعماری استخوان ترابکولار متافیزیک دیستال فمور راست بالا توسط یک میکروسی‌تی‌اسکنر (eXplore Locus SP، GE Healthcare، London، ON، کانادا) با وضوح همسانگرد در هر سه بعد فضایی روی 8 میکرومتر تنظیم شده است. منطقه مورد نظر (ROI) با استفاده از همان مختصات در صفحه رشد استخوان ران انتخاب شد. پارامترهای مورفومتریک استخوان، شامل BMD، محتوای معدنی استخوان (BMC)، محتوای مواد معدنی بافت (TMC)، تراکم مواد معدنی بافت (TMD)، کسر حجمی استخوان (BVF)، جداسازی ترابکولار (Tb. Sp)، تعداد ترابکولار (Tb. N ) و ضخامت ترابکولار (Tb. Th) از طریق آنالیز ROI با استفاده از نرم افزار آنالیز استخوان ABA ارزیابی شد.

3.6. تجزیه و تحلیل پارامترهای بیوشیمیایی

فعالیت آلکالین فسفاتاز سرم (ALP) بر روی یک آنالایزر خودکار (Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, USA) اندازه گیری شد. سطوح سرمی DPD، BGP، و کاتپسین K توسط کیت‌های معرف مربوطه تعیین شد و اسید فسفاتاز مقاوم به تارتارات (TRAP) با توجه به ادبیات مرتبط آنالیز شد [32].

3.7. تجزیه و تحلیل وسترن بلات

سطح بیان پروتئین TRAF6، NF-kB PI3K، Akt، OPG، و RANKL در گروه‌های مختلف با استفاده از آنالیز وسترن بلات شناسایی شد. به طور خلاصه، پروتئین از استخوان درشت نی سمت راست موش با استفاده از بافر لیز حاوی 0.5 میلی مولار فنیل متیل سولفونیل فلوراید، پروتئاز و مهارکننده‌های فسفاتاز استخراج شد. لیزها به مدت 10 دقیقه در دمای 12 × گرم سانتریفیوژ شدند تا مواد رویی برای آنالیز بیشتر بدست آید. غلظت پروتئین لیزات ها با استفاده از روش کمی سازی اسید بیسینکونیک اندازه گیری شد. پروتئین ها (50 تا 100 میکروگرم) با استفاده از 10% SDS-PAGE جدا شدند، به غشای پلی وینیلیدین دی فلوراید منتقل شدند و با آنتی بادی های اولیه مونوکلونال که TRAF6، NF-kB RANKL، PI3K، Akt، OPG و -اکتین را هدف قرار می دهند، انکوبه شدند (1:500). همان غشاء با سیگنال‌های نورتابی شیمیایی که توسط نرم‌افزار Image Lab شناسایی شد، کنده شد و دوباره بررسی شد. اکتین یا توبولین به عنوان یک کنترل داخلی عمل می کند.

3.8. تجزیه و تحلیل آماری

تمام داده‌های به‌دست‌آمده از آزمایش‌های حیوانی با استفاده از آنالیز واریانس یک‌طرفه با آزمون Dennett توسط SPSS (نسخه 22.{2}}، IBM SPSS Statistics، IBM Corp.، Armonk، New York، NY، USA تجزیه و تحلیل شد. ) نرم افزار؛ مقدار p < 0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد و همه نتایج به عنوان میانگین ± انحراف معیار ارائه شد.

4. نتیجه گیری

به طور خلاصه، Cis A،گلیکوزیدهای فنیل اتانوئیدی فعالجدا شده از C. deserticola، فعالیت ضد پوکی استخوان قابل توجهی را روی موش های OVX نشان داد، و مکانیسم مولکولی ممکن است مربوط به غیرفعال سازی NF-kappaB با واسطه TRAF6- و فعال سازی PI3K/Akt باشد، بنابراین احتمالاً یک عامل امیدوارکننده برای درمان پوکی استخوان است. بیماری.

TUBULOSA CISTANCHE NATURAL FORفعالیت ضد پوکی استخوانPHGS75% ECH 30% ACT 12%